（化学工程专业论文）细胞色素c氧化酶的表达、纯化及其活性测定.pdf

e x i ，p u r i t i c a t i o na n d。gt h ea c t i v i t yo fcytochromexpresslon u r l t l c a t i o na n dm e a s u r l nt h ea c t l v l t y0 1 ： y t o c t l r o m e ，g o x i d a s ecf r o ma f e r r o o x i d a n s b y q i nf a n g b e ( j i s h o un o r m a lu n i v e r s i t y ) 2 0 0 5 at h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fs c i e n c e l n c h e m i c a le n g i n e e r i n g i nt h e g r a d u a t es c h o o l o f h u n a nu n i v e r s i t y p r o f e s s o rh ey a n s e n i o re n g i n e e rs h e nj i a n f e n g a s s o c i a t ep r o f e s s o rz e n gj i a j u n e ，2 0 1 1 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：鳓 日期：刎年6 月，日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口 ( 请在以上相应方框内打“4 ) 作者签名： 导师签名： 舜易 1 日期： 锣： w i1 年 渺1 年 6 月弓日 占月弓日 ， 细胞色素c 氧化酶的纯化、表达及其活性测定 摘要 细胞色素c 氧化酶( 常用名为c o ，c c o ，c o x 或者复合体i v ) 是含血红素 铜终端氧化酶大家族的成员之一。它是所有原核和一些真核生物电子传递链上的 终端金属膜蛋白酶，它不但起着催化0 2 还原为h 2 0 的4 电子反应，而且承担着 质子跨过线粒体内膜的功能。参与氧化还原反应：0 2 ( g a s ) + 4 c y t c 2 + ( a q ) + 4 h 3 0 + ( a q ) 一4 c y t c ( a q ) + 6 h 2 0 ( a q ) ，产能2 2 0k j m o l ( p h = 7 ) 。每个0 2 分子消耗8 个内膜 质子，其中4 个质子用于生成水，另外4 个质子泵出膜外。该酶是一个复合的膜 蛋白，通常以二聚体的形式出现，包括多个亚基及不同的金属活性中心。真核生 物线粒体的细胞色素c 氧化酶一般含有1 1 1 3 个亚基，而原核生物含有的亚基数 量相对较少，一般含有四个亚基。亚基i 和亚基i i 是各种呼吸链终端酶的高度保 守的结构，也是功能酶的核心结构。该结构参与催化0 2 的还原和质子泵的作用。 亚基i i 上含有能从还原性细胞色素c 获得电子、水溶性的双核铜蛋白中心即c u a 中心，亚基l 上含有一个低自旋的亚铁血红素a 即h e m ea 、高自旋的亚铁血红素 a 3 即h e m ea 3 和铜金属催化中心即c u b 中心，后两者组成一个双核金属活性中心。 细胞色素c 氧化酶电子传递途径：细胞色素c _ 血红素a _ c u a 中心一血红素 a 3 - c u b 中心一0 2 。它在电子传递的同时耦合质子的传递，并且产生维持正常生命 活动所需的a t p 。 ac i d i t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s 阻f e r r o o x i d a n s ) 是化能自养型细菌，通过氧化亚 铁离子变成铁离子并把电子最终受体0 2 还原成水，从而获取能量。它的细胞色素 c 氧化酶属于a a 3 型酶。该酶的核心结构由线粒体基因编码并定位合成并具有酶催 化活性，依次分别为：亚基i ( c o x a ) 、亚基i i ( c o x b ) 和亚基i i i ( c o x c ) ，其余的由 核基因编码，前两个是该酶的核心亚基。亚基i 是细胞色素c 氧化酶最大的一个 亚基，是一种完整的疏水膜蛋白并带有十二个跨膜螺旋( i x i i ) 结构，含有其中三 个氧化还原反应中心：辅基c u b 、h e m ea 和h e m ea 3 。亚基i i 含有c u a 中心。由 此可见，该细胞色素c 氧化酶也含有四个氧化还原中心，c o x a 在电子和质子的 传递过程中起着重要的作用。 本论文通过聚合酶链从a f e r r o o x i d a n s 中克隆出c o x a 基因，用琼脂糖凝胶电 泳检测和分离目的片段。在原核质粒抽提、纯化、检测合格后，将目的片段和质 粒分别酶切、用琼脂糖凝胶分离、用各自专用试剂盒纯化。