（粒子物理与原子核物理专业论文）低能n与uv对活性污泥菌群结构的影响.pdf

郑州大学硕士毕业论文 低能n + 与u 、，对活性污泥菌群结构的影响 郑重声明 本人的学位论文是在导师指导下独立撰写并完成的，学位论文没有剽窃、抄 袭等违反学术道德、学术规范的侵权行为，否则，本人愿意承担由此产生的一切 法律责任和法律后果，特此郑重声明。 学位论文作者( 签名) ：缸昕 第2 页共5 l 页 伸妊ff 月7 日 郑州大学硕士毕业论文低能n + 与u v 对活性污淀菌群结构的骺响 、r7 8 2 6 7 2 摘要 活性污泥法是目前应用最广泛的一种污水生物处理技术，活性污泥中的微生 物菌群是污水处理厂污水处理效率最主要的决定因素。因此，活性污泥菌群在国 际上一直是环境科学、生态学和环境工程等领域的研究热点。国内对活性污泥中 菌群结构的研究起步较晚，目前跟国外相比还有一定的差距。 本论文对比了研磨和小玻璃珠震荡两种方法的菌胶团破碎效果，结果表明研 磨法释放的微生物数量较小玻璃珠震荡法多1 7 2 倍，并且所制备的菌悬液中杂 质含量少，适宜流式细胞仪的检测。 通过流式细胞术检测，发现活性污泥中a 、b 和y 变形杆菌 ( p r o t e o b a c t e r i a ) 相对含量分别为1 5 0 9 、2 0 5 0 和1 2 0 0 ，与国外许多报道 略有差异，这很可能是由于水质不同，栖息的微生物种类和数量存在差别的原因。 经距活性污泥2 0 c m 处1 5 w 的紫外灯辐照3 m i n 后，活性污泥微生物类群中 变化最大的是b 变形杆菌，致死率达9 0 多；变化最小的是y 变形杆菌，存活 率变为8 1 8 9 ；a 变形杆菌类群变为原来的2 0 7 5 ；假单胞菌属( p s e u d o m o n a s s s p ) 和丛毛单胞菌属( c o m a m o n a ss p p ) 存活率分别为4 0 3 1 和4 1 1 6 ；这表明活 性污泥中各类群对紫外线的敏感程度差别较大。 能量3 0 k e v ，剂量l 10 ”i o n s c m 2 的n + 注入活性污泥菌胶团后，丛毛单 胞菌属的细菌几乎完全死亡，n 变形杆菌的含量也接近于0 。当剂量增大至1 1 0 1 6 i o n s c m 2 时，除了丛毛单胞菌属外，假单胞菌属和n 变形杆菌也均未检测到， 并且b 变形杆菌也几乎完全死亡。 本试验在国内首次将f c m 应用于低能离子束和u v 诱变活性污泥菌群的研 究，分析诱变对活性污泥中菌群结构的影响，以期能为低能离子和u v 诱变菌群 诱变剂量的确定等问题的解决提供理论依据。 关键词：活性污泥荧光原位杂交流式细胞术紫外线低能离子束 第3 页共5 l 页 郑州大学硕士毕业论文 低能盯与u v 对活性污泥菌群结构的影响 a b s t r a c t a c t i v a t e d s l u d g ep r o c e s s i st h em o s tp o p u l a rt e c h n o l o g yi nw a s t e w a t e r b i o t r e a t m e n ta tp r e s e n t ，a n dm i c r o b i a lc o m m u n i t yi na c t i v a t e ds l u d g ei st h ec r i t i c a l f a c t o ra f f e c t i n gt h ee f f i c i e n c yo ft h ep r o c e s si nm o s tw a s t e w a t e rt r e a t m e n tp l a n t s t h e r e f o r e ，t h es t u d yo fm i c r o b i a lc o m m u n i t yi na c t i v a t e ds l u d g eh a sa l w a y sb e e n b e i n gt h eh o ts p o to fe n v i r o n m e n ts c i e n c e ，e c o l o g y e n v f f o n m e n t a le n g i n e e r i n g ，a n d s oo na b r o a d t h er e s e a r c ho nm i c r o o r g a n i s mc o m m u n i t ya th o m e ，h o w e v e r , i sj u s ta t t h eb e g i n n i n gs t a g e ，f a rb e h i n dt h a ta b r o a d b yc o m p a r i n gt h ed i s p e r s i o ne f f i c i e n c yo fa c t i v a t e ds l u d g ef l o cb yg r i n d i n gi n t h em o r t a ra n ds h a k i n gw i t hl i t t l eg l a s