（麻醉学专业论文）激功大鼠触液核5htia受体对神经病理性疼痛的影响.pdf

文 c b h r p c c i c s f c n d m s o d r n p a g p w t f i t c p w l p b s r 、，m s dr a t s s p f t p i t c 5 h t l a h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e c 1 1 r o m cc o n s t r i c t i o ni n j u r y c e r e b r o s p i n a lf l u i d - c o n t a c t i n gn e u r o n s d i m e t h y ls u l f o x i d e n u c l e u sr a p h e sd o r s a l i s p e r i a q u e d u c t a l 黟a y p a ww i t h d r a w a lt h r e s h o l d f u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e p a w w i t h d r a w a ll a t e n c y p h o s p h a t eb u f f e r e ds o l u t i o n r o s t r a lv e n t r o m e d i a lm e d u l l a s p r a g u e - d a w l e yr a t s s p e c e f i cp a t h o g e nf r e e 中文全称 中脑导水管 辣根过氧化物酶 慢性坐骨神经损伤 接触脑脊液神经元 二甲亚砜 中缝背核 中脑导水管周围灰质 缩足阈值 异硫氰酸荧光素 缩足潜伏期 磷酸盐缓冲溶液 延髓头端腹内侧核群 s d 大鼠 无特定病原体 t e t r a e t h y lr h o d a m i n ei s o t h i o c y a n a t e四乙基若丹明异硫氰酸盐 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e1ar e c e p t o r 5 - 羟色胺1a 受体 8 - o h d p a t 8 - h y d r o x y - n ，n d i p r o p y l - 2 - a m i n o t e t r a l i n 8 - 羟一2 一( 二一n 一丙胺) 四氢萘 徐州医学院硕士学位论文 激动大鼠触液核5 - h t l a 受体 对神经病理性疼痛的影响 中文摘要 目的探讨激动大鼠触液核5 - h t l a 受体对神经病理性疼痛的影响。 方法成年雄性s d 大鼠4 0 只，体重2 3 0 - 2 7 0 9 ，采用慢性坐骨神经结扎的方 法建立慢性神经病理痛( c c i ) 模型。第一部分，采用1 6 只雄性s d 大鼠，制作 c c i 模型后随机分成2 组( n = 8 ) ，d m s o 组、8 - o h d p a t 组( 用二甲亚砜( d m s o ) 溶解成1 0 1 “g 9 1 ) 。术后第7 天，各组于给药前和给药后3 ，6 ，1 2 h 分别测定其缩 足潜伏期( p a ww i t h d r a w a ll a t e n c y ，p w l ) 和缩足阈值( p a w w i t h d r a w a l t h r e s h o l d ，p w t ) ，其p 、礼和p w t 基础值在c c i 前测定；第二部分，另取2 4 只 雄性s d 大鼠，制作c c i 模型后随机分成4 组( n = 6 ) ，s h a m 组、c c i 组、d m s o 组、8 - o h d p a t 组( 1 0 , u g 9 1 ) ，s h a m 组仅暴露坐骨神经，不予结扎。各组于术后 第7 天给药，给药后6 h 处死，用免疫荧光标记的方法检测触液核部位5 - h t l a 受 体的表达情况。 结果d m s o 组c c i 前p w t 和p w l 基础值为1 0 1 + 0 8 ，1 1 1 4 - 1 4 ；8 - o h d p a t 组则为1 0 5 4 - 1 1 ，1 1 6 4 - 1 3 。术后第7 天，d m s o 组p 、胛值在给药前和给药后3 ， 6 ，1 2 h 分别为5 1 4 - 0 9 ，5 2 4 - 1 0 ，5 3 4 - 1 0 ，5 0 4 - 1 0 ；p w l 值分别为5 5 4 - 0 8 ，6 7 4 - 1 2 ， 6 2 4 - 1 0 ，5 7 4 - 0 8 。8 o h d p a t 组p w t 值在给药前和给药后3 ，6 ，1 2 h 分别为4 3 4 - 0 8 ， 8 9 4 - 1 5 ，9 9 4 - 1 3 ，9 2 4 - 1 3 ；p w l 值分别为5 3 4 - 1 0 ，1 0 7 4 - 1 4 ，11 5 4 - 2 1 ，1 0 2 4 - 2 2 。