在连接酶的作用下， 将质粒和目的片段连接，获得重组质粒，然后在e s c h e r i c h i ac o l i ( e c o l i ) 成功表达 并用一步n i ”亲和层析法纯化出带有组氨酸标签的蛋白。通过紫外可见扫描测定 该蛋白具有两个特征峰；通过紫外可见扫描测定该蛋白与还原态维生素c 的反应 i i 硕上学位论文 中还原态维生素c 峰形变化，证明了c o x a 具有催化还原还原态维生素c 的作用； 建立了分子结构模拟图，对该酶的空间结构有了更直观的了解，同时也有利于我 们分析该酶的活性中心。 关键词：细胞色素c 氧化酶；亚基i ；电子传递；质子传递；活性；分子模拟结构 i i i 细胞色素c 氧化酶的纯化、表达及其活件测定 a b s t r a c t c y t o c h r o m eco x i d a s e ( c o m m o na b b r e v i a t i o n s ：c o ，c c o ，c o xo rc o m p l e xi v ) b e l o n g st ot h ef a m i l yo fh e m e c o p p e re n z y m e s i ti st h et e r m i n a le n z y m eo fe l e c t r o n t r a n s p o r tc h a i n si ne u k a r y o t e sa n ds o m ep r o k a r y o t e sa n da sa l li t sm e m b e r sc o x ，n o t o n l yc a t a l y z e st h ef o u r e l e c t r o nr e d u c t i o no fd i o x y g e nt ow a t e r ，b u ta l s oa c t sa sa p r o t o np u m pt r a n s l o c a t i n gp r o t o n sv e c t o r i a l l y a c r o s st h ei n n e rm i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e i nt h i sr e d o xr e a c t i o n ：0 2 ( g a s ) + 4 c y t c 2 + ( a q ) + 4 h 3 0 + ( a q ) - - 4 c y t c 3 + ( a q ) + 6 h 2 0 ( a q ) ，t h ee n e r g yi sp r o d u c t e da b o u t2 2 0k j m o l ( a tp h 7 ) f o re a c h0 2m o l e c u l e ， e i g h tp r o t o n sa r et a k e nu pf r o mt h ei n s i d e ，a n df o u ro ft h e s ep r o t o n sa r ep u m p e dt ot h e o u t s i d ea c r o s st h em e m b r a n e c y t o c h r o m eco x i d a s ei sam u l t i s u b u n i t ，w h i c ha c t sa sa d i m e r ，b i g e n o m i c a l l ye n c o d e di n n e rm i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep r o t e i n e u k a r y o t i c c o xi sac o m p l e xe n z y m e ，w h i c hc o n s i s t so f11 - 13s u b u n i t s d e p e n d i n go nt h e o r g a n i s m p r o k a r y o t i ch o m o l o g u e su s u a l l yh a v eal e s sc o m p l e xo r g a n i z a t i o n ，f o u r s u b u n i t sa su s u a l h o w e v e r ，s u b u n i tia n ds u b u n i ti io fv a r i o u st e r m i n a lo x i d a s e s s h o wah i g hd e g r e eo fs e q u e n c ec o n s e r v a t i o n ，o n l yb o t ha r ee s s e n t i a lf o rt h ef u n c t i o n o ft h ee n z y m e t h i sf u n c t i o n a lc o r ec a t a l y z e sb o t ho x y g e nr e d u c t i o na n dp r o t o n p u m p i n g