（分析化学专业论文）全内反射荧光法研究蛋白质与壳聚糖的相互作用.pdf

摘要 摘要 壳聚糖作为重要的天然聚合物，以良好的生物相容性、生物可降解性，对细 胞组织不产生毒性影响，在生物医学等方面得到了广泛的研究应用。壳聚糖对蛋 白质有良好的亲和能力，研究蛋白质与壳聚糖在界面上的相互作用、理解蛋白质 与壳聚糖分子在界面接触时的吸附过程变化对蛋白药物的开发和生物化学研究 具有非常重要的意义。全内反射荧光法是研究界面蛋白质吸附的一种有效的手 段。它利用指数衰减的倏逝波选择性激发介质表面的荧光团分子，产生全内反射 荧光，具有高度的界面( 表面) 特异性，从而可有效排除本体干扰，获取界面信息， 而且又具有非破坏性，能够实时、原位检测蛋白质吸附过程。本文致力于改进实 验室已有的固液界面全内反射荧光分析的部件，考察壳聚糖超薄膜的固定方案， 继而研究三种模型蛋白在壳聚糖超薄膜上的吸附情况。此外，还对罗丹明6 t 3 ( r 6 g ) 在石英水界面上的吸附进行研究，进一步认识咕吨染料在界面的情况。 论文分为四章： 第一章综述了全内反射荧光法在生物体系中的研究应用，以及壳聚糖与蛋白 质相互作用的研究概况。简要介绍全内反射荧光法的原理和应用，对目前全内反 射荧光法在生物体系，特别是固液界面蛋白质吸附的研究作了详尽的概述，同 时还介绍了壳聚糖的性质、应用以及它与蛋白质相互作用研究的状况，最后提出 整篇论文的设想。 第二章在现有可行的实验条件下，以石英片为载体，改进实验室已有全内反 射荧光部件，使其易于进行表面修饰，并且使样品的检测体积减少至2 0 0g t l 。考 察了旋涂法与化学键合法固定壳聚糖薄膜的情况，同时应用全内反射恒波长同步 荧光分析方法，监测壳聚糖表面固定情况。最后确定了以硅烷化试剂自组装在石 英载体上引入活性基团进行表面接枝壳聚糖的化学键合法，并对接枝方法进行了 优化，获得了表面均一的壳聚糖超薄膜。 第三章用荧光素异硫氰酸酯( f i t c ) 标记常见的模型球型蛋白( 牛血清白 蛋白、溶菌酶、牛血纤维蛋白原) ，应用全内反射荧光法分析它们分别与壳聚糖 摘要 超薄膜相互作用的情况，以及对牛血纤维蛋白原和牛血清白蛋白的二元竞争吸附 体系进行研究。 首先成功用f i t c 标记各种模型蛋白质，标记率在0 6 3 8 之间，观测其吸收、 荧光波长均有所红移，荧光各向异性值有6 1 0 倍的增长。 牛血清白蛋白( b s a ) 在壳聚糖上随着本体浓度增加，出现两个吸附增长区。 随浓度增加，吸附在壳聚糖表面上的b s a 可能从平躺取向排布向竖直取向变化； 在平衡浓度大于4 0 0p g m l 以上可能出现多层吸附。p h 对b s a 在壳聚糖上的吸 附作用也有显著的影响，随着p h 增加，b s a 在p h6 5 附近出现了极值，说明 主要以静电相互作用驱动了b s a 吸附。离子强度的增加，屏蔽了蛋白质与壳聚 糖表面、蛋白质蛋白质分子之间的静电斥力，使得b s a 的吸附量增加；而当盐 浓度大于0 1m o l l 之后，由于壳聚糖分子链的刚性变小，容易成团，与蛋白质 接触面积减小，导致吸附量下降。 此外，还考察了另外两种模型蛋白吸附随本体溶液浓度变化的影响，以及对 模型蛋白的吸附过程进行动力学方程拟合。牛血纤维蛋白原的界面荧光随着蛋白 质本体浓度的增加而增加；在低浓度下，双常数速率方程能够得到较好拟合性， 而在高浓度下，准二级动力学模型能够得到较好的拟合性。而溶菌酶在考察浓度 范围内，界面信号随浓度增长变化曲线与l a n g m u i r 吸附等温线形状近似。溶菌 酶对壳聚糖的表面亲和能力比b s a 更好，这可能由于壳聚糖与溶菌酶的底物结 构相似，溶菌酶易吸附于壳聚糖膜上。溶菌酶的吸附动力学过程可用准二级吸附 动力学模型描述，随着吸附初始浓度的增加，吸附速率常数k 也总体有一个数量 级的增长。 比较壳聚糖膜上b s a 与牛血纤维蛋白原在生理条件下竞争吸附的情况，在 壳聚糖界面上，牛血纤维蛋白原的相对竞争吸附能力要大于b s a 。这表明壳聚 糖也能够正常驱动牛血纤维蛋白原的吸附，激发血小板和凝血因子而发生凝血。 第四章利用全内反射恒波长同步荧光法直接测量在石英水界面上的罗丹明 6 g ( r 6 g ) 。通过对其本体、界面荧光光谱的分析，观察到r 6 g 分子在亲水石英 水界面上出现5n m 红移，红移的原因主要是染料分子旋转运动受到限制，石英 表面的刚性限制了分子的自由度，同时，石英水界面更低的极性也对红移产生 影响。同时还考察了r 6 g 在石英水界面上的吸附情况与本体溶液的浓度、p h 摘要 以及离子强度的关系。 