与c c i 前相比，各组在给药前p w l 和p w t 均显著减少( p 0 0 1 ) ，差异有统计学意义； d m s o 组在给药前后p w t 和p w l 无显著变化：与给药前和d m s o 组相比， 2 徐州医学院硕士学位论文 ，6 ，1 2 hp w l 和p 、胛均显著增加( p o 0 1 ) ，差异有统 h t l a 受体双标阳性细胞数分别为2 6 2 - 4 - 1 7 ，1 0 5 + 1 8 ， 1 0 3 - 4 - 1 2 ，2 7 0 - a ：2 6 ，分别占该组大鼠c b h r p 标记细胞总数的9 3 ，3 6 ，3 5 ，9 0 。 与s h a m 组相比，c c i 组和d m s o 组触液核部位c b h r p 5 h t la 受体双标阳 性细胞数显著减少( p 0 0 1 ) ；与c c i 组和d m s o 组比较，8 - o h d p a t 组触液核 部位c b h r p 5 h t l a 受体双标阳性细胞数显著增加( p o 0 1 ) 。 以上结果提示，神经病理性疼痛大鼠在术后第7 天，通过激动触液核5 - h t l a 受体后，其p w t 值和p w l 值及5 - h t l a 受体表达水平均显著增加，二者变化一 致。 结论激动触液核部位5 - h t l a 受体可以减轻坐骨神经慢性损伤所致的神经 病理性疼痛。 关键词触液核5 - h t l a 受体神经病理性疼痛激动剂 本课题受国家自然科学基金资助( 基金号：3 0 8 7 1 3 0 7 ) a r e c e p t o ri n e u si nr a tb r a i no n n e u r o o a t i i l cd a l n - a b s t r a c t o b j e c t i v e t o i n v e s t i g a t e t h ee f f e c to f e x c i t i n g t h e5 - h t l ar e c e p t o ri n c e r e b r o s p i n a lf l u i d - c o n t a c t i n gn u c l e u si nr a tb r a i no nn e u r o p a t h i cp a i n m e t h o d st h em o d e lo fn e u r o p a t h i cp a i nw i t hc 1 1 r o m cc o n s t r i c t i o ni n j u r y ( c c o o ft h es c i a t i cn e r v ew a sm a d ei nm a l es p r a g u e d a w l e yr a t s ( 2 3 0 2 7 0 9 ) t h e4 0r a t s w e r ed i v i d e di n t ot w op a r t s t h ef i r s tp a r t ，t h e16m a l es dr a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e d i n t o2g r o u p s ( n = 8 ) s u c ha sd m s og r o u pa n d8 - o h - d p a tg r o u p ( 10 9 9 l p l ) o nt h e 7 t hd a y ，b e f o r ea n da t3 、6 、12 ha f t e rt h ei n j e c t i o n ，t h eg r o u p sw e r em e a s u r e dw i t hp a w w i t h d r a w a ll a t e n c y ( p a ww i t h d r a w a ll a t e n c y , a w l ) a n dp a ww i t h d r a w a lt h r e s h o l d ( p a ww i t h d r a w a lt h r e s h o l d ，p w t ) ，r e s p e c t i v e l y t h eb a s i cv a l u eo fp w la n dp w t w a s m e a s u r e db e f o r et h ec c im o d e lm a d e t h es e c o n dp a r t ，a n o t h e r2 4m a l es dr a t sw e r e r a n d o m l yd i v i d e di n t o4g r o u p s ( n26 ) ，s h a mg r o u p ，c c ig r o u p ，d m s og r o u p ， 8 - o h - d p a tg r o u p ( 1 0 9 9 9 1 ) o nt h e 