s u b u n i ti io fc y t o c h r o m eco x i d a s e sc o n t a i n st h ew a t e r - s o l u a b l eb i n u c l e a r c u - c uc e n t e r ：c u ac e n t e r ，w h i c hi st h ep r i m a r ya c c e p t o ro fe l e c t r o n sf r o mr e d u c e d c y t o c h r o m ec s u b u n i tic o n t a i n so n el o w s p i nh e m eac h e i n ea ”) a n dab i n u c l e a r m e t a lc e n t e rf o r m e d b y a h i g h - s p i n h e i n e a ( h e m ea 3 ”) a n d c u b t h e e l e c t r o n t r a n s f e rp a t h w a ys t a r t sa tc u a ，w h i c hr e c e i v e sa ne l e c t r o nf r o mac y t o c h r o m e co nt h eo u t s i d eo ft h em e m b r a n e ，f r o mc u at h ee l e c t r o ng o e st oh e m eaa n dt h e no n t ot h eb i n u c l e a rc e n t e r i nt h ec a t a l y t i cr e d o xa c t i o n ，t h ee l e c t r o n - t r a n s f e ri sc o u p l e d t op r o t o n t r a n s f e r ，a n dt h ee n e g e y ，w h i c hi sc o n s e r v e db ya t p , i sr e q u i r e dt or e m a i n n o m a ll i r ea c t i v i t i e s ac i d i t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s 翻f e r r o o x i d a n s ) i sac h e m o l i t h o t r o p h i cb a c t e r i u m w h i c ho b t a i n se n e r g yt h r o u g ho x i d a t i o no ff e r r o u si o nt of e r r i ci o nw i t hm o l e c u l a r o x y g e na st h et e r m i n a le l e c t r o na c c e p t o rr e d u c e dt oh 2 0 t h ec y t o c h r o m eco x i d a s e f r o ma f e r r o o x i d a n sa t c c 2 3 27 0i sa a 3 t y p ee n z y m e t h ec o r eo ft h ee n z y m ei s f o r m e db yt h r e es u b u n i t s ：c o x a 、c o x ba n dc o x c ，w h i c ha r ee n c o d e d b y m i t o c h o n d r i a l ( m t ) d n a ，t h eo t h e rs u b u n i ta r ee n c o d e db yt h en u c l e a rg e n o m e t h e h i g h l yc o n s e r v e dc o x ai s t h eb i g g e s ta n dm o s th y d r o p h o b i cp r o t e i no ft h ec o r e i v ? u b u n i 馏i t s p 姐st h e 洒n e rm i t o c h o n d r i a lm e m b r a n e ( i m m ) w i t h12t r a n s m e m b r a n e 舱? & n 盱心m 眦r e d o x c e n t e r si nt h ee n z y m eo f c o x a ：h e m ea 3 , c u ba n d h e m e a c o x bc o n t a i n sc u a c e n t e r a sm e n t i o n e da b o v e ，w ec a n c o n c l u e dt h a tc c 0h a sf o u r r e