sb e a d s ，w ef i n dt h a tt h eg r i n d i n gm e t h o d r e l e a s e s1 7 2t i m e sm o r em i c r o o r g a n i s m st h a nt h es h a k i n gd o e s ，a n dt h es u s p e n s i o n b yt h ef o r m e ri ss u i t a b l et ot h ef l o wc y t o m e t r y ( f c m ) d u e t oi t sl e s si m p u r i t y t h es a m p l eo f s u s p e n s i o na s s a y e db yf c m s h o w st h a tt h ea ，a n dys u b c l a s s o fp r o t e o b a c t e r i ah o l dar e l a t i v e p e r c e n t a g eo f1 5 0 9 、2 0 5 0 a n d1 2 0 0 r e s p e c t i v e l y w h i c hh a v es o m ed i f f e r e n c ew i t ht h er e p o r t sa b r o a d 。i ti sp o s s i b l et h a t t h e r ei sad i s t i n c t i o no fg e r ms p e c i e sa n da m o u n t si nd i f f e r e n tw a t e ri n h a b i t s a f t e r u l t r a v i o l e t ( u v ) l i g h t ( 1 5 w ，2 0 c m ) i r r a d i a t e s o n t h ea c t i v a t e ds l u d g e f o r 3 m i n u t e s ，t h es e c t i o n so fm i c r o o r g a n i s m sa r ea s s a y e db yf c ma n dr e v e a lt h a tt h e v i a b l er a t e so f * ，b - a n dy - p r o t e o b a c t e r i a ，p s e u d o m o n a s s s p ， c o m a m o n a s s p pd e c r e a s et o9 1 0 ，1 0 ，8 1 8 9 ，4 0 。3 1 a n d4 1 ，1 6 r e s p e c t i v e l y i t s p r o v e dt h a tu vh a sm u c hi n f l u e n c eo nt h es t r u c t u r eo fc o m m u n i t i e si na c t i v a t e d s l u d g e 。 t h ei m p l a n t a t i o no f n + ( 3 0 k e v ) i n t h ef l o c sh a sam o r en o t a b l ee f f e c to nt h e s t r u c t u r et h a nt h eu v ：u n d e rt h ed o s eo fl 1 0 珏i o n s c m 2 ，c o m a m o n a ss p ph a v e e x t i n c t e da n dn p r o t e o b a e t e r i aa r er a r e l yf o u n d ；w h e nt h ed o s ei n c r e a s e st o1 1 0 t t i o n s c m 2 ，b e s i d e sc o m a m o n a ss p p ，p s e u d o m o n a ss s p a n dq p r o t e o b a c t e r i a h a v ep e r i 幽e dc o m p l e t e l y i t st h ef a s tt i m ea th o m et oa p p l yf c mt oa n a l y z et h ec h a n g e so f m i c r o o r g a n i s m 第4 页共5 1 菱 郑州大学硕士毕业论文 低能n + 与u v 对活性污泥菌群结构的影响 c o m m u n i t i e sm u t a g e n i z e db yl o w - e n e r g yi o nb e a ma n du v ，s oa st og i v eu sau s e f u l r e f e r e n c ef o rd e t e r m i n i n gt h es u i t a b l ed o