7 t hd a y ，6 ha f t e r8 - o h d p a ti n j e c t i o n ，w e d e t e c t e dt h ee x p r e s s i o no f5 - h t1ar e c e p t o ri nt h ec e r e b r o s p i n a lf l u i d c o n t a c t i n g n u c l e u sb yi m m u n o f l u o r e s c e n c e r e s u l t st h eb a s i cv a l u eo fp w ta n dp w r lo fd m s og r o u pa n d8 - o h d p a t g r o u pw a s1 0 1 + 0 8 ，11 1 士1 4a n d1 0 5 + 1 1 ，11 6 4 1 3 ，r e s p e c t i v e l y o nt h e7 t hd a y , b e f o r ea n da t3 、6 、1 2 ha f t e rt h ei n j e c t i o n ，t h ep w to fd m s o g r o u pw a s5 1 + 0 9 ， 5 2 4 - 1 0 ，5 3 4 - 1 0 , 5 0 士1 0 ，r e s p e c t i v e l y ；t h ep w lw a s 5 5 + 0 8 ，6 7 + 1 2 ，6 2 4 1 0 ， 5 7 4 - 0 8 ， r e s p e c t i v e l y ；t h e p w t o f8 - o h d p a t g r o u p w a s 4 3 4 0 8 ，8 9 + 1 5 , 9 9 + 1 3 , 9 2 4 1 3 ，r e s p e c t i v e l y ；t h ep w l w a s5 3 4 1 0 ，1 0 7 4 1 4 ，11 5 + 2 1 ， 1 0 2 4 2 2 ，r e s p e c t i v e l y ；c o m p a r e dw i t ht h eb a s i cv a l u e ，t h ep w la n dp w tv a l u eo f e a c hg r o u pd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yb e f o r et h ei n j e c t i o ni f , 0 0 1 ) c o m p a r e dw i t ht h e d m s og r o u po rp r e m e d i c a t i o n ，t h ep w la n dp w tv a l u eo f8 - o h - d p a tg r o u p i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y ( p 0 0 1 ) t h en u m b e ro fn e u r o n sw i t hc b - h r p 5 h t l ar e c e p t o rd o u b l el a b e l i n go fe a c h 4 n e u r o p a t h i cp a i n ；a g o n i s t 5 医学院硕士学位论文 击鲁士 和吾 它广泛参与多种机能活动的调节和某些病理生 理过程。作为一种内源性的生物活性物质，它在不同种属的动物体内均有分布。 早在上世纪4 0 年代，p a g e 等人就发现在血管内存在一种血小板源性的具有收缩血 管特性的物质，并将它命名为血清素，随后的研究发现其化学结构为 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e ( 5 h t ) 。这是神经科学发展史上最重要的发现之一。目前已知 5 - h t 必须通过与细胞表面的不同受体结合才能发挥作用。而受体的分型则根据其 对特异性配体的药理学反应，基因序列同源性，基因组分以及第二信使偶联的传 递途径来划分。 目前，作为第一个被克隆的5 h t l a 受体被研究的最为广泛。5 - h t l a 受体含 有4 2 1 个氨基酸，分子量为4 4 0 0 0 ，其基因编码由13 0 9 个碱基对组成，与b 2 肾上腺素 受体有高度同源性。5 - h t l a 受体为g 蛋白偶联受体，有7 个0 【螺旋形成的跨膜区。 在中枢神经系统中，高密度分布于额叶皮层、海马、外侧隔、中缝背核、脊髓背 角等。在外周则多分布于回肠，淋巴组织，血管平滑肌，肾等组织。人类5 一h t l a 受体的染色体基因定位在5 q l1 2 1 1 3 。以往研究认为，它与焦虑、酒精依赖、冲动 行为、精神分裂、疼痛等多种临床疾病相关，而近年来它与疼痛的关系日益受到 人们关注。 