关键词：壳聚糖薄膜；蛋白质；全内反射荧光法 a b s t r a c t a b s t r a c t a sa l li m p o r t a n tn a t u r a lp o l y m e r , c h i t o s a nh a sb e e na p p l i e de x t e n s i v e l yi nb i o m e d i c i n e f o ri t sb i o c o m p a t i b i l i t y , b i o d e g r a d a t i o n , a sw e l la sn o n t o x i c i t yt oc e l l u l a rt i s s u e s t h e r ei s g o o da f f m i t yb e t w e e ne h i t o s a na n dp r o t e i n f o rt h ed e v e l o p m e n to fp r o t e i nd r u g sa n dt h e r e s e a r c ho fb i o c h e m i s t r y , i ti ss i g n i f i c a n tt op r o b et h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nc h i t o s a na n d p r o t e i n , a n dt oo b s e r v ec h a n g e so fa d s o r p t i o nw h e nb o mo ft h e mc o n t a c ta ti n t e r f a c e t 0 “ i n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y ( t i r f ) i sa l le f f e c t i v et e c h n i q u et oi n v e s t i g a t e p r o t e i na d s o r p t i o na ti n t e r f a c e t h et o t a l i n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c eg e n e r a t e sf r o m i n t e r r a c i a lf l u o r o p h o r e ，w h i c hi ss e l e c t i v e l ye x c i t e db ye v a n e s c e n tw a v e t h e r e f o r e ，t h e r ea 佗 s e v e r a lc h a r a c t e r i s t i c sf o re v a n e s c e n tw a v ei n d u c i n gf l u o r e s c e n c e ，s u c h 笛s u r f a c es p e c i f i c i t y , e l i m i n a t i o no fb u l l ( i n t e r f e r e n c ea n dn o n - d e s t r u c t i o n i th a sb e e ns u c c e s s f u lt oi n v e s t i g a t e p r o t e i na d s o r p t i o ni ns i t u ，r e a l t i m eb yt h i st e c h n i q u e t h i sd i s s e r t a t i o ni sc o n c e r n e do nt h e i m p r o v e m e n to fi n s t r u m e n t a ld e v i c eo ft i r ff o rp r o b i n gs o l i d l i q u i di n t e r f a c e ，t h eo p t i o no f s u i t a b l em e t h o df o ri m m o b i l i z i n gc h i t o s a n ，a n dt h ea n a l y s i so fi n t e r a c t i o nb e t w e e nm o d e l p r o t e i n sa n du l t r a t h i nc h i t o s a nf i l mw h i c hw a si m m o b i l i z e do ns i l i c as u b s t r a t e i na d d i t i o n ， t h ea d s o r p t i o nb e h a v i o ro fr h o d a m i n e6 g ( r 6 g ) a ts i l i c a w a t e ri n t e r f a c ew a sa l s oc o n c e r n e d t h ed i s s e r t a t i o ni sc o m p o s e do ff o l l o w i n gp a r t s ： i nt h ef i r s tc h a p t e r , t h ea p p l i c a t i o no ft o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c et e c h n i q u ei n t h er e s e a r c ho fb i o l o g i c a ls y s t e m sa n dt h ea d v a n c eo nt h