（水产养殖专业论文）湖光岩玛珥湖可培养菌群多样性初步研究.pdf

湖光岩玛珥湖可培养菌群多样性初步研究 摘要 微生物作为物质循环和能量流动的主要参与者，在湖泊生态系统中起着特别重要 的作用；湖光岩玛珥湖是典型的、玛珥类型的火山口湖泊，具有非常鲜明、独特的地 质和水文环境条件，但有关该湖泊微生物组成的研究还比较少。因此，本研究采用纯 培养法和1 6 sr r n a 基因序列分析的方法对湖光岩玛珥湖中可培养细菌的多样性进行 研究，以了解此类湖泊可培养细菌的多样性。 研究选择了四类7 种不同的培养基从湖光岩玛珥湖水体和底泥中分离得到2 9 5 株细菌，通过水煮法提取分离菌株的d n a ，以p c r 扩增获得细菌1 6 sr r n a 基因， 使用四种限制性内切酶( h i n 6i 、h i n fi 、m s ei r s ai ) 对1 6 sr r n a 基因扩增片 段分别单酶切、综合酶切，经带型分析和分类后，获得具有代表性的菌株7 l 株。进 而根据上述菌株的1 6 sr r n a 基因序列构建了分子系统发育树。 结果表明，7 1 个分离菌株属于5 个大的系统发育类群：放线菌f ( a c t i n o b a c t e r i a ) 、 拟杆菌门( b a c t e r o i d e t e s ) 、异常球菌一栖热菌门( d e i n o c o c c u s - t h e r m u s ) 、变形菌门 ( p r o t e o b a c t e r i a ) 和厚壁菌门( f i r m i c u t e s ) 包含8 个纲、1 3 个目、1 8 个科、2 7 个属。 优势类群为p r o t e o b a c t e r i a 门( 4 4 株，6 2 0 9 6 ) 其中仅r - p r o t e o b a c t e r i a 亚门就已达3 5 株，4 9 3 ；其次是f i r m i c u t e s 门( 1 7 株，2 3 9 9 6 ) ；再次是b a c t e r o i d e t e s 和a c t i n o b a c t e r i a ( 各4 株，5 6 ) ；比例最小的为d e i n o c o c c u s t h e r m u s ( 2 株，2 8 ) 。这些分离物 中，5 3 0 、5 - 2 分别代表单胞菌科( p s e u d o m o n a d a c e a e ) 和莫拉菌科( m o r a x e l l a c e a e ) 的新种属；另有5 株细菌可能代表对应科目中的新种属：5 3 可能代表肠杆菌科 ( e n t e r o b a c t e r i a c e a e ) 、7 - 1 7 可能代表b 变形杆菌门未定科( i n c e r t a es e d i s5 ) 中的新 种属和c 8 可能代表红环菌科( r h o d o c y c l a c e a e ) 的新属以及p 8 和p 2 可能代表芽孢 杆菌科l 亚科( b a c i l l a c e a e1 ) 的2 个新属。 从以上结果可以看出，湖光岩玛珥湖内细菌存在着其他湖泊常见的类别如 a c t i n o b a c t e r i a 、p r o t e o b a c t e r i a 和f i r m i c u t e s ，具有一定的相似性，又出现了些不常见 的类别d e i n o c o c c u s t h e r m u s ，显示出了湖光岩玛珥湖的特异性；并且潜藏着较多的 新的微生物类群( 物种) ，可作为微生物资源新的来源。 关键词：湖光岩玛珥湖；可培养细菌；1 6 sr r n a 基因；系统发育分析；细菌多样性 d i v e r s i t yo fc u l t i v a t i o n - d e p e n db a c t e r t i ai nh u g u a n g m a a r l a k e a b s t r a c t a sm a j o rp a r t i c i p a n t si nn u t r i e n tc y c l i n ga n de n e r g yf l o w , m i c r o o r g a n i s m sp l a ya l l i m p o r t a n tr o l ei ne c o l o g ya n de n v i r o n m e n to fl a k e h u g u a n gm a a rl a k ei sat y p i c a l c a l d e r am a a rl a k e ，w h i c ht a k e so n p r e t t ys h a r p - c u tg e o l o g i c a l 丛w e l l a s u n i q u e h y d r o - e n v i r o n m e n t a lf e a t u r e s 、m l i l ei t sh a r d l yr e p o r t e da b o u tt h es t