s a g eo ro t h e rp r o b l e m sw h e nw ee n g a g ei n m i c r o b i a lc o m m u n i t yb r e e d i n gb yu va n dl o we n e r g yb e a m k e yw o r d s ：a c t i v a t e ds l u d g e f l u o r e s c e i ni ns i t uh y b r i d i z a t i o n f l o wc y t o m e t r y u l t r a v i o l e tl i g h t l o w - e n e r g yi o nb e a m 第5 页共5 l 页 郑州大学硕士毕业论文 低能n 十与u v 对活性污泥菌群结构的影响 引言 活性污泥法是目前应用最广泛的一种污水生物处理技术，其基本原理是利 用活性污泥中的微生物菌群降解污水中的各种有机污染物，因此，活性污泥中的 微生物菌群是污水处理厂污水处理效率最主要的决定因素。但由于菌胶团中微生 物种类的复杂性菌胶团中有细菌、放线菌、真菌、原生动物和后生动物等至 少数百种微生物，目前有关活性污泥中微生物菌群的诱变筛选工作还较少。鉴于 以上原因，本实验室同郑州市污水处理厂合作开展了活性污泥中微生物菌群的诱 变选育工作。而诱变方式和诱变剂量的确定等问题的解决首先要了解诱变源对污 泥菌群结构影响。 流式细胞术( f l o wc y t o m e l a y ，f c m ) 是上世纪七十年代发展起来的一项对细 胞或其它微小生物颗粒快速定量分析的新兴技术，它能同时对样品的多种物理和 生物学参数进行定量检测，并可以实现对特定细胞群体进行快速的分选。在环境 微生物的检测中，f c m 常与f i s h 相结合进行原位检测微生物生态的结构和功能 以及用于微生物种类的鉴定。这在国外是一个研究热点，但在国内目前还尚未见 有相关报道。 本试验在将f c m 应用于低黥离子柬和u v 诱变活性污泥菌群的研究，分析 诱变对活性污泥申菡群结构的影响，以期能为低能离子和u v 诱变菌群诱发剂量 憋确定等闲题的勰决提供理论依掇。 活性污泥颗敉中的微生物多以束缚态的形式存在，年用f c m 研究活性污泥 蘩皴交孛貔畿生物生态绩掏，毖缀将这些窳缚态懿微生锈释敷凄采。零实验慰魄 了研磨和小玻璃珠震荡两种方法，结果表明研磨法处理重憋5 次的活性污泥样品 繇释放瓣徽生耪鬃较多，院来经怒理酶群菇增掬1 2 i 1 8 倍，荠鼓簿潮备鹣藤器 液中杂质含量少，适宜流式细胞仪的检测。 制备的菌悬液样品通过荧光原位杂交( f i s h ) 和流式缅胞术( f c m ) 相结 合的方法避行检测，结果是示：旺、8 釉y 变形杆菌( p r o t e o b a c t e r i a ) 相对含 量分别为：1 5 0 9 、2 0 5 0 和1 2 0 0 ，岛国外许多报道略有差异，可能是由于 水凄不霹，援惠靛皴生物葶孛类翻数量也鸯差别豹缀困。 经躐活性污溅2 0 c m 处1 5 w 的紫外灯辐照3 m i n 后，活性污溅微生物类群中 第9 页共5 l 瑟 郑州犬学硕士毕业论文 低能盯与u v 对活性污泥赣群结构的影响 变化最大的是b 变形杆菌，致死率达9 0 多；变化最小的怒y 变形杆菌，存活 率变为8 1 8 9 ；a “变形秆蓊类群变为原来的2 0 7 5 ；假单胞菌属( p s e u d o m o n a s s s p 3 和丛毛单胞菌属( c o m a m o n a ss p p ) 存活率分别为4 0 ，3 l 翱4 1 1 6 。这表明活 性游泥中各类群对紫外线的敏感程度差别较大。 低能妒注入鞠紫步 线辐照对援性污泥醛落结搀也毫缀大瓣影峨。使用戆量 为3 0 k e v ，剂量为l 1 0 i o n s c m 2 的n + 注入活性污泥菌胶团后发现，丛毛单胞 蓥满( c o m a m o n a ss p p , ) 基3 缀蘩足手宠全嚣亡，a 交影耪蕊( p r o t e o b a c t e r i a ) 熬含 量也接近于0 ；当荆屋进一步增大至l 1 0 1 6 i o n s e r a 2 时，除了丛毛单胞菌属外， 籁攀旎菌满( p s e u d o m o n a ss s p ) 释n 。变形耪藏氇臻来裣灞到，并且一交形释蔼奄 几乎完全死亡。 由上述结果可翔；不同类群对低能注入和紫外线的敏感程魔不同。这就 为我l f 】进行活性污混萤群终构诱变提供一魑启示剥用微生物对诱变剂的敏 感度不同进行有选择的筛选诱变。较u v 辎照，低能离子束在这方黼更有希攫实 现突酸，这是由于爨瞧离予滚具毒戆量黄遴、震量滋辍季曩惫凌交换兰秘联会终廷 为体的生物学效应，因而可产生较辐射诱变更高的突变频率和较宽的诱变图 谱。 第l o 页共5 l 页 郑燃大学硬主毕烂蹙文 低能n + 与u v 瓣选性污落藏嚣缝构的影响 l 、文献综述 1 1 活性污溯法 1 1 1 基本工艺流程 活性污泥法自1 9 1 4 年由英国的阿登( e a r d e m ) 和洛基特( w t l o c k e r ) 创始以来，迄今已有9 0 余年的历史。