es t u d yo fi n t e r a c t i o nb e t w e e n c h i t o s a na n dp r o t e i nw e r er e v i e w e d t h ep r i n c i p l ea n da p p l i c a t i o no ft i r fw e r ei n t r o d u c e d b r i e f l y t h er e s e a r c ho nb i o l o g i c a ls y s t e m s ，e s p e c i a l l yo nt h es t u d yo fp r o t e i na d s o r p t i o na t s o l i d w a t e ri n t e r f a c e ，w a sd e s c r i b e di nd e t a i l t h e nt h ep r o p e r t ya n da p p l i c a t i o no fc h i t o s a n w e r ei n t r o d u c e d ，a sw e l l 雒t h eh o tt o p i c so nt h es t u d yo fc h i t o s a n p r o t e i ni n t e r a c t i o n t h e p l a no f d i s s e r t a t i o nw a s p u tf o r w a r da tt h el a s tp a r to f t h i sc h a p t e r i nt h es e c o n dc h a p t e r , an e wt i r fc e l lw a sd e v e l o p e db a s e do nt h ep r e s e n te x p e r i m e n t a l i v a b s t r a c t c o n d i t i o n s m i c r o f l u i dc e l lm a d eu po fs i l i c as l i c e s ，o fw h i c hd e t e c t i o nv o l u m ew a s m i n i m i z e dt o2 0 0 肛l ，w a sm o r ee a s i l yf o rm o d i f i c a t i o na n dc l e a n i n g t h ei m m o b i l i t yo f c h i t o s a nf i l m sw a sm o n i t o r e db yt o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o ns y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c e ( t i r s f ) t w om e t h o d s ( s p i nc o a t i n ga n dc h e m i c a lb o n d i n g ) w e r ee m p l o y e dt oi m m o b i l i z ec h i t o s a n o n t ot h es i l i c as u b s t r a t e w ef i n a l l ya p p l i e dc h e m i c a lb o n d i n gm e t h o dt of a b r i c a t ec h i t o s a n f i l m ，w h i c hu t i l i z e ds e l f - a s s e m b l ym e m b r a n et oi n t r o d u c ea c t i v eg r o u pf o rs u r f a c eg r a f t i n g 皿ep r o t o c o l so fg r a f t i n gw o r eo p t i m i z e da sw e l l a sar e s u l t ，t h eu n i f o r mu l t r a t h i nc h i t o s a n f i l mw a so b t a i n e d i nt h et 1 1 硼c h a p t e r , t h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nm o d e lh t cl a b e l e dp r o t e i n s ( b s a , f i b r i n o g e n , l y s o z y m e ) a n du l t r a t h i nc h i t o s a nf i l m 憾i n v e s t i g a t e db yt i r f , r e s p e c t i v e l y t h ec o m p e t i t i v ea d s o r p t i o nb e t w e