r u c t u r eo ft h i sk i n do f l a k e , s ot h em e t h o do nb a c t e r i ap u r ec u l t i v a t i n ga n da n a l y z i n g16 sr r n ag e n es e q u e n c e s w b t eu s e dt oi l l u s t r a t et h ed i v e r s i t yo fc u l t m 曲l eb a c t e r i ai nh u g u a n gm a a rl a k e 2 9 5s t a i n sw e r eo b t a i n e df r o mw a t e ra n ds e d i m e n ts a m p l e sb ye m p l o y i n g7d i f f e r e n t m e d i aw h i c h b e l o n gt o4t ) p 髓a f t e rd n a e x t r a c t i o nv i ab o i l i n gb a c t e r i a , 16 sr r n ag e n e s w e r ea m p l i f i e db yp c rr e a c t i o na n da m p l i c o n sw e r ec u ts e p a r a t e l yb yr e s t r i c t i o nc n z y m e s ( 肺刀6i 、h i n fi 、m s ei ，r s ai ) t h r o u g h n z y n l ec u t t i n g 、a n a l y s i n ga n dc l a s s i f y i n g s t r i p s ，16 sr r n ag e n e so f7 1 s t a i n sr e p r e s e n t i n gd i v e r s eb a c t e r i aw e r ec l o n e da n d s e q u e n c e d f u r t h e r m o r e , 16 sr r n ag e n ep h y l o g e n e t i ct r e e sw e r ec o n s t r u c t e da n da n a l y z e d i nd e t a i l ，b yu s i n gb i o l o g i c a ls o f f w a r e s t h er e s u l ts h o w e dt h a t71 s e q u e n c e sw e r ed i v i d e di n t o5p h y l o g e n e t i cb r a n c h e s ( a c f i n o b a c t e r i a 、b a c t e r o i d e t e s 、d e i n o c o c c u s t h e r m u s 、p r o t e o b a c t e r i aa n df i r m i e u t e s ) c o n t a i n i n g8c l a s s e s 、1 3o r d e r s 、1 8f a m i l i e sa n d2 7g e n e r a p o p u l a t i o no f p u r ec u l t u r e si n h u g u a n gm a a rl a k ew a sd o m i n a t e db yp r o t e o b a c t e r i aw h i c ha c c o u n t i n gf o r6 2 0 w i t h 4 4s t a i n s , a m o n gt h i s p h y l u mo n l yt - p r o t e o b a c t e r i a a c c o u n t e df o r4 9 3 ：t h e s u b d o m i n a n c ew a sf i r m i c u t e sw h i c ha c c o u n t i n gf o r2 3 9 诵t l l17s t a i n s ：b o t h b a c t e r o i d e t e sa n da c t i n o b a c t e r i ah a v e5 6 p e r c e n t a g e ；t h el a s t2s t a i n sb e l o n gt o d e i n o c o c c u s t h e r m u s ，o n l y2 8 m o r e o v e r , s t a i n s5 3 0 & 5 - 2r e p r e s e n tu n k n o w ng e n e r a o fp s e u d o m o n a d a c e a ea n dm o r a x e l l a c e a