d o x a c t l v e c e n t e ra n dc o x ap l a y s a i m p o r t a n ti ne l e c t r o n t r a n s l a t i o na n d p r o t o n c o u p l e d e l e c t r o nt r a n s f e r 1n ec o x ag e n eo ft h e c y t o c h r o m eco x i d a s ef r o m 彳以，加d x f 妇疗s w a sc l o n e d t h r o u g h p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o na m p l i f i c a t i o n t h ed n a f r a g m e n t sw a sd e t e c t e d a n ds e p a r a t e d b ya g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i s a f i e rt h ee x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o na n d 。擘耻o f t h ep r o k a r y o t i cp l a s m i dv e c t o r ，t h ed n a f r a g m e n t sa n dt h ev e c t o rw e r e d i g e s t e d b yr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e ， s e p a r a t e db yg e le l e c t r o p h o r e s i sa g a r o s ea n d 兰：1 1 1 ：砒e d b ys p e c i a lk 5 t s ，r e s p e c t i v e l y w eg o tr e s t r u c t i o np l a s m i db y c o n n e c t i n gt h e d n a f r a g m e n t sw i t ht h ev e c t o ru n d e rt h ec o n d i t i o no f t 4 d n a i g a s e ，t h e ns u c c e s s f u l l v e x p r e s s e d1 ne s c h e r i c h i 口c o l i ( e c o l i ) ，f i n a l l yp u r i f i e dt h e h i s t a g g e dc o x ab yn i c k e l m e t a l 。a f f i n l t yr e s i nc 0 1 u m nc h r o m a t o g r a p h yt oh o m o g e n e i t y u v - v i s s c a n n i n gf o rt h e c o x a s h o w e d h a t h e r ew e r et w om a jo ra b s o r p t i o np e a k sa n d t h er e a c t i o no fc o x a w l t j 】c y t o c h r o m ect e s t e dt h a tc o x a p l a y sai m p o r t a n tc a t a l y t i cr 0 1 ei nt h er e d u c t i o no f r e 鼍u c e d c ”o c h r o m e c t h r o u g hm o le c u l a rs t r u c t u r e m o d e l i n go fc y t o c h r o m ec ：) n ，骶n b em o r ei n t u i t i v ei nu n d e r s t a n d i n go f i t ss p a t i a ls t r u c t u r e ，m e a n w h i l e 1 tc a n b eu s e f u lt oa n a l y s i st h es t r u c t u r eo f t h ec a t a l y t i ca c t iv ec e n t e r k e y w 。r d s ： c y t o c h r o m ec。x i d a s e ( c c o ) ；c o x a ； e l e c t f 。n t r a n s l a t i 。n ；p r 。t 。