e nb s aa n d f i b r i n o g e nw a s s t u d i e da sw e l l f i r s t l y , i tw a ss u c c e s s f u lt ol a b e lm o d e lp r o t e i n sw i t hf i t c ，w h o s el a b e l i n gr a t i o sw o r e b e t w e e n0 6t o3 8 r e ds h i f t sw e r eo b s e r v e db o t hi na b s o r p t i o na n df l u o r e s c e n c es p e c t r a t h e r ew a s6 - 10t i m e si n c r e a s ei nt h ev a l u eo ff l u o r e s c e n ta n i s o t r o p yo fl a b e l e dp r o t e i n s s e c o n d l y , w i t hi n c r e a s eo fc o n c e n t r a t i o no ff i t c b s ai nb u l ks o l u t i o n ，t w og r o w t h r e g i o n so fi n t e r f a c i a li n t e n s i t yo ff i t c b s aw e r ep r e s e n to nc h i t o s a nf i l m i ti ss u g g e s t e d t h a tf i t c - b s aw i l la d s o r bo nc h i t o s a nf i l m 、析t 1 1t h eo r i e n t a t i o n sc h a n g i n gf r o mh o r i z o n t a lt o v e r t i c a l ，a n da sm u l t i l a y o rs t r u c t u r ea th i l g hc o n c e n t r a t i o n ( m o r et h a n4 0 0 “g m l ) t h e a d s o r p t i o no ff i t c b s ad e p e n d e dw i t hp hv a r i a t i o n s w i t hp hi n c r e a s i n g ，t h e r ew a sa n e x t r e m ev a l u eo fi n t e f f a c i a li n t e n s i t ya p p r o x i m a t e l ya tp h6 5 i ti si l l u s t r a t e dt h a tt h e e l e c t r o s t a t i ca t t r a c t i o nw a st h em a i nd r i v i n gf o r c et oa d s o r bb s a i n c r e a s i n go fi o n i cs t r e n g t h s c r e e n e dt h er e p u l s i v ef o r c e sb e t w e e np r o t e i n c h i t o s a n ，p r o t e i n p r o t e i na tp h7 4 a sar e s u l t , t h ea m o u n to fa d s o r b a t e sw a si n c r e a s e d h o w e v e r , h i g h e rc o n c e n t r a t i o no fs u p p o r t i n g e l e c t r o l y t ei n d u c e dt h ed e c r e a s ei nb s aa d s o r p t i o nf o rc h i t o s a nc h a i n st e n d e dt oc u r l i n gt ob e c o n g l o b a t i o n ，w h i c hr e s u l t e di nf e w e rs i t e st oc o n t a c tw i t hp r o t e i n t h i r d l y , w ei n v e s t i g a t e dt h ec o n c e n t r a t i o ne f f e c t sa n da d s o r p t i o nk i n e t i c so fo t h e rt w o m o d e l p r o t e i n s f o rf i b r i n o g e n , i n t e r f a c i a li n t e n s i t yw a si n c r e a s e d w i t t lt h ei n i t i a