在中枢神经系统中有一种特殊的神经元，其胞体或突起可与脑脊液接触，被称 为接触脑脊液神经元( c e r e b r o s p i n a lf l u i d - c o n t a c t i n gn e u r o n s ，c s f c n s ) ，简称触液 神经元。根据其胞体与室管膜的位置关系，c s f c n s 可分为以下三种类型：室管膜 上神经元、室管膜内或室管膜下神经元和距室管膜较远，胞体位于脑实质内而突 起可伸入到脑脊液中的远位触液神经元2 1 。张励才等3 1 首次采用c b h r p 逆行示 踪方法对远位触液神经元在脑内的分布进行观察，发现大鼠脑实质内恒定而集中 分布着被c b h r p 标记的细胞群，将其高度集中分布区域称之为触液核，并确定 6 铲a y ，p a g ) 腹侧至第 与疼痛相关的神经活 们不难推测，触液核 部位可能是5 h t l a 受体在中脑的主要分布区域，我们通过干预触液核部位的 5 - h t l a 受体来观察其在神经病理性疼痛中的作用，这无疑将为针对5 一h t l a 受体在 疼痛治疗中的应用提供理论依据。有研究发现 1 远位触液神经元( d i s t a l c e r e b r o s p i n a lf l u i d c o n t a c t i n gn e u r o n s ，d c s f c n s ) q b 5 h t l a 受体在神经病理性痛中 表达发生变化，并根据d c s f c n s 和脑室之间关系，推测将5 一h t l a 受体激动剂直 接注射到脑室系统或者d c s f c n s 所在部位可能减轻神经病理性痛。 本实验通过观察触液核部位注射5 h t l a 受体激动剂8 o h d p a t 对神经病理性 疼痛( c c i 模型) 大鼠的行为学及触液核部位5 h t l a 受体表达的影响，探讨触液 核5 h t l a 受体通过痛觉下行调节系统对神经病理性疼痛的调节作用。该研究所涉 及的领域是当前疼痛治疗研究中的重点和前沿，具有一定的原始创新性，在该领 域的国内外研究中尚未见报道。 7 医学院硕士学位论文 1 材料 1 1 主要的试剂与药品 c b h r p ( 3 0 ) 5 - h t l a 抗体 c b 抗体 d m s o 二甲亚砜 t 刚t c 标记的驴抗羊抗体 f i t c 标记的驴抗兔抗体 1 0 水合氯醛 小牛血清 双氧水( 分析纯) 多聚甲醛( 分析纯) 磷酸二氢钠( 分析纯) 磷酸氢二钠( 分析纯) 氯化钠( 分析纯) 蔗糖( 分析纯) 甲苯胺蓝( 分析纯) 1 2 主要仪器 大鼠脑立体定位仪 手术器械一套 微量注射器 激光共聚焦显微镜( t c s s p 2 ) 材料和方法 中国协和医科大学 美国s i g m a 公司 美国s i g m a 公司 美国s i g m a 公司 美国s a n t a c r u z 公司 美国s a n t a c r u z 公司 上海制药厂 美国s a n t ac r u z 公司 北京中杉 上海申工 上海申工 上海申工 上海申工 上海申工 上海申工 日本 江苏徐州 中国上海 德国l e i c a 公司 k i 徐州医学院硕士学位论文 冰冻切片机 显微照相系统 图象分析系统 电子微量天平 制冰机 1 3 实验动物 德国l e i c a 公司 日本o l y m p u s 公司 德国l e i c a 公司 中国上海 日本三洋 所有实验均遵从国际疼痛研究联合会相关指南，并得到徐州医学院实验动物 伦理委员会的许可。s p f 级s d 雄性大鼠4 0 只，体重( 2 3 0 - 2 7 0 ) g ，由本院实验动物 中心提供( 实验动物许可证号：苏s c x k 2 0 0 5 0 0 0 5 ) ，实验前至少一周，使动物在 独立环境保持室温( 2 3 + 1 ) 及1 2 - - - , 1 2h 明暗光照( 晨起0 8 ：0 0 为光照) ，能够自由 取食和进水。 9 ，l 徐州医学院硕士学位论文 2 方法 2 1 实验动物分组雄性s d 大9 4 0 只，s p f 级，体重( 2 3 0 2 7 0 ) g ，由本院实 验动物中心提供，1 2h 1 2h 明暗光线交替，自由进食和饮水。第一部分，取1 6 只雄 性s d 大鼠，制作神经病理性疼痛模型( c c i ) 后随机分成2 组( n = 8 ) ，d m s o 组、 8 - o h d p a t 组( 用二甲亚砜( d m s o ) 溶解成l 愀，) ，于术后第7 天进行行为学 检测；第二部分，另取2 4 只雄性s d 大鼠，制作c c i 模型后随机分成4 组( n = 6 ) ，假手 术组( s h a m 组) 、c c i 组、d m s o 组、8 - o h d p a t 组( 用二甲亚砜( d m s o ) 溶解 成l o l u g l , d ) ，于术后第7 天进行免疫荧光检测。 2 2c c i 模型制作c c i 模型参, 昭, , b e n n e t t 和x i e 8 1 的方法，用戊巴比妥( 4 0m g k g b o d y w e i g h t ，i p ) 麻醉大鼠后，在一侧股骨中段暴露坐骨神经，以4 0 丝线每间隔 1m l n 结扎4 道，松紧度以大鼠后趾轻微抽动为度。