随着实际运行经验的积累和科学技术的发 展，活性污泥法亦不断改进和发展，至今它已成为城市污水和些工业废水处理 特别是大规模污水处理的主体。活性污泥法的基本流程如图1 1 所示，系统主要 由初沉池、曝气池、二沉池、曝气系统以及污泥回流系统组成。流程中，活性污 泥为主体，通过回流和初沉池出水一起进入曝气池，亘相混和接触，废水中可生 物降解的有机物质被微生物所利用，在利用过程中，进水b o d 5 得以降低，而活 性污泥量增加。从曝气池流出的混合液( 活性污泥和废水的混合体) ，进入二沉池 予以固、液分离，分离后上层水排出系统，底层污泥部分回流到曝气池，大部分 则排出，进行进一步消化处理( 这部分污泥称剩余污泥，来自微生物的增殖) 【1 , 2 】。 痹 图1 1 活性污泥工艺基本流程图 f i 9 1 1 p r i n c i p a lf l o wc h a r to f a c t i v a t e ds l u d g et e c h n o l o g y 1 1 2 活性污泥的性质与组成 活性污泥在活性污泥法系统中是进行有机污染物质转化的主体。由于它不是 一般的污泥，而是栖息着具有生命活力的微生物群体的絮绒状污泥，故人们称之 为活性污泥。当废水与它接触，微生物细胞壁外的粘液层就能将废水中的有机污 染物质予以吸附，并在生物酶的作用下，进行代谢、转化。在这生化反应过程中， 微生物自身得到良好的生长、繁殖，同时废水亦得到了无害化处理。良好的活性 污泥具有很强的分解有机物的能力和良好的沉降性能，絮凝体的大小约为o 0 2 0 2 m m ，多为黄褐色，微具土壤味，密度约为1 0 0 5 9 c m 2 ，含水率9 9 左右。活 性污泥由有机物及无机物两部分组成，组成比例因污泥性质的不同而异。例如， 第1 l 页共5 l 页 郑州大学硕士毕业论文 低能n + 与u v 对活性污泥菌群结构的影响 城市污水处理系统中的活性污泥，其有机成分占7 5 8 5 ，无机成分仅占1 5 2 5 。活性污泥中有机成分主要由生长在活性污泥中的微生物组成p j 。 活性污泥中栖息着的微生物，以好氧性微生物为主，是一个以细菌为主的群 体。其中，除细菌外，还有真菌，如酵母菌、霉菌，以及原生动物、后生动物等。 原生动物以细菌为食物，后生动物以细菌和原生动物为食物。它们之间构成了一 个相对稳定的生态系统和食物链。 细菌是活性污泥的组成和净化功能中心，是活性污泥有机相的最主要成分。 活性污泥上的细菌以好氧、异养型细菌为主，其中主要的类群有动胶菌属 ( z o o g l o e a ) 、假单胞菌属( 胁e 砌坍d h 甜s p p ) 、芽孢杆菌属( 肋c f f ，淞s p p ) 、小球菌 属( m i c r o c o c c u ss p p ) 、黄杆菌属( f l a v o b a c t e r i u ms p p ) 、产碱杆菌属口j c 口，瑶y 聆时 s p p ) 、无色杆菌属( a c h r o m o b a c t e rs p p ) 、产气杆菌属( a e r o b a c t e rs p p ) 、棒状 杆菌属( c o r y n e b a c t e r i u ms p p ) 、八叠球 禹( s a r c i n as p p ) 、螺菌属( s p i r i l l u ms p p ) 、 诺卡氏菌属( n o c a r d i as p p ) 等【4 j 。 活性污泥中的许多细菌具有凝聚、绒粒化的性能。如动胶菌t | i i 、埃希氏大肠 秆菡氍c o l i ) 、产碱秆菌耩、暇擎脆萤藩、芽擒脊麓属、黄秆菌满等都其肖絮凝 能力。因此，在活性污泥中，细菌通常以菌胶团形式存在，只有少数以游离状态 存在。所谓菌胶豳，就是由细菌以及细菌分泌的胶质组成的绒粒，它是一个相当 复杂豹微生物群落【5 一。 与活性污泥处理系统有关的真菌是徽小的腐嫩或寄生的丝状蒲，这种真菌具 蠢分鼹碳农弦会物、l 塞蕊、蛋自囊及其毽含氮纯会物熬凌戆。逶爨丝状蘩瓣存在 ( 但不是大量存在) 有利于菌胶团的形成，丝状菌的异常增殖会导致活性污泥膨 骧现象。 在活性污泥处理系统中，有大量的原生动物和微型届生动物，他们以游离的 细菌和宥梳微粒作为食物，因诧w 以起至提高出永水质静作用。融于原生动物及 聪生动物是细菌豹主要撼食者，它们的数量会随卷污水处理的运行条件及处理水 质的变化而变化，所以，可以通过显微镜观察活健污泥中的原生动物及后生动物 熬秘类采翔叛处理东矮熬好坯。灏 逝，一般将原、嚣生动物豫为滔牲污涎系统中 的指示蚀生物。 纂1 2 页菸5 l 页 郑州大学硕士毕业论文 低能扩与u v 对活性污泥菌群结构的影响 1 2 活性污泥中微生物菌群的研究方法及进展 活性污泥菌群的研究一直是环境科学、生态学和环境工程等领域的研究重 点。因为它的研究不仅可以探知蕴藏于其中的无法估量的种质资源，监控曝气池 的运行状态，而且还可以为提高活性污泥的生物降解能力提供理论基础。 人类对活性污泥菌群的研究是随着对其研究方法的发展而逐步深入的。早 期的研究以显微观察、纯培养等为主，研究也主要集中在形态观察、优势菌鉴定 和生化分析这些层次上。