l v c o n c e n t r a t i o n a tl o wc o n c e n t r a t i o n ，d o u b l ec o n s t a n te q u a t i o nw a sf i t t e dg r e a t l yt ot h e a d s o r p t i o nk i n e t i c sc u r v e s a th i g hc o n c e n t r a t i o n ，p s e u d o - s e c o n do r d e rm o d e la p p e a r e da s t h eb e s tf i t t e rt oa d s o r p t i o nk i n e t i c sc u r v e s f o rl y s o z y m e ，i n t e r r a c i a li n t e n s i t yc h a n g i n gw i t h c o n c e n t r a t i o no ff i t c l y zw a si nt h es a m es h a p ea sl a n g m u i ra d s o r p t i o ni s o t h e r m t h e a f f i n i t yo fl y s o z y m et oc h i t o s a nw a sm u c hb e t t e rt h a nt h a to fb s af o rt h es t r u c t u r eo f c h i t o s a nw a ss i m i l a rt os u b s t r a t eo fe n z y m e p s e u d o - s e c o n do r d e rm o d e lc o u l dd e s c r i b e a d s o r p t i o np r o c e s s e so fl y s o z y m eo nc h i t o s a n f i l me x a c t l y w j 也i n c r e a s eo fi n i t i a l c o n c e n t r a t i o no fl y s o z y m e ，t h e r ew a so n e - o r d e rm a g n i t u d ei n c r e a s ei na d s o r p t i o nr a t e c o n s t a n t ( k ) a n dt h e n , t h es t u d yo fc o m p e t i t i v ea d s o r p t i o no fb s aa n df i b r i n o g e no nc h i t o s a nf i l ma t p h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o nw a sc a r r i e do u t i tw a sr e v e a l e dt h a tt h e r e l a t i v ec o m p e t i t i v e a d s o r p t i o nc a p a c i t yo ff i b r i n o g e nw a sm u c hl a r g e rt h a nt h a to fb s a t h er e s u l tc o n f i r m e d t h a tc h i t o s a n ，a so t h e rc o m m o nh a c m o s t a t i c ，w o u l da d s o r bb l o o dp r o t e i na n da c t i v a t ep l a t e l c t a n dc o a g u l a t i o nf a c t o rf o rc l o t t i n g i nt h ef o u r t hc h a p t e r , t o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o ns y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c e ( t i r s f ) w a s d e v e l o p e da sad i r e c ta n ds u c c e s s f u lt o o lt oi n v e s t i g a t eax a n t h e n ed y e ( r 6 g ) a tt h e s i l i c a w a t e ri n t e r f a c e f r o ma n a l y s i so ff l u o r e s c e n c es p e c t r ab o t hi nb u l l 【a n di n t e r f a c e ，5m n r e ds h i f to ff l u o r e s c e n c es p e