e ；o t h e r5s t i a n sm a yr e p r e s e n t4n o wp o t e n t i a l g e n e r ao fd i f f e r e n tf a m i l i e s ：5 - 3 、7 - 1 7a sw e l la sc 8r e p r e s e n t i n gt h en e wg e n e r ao f e n t e r o b a c t e r i a c e a e 、i n c e r t a es e d i sa n d r h o d o c y c l a c e a e o fb - p r o t e o b a c t e r i a ， s t a i n s - - p 8 & p 2w o u l db et h en o v e lg e n e r ao f b a c i l l a c e a e l t h u s ，i no n eh a n dh u g u a n gm a a rl a k ei ss i m i l a rt ou s u a ll a k e sf o ra c t i n o b a c t e r i a 、 p r o t e o b a c t e r i aa n df i r m i c u t e se a s i l yf o u n di no t h e rl a k e s ，i nt h eo t h e rh a n dh u g u a n g m a a rl a k ei sd i f f e r e n tf r o mt h eu s u a ll a k e sf o rd e i n o c o c c u s t h e r m u sh a r d l yf o u n di n o t h e rl a k e s ；a sw e l lt h e r ea r es o m ep o t e n t i a ln o v e ls p e c i e so fm i c r o b e s ，c o n f i r m i n gi ta sa l l n e ws o u r c ef o ri s o l a t i n gv a l u a b l em i c r o o r g a n i s m k e yw o r d s ：h u g u a n gm a a rl a k e ；c u l t i v a t e db a c t e r i a ；16 sr r n ag e n e ；p h y l o g e n e t i c a n a l y s i s ；b a c t e r i a ld i v e r s i t y i i i 广东海洋大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得 的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承 担。 作者签名蓄多刍 2 。可年月 t 罗日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“4 ) 作者签名：专乡多 翩躲肋 ， 6 月厂尸日 ， 易月，夕日 年 年 昴，哆 0 0 2 2 广东海洋大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 玛珥湖概况 玛珥的英文“m a a r ”来源于拉丁文“m a r e 一，即海的意思，是居住在德国莱茵地 区的人们对当地有水的湖泊、沼泽的称呼。1 9 世纪早期，德国科学家s t e i n i n g c r 最早 从德国西部艾费尔高原( e i f e i ) 第四纪火山区的小而圆形的火山口湖研究开始，初步把 玛珥( m a a r ) 定义为一种火山类型。b u c h e l 对德国西部e i f e l 区的玛珥进行了综合研究， 提出了玛珥即是由环形墙、火山口沉积物、火山筒和馈浆通道组成的系统，并概括了 玛珥发生发展的不同演化阶段【。根据联合国地质专家介绍【2 1 ，玛珥湖有以下几个特 征：湖是平地火山爆炸后冷却下沉形成的：火山爆炸时，喷出的是蒸汽和碎屑，而不 是岩浆；爆炸口低于海平面，湖水永不干涸；水源是地下自然渗透出的矿泉水，含有 多种微量元素和矿物质，并具有神奇的自我净化功能。玛珥湖是世界地质精品，因首 先在德国玛珥发现而得名。上世纪8 0 年代，联合国曾派专家对广东湛江湖光岩玛珥 湖进行了长期的探测。结果测定，1 6 万年前，地下炽热的岩浆与地下水混合形成高 压过热水，冲破地岩产生大爆炸，形成了这个低于海平面4 4 6 米的深坑，积水向深坑 汇聚，于是便有了湖光岩玛珥湖p j 。 湖光岩玛珥湖整个结构非常简单：无出口和入口，补给区仅限于环形墙内，汇水 面积接近湖水面积；湖盆结构简单，特殊的深度湖面比以及相对稳定的水体；水体 较深，湖体范围小，避免了构造变动影响和风场的干扰【4 l ，所以它在时间和空间尺度 上对环境变化非常敏感，记录了丰富的环境演化信息【5 】1 9 9 7 年，联合国地球研究中 心会同中国科学院地质研究所的专家，耗资4 5 0 万美元，对湖光岩进行了勘探，从钻 出的沉积物分析，确定湖光岩为世界罕见、中国唯一的玛珥湖。