随着现代分子生物学技术和显微技术的发展，目前的研 究手段己发展为以分子生物学技术为主要依托的p c r 技术、荧光原位杂交 ( f i s h ) 和流式细胞术( f c m ) 等，人们已能在分子水平上对活性污泥菌群进 行原位研究。 1 2 1 显微观察法 显微观察是科学家们最早使用的活性污泥菌群结构研究方法。1 9 3 9 年 h e u k e l e k i a n 和l i t t m a n 7 l 在观察活性污泥菌胶团形成过程中发现活性污泥中大部 分细菌呈杆状，长1 5 3 5um ，宽1 2um 。后来d i a s 和b h a t 【8 】通过观察形态特 征将活性污泥菌胶团形成菌动胶菌属与丛毛单胞菌属( c o m a m o n a ss p p ) 的细菌区 分开。荧光显微镜出现后，一些含特殊荧光的微生物如产甲烷微生物含f 4 2 0 辅 助因子，在4 2 0 n m 波长激发下，产生绿色荧光，可通过荧光显微镜来鉴定跚。这 些研究是零碎的、不系统的，但是由于其简单直接，现在仍有许多实验室将这种 方法运用于初步研究。 1 2 2 平板培养分离法 作为微生物研究的经典手段之一，平板培养分离法法在研究活性污泥的优 势菌群过程中起到过十分重要的作用。从中分离鉴定出许多类群，如无色杆菌属、 产气杆菌属、产碱杆菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属( b r e v i b a c t e r i u m ) 、丛毛单胞 菌属、棒状杆菌属、黄杆菌属( f l a v o b a c t e r i u m ) 、微球菌属、假单孢菌属、螺菌 属和动胶菌属等，并初步估算了各类群的含量 s , l o q 2 】。但是，近年来现代分子生 物学研究发现，经典平板分离方法研究自然菌群中微生物多样性有很大的缺陷： 表现为即使用最优良的培养基分离出微生物种类也只占自然微生物种类总数的 l 1 5 1 3 ，1 4 1 ，而某些特定种类的微生物还需要特殊的培养基【t s , t 6 ，而且这种分离 培养方法也不能很好的反映自然菌群微生物多样性的原始状态。 第1 3 页菇5 l 页 郑州大学硕士毕业论文 低能n + 与u v 对活性污泥麓群结构的影响 1 2 3 细胞生化成分分析法 采用玺物标记分予律必签定徽生物静瀚决定圈子，可敬变显徽镜等辩形观 察方法带来的人为误差，同时给定擞研究种搽开辟了新方法。生物标记的魁微生 物生化成分及其胞外产物。定量生物标记时笼需培养，可直按提取( 如p l f a 法) ， 也可原位检测( 如凫疫荧光原位杂交技术 。 1 2 3 ip l f a 谱图分析技术 磷脂脂肪酸( p h o s p h o l i p i df a t t ya c i d ，p l f a ) 谱图分析技术是上世纪七十年代 末、八十年代初w h i t e 和f i n d l a y 1 7 , 1 8 】于创立的。利用该技术不需要纯培养就可以 根据脂肪酸谱图定量分析和描述微生物群澍19 1 。2 0 0 1 年f o m e y 等伫0 1 利用这种方法 研究活性污泥中微生物的组成变化，实验表明活性污泥中微生物群落可以根据支 链p l f a 和多聚不饱和p l f a 的含量判定，并且不同地区或者同一地点不同时间的 微生物群落结构都有变化。他们认为用p l f a 方法鉴定细菌群落，提供的信息不 仅是群落中的相对丰度，也有生理状态的信息。环境压力会导致饱和与不饱和脂 肪酸之间的比例上升，值得注意的是脂质生物标记分析不能检测环境中的每一种 微生物物种，因为许多物种的p l f a 模式部分重叠：这种方法还存在一个缺陷， 就是很难将磷脂脂肪酸模式与微生物的特殊动力学联系起来。 1 2 3 2 免疫荧光原位杂交技术 免疫荧光原位杂交技术是利用荧光素标记的抗体特异性地与细胞表面抗原 决定簇结合进行微生物的生理生化特性的研究方法。该方法无需培养，即可很灵 敏地鉴定微生物【2 ”。但是该方法也存在两个不足之处：抗体的产生需要纯度很 高的抗原诱导，这就大大限制了免疫原位杂交的应用范围；抗体的制备代价昂 贵并且用时较长，原因是抗体一般是在动物体内诱导产生，然后需要经过复杂的 分离提纯等步骤【2 2 1 。所以在微生物生态研究中，与核酸探针荧光原位杂交技术相 比，免疫荧光技术应用范围相对较窄。 1 2 4 以p c r 为主要技术的分子生物学方法 p c r 技术和变性梯度凝胶电泳( d g g e ) 或温度梯度凝胶电泳f r g g e ) 等电泳 技术的结合衍生出许多新的检测微生物群落多样性的分析方法，如 p c r - r f l p l 2 3 1 、p c r s s c p t 2 4 ) 、p c r - d g g e 2 5 1 和p c r - t g g e 【2 6 0 7 】等。它们都可形 成复杂的微生物指纹，通过多态性分析可得出群落特征及群落与群落之间的相似 第1 4 页共5 l 页 郑州大学硕士毕业论文低能n + 与u v 对活性槽泥菌群结构的影响 惶。例如d a b e r t 等皿4 】在研究好氧去磷系统时，运用p c r - s s c p 方法分析了活性 污潺孛各微生物类瓣豹会爨( 如图l 。