c t r aa th y d r o p h i l i cs i l i c a w a t e ri n t e r f a c ew e r eo b s e r v e d t h e b a t h o c h r o m i cs h i f tw a sm a i n l yd u et ot h el i m i t a t i o no fr o t a t i o n a lm o v e m e n t so ft h ed y e t h e r i g i d i t yo ft h es i l i c as u r f a c er e s t r i c t e dt h ef r e e d o mo ft h em o l e c u l e s t h el o w e rp o l a r i t yo f m i c r o e n v i r o n m e n ta tt h es i l i c a w a t e ri n t e r f a c et h a nt h a ti na q u e o u se n v i r o n m e n ts h o u l da l s o m a k eac o n t r i b u t i o nt ot h ep h e n o m e n o n m e a n w h i l e ，t h ee f f e c t so fb u l kc o n c e n t r a t i o n ，p h ， a n di o n i cs t r e n g t ho nt h ea d s o r p t i o no fr 6 gw e r es t u d i e da sw e l l v i a b s t r a c t k e y w o r d s ：u l t r a t h i nc h i t o s a nf i l m ；p r o t e i n ；t o t a l i n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y ( t i r f ) v 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。本人 在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标 明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。 声明人( 签名) ：砖徒 年月日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大学有 权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版，有权 将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查 阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的 标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 l 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( ) ( 请在以上相应括号内打“ ) 作者签名：际镜 日期：年月 日 导师签名：日期：年月日 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 全内反射荧光法在生物体系中的应用 全内反射荧光法已成为荧光光谱学在生物化学应用中的重要工具。表面分子的分布 和动力学是众多生物学核心问题，例如：激素、神经递质和抗原对细胞的结合和刺激， 血浆蛋白在异物表面沉积引起凝血，细胞表面吸附扩散等。全内反射领域的最初工作由 h a r r i c k 等【l 】在2 0 世纪六十年代开始从事。全内反射荧光实验是f l t h i r s c h f i e l d 2 在1 9 6 5 年完成。1 9 7 6 年，h i r s c h f i e l d 3 首次尝试用全内反射荧光法测定溶液中的单分子，揭开 了单分子荧光检测的序幕。8 0 年代后，全内反射荧光法得到了快速地发展，并被广泛地 应用到界面物质多样性的研究中，从蛋白质到聚合物、染料等。 全内反射荧光法在生物中的应用主要体现在以下几方面：蛋白质吸附平衡、表面分 子浓度梯度变化、表面分子的定向、表面定量和其他表面性质的测量、选择性观测等等。 1 1 1 全内反射荧光法原理 众所周知，当一束光以入射角o 。从折射率1 1 。的介质1 照射到折射率1 1 。的介质2 ，到 达两介质的交界面时，将同时发生光的反射和折射。反射光以与入射光相同的角度0 。回 到介质l ，而折射光以满足折射定律的0 。进入介质2 ，因此存在一个临界角0 。，在入射角 为0 。时折射角0 。为2 。按照折射定律，临界角的方程为： 。