科学家们经过2 年的 研究分析，从沉积物可分析到整个地球十六万年以来，古台风、古气候、古降雨量的 变化情况。了解到整个地球人类的兴衰和植物的变迁，对目前地球环境保护提供重要 科学依据。已引起了联合国和中国科学院的高度重视。现在联合国新任务是在湖光岩 建立环保观察点一1 1 j 。 湖光岩玛珥湖具有非常鲜明、独特的地质和水文环境条件。它是世界上唯一分布 在亚热带区域、低海拔的玛珥湖。其水上面积占总面积的6 0 左右，湖表面形态近似 圆形，湖水面积约2 2 3 k m 2 ，海拔2 3 m ，最大水深约2 0 m ；湖水清澈湛蓝，远离城郊 和工厂，保持着原生态环境。湖的周围分布有玄武质火山碎屑岩及不同程度的红土化 表层，同时湖区周围含有大量植被，这些构成了湖泊生物的主要营养来源【4 1 。红土主 要是由湖光岩组火山岩( 玄武岩) 风化残积而成，富含硅、铝、铁、钙、镁等元烈们。 当降水加强时，这些营养物质可被带入湖中，供给湖水中的生物类群。湖的表层水体 富氧低盐 7 1 ，而且在长时间尺度上几乎没有变化【引。湖光岩玛珥湖沉积物最大厚度达 1 湖光岩玛珥湖可培养菌群多样性初步研究 6 0 m e s l 湖底以还原生境为主，底栖生物很少 9 1 。 湖光岩玛珥湖具有极高的科学价值。其处于东亚季风与西南季风的交汇点，是台 风和热带风暴登陆的桥头堡，厄尔尼诺的重要影响地区；湖底沉积物是地球古气候的 高分辨率信息载体，这些沉积纹泥高分辨率地记录了湖光岩玛珥湖形成以来该区古环 境演变过程，地质学家从沉积物可了解到整个地球过去的全球变化，为目前地球环境 保护提供重要科学依据。目前国际上的玛珥湖研究集中在欧洲【1 0 】，欧洲先后执行了 地质玛珥研究计划( g e o m a a r s ，1 9 8 6 , - - 1 9 8 9 ) 和欧洲玛珥研究计划( e u r o m a a r s ， 1 9 9 0 , , 1 9 9 3 ) ，高分辨率地获取了连续完整的玛珥湖沉积记录，并通过纹层年代学、沉 积学、地球化学、古生物学、孢粉学、古地磁学、硅藻学等多学科交叉，多指标综合 方法进行系统研究。玛珥湖沉积与环境研究获得了巨大进展，使以年为分辨率的环境 一气候记录从历史记录的几百年扩展到最近7 万多年，玛珥湖研究区也从德国的e i f e l 扩展到法国、意大利等整个欧洲。欧洲湖泊钻探项目( e l d p ，1 9 9 6 - - 2 0 0 0 ) 集中研究 分布于欧洲的玛珥湖，获取末次间冰期以来以年甚至以季节为时间尺度的高分辨率古 气候记录，旨在理解欧洲大陆气候演变的过程和动力机制。 1 2 湖泊环境微生物研究信息 微生物与整个湖泊水域的生态系统有着密切联系，参与物质循环和能量流动，发 挥着重要作用。水体中的有机物均通过不同类型微生物分解后进入再循环。有机物的 生物氧化主要靠异养细菌和其他微生物将其分解成较简单的化合物从中获取物质和 能量用于自身的生长和繁殖：且细菌不能直接吸收大分子量的复杂有机化合物，这些 复杂的有机化合物必须在有体外酶的作用下水解成小而简单的化合物后才能吸收到 体内进行代谢。如机体所需要的c 、n 、p 等元素就是在细菌的参与下不断的循环【i i j 。 水体中的固氮细菌能固定大气中的气态氮，氨化细菌可将大分子有机含氮化合物 分解成植物可利用的氨态氮，从而有利于有机污染物的降解和转化；氨氧化细菌能将 氨氮氧化成亚硝氮，而亚硝酸氧化细菌可以将亚硝氮氧化成硝基氮【1 2 】，从而可避免氨 盐和亚硝酸盐对水生生物的毒害。未被植物吸收的硝酸盐又可被硝酸盐还原菌或脱氮 菌还原成气态的n 2 或n 2 0 而释放到大气中【1 3 】。正是由于水域中各类氮利用菌的相互 作用，才使生态系统中各种氮的形态保持在一个合适的水平。 同样，微生物在碳素的分解过程中发挥着不可替代的作用。绿色植物和藻类通过 光合作用将大气中的c 0 2 固定成细胞内的含碳物质，再加上人类活动而带入的含碳 化合物，构成了湖泊碳素的主要来源。这些漂浮于水体中、沉入湖底的含碳物质或被 异养微生物分解成腐殖质，或被微生物吸收参与湖泊食物链循环，或通过呼吸或者发 酵作用生成气态物质( 如甲烷，c 0 2 等) 回归到大气中。因此，异养微生物在碳素的分 解过程中发挥着不可替代的作用。 磷是影响水体生产力的主要营养物质，在水生生态系统中可以以有机磷和水不溶 2 广东海洋大学硕士学位论文 性无机磷等多种形式存在。其中水溶性无机磷( w s i p ) 是最重要的一种，因为它能被 浮游植物直接吸收，因此可直接地影响水体生产力；水不溶性无机磷( i s i p ) 和有机磷 ( o p ) 不能被浮游植物直接利用，但能被无机磷溶解菌( i p b ) 和有机磷分解菌( o p b ) 转 变成可溶性的形式【1 4 】。由此可见，微生物在释磷过程中也起着非常重要的作用。 综上所述，微生物作为物质循环和能量循环的主要参与者，起着不可忽视的作用。 湖泊微生物的多样性研究，更有助于我们深入地掌握湖泊微生物的分布特征及其在湖 泊生态系统中的功能与作用，对深入开展湖泊生态环境研究具有重要的意义。 