（分析化学专业论文）rudppx2bipy2的合成及其在dna检测中的应用.pdf

中山大学硕士论文： r u ( d p p x ) 2 b i p y 2 + 的合成及其在d n a 检测中的应用 r u ( d p p x ) 2 b i p y 2 + 的合成及其在d n a 检测中的应用 专业：分析化学 硕士生：李旭锋 指导教师：凌连生副教授 摘要 核酸探针技术是定量检测核酸和研究核酸结构与功能的重要手段，发展低 污染、高灵敏度、高选择性d n a 识别探针，对环境分析、临床分析和分子生 物学都有着不言而喻的重要意义。核酸分子“光开关”定量检测核酸的灵敏度 高，抗干扰能力强，同时还可以识别d n a 和r n a 、不同构型d n a 以及错配 寡聚核苷酸序列。基于核酸分子“光开关在核酸结构分析和含量检测中的优 点，本工作合成了新的核酸分子“光开关 r u ( d p p x ) 2 b i p y 2 + ( d p p x 为7 ，8 - 二甲 基二吡啶并【3 ，2 a ：2 ，3 c 】吩嗪；b i p y 为2 ，2 一联吡啶) ，研究了它在核酸分析中的 应用和作用机理。主要研究内容如下： 1 、综述了几类荧光探针的结构、性质、应用、局限性和前景。 2 、 合成了一种新型核酸分子“光开关 r u ( d p p x ) 2 b i p y 2 + ，并采用了元 素分析、质谱和1 h 核磁共振进行表征。 3 、研究了探针在小牛胸腺d n a 、变性小牛胸腺d n a 、酵母r n a 和寡 聚核苷酸检测中的应用。实验结果表明，探针具备分子“光开关”的 特性，在小牛胸腺d n a 等核酸分子检测中具有很高的灵敏度，可以 用来测定3 3 7n g m l - - 1 0 t g m l 小牛胸腺d n a 、0 21 t g m l - - 1 4 i t g m l 酵母r n a 、o 3p 咖l o 6i t g m l 变性小牛胸腺d n a 、 2 3 4 x 1 0 。1 1m o l l - - - 1 5 2 x 1 0 。7m o l l 寡聚核苷酸d ( a ) 2 0 、9 6 0 x 1 0 。1 2 m o l l ，- - 1 5 2 x 1 0 。7m o l l 寡聚核苷酸d ( t ) 2 0 和1 7 3 x 1 0 1 1m o l l ，- - 1 5 2 x 1 0 。7 m o l l 互补核苷酸d ( a ) 2 0 d ( d 2 0 ，它们的检测限分别为3 3 7 中山大学硕士论文： r u ( d p p x ) 2 b i p y 2 + 的合成及其在d n a 检测中的应用 n g m l 、2 2 7n g m l 、1 2 2n g m l 、2 3 4 x 1 0 1 1m o l l 、9 6 0 x 1 0 1 2 m o l l 和1 7 3 x 1 0 。1m o l l 。同时实验还发现，此探针不但可以检测双链核酸 分子，还可以检测单链核酸分子。实验还进行了探针检测d n a 的机 理研究。机理表明，探针在双链结构的核酸检测中，主要是插入结合 作用发射荧光，而在单链核酸检测中的机理还有待证明。 关键词：d n a ；荧光； r u ( d p p x ) 2 b i p y l 2 + ； i i 中山大学硕士论文： r u ( d p p x h b i p y 2 + 的合成及其在d n a 检测中的应用 s y n t h e s i so f r u ( d p p x ) 2 b i p y l 2 + a n di t sa p p l i c a t i o ni n t h ed e t e r m i n a t i o no fd n a m a jo r ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r y n a m e ：l ix u f e n g s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s o rl i n gl i a n s h e n g a b s t a r c t d n a p r o b et e c h n o l o g yi sa l li m p o r t a n tm e a n so ft h es t u d yo fq u a n t i t a t i v e d e t e c t i o no fn u c l e i ca c i d sa n dn u c l e i ca c i ds t r u c t u r ea n df u n c t i o n i ti si m p o r t a n tt o d e v e l o pl o wp o l l u t i o n ，h i g hs e n s i t i v i t y ，h i g hs e l e c t i v i t yo fd n ap r o b e si nt h e e n v i r o n m e n t a la n a l y s i s ，c l i n i c a la n a l y s i sa n dm o l e c u l a rb i o l o g y n u c l e i ca c i d m o l e c u l a r ”l i g h ts w i t c h ”q u a n t i t a t i v ed e t e c t i o no fn u c l e i ca c i d sw i t hh i g hs e n s i t i v i t y a n ds t r o n ga n t i i n t e r f e r e n c ea b i l i t y ，b u ta l s ot oi d e n t i f yd n aa n dr n a ad i f f e r e n t c o n f i g u r a t i o no ft h ed n a ，m i s m a t c ho l i g o n u c l e o t i d es e q u e n c e b a s e do nt h e a d v a n t a g eo fn u c l e i ca c i dm o l e c u l a r ”l i g h ts w i t c h ”i nt h ea n a l y s i so fn u c l e i ca c i d s t r u c t u r ea n dd e t e r m i n a t i o n w es y n t h e s i s e dan e wn u c l e i ca c i dm o l e c u l a r ”l i g h t s w i t c h ”c o m p l e x r u ( d p p x ) 2 b i p y 2 + ( d p p x = 7 ，8 - d i m e t h y l - d i p y r i d o 【3 , 2 - a ：2 ，3 - c 】 p h e n a z i n e ；b i p y = 2 ，2 一b i p y r i d i n e ) a n ds t u d i e di t sa p p l i c a t i o ni nd n aa n a l y s i s m m a i nc o n t e n t sw e r ea sf o l l o w i n g ： 1 t h er e s e a r c hi ns e v e r a lk i n d so ff l u o r e s c e n tp r o b ei n c l u d i