s h a m 组以同样方法暴露坐骨 神经，但不予结扎。 2 3侧脑室注入c b h r p 所有动物在取材f i 百4 8h ，均以戊巴比妥麻醉( 4 0 m g k gb o d yw e i g h t ，i p ) ，参照大鼠脑立体坐标图谱( p a x i n o sa n dw a t s o n ) ，于立 体定位仪( 日本) 上向大鼠一侧侧脑室 前囟：( 一1 2 - t ：0 4 ) n l l n i 深：( 3 2 + 0 4 ) m m ：中 缝向左右旁开( 1 4 + 0 2 ) m m 注射3 0 c b h r p 舡。所有动物注射后置于原安静、 适宜的环境中喂养4 8h 。 2 4 触液核定位注射8 o h d p a t8 - o h d p a t 处理组以d m s o 为溶媒配制 成1 蝴，参照大鼠脑立体坐标图谱( p a x i n o sa n dw a t s o n ) ，在c c i 模型建立第 七天后，我们用微量注射器向触液核部位缓慢注入l u l 药物，5 m i n 注射完毕。d m s o 组注入容量为l u l 。 2 5 行为学检测术后第7 天，各组于给药前和给药后3 ，6 ，1 2 h 分别以缩足 潜伏期( p a ww i t h d r a w a ll a t e n c y , p w l ) 和缩足阈值( p a ww i t h d r a w a lt h r e s h o l d ，p w t ) 对大鼠热痛敏和机械触诱发痛反应进行评分，其p w l 和p 、胛基础值在c c i 前测定。 1 0 徐州医学院硕士学位论文 p w l 测定方法为：实验前使大鼠安静3 0 m i n ，将大鼠置于有机玻璃箱中，用热痛敏 刺激仪以连续密集激光束照射大鼠坐后足底中央直至大鼠出现缩足或者舔舐足底 反应，记录出现反应的时间，间隔1m i n 测定1 次，取连测3 次的平均值记录为每 只大鼠的p w l 。设定2 5s 切断光束照射以避免大鼠足底烧伤。p w t 测定方法：实 验前使大鼠安静3 0m i n ，将大鼠放置于底部为金属丝网的塑料盒o ? ( 3 5c m 3 0c m 2 5c m ) ，以不同力量v o n f r e y 丝刺激大鼠后足底并持续6 8s ，如大鼠出现缩足或 者舔舐足底则为阳性反应，每种力量的v o n f r e y 丝测定5 次，直至出现3 次以上阳 性反应，采用u p d o w n 方法四1 计算p w t 值。 2 5 取材及标本的制作术后第7 天，各组大鼠于给药后6 h 用1 0 水合氯醛 ( 3 0 0m g k g 体重) 腹腔注射麻醉，行左心室主动脉插管，先用3 7 。c 生理盐水1 5 0 m l 快速冲洗，再用4o c 含4 多聚甲醛的磷酸缓冲液( p b ) 3 5 0m l 灌流，先快后 慢。取大脑组织后，固定于p b 中6h ，转入含2 0 的蔗糖磷酸盐缓冲液( p b s ) 中过 夜。取触液核所在相应脑干区域进行冰冻冠状切片( l e i c ac m l 9 0 0 ，德国) ，片厚 3 0 1 m a 。 2 6 免疫荧光标记及激光共焦显微镜技术切片经0 1 t r i t o nx 1 0 0 处 理1 5m i n ，小牛血清l ：4 0 孵育1h ，然后加入一抗山羊抗c b ( 1 ：2 0 0 ，s a n t ac r u z 公 司) 和兔抗5 h t l a ( 1 ：5 0 0 ，s i g m a 公司) 混和抗体孵育4 8h ，再加入二抗t r i t c 标 记的驴抗山羊( 1 ：2 0 0 ，s a n t ac r u z 公司) 和f i t c 标记的驴抗兔( 1 ：2 0 0 ，s a n t ac r u z 公司) 孵育lh 。上述各步问用0 0 1m o l l 的p b s 充分漂洗。贴片、甘油封片，然后， 用激光共聚焦显微镜观察并摄片。免疫染色对照用p b s 代替一抗，其余步骤同前。 2 7 显微图像分析和统计学处理免疫荧光染色切片采用激光共聚焦显微 镜技术观测，在低倍镜下，c b h r p 阳性细胞胞体显示为红色荧光。5 h t l a 阳性 细胞呈绿色荧光，两者共存的细胞呈黄色。采用i m a g e p r op l u sv e r s i o n6 0 图像分 析软件( m e d i a c y b e m e t i c s ，b e t h e s d a ，u s a ) 。光镜切片细胞计数方法：各例动物取相 同层面c b h r p 阳性细胞最集中的脑组织切片，于1 0 0 倍放大在固定部位截取一屏 1 2 用于统计学分析。各组数据 较用单因素方差分析，组内 各组动物痛行为学的p w l 和p w t 见表1 。d m s o 组c c i 前p w t 和p w l 基础值为1 0 1 + 0 8 ，1 1 1 + 1 4 ：8 - o h d p a t 组则为1 0 5 + 1 1 ，1 1 6 - a ：1 3 。