湖泊的生境类型各不相同：有富营养的，有贫营养的，有含盐量高的，有海拔高的 等等。正是由于湖泊生境类型的各不相同，使得湖泊微生物的多样性异常丰富，因此， 对湖泊微生物的研究可从多方面，不同角度来进行。近年来，随着分子生物学技术的 发展和应用，湖泊微生物多样性逐渐地被人们所认识。众多国内外学者做了单个或多 个湖泊的微生物多样性的研究，极大地推动了湖泊微生物多样性研究的发展。这些成 果对研究微生物在湖泊生态循环中的作用和开发湖泊微生物资源具有导向作用【1 5 1 。 研究者发现湖泊细菌多样性的影响因素很多，如水温、酸碱度( p h ) 、透明度以 及盐度等。w u l l 6 】等报道盐度是影响细菌群落结构多样性的一个重要因素，他们发现 例如不同类型的变形杆菌( p r o t e o b a c t e r i a ) 的相对丰度会随着盐度的变化而发生距剧 烈的演替，而只有少数种类的湖泊细菌能适应大范围的盐度变化。同样w h 等【1 7 1 通过 对太湖内两个典型生境研究发现，浮游植物为主的东湾和大型沉水植物为主的梅梁湾 这两处不同生态环境中浮游细菌群落组成有很大差别，比较统计学分析结果显示沉水 植物优势是影响浮游细菌群落组成的重要因子，是造成太湖生境内浮游细菌群落组成 异质性的主要因素。j i a n g 等【1 8 】研究中国西北的c h a k a 湖，发现高盐度的湖水中鉴定 的克隆大部分都是属于拟杆菌( b a c t e r o i d e t e s ) ，低盐度的湖水底泥中鉴定的克隆大部 分是属于低g + c 革兰氏阳性菌。这说明盐度是影响湖泊细菌群落多样性的另一个重 要因素，即使有少数种类的细菌能够在不同盐度的湖泊环境中找到，但是不同盐度环 境的湖泊其内部的细菌类群会发生很大的变化，而且某一特定细菌类群的丰度在很大 程度上也会受到盐度的影响 细菌的群落结构在碱性湖泊中有其独特的多样性分布。例如l - 6 p e z - g a r c i a 等【1 9 1 研究碱性v a n 湖，结果显示大多数的细菌都属于低g + c 革兰氏阳性菌厚壁菌门 ( f i r m i c u t e s ) ，且它的多样性最为丰富，其他类型包括a 、肛、7 - 变形杆菌，噬纤维 菌屈挠杆菌拟杆菌( c y t o p h a g a - f l e x i b a c t e r - b a c t e r o i d e s ) ，蓝细菌( c y a n o b a c t e r i a ) ， 放线菌( a c 疗n o b a c e h a ) 。其中洳、p 、7 - p r o t e o b a c t e r i a 的序列与已经鉴定的能降解 有机化合物的细菌同源性很高，而高g + c 革兰氏阳性菌a c t i n o b a c e r i a 的序列与能够 降解烃类物质的嗜碱性菌动性球菌属( p l a n o c o c c u s ) 和芽孢杆菌属( b a d l l u s ) 的 同源性非常高。m a t 2 0 】等研究了中国内蒙古的碱性b a e r 湖，发现革兰氏阳性菌在文库 中所占的比例相对其他类群比较小，克隆中大部分都属于革兰氏阴性菌，其中洳、p 、 3 湖光岩玛珥湖可培养菌群多样性初步研究 t 和8 - p r o t e o b a c t e r i a 所占的比重分别为2 4 、3 1 、3 3 和2 。这显示出不同的碱 性湖泊，细菌群落的微生物多样性也各有不同；而且在碱性湖泊中，存在着大量的能 够降解有机化合物的细菌，他们的存在可能同湖泊环境的化学平衡息息相关。 湖泊的深度同样也会对细菌的微生物多样性产生影响。在不同的深度，湖泊细菌 的微生物多样性的分布也不相同。h u m a y o u n 2 1 】等研究了不同深度的湖泊微生物多样 性。他们发现文库中的细菌类型大多都属于q p r o t e o b a c t e r i a ( 占6 ) 、y - p r o t e o b a c t e r i a ( 占l o ) 、c f b ( 占1 9 ) 、高g 卜c 革兰氏阳性菌a c t i n o b a c e r i a ( 占2 5 ) 、低g + c 革兰氏阳性菌b a c i l l u s 和梭菌属( c l o s t r i d i u m ) ( 占1 9 ) ，还有一部分属于b 、 8 - p r o t e o b a c t e r i a 和疣微茵目( v e r r u c o m i c r o b i a l e s ) 。研究结果说明了下层水样( 缺氧 环境) 微生物多样性更为丰富。w e v e r 等【2 2 】得到了相似的结论。由此可以看出，湖泊 细菌微生物的多样性随着湖泊深度的变化会发生显示的变化，一般说来，下层水样的 细菌微生物多样性更为丰富，这可能是由于湖底的特定环境( 如缺氧、低温等) 所造 成的。 湖泊细菌类群微生物多样性因不同的营养类型也不尽相同。t a m a l 【i 【2 3 】等发现富营 养湖泊中主要细菌是p r o t e o b a c t e r i a ( 4 7 ) ，且在p r o t e o b a c t e r i a 中，5 、p 和 7 - p r o t e o b a c t e r i a 分别占2 3 2 、1 2 5 和9 8 ；硝化螺旋菌门( n i t r o s p i r a ) 则占全部 克隆的1 3 4 。