c = s i n 吐( n t j n l )( 1 1 ) 尽管光完全反射，仍有少量光以倏逝波的方式穿透光密介质进入光疏介质( 如图1 1 ) ，这 种倏逝波是一个沿平行于界面方向传播的行波，其能量e ( z ) 随离开界面的距离z 呈指数 迅速衰减： e ( z ) = e ( o ) e z l d p( 1 2 ) 其中d ，称为倏逝波的渗透深度或有效深度( 穿透深度) ，它与入射角、入射光波长及两 介质的折射率有关，其大小表示为： 厦门大学硕士学位论文 d p = k 2 兀( n 1 2 s i n 2 0 广皿2 2 ) 1 ，2 l ( 1 3 ) 一般情况下，倏逝波具有和入射光相同的频率，它只存在于界面层，一般渗透深度 大约在几百纳米左右，无法被大量本体分子所吸收，因此只能选择性激发在界面层的荧 光团，从而产生所谓的全内反射荧光，实现空间分辨的目的。 牖怖2 。 1 = d e c a y se x p o n e n t i a l l yi n t ot h eo p t i c a l l yr a r em e d i u m 1 1 2 蛋白质在固液界面的研究 全内反射荧光研究初始是在固相载体上进行 4 】；由于传统的方法无法对于吸附发 生的局部区域进行研究，而t i r f 恰好能实现空间分辨，达到研究界面区域的蛋白质一 表面相互作用的目的，因此，它马上就应用于蛋白质吸附的研究【5 】，一直以来t i l 心在 固相载体的蛋白吸附是研究最成熟的。 2 第一章文献综述 蛋白质吸附能“催化”细胞附着、阻塞人工动脉和血液透析、淤塞生物传感器和蛋白 质纯化中的膜，影响食品工业中的热交换器。所以，蛋白质在固体表面的吸附在生物医 学、生物材料、食品等工业领域得到了广泛的研究。例如，过去几十年中，人们一直希 望控制、预测和利用蛋白质的吸附，当前大量的研究工作主要集中于理解蛋白质在界面 处的行为，每年出版的有关该方面的文献达3 0 0 篇以上 6 】。蛋白质在界面上的行为涉及 了许多问题： ( 1 ) 吸附机理 ( 2 ) 界面上的构象和取向 ( 3 ) 竞争吸附 ( 4 ) 固体表面的化学性质对蛋白吸附的影响 ( 5 ) 蛋白质在界面的定量 ( 6 ) 蛋白质的吸附对细胞与固体表面的相互影响 1 1 2 1 吸附机理的研究 通常人们用简单的模型来研究蛋白质的吸附，它们包括t l b 单层膜 7 】，脂质体双 层膜 8 9 】，囊泡【1 0 】，胶束等。最简单的采用带有不同疏水残基的单分子层，在一定的 疏水范围内，考察疏水界面对蛋白吸附动力学的影响。 比较吸附于石英表面由香豆素标记的聚合链和普通聚合链的自交换而得的聚氧乙 烯( p e o ) 层，发现表面行为是非平衡的，这与先前的研究认为吸附p e o 局部平衡不同。 表面会产生玻璃化，而在本体中( 溶液或融熔物) 则不会发生玻璃态。对p e o 水一石英 体系，在纯溶剂中恒温下能够测得的松弛时间可以保持1 0 h ；尽管在此时间之外也有松 弛，但是这种由自交换引起的额外的表面演化不可测，自交换通常并不完全。这揭示了 聚氧乙烯聚合链的集群不可逆地黏附于表面，还说明各种各样的界面状态( 它们的表面 黏附范围不同) 是长时间存在的 1 1 】。 由十八烷基三氯硅烷，二十烷基酸和二棕榈酸卵磷脂自组装而成的有机薄层上研究 了人生长因子重新联合吸附过程，并比较了在石英和甲基化的石英载体的吸附。由生长 荷尔蒙( h g h ) 单色氨酸残基发射的内源荧光的光谱、强度，猝灭与吸附动力学以及蛋白 构象相关。因为不同的烷基化疏水表面的表面密度和构象自由度不同，则观测到的生长 3 厦门大学硕士学位论文 荷尔蒙的吸附量不同；发现在如果烷基链是有序结构则蛋白吸附量远小于非有序结构的 脂肪酸和磷脂层。甲基化的表面有更大的荷尔蒙构象变化，发射光谱有7n m 的蓝移，荧 光猝灭效率、构象变化在脂肪酸和磷脂上较小。在疏水头基的自组装单层的吸附动力学 与固体疏水表面相似，吸附在石英表面h g h 的构象变化比较小，而吸附在脂肪酸头基 的则更j , 1 2 。 1 1 2 2 蛋白质在界面上的构象和吸附取向 表面上能够吸附酶，抗体或细胞黏附蛋白，如果这些蛋白在界面上发生构象变化， 随后的生理过程就会受到影响，许多理论认为蛋白质在界面吸附会使熵值增加，也可能 使蛋白的结构在表面发生改变，重新取向和去折叠，使得蛋白质与表面的结合面积增大； 被吸附蛋白从可逆状态转换为不可逆，这使蛋白与表面结合更加紧密，自身结构可能会 松散。然而，生物体要保持一定的生物活性依赖于一定的天然结构，所以在一些表面上 蛋白质的构象变化是十分有限的。近年来用t i r f 研究溶茵酶是一大热点，因为溶菌酶 是一种能分解粘多糖的酶，廉价易得，结构成刚性，对其构象的研究是评价新结构方法 的标准。在1 9 8 7 年人们就比较研究了人溶菌酶和鸡蛋溶菌酶 1 3 】。 c c z e s l i k 等以鸡蛋溶菌酶和葡萄糖球菌核酸酶进行了一系列的构型和定向的研究 【1 4 】。以色氨酸残基为内源荧光为探针用t i r f 和频域时间分辨荧光偏振进行研究，在 很大的温度范围内，葡萄糖球菌核酸酶和鸡蛋白溶菌酶的内在动力学和整体转动因吸附 而减小。随着温度的提高，蛋白分子完全固定并且整体转动部分扩增，这与色氨酸残基 的局部自由度有序参数有关，它是个不为零的常数。这说明了在吸附蛋白中的色氨酸残 基的重新定向的角度范围比起溶解蛋白是受限的( 即使在高温下也不例外) ，这种技术 可以更好地理解蛋白在固相载体上的活性。 