n t r a n s l a t i o n ；a c t i v i t y ；m o l e c u l a rs t r u c t u r em o d e l i n g v 细胞色素c 氧化酶的纯化、表达及其活件测定 目录 湖南大学学位论文原创性声明和学位论文版权使用授权书i 摘要i i a b s t r a c t 1 1 、， 插图索引i x 附表索引- 一x 第1 章绪论一1 1 1c o x a 的组成一2 1 1 1h e m ea ：1 1 1 2h e m ea 3 3 1 1 3c u b 中心4 1 2 细胞色素氧化酶的电子传递机理4 1 2 1 细胞色素氧化酶的催化循环5 1 2 2c o x a 在参与的电子传递中的作用7 1 2 3c o x a 参与的质子传递8 1 3 课题的研究目的和研究内容一9 1 3 1 依据和目的9 1 3 2 论文的主要研究内容10 1 3 3 论文课题受资助情况1 1 第2 章实验材料和实验方法1 2 2 1 实验材料1 2 2 1 1 菌种12 2 1 2 培养基12 2 1 3 么厂基因组抽提试剂13 2 1 4 质粒提取试剂1 3 2 1 5 琼脂糖凝胶电泳1 3 2 1 6 蛋白样品纯化试剂1 3 2 1 7 不连续体系s d s p a g e 电泳1 4 2 1 8s d s p a g e 胶保存试剂1 5 2 1 9 蛋白样品活性测定试剂1 5 2 2 实验仪器1 6 2 3 实验方法1 6 v i 硕上学位论文 2 3 1p c r 扩增1 6 2 3 2 酶切p c r 产物及载体p l m l 1 7 2 3 3 琼脂糖凝胶电泳1 8 2 3 4 载体和目的片段连接反应1 8 2 3 5c a c l 2 法制备感受态1 8 2 3 6 重组质粒的转化19 2 3 7 阳性克隆的筛选1 9 2 3 8 蛋白质表达转化2 0 2 3 9 蛋白质的条件表达2 0 2 3 1 0 蛋白质的纯化2 0 2 - 3 1 1s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 一2 1 2 3 1 2 蛋白样品的活性测定2 3 2 4 测试分析方法2 3 2 4 1 琼脂糖凝胶电泳2 3 2 4 2s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 2 4 2 4 3 紫外可见分光光度计( u vs c a n i n g ) 一2 4 2 4 4 分子结构模型图的模拟( m o l e c u l a rs t r u c t u r em o d e l i n g ) 一2 4 第3 章c o x a 的基因克隆、表达、纯化及活性测定2 6 3 1c o x a 基因的克隆一2 6 3 1 1c o x a 基因的克隆一2 6 3 1 2 连接反应及阳性克隆的筛选2 7 3 2c o x a 蛋白的表达2 8 3 2 1s d s p a g e 分析c o x a 蛋白2 8 3 2 2u v v i s 分析c o x a 蛋白2 9 3 3 本章小结3 0 第4 章c o x a 蛋白的活性测定及分子建模一3 1 4 1u v v l s 分析c o x a 蛋白的活性31 4 1 1 细胞色素c 氧化还原吸收光谱3 1 4 1 2c o x a 活性的测定31 4 2 分子模拟c o x a 蛋白3 3 4 2 1c o x a 蛋白序列的同源比对3 3 4 2 2c c o 蛋白分子模型图3 5 4 3 本章小结3 6 结论3 7 参考文献3 8 v i i 细胞色素c 氧化酶的纯化、表达及其活性测定 致j 射4 6 附录a攻读学位期间所发表的学术论文4 7 v i i i 硕士学位论文 插图索引 图1 1 细胞色素氧化酶的结构1 图1 2a f e r r o o x i d a n s 菌中细胞色素c 氧化酶的拓扑学结构2 图1 3( a ) 血红素a 平面图( b ) 血红素a 立体轴向结构图3 图1 4 细胞色素氧化酶催化机制简图5 图1 5 细胞色素氧化酶催化循环详细图( h p + 代表跨膜的运动的质子) 6 图3 1c o x a 蛋白的p c r 产物电泳图2 7 图3 2 克隆子单酶切电泳图2 7 图3 3c o x a 连接产物双酶切电泳图2 8 图3 4c o x a 蛋白s d s p a g e 电泳图一2 8 图3 5 彳厂中c o x a 蛋白的u v - v i s 图一2 9 图4 1 细胞色素c 完全氧化态和还原态吸收光谱3 1 图4 2c o x a 蛋白酶活性测定一3 2 图4 3 不同来源的c o x a 蛋白的同源比对3 5 图4 4c o x 蛋白分子核心区域模拟图3 5 i x 细胞色素c 氧化酶的纯化、表达及其活性测定 附表索引 表2 1 实验仪器与设备1 6 表2 2p c r 反应体系1 7 表2 3 凝胶的配方及用量2 1 表2 4 每次测样加入量2 3 x 硕七学位论文 第1 章绪论 细胞色素c 氧化酶是是含血红素铜终端氧化酶大家族的成员之一，同时也是 电子传递链上的终端金属膜酶。它通常以二聚体的形式存在，这也是其保持结构 稳定和功能完整的最基本的单位【2 引。它承担着从细胞色素c 接收电子传给最终受 体0 2 ，催化0 2 还原为h 2 0 ，并与质子泵功能相偶联。