文库中其他已经鉴定的克隆属于酸杆菌门( a c i d o b a c t e r i a ) 、绿弯菌门 ( c h l o r o f l e x i ) 、拟杆菌门( b a c t e r o i d e t e s ) 和绿菌门( c h l o r o b i ) 等等。另外，季节的 变化会很大程度上影响湖泊微生物的多样性，通过对富营养湖泊m e n d o t a 、腐殖质湖 泊c r y s t a lb o g 和贫营养湖泊c r y s t a l 进行了研究【2 4 1 。研究者发现随着季节的变化，三 个湖泊细菌群落的微生物多样性也会发生变化。在春秋两季，湖泊细菌的群落组成相 对比较稳定，但是在夏季却会发生较大的变化，变化特点就是细菌微生物多样性的减 少。 杭州西湖是我国著名的风景旅游湖泊，也是一个典型的富营养化水体，沼泽化倾 向十分严重。吴根福等【2 5 】研究报道的疏浚过程中西湖水体和底泥中可培养的异养细菌 的生态分布及其多样性的变化，发现该水域内优势菌为假单胞菌属( p s e u d o m o n a s s p ) 、肠杆菌科( e n t e r o b a c t e r i a c e a e ) 和气单胞菌属( a e r o m o n a ss p ) ，且优势菌的 优势度高。水体中的细菌有9 5 为革兰氏阴性杆菌，占据绝对优势，革兰氏阳性菌很 s 少，且限于芽孢杆菌属；产色素菌的比例相对较高，以产黄色素菌落为主；而表层 沉积物中黄色素的菌落较少，芽孢杆菌的比例则相对较高。就季节变化来看，杭州西 湖水域异样细菌分布有其特殊性。般说来湖泊中的细菌数量在温度较高的夏季较 多，但可能因西湖面积较小、湖水较浅，夏季藻类生长十分旺盛，原生动物生物量较 高而导致细菌可利用的n 、p 等物质的含量下降使得西湖水域的异氧细菌数量夏季反 而比冬季要少。另外，吴根福等【2 6 】通过培养方法对西湖和杭州大运河内富营养养殖区 细菌群落分布进行研究。发现即使西湖和杭州大运河整体营养状态指标评估值所差无 4 广东海洋大学硕士学位论文 几，但诸如蛋白水解菌( p h b ) 、粪大肠菌群( f c ) 、氮利用菌、磷酸盐矿化菌和纤 维素分解菌( c d b ) 等之类的可培养细菌的丰度却十分不同，西湖的丰度比杭州大运 河的丰度要小的多。相关性分析表明不同细菌的生理组丰度主要受浮游植物和浮游动 物生物量的影响，而不受培养基利用情况的影响。从西湖分离得到的1 5 个分离物构 成的6 个系统发育系，为丫- p r o t e o b a c t e r i a ( 5 ) 、肛p r o t e o b a c t e r i a ( 3 ) 、a - p r o t e o b a c t e r i a ( 2 ) ，a c t i n o b a c t e r i a ( 1 ) 、f i r m i c u t e s ( 4 ) 和b a c t e r o i d e t e s ( 1 ) ；而杭州大运河的2 2 个分 离物只构成了4 个系统发育系，分别为丫- p r o t e o b a c t e r i a ( 8 2 ) 、a - p r o t e o b a c t e r i a ( 9 ) 、 f r m c u t e s ( 4 5 ) 和b a c t e r o i d e t e s ( 4 5 ) ，以上看出西湖内细菌多样性要比杭州大 运河内的丰富。 g o r d o n 等【2 刀研究了终年冰雪覆盖的南极湖泊内微生物情况，得到1 9 8 个克隆子 的文库，该文库内除了占优势的蓝细菌( c y a n o b a c t e r i a ) 、变形杆菌( p r o t e o b a c t e r i a ) 和浮霉状菌护肠n c t o m y c e t a l e ) 外，还包括酸杆菌( a c i d o b a c t e r i u m h o l o p h a g a ) ，放线 菌( a c t i n o b a c t e r i a ) 等。另外，利用6 个寡核糖核酸探针分析，得出在蓝细菌占优势 的冰湖里存在着细菌种群多样性，而且冰湖微生物种群里的主要类别在冰湖边界的陆 地区域也同样被发现。他们推测占优势的有机体并不是唯一地适应冰湖生态系统的细 菌类群，而是那些源于该地区其他区域，经由湖底底泥携带随机转移到冰湖这一不寻 常生境的种类。 p e m t h a l e r 等【2 s 报道了澳大利亚一贫营养型高山湖泊内浮游细菌和古细菌随季节 变化的情况。观测夏季和冰雪覆盖的冬季所采集的样品内群落组成的变化和生物量的 波动。 - p r o t e o b a c t e r i a 是浮游细菌的优势类别，占年平均总量的2 4 ，春季 a - p r o t e o b a c t e r i a 也占有同样的优势地位，平均为1 1 。