2 所忝) 。扶躅中可以爱出d n a 占优势靛类 群是：c y t o p h a g a l e s 和昼一p r o t e o b a c t e r i a ，它们分别占分析序列的3 9 和1 7 。 p c r 法在该矮：凌疲溺i 鬻广泛，魏是它粕瞧存在诲多戆不足之楚：每浚d n a 的提取效率不同，从而导数结果爨复性差；原核生物细胞裂解的程度不间，结 聚警致不荔袈解绥耱静事发信计镝低；等l 耪对不潜样品的扩增效率有差弊，敖 会带来群落丰度估计的偏嫠；由于真核，主物的核糖体的编码基因以及调节机制 眈较复杂，对其研究还不够透彻，现今应用在真核微生物群落结构的分析上还魄 较少 2 s 3 ”。 图1 2 活性污泥中器类群的1 6 sr d n a 组成和分布图 f i 9 1 2a 饿l i a t i o na n dd i s t i l b u t i o no f t h ec l o n e d1 6 sr d n ao f t h em o l e c u l a ri n v e n t o r y i na c t i v a t e ds l u d g e 1 2 s 核酸探针荧光原位杂交( f l s h ) 技术 攘钤是蔻与特定核替酸彦列发生特爨牲结合戆已知核酸片段。它可以是长 谍针( 1 0 1 0 0 0 b p ) ，又称艇因探针；也可以是短檫昝酸片段( 1 0 s o b p ) 。可以是由 烈a 复转录或的e d n a 搽铮，氇鼍班是p c 襄产携凌夭工会残熬豢核营黢擦铮。 以核酸探针为基础的荧光原位杂交( f l u o r e s c e n ti ns i mh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 技术是 黼前擎个纲施承平上原位分析徽壅物群藩结构常蠲鹣分子生态学方法。穰獾那些 融公布的、定位我不同分类等级的1 6 sr r n a 或2 3 sr r n a 分子的特征能置，设 计寡核苷敬探针( 通常为化学合成的1 5 2 5 b p 的单链d n a 分子) ，然后靥荧光素 橼记探钞。荧光掭记的掇转可以靼细胞d n a 豹特定区域特异性媳结合，当激发 光照射荧光素上时，即有荧光信母产生。激发光的产生和荧光信芍的接收可以通 第1 5 页薨5 1 页 郑州大学硕士毕韭论文 低能科与u v 对罐蛙污娓蔼嚣结梅的瓣嗨 过特糕的显微镜和流式细胞仪等装置实现。 1 2 5 1 显徽术 屉微术所利用的显微镜类型有；落射荧光显微镜( e p i f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ， e m ) 、激光掴描共聚焦显微镜( 1 a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y ，l s c m ) 、和 双光予激发激光扫撼显镟镜( t w o - p h o t o ne x c i t a t i o nl a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y ， t p e l s m ) 等。对于活性污泥的研究，前两种盟微镜威用较广范 1 3 , 3 2 - 3 4 j ；t p e l s m 由予其玲撂器贵，缓建较乡 3 7 1 。1 9 9 3 年w a g n e r 等t 1 冀零l 攥掰b 3 3 8 、a l 器l b 、b e t 4 2 a 和g a m 4 2 a 镣荧光探针特异性地与活性污泥菌胶团杂交，然飚利用e m 观察计数， 结栗发现稃赫b i 翻b 2 中a 、叠帮v 变形耱藻类群禽董分掰为：1 0 、4 2 和 3 4 ，3 7 、3 7 和7 ；这三个类群的总含摄均超过了活性污泥总细胞的8 0 ， 因 i i ：他们认为活性浮泥中静优势菌群是a 、0 和y ，交形秆蒲。后来w a 即魁等1 田 又刹爆l s c m 扫港煮淡瀵曦缝搂达了这个结聚。2 0 0 5 年l 印貔等d 7 】瑷溪性污滋失 研究对象比较了三种湿微镜备自的优势和劣势。研究发现，照微直接观察技术合 逶冀否主要鞭决于微生耪絮凝颗粒豹类鍪。辩予缨稳密度大靛藩获潮t p 嚣l s m 法最适合；但是对于典型的活性污泥菌胶团来说，e m 和c l s m 法效聚较好。这 些方法虽然赢观，但是当用于定量研究活性污泥中微生物结构时，一般需要入工 计数，因此会为实验结果带采主观性偏差。 l 252 流式细胞术o c c m ) 流式缨艇本( f l o wc y t o m e t r y ，f c m ) 是髓纪七十年代发展起来茨一矮瓣缨 胞或其它微小生物颗粒快速定量分析的新兴技术，它能同时对样品的多种物瑷和 生懿学参数遴李亍定燕捡嚣，辩毒疆实溪黯特定绥蕤群钵进行捩速嚣分选。f c m 盼硬件是流式细胞仪系统，该仪器主疆由液流系统掣洮源、光电检测系统、信号 处理系统及分遥装嚣组成。箕工作淼理如图1 3 所示，生物样品制备成革细魏悬 浮液，经荧光染色处理，在离压氮气驱动下和外层鞘液约束下，高速从流动黛蛉 喷嘴喷出，形成单细胞排列的液柱。由光源发出的激光束聚焦后与液糕垂直相交， 形成测量区。