c c i 术后 第7 天，d m s o 组p w t 值在给药前和给药后3 ，6 ，1 2 h 分别为5 1 4 - 0 9 ， 5 2 + 1 0 ，5 3 - 4 - 1 0 ，5 0 - a ：1 0 ；p w l 值分别为5 5 - 4 - 0 8 ，6 7 4 - 1 2 ，6 2 4 - 1 0 ，5 7 + 0 8 。 8 - o h d p a t 组p w t 值在给药前和给药后3 ，6 ，1 2 h 分别为4 3 4 - 0 。8 ，8 9 + 1 5 ，9 9 - 4 - 1 3 ， 9 2 4 - 1 3 ；p w l 值分别为5 3 + 1 0 ，1 0 7 + 1 4 ，1 1 5 + 2 1 ，1 0 2 + 2 2 。与c c i 前相比，各组 在给药前p w l 和p 、胛均显著减少( p o 0 1 ) ，差异有统计学意义。d m s o 组在给 药前后p w l 和p w t 均无明显变化；与给药前相比，8 - o h d p a t 组在给药后3 ， 6 ，1 2 hp w l 和p w t 均显著增加( p o 0 1 ) ，差异有统计学意义；与d m s o 组相比， 8 - o h d p a t 组在给药后3 ，6 ，1 2 hp 、礼和p w t 均显著增加( p o 0 1 ) ，差异有统 计学意义。 2 c b i - i r p 标记神经元及c b h r p 5 h t l a 受体双标表达及计数 在脑实质的特定部位恒定出现c b h r p 标记的两个神经细胞簇，且数量稳定， 分布位置固定，于中缝背核背侧端中线两侧对称分布，其它脑区未见c b h r p 标记 神经细胞簇( 图1 ) 。各组c b - h r p 标记神经元的数量接近，无统计学差异( 表2 ) 。 各组c b h i 冲阳性( 红色) ，5 - h t l a 受体标记阳性( 绿色) 及c b h r p 5 h t l a 受体双重标记阳性细胞( 橙色) 表达及计数见表2 ，图2 ，图3 。各组大鼠 c b h r p 5 h t l a 受体双标阳性细胞数分别为2 6 2 + 1 7 ，1 0 5 + 1 8 ，1 0 3 4 - 1 2 ，2 7 0 - a ：2 6 ， c b h r p 标记阳性细胞数分别为2 8 2 + 1 4 ，2 9 0 - a ：1 4 ，2 9 6 - a ：1 5 ，2 9 8 - 4 - 1 5 ，其中s h a m 组( a ) 在第7 天c b h r p 5 h t l a 受体双阳性神经元的数量大约是c b h r p 阳性神经元数量 的9 3 ；c c i 组0 3 ) 和d m s o 组( c ) 大鼠在第7 天，c b h r p 5 h t l a 受体双重标 记细胞约占c b h r p 标记细胞总数的3 6 和3 5 ，两组间无显著差异，与假手术组 相比显著减少( p 0 0 1 ) ，差异有统计学意义；8 - o h d p a t 组( d ) 大鼠在第7 天 l 1 4 细胞总数的9 0 ，与 s o 组相比显著增加 t i 徐州医学院硕士学位论文 讨论 1 激动触液核5 h t l a 受体神经病理性痛大鼠行为学变化及意义 本实验神经病理性疼痛模型为慢性坐骨神经损伤模型，其来源经典可靠。在 建立慢性坐骨神经损伤模型后，我们发现大鼠表现出结扎一侧后爪不愿着地，足 底外翻，缩足等公认现象，而行为学检测结果提示各组大鼠缩足阈值( p w t ) 和 缩足潜伏期( p w l ) 均较给药前显著减少，这与以往有关c c i 的文献报道一致，提示 本实验神经病理性疼痛模型制作成功。而通过向大鼠触液核部位精确微量注入 5 - h t i a 受体特异性激动n 8 o h d p a t ，我们发现其缩足阈值( p w t ) 和缩足潜伏 期( p w l ) 均较给药前显著增加，而触液核注入溶媒二甲亚砜( d m s o ) 前后二者无 明显变化，这表明激动触液核部位5 h t l a 受体能减轻神经病理性疼痛。 2 激动触液核5 h t l a 受体神经病理性痛大鼠免疫荧光变化及意义 本实验中各组大鼠远位c s f c n s 的数量无统计学差异，而且位置较固定。同 时，我们发现，该类神经元大多含有5 h t l a 受体。s h a m 组c b h r p 5 h t l a 受 体荧光双标阳性数约为c b h r p 标记细胞数的9 3 ，而c c i 组和d m s o 组则分别为 3 6 ，3 5 左右。激动n 8 o h d p a t 组则约为9 0 ，这种变化提示触液核部位的 5 - h t l a 受体与神经病理性疼痛的发生发展存在一定联系。而我们通过激活触液核 部位的5 h t l a 后，发现神经病理性疼痛大鼠的行为学及触液核5 h t l a 受体表达均 有显著变化，其p w t 值及p w l 值的变化与触液核5 h t l a 受体表达变化一致，这种 变化的一致性提示5 h t l a 受体可能通过触液核建立脑实质与脑脊液之间的信息联 系，从而参与对神经病理性疼痛的调节。 