虽然噬纤维菌一变形杆菌优势 地位不明显，但全年的大部分时间，却是纤维状形态类型的主要部分至于古细菌， 他们研究得出线状古细菌在秋季时数量形成高峰，杆状古菌则在冬季冰雪形成期数量 达到高峰。 为揭示放线菌类的全球湖泊分布及系统发育情况，g 1 6 c k n e r 2 9 1 等研究了来自澳大 利亚的g o s s e n k o l l e s e 湖、德国的f u c h s k u h l e 湖以及俄罗斯的b a i k a l 湖。从三个湖泊 内获得1 9 0 条细菌1 6 sr r n a 基因序列，将其与现有r r n a 基因数据进行系统发育比 较，得到1 6 个系统发育支。其中6 支属于变形杆菌的口亚纲，4 支属于肛亚纲，1 支属于1 亚纲：4 支属于噬纤维菌一黄杆菌( c f ) 类群，以及1 支属于放线菌纲。通 过放线菌特异性探针对放线菌分支杂交显示g o s s e n k o l l e s e 湖中放线菌的丰度可达到 1 7 x1 0 5 个m l ，另外两个湖泊中则有很强的季节波动性和高丰度。结合系统发育分 析和f i s h 杂交结果，证实了淡水生态系统中的放线菌类群在全球有广泛的分布、较 大的丰度以及较高的生物量。 迄今为止，对世界上火山口湖泊中微生物群落结构研究最为深入的是美国俄勒冈 地区海拔1 8 8 2 m 的火山口湖c r a t e rl a k e 3 0 】。u r b a c h 等研究了c r a t e r 湖内特殊浮游细 5 湖光岩玛珥湖可培养菌群多样性初步研究 菌群落结构发现该火山口湖的浮游细菌分布特征不同于一般有氧湖泊。在上部的透光 层水体中，优势类群是疣微菌纲疣微菌目( v e r r u c o m i c r o b i a l e s ) 的一个新亚类 c l l 2 0 - 1 0 和放线菌纲放线菌目( a c t i n o m y c e t e s ) a c k 4 亚类。前者在其他湖泊中很罕 见，后者在其他湖泊中通常是一劣势类群。3 0 0 - - 5 0 0 米的深水区的类群由两个不同 的不可培养的分类组成，c l 5 0 0 1 1 一绿色无硫菌的一新支和海洋泉古菌 ( c r e n a r c h a r o t a ) 组i ，而在普通湖泊或淡水环境内据优势地位的f l - p r o t e o b a c t e r i a 在c r a t e r 湖却相对很少，约占克隆子数的6 3 。探针分析证实该湖体垂直结构的一 些细菌组群和外海系统所观察的的细菌类型相似。运用r r n a 法比较c r a t e r 湖和其他 湖泊，他们认为低浓度的痕量元素和有机物质，热液渗透的化学作用以及高水平的紫 外光照射等选择性因子是c r a t e r 湖浮游细菌种群和其他湖泊的不同原因。u r b a e h 等【3 u 还发现了其他一些不占优势地位的全新类群，如待定门a b y l 中的一个亚类和待定门 0 9 1 0 亚类c l o - i 。这两个待定门都是目前完全未被认知的细菌新门类。这些极为独特 的微生物类群组成特征和该火山口湖特有的环境特征密切相关。 综上所述，湖泊细菌多样性是非常丰富的，而且随着湖泊生境类型的不同，他们 的群落组成也各不相同。它们的变化虽然没有统一的规律，但是通过对已报道文献的 对比总结，还是能够粗略的了解到不同环境下湖泊细菌类群的分布【i5 1 。 1 3 水域微生物研究方法 早期的水域微生物多样性研究建立在传统的微生物培养技术的基础上。然而由于 培养条件与自然条件的差异，实际上培养所得到的只是自然环境中的少部分菌种 ( o 0 0 1 1 5 ) 【3 2 羽】，而且往往加入了浓度远高于自然状况的营养物质，其结果是 在新的选择压力下群落结构通常会发生变化，适应富营养条件的菌种成为优势种，取 代了自然条件下的优势种【3 5 】。2 0 世纪8 0 年代末至9 0 年代以来，分子生物学技术开 始被广泛应用于微生物群落结构分析，且发展非常迅速，研究的焦点集中在具有保守 序列的1 6 sr d n a 上。与传统的培养方法相比显示出了一定的优越性，推动了微生物 多样性研究的快速发展。 当前应用于水域微生物多样性研究的主要的分子生物学研究方法如下： 1 3 1 分子杂交法 包括膜杂交和原位杂交方法等。其原理是：人工合成能与某类群微生物特征基因 序列互补的寡聚d n a 或r n a 探针，并以荧光或放射性标记该探针，然后利用探针 与微生物基因杂交，通过荧光显微镜技术或放射自显影技术对微生物的群落结构进行 研究。此法特点是不需要对目标基因进行p c r 扩增，因此可以避免p c r 过程中产生 的误差；但同样因未对目标基因进行扩增，目标基因浓度较低，有时会给检测带来困 难；且有时目标类群的目标基因序列并非完全同一，而是有亚类群之间的差异，结果 所设计的探针d n a 序列与某些亚类群的目标基因互补性较差，从而导致该类群的估计 6 广东海洋大学硕士学位论文 过低【蚓；而更重要的不足之处是，只能用来检测事先估计到其存在、已知其目标基因 序列、并为之设计好引物的类群。 1 3 2 克隆基因文库分析法 提取微生物的基因组d n a 并以p c r 法扩增保守序列，然后建立基因文库，最后通 过分析基因文库获得关于微生物群落多样性的信息。