催化反应式如下【2 , 3 , 3 2 】： 0 2 ( g a s ) + 4 c y t c p ( a q ) + 4 h 3 0 + ( a q ) _ 4 c y t c ”( a q ) + 6 h 2 0 ( a q ) ，2 2 0k j m o l ( p h = 7 ) 。催 化净反应式：0 2 + 8 h i n + + 4 e 。一2 h 2 0 + 4 h o u t + ，从中可以看出每还原一个氧分子， 需要消耗膜内8 个质子氢，其中4 个用于还原氧气，另外4 个被迁移至膜外【2 】。 c c o 的三维结构已经被确定【4 ，同时对c c o 的突变型和与辅酶q 氧化酶周围相 关的位置的研究，加深了氧还原是偶联机制的了解，分析了c c o 中相关亚基的功 能，并确定了它们的分子作用，提出了v l h 产生的两个可能机制：一是氧分子还 原需要的质子来自于线粒体的基质，已检测到其内膜表面在能化时存在着被束缚 的高能质子；二是质子在c c o 作用下能够通过线粒体的膜迁移( 泵入质子) 1 0 】。 c c o 利用氧分子还原生成水的过程获取自由能，由于通过膜内外两侧的质子浓度 有差异，因而产生了质子电化学电位梯度( v l h ) 。它利用从亚铁细胞色素c 传递过 来的电子催化氧气分子的还原，并且产生了因质子浓度差异引起的电化学电位梯 度( v l h ) ；同时，它还能把氧化还原反应过程中释放的能量通过氧化磷酸化以含有 高能磷酸键的a t p 的形式储存。由此可见，它在能量产生中起着主要作用。 露 曩 图1 1 细胞色素氧化酶的结构 f i g u r e1 1 t h es t r u c t u r eo fc y t o c h r o m efo x i d a s e 通过x 射线测定哺乳类动物4 1 、细菌类5 】和副菌类【6 1 细胞色素氧化酶，发现 细胞色素c 氧化酶的纯化、表达及其活性测定 它们都有四个氧化还原活性中心( 如图1 1 ) 。在电子传递过程中起控制作用的是 亚基i i 上的双核金属c u a 中心和亚基i 上的低自旋亚铁血红素a ；而亚基i 上能 形成c u b 双核中心的c u b 和高自旋的亚铁血红素a 3 ，同时也是0 2 的键合位点。 它们都是由线粒体基因编码并定位合成的。 细胞色素c 氧化酶是多亚基膜蛋白，真核生物线粒体的细胞色素c 氧化酶一 般含有1 3 个亚基 7 , 8 , 4 5 】，而细菌一般则含有4 个亚基【9 1 。从彳f e ，r o o x i d a n s a t c c 2 3 2 7 0 菌中克隆出的c c o 含有4 个亚基，其中c o x a 是其最大亚基，也是由 线粒体基因编码并定位合成的，占有三个氧化还原催化活性中心：h e m ea 、h e m e a 3 和c u b 。可见研究c o x a 在电子和质子传递中的作用机理对弄清楚细胞色素c 氧化酶的作用机理起着重要的作用。 1 1c o x a 的组成 以a f e r r o o x i d a n sa t c c 2 3 2 7 0 为模板中克隆出的c o x a 是细胞色素c 氧化酶最 大的保守亚基，拥有两个血红素基团( h e m ea 和h e n m ea 3 ) 和一个铜中心( c u b ) 、 两个高度疏水区域和一个1 2 个跨膜螺旋核心区( 如图1 2 ) 。这些螺旋以近似三 重轴对称方式排列在膜中，膜外部分很少。两个血红素一起形成还原催化部位的 双核中心。两个血红素位于酶蛋白内部，距离胞质侧表面约1 5a ，两个血红素平 面都垂直于膜表面且各自的2 个丙酸根基团都伸向胞质侧。 ， ； l i i嚣￥疆疆 磊j 、，“。i ? 。j 。_ 一。， 图1 2a f e r r o o x i d a n s 菌中细胞色素c 氧化酶的拓扑学结构 f i g u r e1 2 m e m b r a n et o p o l o g yo f t h ec y t o c h r o m eco x i d a s ef r o ma f e r r o o x i d a n s 1 1 1h e i n ea 所有血红素蛋白都含有一个血红素作为它的辅基。血红素是由一个二价铁离 子镶嵌在一个原卟啉环而构成的称为铁卟啉的化合物。按照血红辅基的结构不同， 2 附 瓣 ；。和一。呛心攥鬻嚣下。 ；：慈蓬号 。士霉辛是，、，擎霹繁下 ；：商霸量。一 f六霹萋， l；。，司矧删训戳剐矧剖掣。 l -|舡誉茹謦扣。； 霹蕴 硕士学位论文 由辅基血红素a ( 如图1 3 ) 组成的细胞色素称为细胞色素a ，它是一个具有卟啉 分子结构的小分子，在卟啉分子中心，由卟啉中四个吡咯环上的氮原子与一个亚 铁离子配位结合，其中有两个n 上分别含有一个质子，除此之外，这个铁离子还 可以与两个相同或者不同的配体配位。当它作为电子传递反应的载体和氧气载体 时，就是通过铁离子化合价的改变来实现。 在h e m ea 中的f e 原子含有六个价键低自旋，以+ 2 或者+ 3 氧化态的形式存 在【1 , 4 2 】。细胞色素a 中f e 无论出于f e ( i i ) 或则f e ( i i i ) 状态，两个轴向位置都为h i s 组氨酸的氮所占据( 如图1 3 ( b ) ) ，是低自旋血红素，不能与氧相互作用，但是能 介导电子传递给双核中心【1 0 , 3 3 j 。