通过测爨区蛇细胞在激光照射下产生散射光和荧必，然慝经光敏元 件接收光信号，并将光信号转变成电信号，激后经计算机处理分析得出被测细胞 多缀参数。褒计算捉控暴l 下逡行缨黩势透露，霉要楚瞧；l ：绘蘩分选豹纲您热上歪 电荷或负电荷，当带电单细胞液流通过高压静电偏转板时，液流发生偏转，然后 第1 6 孤共s l 戮 郑州大学硕士毕业论文 低能矿与u v 对活性污泥菌群结构的影响 收集分离样品，从而完成细胞分选。 在环境微生物的检测中，f c m 常与f i s h 相结合进行原位检测微生物生态的 结构和功能以及用于微生物种类的鉴定。例如1 9 9 5 年w a l l n e r 等利用 f i s h f c m 对活性污泥中的微生物群落结构进行了分析，结果发现活性污泥中变 形杆菌纲a 一，b 和y 亚纲分别占1 7 ，4 1 和7 7 ，不动杆菌属翻c i n e i o b a c t e r s p p ) 占4 7 。后来他们i ”】又对不动杆菌属进行了分选，所分离的微生物纯度超 过了8 0 。然而也有人提出质疑，他们认为对于某些特殊的微生物群体，如低 r r n a 含量但具代谢活性的微生物 2 s l 和高r r n a 残留量但不具代谢活性的微生物 2 9 , 30 1 ，作用不是太大。尽管如此，由于该技术不仅快速、灵敏和准确，而且还具 有客观、直接和可同时进行多参数检测和分析等优点，因此在国外应用仍然很广 泛，但在国内尚未见有同类报道。本试验拟采用f i s h 和f c m 相结合的方法进 行活性污泥微生物群落结构及其变化的研究。 图1 3 流式细胞仪工作原理图 f i 9 1 3p r i n c i p l eo ff l o wc y t o m c t c r 1 3 低能离子和紫外线的诱变特点及其对活性污泥菌群结构的影响 由于活性污泥申菌群的复杂性，目前通过诱变手段研究活性污泥的报道极少 且均集中在对污泥活性影响这个最表面的层次上，而有关诱变剂对活性污泥菌群 第1 7 页共5 l 页 酃州大学硕士毕业论文 低能矿与u v 对活1 生污泥菌群结构的影响 结掏影响的碜 究几乎没蠢。 1 3 1 紫外线的诱交特点及其活性污滋蔼群结构的影响 紫外线( u v ) 诱变作为一种实骏室常用的生物育种技术，已被广泛按骚。 紫外线辐照会引起d n a 链上相邻螓睡形成二聚倦，使褥d n a 双链绩构发袅交 化，最终蹲致碱基阊静援常配对受黻，基西复制翻转录失常，进丽引发生物纲胞 的基因突变或凋亡。 旱在二卡世纪丸十年代，紫强线诱变已经威予活性污淀憾炊戆改良上。拣 箍等辫】掰究发现紫外绫辐照4 0 s 詹，活性污泥静c o d 降解速率提高了5 3 ，诱 变率约为2 2 3 x1 0 。4 。李伟民等【4 3 】利用同样的方法，把活性污泥的c o d 去除率 提离2 0 - - 2 8 。然藤，德们斡研究仍傍露盔性炊魄改变上，筠没有涤入到微釜 物群落交化豹层次；u v 辐照后，活憔污挠群落结构变纯的报道嗣前尚束查副。 1 3 2 低能离子的诱变特点及其对活性污泥菌群结构的影响 自二十世纪八十年代中期，低能离子生物学研究在我国兴起以来，离子注 入生物学在基础应用研究上取得了很大的发展，并取得了可观的社会效益和经济 效益【“, 4 5 1 。低能离子注入生物体后，可产生能量传递、质量沉积和电荷交换三种 联合作用为一体的生物学效应，从而产生较高的突变频率和较宽的诱变图谱；因 而其作用过程和作用内容比其它电离辐射更复杂、更广泛【4 日。因此在农作物和微 生物诱变育种方面应用越来越广泛。 低能离子注入技术首先应用于农作物的诱变育种，这项技术在水稻、蔬菜、 小麦、玉米、大豆、烟草、茶树、甘薯和谷子的品种改良等方面也取得了可喜的 成果，十多个新品种在山东、安徽两省通过鉴定嘲。 在微生物上的应用起步虽然较晚，但是诱变效果显著，成绩斐然。中国科 学院等离子体物理研究所先后对利复霉素、花生四烯酸、v e 、柠檬酸生产菌种 进行改良。经诱变筛选，利复霉素发酵水平提高4 0 ，2 0 吨罐化学效价达6 3 0 0 单位【47 1 ；花生四烯酸生产菌是经离子束辐照，发酵水平提高较多的另一品种，其 产酸量最终提高至细胞干重的4 5 t 4 8 1 ，在5 0 吨发酵生产花生四烯酸占总脂的5 0 以上，是美国专利水平的2 5 倍。本实验室王雁萍等【4 9 】用氮离子注入对嗜碱芽 孢杆菌进行诱变育种，获得了产生1 3 环糊精葡萄糖基转移酶是出发菌株2 倍以 上的高产菌株，酶活力可达6 0 0 0 u m l 以上。谈重芳等 5 0 l 利用低能氮离子诱变假 第1 8 页菸5 l 页 郑州大学硕士毕业论文 低能n + 与u v 对活性污泥菌群结构的影响 丝酵母t 2 p ( c a n d i d a s o r b o x y l o s a t 抻) ，提离了立体逡择性表解蠢潦芬乙蘸戆黢力。 但燕，目前尚未豫有低麓离子注入活性污游方面的报道。本试验报将低能 离子注入活性污泥中，并分析污泥中微生物群落绺构的变化，以期能为拓宽离子 生甥学的磅究领域作出鸯薤粒探索。 1 4 立题依据及意义 活性污泥法是目前应用最为普遍的污水处理技术，其基本原理是利用活性 污泥中鲍微生物藏群黪艇污隶中靛各荦申寿枫污染物，困梵，活魏污泥孛的微嫩秘 菌群是污水处理厂污水簸理效率最童震的决定性戳索。