基因文库分析的具体方法有以下 几种：一、以菌落杂交法( c o l o n y h y b r i d i z a t i o n ) 利用具有类群特异性的d n a 探针对文库 进行快速扫描【3 7 】，通过观测每一种基因型的拷贝数，可以估计各类群微生物的丰度， 应用此方法的前提是己知群落中各类群的特征基因序列，并针对特征序列合成探针， 但实际上预测各类群的特征序列比较困难；二、r f l p 分析：对各个克隆进行r f l p 指纹图谱分析，此方法较d n a 测序法节省时间，但本身不能确定各菌种的分类地位。 三、d n a 测序：能够提供关于各个克隆分类地位的可靠的信息，但需要很长的试验周 期、大量的试验材料，实际工作中对所有的克隆进行测序难以实现，通常需要与r f l p 法或t - r f l p 法结合，或者只随机选取部分克隆进行测序；而且根据克隆的拷贝数估 计种群丰度将导入随机误差。 1 3 3 基因指纹图谱技术 1 3 3 1 单链构象多态性法( s s c p ) 单链构象多态性分析是将p c r 扩增的双链d n a 经解链变成单链d n a 后，在不含变 性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，d n a 单链的迁移率除与d n a 链的长短有关外， 更主要的是取决于由d n a 单链自身折叠所形成的构象。这种构象由d n a 单链碱基顺序 决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用( 主要是氢键) 类维持。相同长度的 d n a 单链因其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，因而电泳迁移率不 同。当靶d n a 中发生碱基置换或碱基插入、缺失等改变时，由于迁移率变化会出现波 动变化，从而提示该片段存在有基因突型3 引。m y r a n 掣3 9 】首先将p c r s s c p 技术用 于多种细菌的快速诊断。他们从细菌的1 6 sr r n a 基因区中选择2 对引物：p 1 l p p 1 3 p 和e r l 0 - e r l l ，用该法共检测了1 5 属4 0 种1 1 l 株细菌，除了志贺菌属各种菌株带型 相同外，对其他细菌可检测到属和种的水平，并建立了梭状芽胞杆菌、李斯特菌、假 单胞菌以及肠杆菌等菌属的种特异性电泳图谱。 1 3 3 2 变性温度梯度凝交电泳法( d g g e t g g e ) 1 9 9 3 年m u y z e r i 删首先采用变性梯度凝胶电泳法分析1 6 sr r n a 基因，其原理是 通过在电泳凝胶中建立由低到高的变性条件梯度，使变性条件不同的d n a 依次变性， 产生电泳迁移速率的差异，从而将其分离开来，由于d g g e 法不依赖限制性酶切， 从而能够保证目标d n a 的完整性，分离所得的目标d n a 片段经纯化后可直接用来测序， 是该法的优点。 但是到目前为止，对没有进行荧光或同位素标记的d n a 的染色技术灵敏性相对 较低，造成d g g e 法的灵敏度较低；与可以使用内标法的t - r f l p 法相比，d g g e 法 7， 湖光岩玛珥湖可培养菌群多样性初步研究 的另一个缺陷是没有合适的分子量标准物，使得不同次电泳的样品之间难以进行比 较。 1 3 3 3 限制性酶切片段长度多态性法( r f l p ) r f l p 技术是由b o t s t c i n 等首次提出的一种最早的分子遗传标记技术。其基本原理 是限制性内切酶能识别不同生物的d n a 分子中特定的核普酸序列，并将基因组中的 d n a 分子降解成许多长短不一的酶切片段。对于特定的d n a 限制性内切酶组合，其所 产生的片段是特定的，所以它能作为某一d n a 的特有“指纹 ，即片段差异的多态性。 r f l p 可由许多基因突变类型引起，如一个或多个碱基的替换、插入或缺失等都可导 致某种识别位点的丧失或形成一个新识别位点，从而减少或增加片段数目并改变片段 长度，引起位点多态和长度多态性；串联重复单位数目不同也可以引起片段长度多态 性的变化。r f l p 标记具有许多优点，诸如r f l p 标记源于基因组d n a 自身的变异，如 突变、易位和倒位等，其标记数量较大；无表现型效应，检测不受环境条件和发育阶 段的影响；呈简单的共显性遗传，也不受杂交组合的影响：实验结果重复性好等。 已知细菌的1 6 sr r n a 基因序列高度保守，通过利用能识别特定d n a 序列的限 制性核酸内切酶酶切p c r 扩增得到的1 6 sr r n a 基因，因不同种群d n a 序列酶切位 点有差异，可得到长度与数量不同的d n a 片段【4 1 】，通常用高分辨率的聚丙烯酞胺凝 胶电泳来分离，用银离子染色剂染色而得到特异的电泳图谱称基因的酶切指纹图谱。 此法能够反映多个酶切位点所包含的d n a 序列信息，因此在进行微生物群落物种多 样性比较时能提供较丰富的信息，适用于较复杂的群落之间的比较。 1 3 3 4 限制性酶切末端片段长度多态性法( t - r f l p ) 其原理与r f l p 法相似