其氧化还原作用表现为f e 离子价态在+ 2 与+ 3 价 之间变化。其作用是每次接收c u a 传递的单个电子1 3 3 1 ，并把它传给c u b h e m ea 3 双核金属活性中心。在电子从c u a 传递至h e m ea 这个过程并不耦合质子的传递， 后一过程耦合质子的传递【2 l 6 7 j ，因此c u a 部分是快速电子反应过程，而后者有质 子的参与缓减了反应速率，成为催化反应的控速步骤。h e m ea 在d 环上的丙酸盐 在电子从c u a - - - h e m ea 的过程中起着重要的作用【6 7 1 。有报道9 , 2 0 1 澳, 0 出c u a 距离 h e i n ea 近，而相对远离h e m ea 3 。这也可能是c u a 传递电子给h e m ea 的一个原 因。 血红厩a 一绸胞也赢辅勰 图1 3 ( a ) 血红素a 平面图 。7 ”- ”+ 一“”“”j 。j 1 j错x? 0 n 鬃旅。二巍， y n l n ( b ) 血红素a 立体轴向结构图 f i g u r e1 3 ( a ) t h ep l a n es t r u c t u r eo fh e m e ；( b ) t h ea x i a ls t r u c t u r eo fh e m e 1 1 2h e m ea 3 与h e m ea 相比，在h e m ea 3 中f e 原子以+ 3 价形式存在时，它含有六个价键 高自旋；以+ 2 价形式存在时，它含有五个价键高自旋 1 , 1 2 , , 3 3 , 3 6 - 3 8 】。f e 中心轴向 的一个位点与被h i s 组氨酸中的氮原子所占据，另外一个位点是空着的( 如图 1 3 ( b ) ) ，用于键合其它分子如0 2 【8 4 】或者h 2 0 2 1 4 9 1 。其作用是接受来自h e i n ea 的电 子，并把它传递到0 2 的结合位点c u b 中心，并参与了质子迁移。它的h i s 组氨 酸末端丙酸盐末梢有两个由氢键结合的重要残基：a r 9 4 3 8 和a s p 3 6 4 ，它们在质 子传递过程中起着重要的作用1 3 4 1 。h e m ea 和h e m ea 3 中的羟乙基法尼基和乙烯基 3 细胞色素c 氧化酶的纯化、表达及其活性测定 官能团都朝向基质一侧，而其丙酸盐则朝向外膜一侧延伸【1 1 , 4 3 】。所不同的是h e m e a 中法尼基官能团被在亚基i 上的一个螺旋束紧紧包裹，而h e m ea 3 中羟乙基法尼 基基团成u 型，在亚基i 和亚基i i 之间摆动 2 0 , 4 3 j 。根据w i k s t r 6 m 和他的同伴报 道，认为h e m ea 的丙酸盐在质子传递的k 通道中起着中重要作用。 1 1 3c u b 中心 c u b 中心其n 端连接与三个高度保守的、由碱性咪唑基和极性a 氨基酸组成 的组氨酸配体配位。所有高自旋的血红素a 3 与有三个配位体配位连接的c u 离子 中心很近，约5a 左右【6 】。c u b 中心能与h e i n ea 3 通过静电作用形成双核金属氧化 还原反应中心即c u b h e m ea 3 中心，这个中心能够键合0 2 分子，并能够获取电子 传递给0 2 还原形成水【1 1 , 2 1 】。与c u 离子中心结合的一个组氨酸末端和与芳香羟基 官能团上的碳正交的酪氨酸残基共价结合 1 1 , 2 1j ，这种组合在酶的催化活动中起着 重要的作用。酪氨酸残基，当双核中心氧化时质子化；在形成水分子链的过程中， 通过k 通道提供给c u b 中心一个质子，形成p m 去质子化的状态，并参与耦合质 子传递【1 2 ，1 8 ，1 9 ，2 1 1 。这种h i s t y r 组合在催化过程中，一方面为0 2 双键的断裂提供 第四个电子，而自身被氧化成自由基；另一方面通过k 通道提供质子给c u b 中 心，以形成水分子 4 , 6 , 4 3 , 8 2 1 。由此可见，这种组合是反应中心的重要组成成分，具 有平衡双核中心的电荷，调节氧还原和质子消耗的功能，在催化反应电子和质子的 传递过程中过程中起着的重要。 w o o d r u f fa n dc o w o r k e r s 采用时间分辨光谱法，通过追踪c o 在h e m ea 3 和c u b 之间的传递，并伴随着光解离h e m ea 3 c o ，确定了c u b 是0 2 进入亚铁血红素 铜氧化酶的活性位点【4 0 , 4 1 1 ；同时，这个中间体也参与了质子泵的作用。由此可以 看出，这个双核中心中间体在电子和质子的传递过程中起着相当重要的作用 1 5 ，3 2 - 3 4 1 。 1 2 细胞色素氧化酶的电子传递机理 在整个催化循环中，带正电的p 端的可溶性亚铁细胞色素c ( c y t c ) 给出电子 首先传给c u a 引，然后c u a 将电子传给h e m ea ，h e m ea 再将电子传递给双核中 心即h e m ea 3 - c u b ( 如图1 1 ) 。细胞色素c 氧化酶的完全氧