3 触液核5 h t l a 受体与神经病理性痛的联系 由于触液核存在特殊的超微结构，其胞体位于脑实质，而突起可伸入到脑脊 液中。我们有理由推测触液核可能有别于一般中枢神经元而具有特殊性，本课题 研究表明3 “1 它可能充当了外周神经元和中枢神经元的双重角色，其在脑与脑脊 1s 徐州医学院硕士学位论文 液之间的物质交流、信息传递和功能调控过程中，以及痛觉下行调节系统的疼痛 信息转导和调控方面均扮演着重要角色。另外，触液核主要分布于中缝背核，此 处也是5 h t 合成释放处，故大鼠触液核内神经元可能是5 h t 能神经元，构成从中 缝核至脊髓背角和后侧角的5 h t 神经通路，参与痛觉下行调制系统的组成。 我们知道，5 - h t 在调节伤害性刺激的传递方面起着多重作用，在中枢，它一 般表现为镇痛作用。本实验研究发现触液核5 h t l a 受体在对伤害性刺激的调节起 着重要作用，被激活后主要表现为痛觉抑制。目前，针对脑实质内5 h t l a 受体在 内源性调节神经病理性疼痛所致的痛觉超敏的研究甚少。w dh 等0 1 研究发现， 延脑头腹内侧区( r v m ) 部位的5 h t i a 受体参与下调神经病理性疼痛所致痛觉超 敏。本课题组发现巧1 触液核中5 h t i a 受体在神经病理性痛中表达发生变化，此变 化与神经病理性痛时程一致，其结果提示触液核中5 h t l a 受体不仅参与神经病理 性痛的发生发展过程，同时也参与了其恢复过程，并根据触液核和脑室之间关系， 推测将5 h t l a 受体激动剂直接注射到脑室系统或者触液核所在部位则可能产生 镇痛作用。本实验进一步证实以上推论，通过对触液核精准定位，激活触液核部 位5 一h t l a 受体后可以减轻大鼠神经病理性痛，说明触液核存在由5 h t l a 受体介 导的疼痛信号传递。另外，术后第七天，神经病理性疼痛大鼠的痛觉敏感度显著 增加，而此时触液核5 h t l a 受体的表达下调，这与神经病理性疼痛大鼠5 h t l a 受 体在外周水平的表达变化相反，其原因可能是神经病理性疼痛相关信号通过脊 髓束或脑脊液上行作用于触液核，并抑制其5 h t l a 受体表达。 内源性痛觉下行调制系统主要由中脑导水管周围灰质( p a g ) 、延髓头端腹 内侧核群( r v m ) 和一部分脑桥背外侧网状结构组成，它在脊髓背角内释放5 - h t 作为主要神经递质而发挥下行调节作用1 2 1 ”。以往研究表明，5 - h t l a 受体在 对伤害感受性信息的调制方面具有抑制、易化双相作用。e i d e 4 1 实验室的系列 工作表明，小鼠鞘内注射5 - h t l a 受体激动剂8 - o h d p a t 和5 - h t l b 受体激动 剂r u 2 4 9 6 9 等可明显抑制其甩尾反射，如鞘内预先给予s p 、8 - o h d p a t 和 1 6 徐州医学院硕士学位论文 r u 2 4 9 6 9 对甩尾反射的抑制作用则明显减弱。有研究表明1 1 5 1 9 向中脑导水管周 围灰质( p a g ) 注入吗啡将产生镇痛效果，而无论在坐骨神经损伤组( c c i ) 还 是对照组，鞘内注射5 - h t l a 受体拮抗剂都能使得使得这一效果减弱，而鞘内注 入5 h t 2 和5 - h t 3 受体阻滞剂却不能减弱吗啡所致的镇痛作用。另外，c o l p a e r tf c 等6 1 研究表明，5 - h t l a 受体激动剂f 1 3 6 4 0 能减少阿片类药物在减弱各种急慢 性疼痛以及伤害性刺激带来的副作用，比如耐受，痛觉超敏等。与以上结果相悖， 另一些实验结果显示，激活脊髓的5 - h t l 受体可明显易化脊髓的伤害性反射，大鼠 5 - h t l a 或5 - h t l b 受体激动剂均可明显易化大鼠的甩尾反射和脊髓背角神经元 对伤害性刺激的反应。卓敏等n 7 1 的一系列研究工作也提示脑干下行易化系统对 脊髓伤害性反射的易化作用是通过5 - h t l a 和5 - h t l b 受体介导实现的。产生 双相作用的原因包括：( 1 ) 不同5 - h t 受体亚型的作用不同。5 - h t l 和5 - h t 5 受体 直接抑制神经元活动，5 - h t 2 、5 - h t 3 、5 - h t 4 、5 - h t 6 和5 - h t 7 受体直接兴奋神 经元活动；( 2 ) 5 - h t 受体分布的位置不同。5 - h t 受体位于初级传入纤维、兴奋性 中间神经元和投射神经元，也可以位于抑制性中间神经元，因此会产生不同的作用。 本实验通过观察远位触液核部位注射5 - h t l a 受体激动剂8 - o h d p a t 对神经病理 性疼痛( c c i 模型) 大鼠的行为学及触液核5 - h t l a 受体表达的影响，结果表明 触液核5 - h t l a 受体可能通过建立脑实质与脑脊液之间的信息联系抑或通过痛觉 下行调节系统对神经病理性疼痛进行调节而表现为痛觉抑制，又抑或是二者共同 作用的结果，其具体原因还有待进一步研究，这对临床治疗神经病理性疼痛有一 定指导意义。 触液核通过5 h t l a 受体密切参与疼痛信号的转导与调控。