鸡蛋白溶菌酶与水石英界面相互作用发生了构象的改变。在不同温度范围的t i r f 光谱和溶液相光谱比较，发现吸附溶菌酶的最大波长的荧光强度比起溶解相中 ( 2 0 6 0 0 c ) 红移了7 a m ，这说明了当溶菌酶吸附在石英上是反折叠的。在温度诱导下， 石英干胶片上溶菌酶和葡萄糖球菌核酸酶的吸附急剧增加( 用光学反射计测量) ，这说 明了相应的吸附过程是吸热并且是熵驱动的。这种熵增源于低温下构象的变化，实验结 果表明，有着更小的g i b b s 能的未折叠的蛋白有很大的吸附倾向，在溶液中当蛋白处于 4 第一章文献综述 反折叠温度之上，疏水残基脱水，受热而以伸展状态暴露在水中，这很可能是溶菌酶和 葡萄糖菌核酸酶的吸附驱动力 1 5 1 。 使用全内反射荧光法，c c z e s l i k 等 1 6 1 观测到溶菌酶在疏水界面的吸附动力学，有 时在特定条件下，溶菌酶运动过度；而当自由溶菌酶的浓度低或是表面流动速率小时， 单层的覆盖度接近它的极限值，人们通过比较卷曲和取代模型的数据，认为这种行为是 界面从末端向侧向定向的松弛( 它发生在卷曲时，不是侧向吸附的蛋白取代末端吸附的 蛋白) 并定量地预测了不同吸附过程( 如自由溶液的浓度、流动速率、流动溶剂的干扰) 。 另外，s m d a l y 等人就溶菌酶在石英表面的定向机理作出了解释 1 7 】，用t i r f 、 流动电流、光学反射计研究不同溶剂条件下鸡蛋溶菌酶在石英表面的重新定向的机理。 在表面有两个阶段的重新定向发生在溶菌酶层。第一阶段是优化溶菌酶与带电表面相互 作用的重新定向，同时减小吸附分子之间的侧向排斥力。这一过程表明吸附层到达临界 表面覆盖度，且吸附蛋白之间存在侧向相互作用。定向速率和本体蛋白浓度、剪切速率 有关，表明来自本体的蛋白也参与了重新定向。初始的定向使得活性位点面朝溶液，并 且大多数正电氨基酸片断与负电石英表面连接。第二阶段是缓慢重构过程，它发生在吸 附层的覆盖度逐渐接近饱和时，且重构对应于蛋白分子重新定向，这些蛋白由于第一阶 段重新定向使其能够填充表面空白。流动电流的测量证实了两阶段的重新定向机理的假 设，表明被吸附的溶菌酶首先引起表面电位的反转，接着当溶菌酶优化其取向时，发生 了向0 电位正电减少的慢速松弛。相应的，吸附层的解吸部分显著小于重新定向前的部 分。 1 1 2 3 蛋白质在表面的竞争吸附 蛋白质竞争吸附与其它粒子竞争吸附的区别在于，蛋白质的吸附是不可逆的过程。 影响因素中，除了最需要的测量因素竞争物质的相对浓度，精确描述蛋白质竞争吸 附的过程，不仅包括蛋白吸附中不可逆的特征，还包括影响竞争的影响因素，包括：不 同离子的传输速率，吸附速率，每个离子转化为不可逆状态的转换速率。因此，混合蛋 白体系的研究成为近年的热点，这些研究让我们对玻璃，石英，以及其他许多材料的界 面交换现象有所了解。 m m a l m s t e n d x 组一直致力于蛋白质竞争吸附，特别是血浆蛋白的研究。材料与血 5 厦门大学硕士学位论文 液接触时首先发生的是血浆蛋白在材料表面的吸附，吸附的蛋白质的种类和数量对后 继的凝血过程有着决定性的影响，并且蛋白质的种类和数量又取决于材料的表面性质。 因此搞清楚蛋白质在材料表面的吸附行为，材料优先吸附的蛋白质的种类，以及吸附蛋 白质对材料血液相容性的影响，是非常有意义的。他们的工作包括了对表面修饰了带有 不同烷烃链长的石英表面蛋白质竞争吸附【1 8 】，在聚合物表面的蛋白质的竞争吸附 1 9 】， 电解质对蛋白吸附的影响 2 0 】，表面活性剂和蛋白质的竞争吸附 2 l 】，在自组装单层中 蛋白吸附顺序的变化 2 2 】，在胃肠药物传输的吸附研究 2 3 】。 该小组应用t i r f 和椭圆偏光光度法研究了h s a ( 人血清白蛋白) ，h g g ( 人丙种球 蛋白) ，f i b r i n o g e n ( 纤维蛋白原) 等混合血浆稀释1 0 0 倍吸附在三种不同的等离子表面 ( 带有不同的表面电荷和表面能) 的情况。在疏水的p p h m d s o ( 六甲基二硅氧烷) 上几 乎没有蛋白被取代，而吸附层主要f l 习h s a 和i g g 占据，f i b r i n o g c n 只占有很小的部分；在 p p 从( 丙烯酸，带负电) 、p p d a c h ( 环己二胺，带正电) 修饰的表面上f i b r i n o g c n 完全占据了表面，而h s a 和i g g 则很少【1 9 】。 用椭圆偏光法和t i l 讧测量吸附时间、p h 、电解质过剩浓度对蛋白质吸附的影响。 当p h = 7 2 时，h s a 自交换缓慢( 要数小时) ，而与预吸附时间无关( 9 0 s 9 0 r a i n ) ：在p h 8 时，电解质过剩浓度为5 m m c s - 9 8 ) ，氢氧化钠，氯化 钠，邻苯二甲酸氢钾，均为国产试剂，使用前未进一步处理。去离子水，超纯水，氮气。 2 2 2 仪器 除特别指明外，其它荧光光谱都在实验室自制的荧光仪上绘制，1 5 0w 的氙灯作光 源，激发和发射狭缝光谱带宽为5a m ，激发和发射单色仪的扫描速度均设为2 4 0 r a n m i n 。本体实验使用1 0m m x l 0h i m 石英比色皿。界面实验用半圆柱形石英棱镜实现 对光的全内反射