但由于藏胶团中微生物种 类的复杂性菌胶团中有细菌、放线菌、真菌、原生动物和尉生动物等至少数 匿静徽生物，基兹有关溪娃污混孛微黛甥墓饕鹃诱变筇选工俘逑较少。鉴予以上 原因，本实验室同郑娴市污水处理厂食作开展了活徽污泥中微生物菌群的诱嶷选 育工作。而诱变方式和诱交剂量的确宠等问题的解决首先要了解诱变源对污溅菌 群结梅影响。 f c m 是近年来发戚起来的一项新型细胞检测和分选技术，它能同时对样品 的多种物理和生物学参数进行定量檎测，并可以实现对特定细胞群体进行快速的 努选，是嚣煎整赛上礤究蔫嚣弦挎鼗淹侠捷、有效熬方法。国终爨上整纪丸卡年 代起就有大量使用f c m 研究活性污淀菌群的研究报道，而国内尚未见有这方面 的报道。 本磺究在霉内首次将f c m 应用予低裁枣子翔w 诱变活瞧浮渥蓝群懿黟 究， 分析诱交对活性污泥中蔺群结构的影响，以期能为低能离子和t w 诱变菌群诱变 剂量的确定等问题的解决提供理论依据。 第1 9 蕊荚5 l 茭 郑州大学硕士毕业论文 低能n + 与u v 对活性污泥菌群结构的影响 2 、材料和方法 2 1 实验材料和试剂 活性污泥悬浊液：取自郑州市污水处理厂二系列曝气池中部。活性污泥的运行参 数如表2 1 所示。 表2 1 二系列曝气池中活性污泥的运行参数 t a b l e2 1t h eo p e r a t i n gp a r a m e t e r so fa c t i v a t e ds l u d g e i nt 1 1 em i d d l eo f a e r a t i o ns t a g e2 浓度( m g l ) 沉降比污泥指数 p h 颜色气味 m l s sm l v s s s v 3 0s v l ( m e l ) 1 5 0 0 1 0 5 0 5 0 1 8 07 2 7 4 黄褐色土腥味 + 郑州市污水处理厂化验室提供( f r o ma n a l y s i sl a bo f z h e n g z h o uw a s t e w a t e rt r e a t m e n tp l a n o 无菌污水：取自郑州市污水处理厂二系列二沉池。1 2 1 高压湿热灭菌3 0 r a i n 。 寡核苷酸探针：由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；5 端由6 - c a r b o x y f l u o r e s c e i np h o s p h o r a m i d i t e 修饰，探针类型和序列如表2 1 3 所示。另外，竞争 性探针u b e t 和u g a m 分别是5 端未经修饰的b e t 和g a m 探针。 h o e c h s t 3 3 3 4 2 ：购于s i g m a 公司； c a l i b r i t e t m 3 ：b db i o s c i e n e e su s a ： a l i g n f l o w t mf l o wc y t o m e t r ya l i g e n m e n tb e a d s ；e u g e n e ，o r e g o n ，u s a ； 其它试剂均为化学纯。 2 2 便器 a i r t e c h 超净工作台 苏净集团安泰公司 磁力搅摔器 上海志威电器有限公司 u n i v e r s a l 3 2 rh e t t i c hz e n t r i f u g e n 低温离，0 捉 德国 f a c s v a n t a g es ef l o wc y t o m e t e r b d 美国 b 2s e r i e ss y s t e m 糙| e 廷0 s c o p e s m o t i e 德国 f 2 一a 分子杂交仪 太仓市科教器材厂 藏球诗数板 上海带求精擞亿试翻仪器有黻公司 a x i o v e r t2 0 0 0 mf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ：c a r lz e i s ss h a n g h a ic o 1 t d t i t a n 离子注入装置俄罗斯科学院谣伯利亚分院强电研究所制造俄罗新 第2 0 页共s l 页 郑州大学硕士毕业论文低能n + 与u v 对活性污泥菌群结构的影响 2 3 实验方法 2 3 1 实验条件的探索 2 311 活性污泥微生物悬液的制备 2 3 1 1 1 活性污泥中游离微生物的去除 取活性污泥悬浊液，静置3 0 m i n ，小心将上清液吸出，加入等体积的p b s ( p h 7 2 ) 溶液，摇匀，重复上述操作5 次。利用显微镜直接计数法分别测定吸 出上清液中微生物的浓度。 2 3 1 1 2 样品的固定和保存 4 的多聚甲醛溶液和洗涤后的活性污泥以3 ：l 混合，在4 条件下固定1 6 h 。 然后用p b s ( p h 7 2 ) 洗涤三次。最后用含5 0 乙醇的p b s ( p h 7 2 ) 重悬，在一2 0 条件下可保存两周。 2 3 113 样品的机械破碎