当机体受到外界伤 害性刺激时，内源性下行抑制和易化系统同时被激活，一旦两者相互平衡关系失衡， 以某一种占优势时，5 h t l a 受体将表现出不同作用。5 一h t l a 受体在痛觉调制系 统中介导了痛觉抑制或痛觉易化作用，还是5 h t l a 受体同时介导了痛觉抑制和 痛觉易化作用? 以往的实验结果有矛盾，因此还需要更多的实验和不同方法来证明 1 7 徐州医学院硕士学位论文 5 h t l a 受体在痛觉调制系统中的作用。随着生命科学和生物技术的迅猛发展， 5 - h t l 受体亚型的结构特征、生理和生化活性以及与疼痛的关系正在逐步被揭示， 这将为疼痛信号的转导机制作出进一步的解释，也为研发临床新型止痛药物提供 新思路。 位论文 结论 在本实验条件下，得出如下结论： 1 在慢性坐骨神经损伤后，神经病理性疼痛大鼠行为学发生显著改变。 2 大鼠触液核5 - h t l a 受体在慢性坐骨神经损伤后表达水平发生变化，此变化与神 经病理性疼痛大鼠行为学改变关系密切。 3 触液核5 h t l a 受体激活可以减轻慢性坐骨神经损伤( c c i ) 所致的神经病理性 疼痛，提示5 h t l a 受体可能通过触液核与脑脊液或其他中枢神经元之间的联系 而参与疼痛信息传递，这为触液核在疼痛信号转导和调控中发挥作用提供了理 论基础，也对临床治疗神经病理性疼痛具有一定的指导意义。 1 9 徐州医学院硕士学位论文 论文图表 表1各组动物痛行为学的p w l 和p w t ( - x ：i ：s ，n = 8 ) t a b l e1 b e h a v i o r a ls t u d i e so fp a ww i t h d r a w a ll a t e n c ya n dp a ww i t h d r a w a lt h r e s h o l d 与d m s o 组比，尸 0 o l 与给药前比，4 p 0 0 1 - 与c c l 前比，气p o 0 1 表2 各组动物c b h r p 5 h t l a 、c b h 融，受体双重标记细胞计数( l - l s ，n - 6 ) t a b l e2 n u m b e r o f n e u r o n sw i t hc b - h r pt r a c i n go rc b h r p 5 h t l ar e c e p t o rd o u b l el a b e l i n g 与s h a m 组比，p o 0 1与c c i 组比，。p 0 0 1 ，与d m s o 组比，j p o 0 1 2 0 瓤粕_ 一o ，多 迁蕊二 廖 磊 o 零。露i 鼍， ff 一耘+ 、 。i + 夺 ，竹 - 一+ 一一一。 塞萋爨 竹 - 9 刍 、r a i 奎 f 。唯一， - 晦。邀 龟 ，1 曩 谴毒 6 “c 啕垂， 0 龟 。誓 妇。 b 蠢。 ，番。q 。 譬产p 。 - 一p 屯和 i t - l m c l q m - j 伪j m d - 】嘎订蟹 ：j ：i n ： 菇 龉 、 产 擎 叠“h 一 ，麓气 碍p v崩， 鬈 謦节 o ， 。扩 ，筇 | 1 瞧醪，黔趣鼍碜 s h a m 织c c l 绢d m s o 绢8 - o h d p a t 绡 一c b - h r p 5 一h t i a c b - h r p 图3 各组动物c b - h r p 、c b h r p 5 一h t ia 受体双重标记细胞计数( 畏土s ，1 1 = 6 ) f i g 3 n u m b e ro f n e u r o n sw i t hc b - h r p ( r a c i n go rc b - h r p s h t i ar e c e p t o rd o u b l eh b e l m g 与s n a m g f li ：1 ：，尸 o 0 1与c c i 组比，# p o 0 1 ，与d m s o 组比，p 0 0 1 徐州医学院硕士学位论文 参考文献 武胜昔，王亚云，王文，等大鼠神经系统内5 - 羟色胺1 a 受体亚型的定位分 布 j 】神经解剖学杂志，2 0 0 2 ；1 8 ( 4 ) ：3 0 1 3 0 6 v i 曲b ，s i l v am j m ，f r a n kc l ，v i n c z ec ，c z i r o ks j ，s z a b 6a ：t h es y s t e mo f c e r e b r o s p i n a lf l u i d - c o n t a c t i n gn e u r o n s i t ss u p p o s e dr o l e i nt h en o n s y n a p t i e s i g n a lt r a n s m i s s i o no f t h eb r a i n h i s t o lh i s t o p a t h o l ，2 0 0 4 ；1 9 ( 2 ) ：6 0 7 6 2 8 w a n gm s ，z h a n gl c m e t h o d o l