n gi t ss t r u c t u r e 、 c h a r a c t e r 、a p p l i c a t i o n s 、l i m i t a t i o n sa n dp r o s p e c t si sr e v i e w e d 2 【r u ( d p p x ) 2 b i p y 2 + w a ss y n t h e s i z e d ，a n di t ss t r u c t u r ew a sc h a r a c t e r i z e dw i t h e s i m s 、e l e m e n t a la n a l y s i sa n dn m r 3 s t u d yo ft h ep r o b ei nt h ec a l ft h y m u sd n a ，d e n a t u r e dc a l ft h y m u sd n a ， y e a s tr n a a n do l i g o n u c l e o t i d ed e t e c t i o n t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a tt h e m o l e c u l a rp r o b ew i t h ”l i g h ts w i t c h ”c h a r a c t e r i s t i c s ，i nc a l ft h y m u sd n aa n do t h e r n u c l e i ca c i dd e t e c t i o nw i t hh i g hs e n s i t i v i t y , i tc a nb eu s e dt od e t e r m i n a t i o no f3 3 7 n g m l - - - 1 0i t g m lc a l ft h y m u sd n a ，0 2i t g m l 1 4 p g m ly e a s tr n a ，0 3 r t e d m l 一- 0 6 t g m ld e n a t u r e dc a l f t h y m u sd n a ，2 3 4 x 1 0 m o l l - - 1 5 2 x 1 0 。7 m o l l o l i g o n u c l e o t i d ed ( a ) 2 0 ，9 6 0 x 1 0 。1 2m o l l 一1 5 2 x 1 0 。7m o l lo l i g o n u c l e o t i d ed ( t ) 2 0 a n d1 7 3 x1 0 。m o l l - - - 1 5 2 x1 0 。7m o l ln u c l e o t i d ec o m p l e m e n t a r yd ( a ) 2 0 d ( t ) 2 0 ， t h e i rd e t e c t i o nl i m i t sw e r e3 3 7n g m l 、2 2 7n g m l 、1 2 2n g m l 、2 3 4 x1 0 q 1m o l l 、 i i i 中山大学硕士论文： r u ( d p p x ) 2 b i p y 2 + 的合成及其在d n a 检测中的应用 9 6 0 x10 1 2m o l la n d1 7 3 x10 。l lm o l l ，r e s p e c t i v e l y a tt h es a m et i m e ，t h ee x p e r i m e n t a l s of o u n dt h a tt h i sp r o b ec a nd e t e c tn o to n l yd o u b l e s t r a n d e dn u c l e i ca c i dm o l e c u l e s ， b u ta l s oc a nd e t e c ts i n g l e s t r a n d e dn u c l e i ca c i dm o l e c u l e a l s o c a r r i e do u t e x p e r i m e n t sp r o b et h em e c h a n i s mo f d n a t e s t i n g t h em e c h a n i s mi n d i c a t e dt h a tt h e p r o b ei nt h ed o u b l e s t r a n d e dn u c l e i ca c i dt e s t i n g ，m a i n l y i n s e r t sf u n c t i o nl a u n c h f l u o r e s c e n c e ，a n di nt h es i n g l e s t r a n d e dn u c l e i ca c i dd e t e c t i o nm e c h a n i s mh a sy e tt o b ep r o v e d k e yw o r d s ：d n a ；f l u o r e s c e n c e ； r u ( d p p x ) 2 b i p y 2 + i v 中山大学硕士论文： r u ( d p p x ) 2 b i p y 2 + 的合成及其在d n a 检测中的应用 主要缩写对照表 缩写英文名中文名结构式 b i p y 2 ，2 - b i p y r i d i n e 2 ，2 联吡啶 p h e n 1 ，10 - p h e n a n t h r o l i n e邻菲咯琳 d b d i p y r i d o 【3 , 2 - a ：2 ，3 - c 】 二吡啶并 h d p p z 双焱： p h e n a z i n e【3 , 2 一a ：2 ，3 一c 】吩嗪 u n 7 , 8 - d i m e t h y l d i p y r i d o 3 , 2 - a ： 7 , 8 二甲基- - n t t 啶 贩焱：d p p x u 2 ，3 - c 】p h e n a z i n e并【3 ，2 一a ：2 ，3 一c 】吩 嗪 v 中山大学硕士论文： r u ( d p p x ) 2 b i p y 2 + 的合成及其在d n a 检测中的应用 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的知道 下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的 内容外，本论文不包括任何其他个人或集体己经发表或撰写过 的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已 在文中以明确的方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果 由本人承担。 多 日 支矽月 荔翟 签 年 者q ， 惴7 刘 沙 论 ： 位 期 学 日 中山大学硕士论文： r u ( d p p x ) e b i p y 2 + 的合成及其在d n a 检测中的应用 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本人在导师 指导下完成的成果，该成果属于中山大学化学与化学工程学院， 受国家知识产权法保护。在学期间与毕业后以任何形式公开发 表论文或申请专利，均需由导师作为通讯联系人，未经导师的 书面许可，本人不得以任何方式，以任何其它单位作全部和局 部署名公布学位论文成果。本人完全意识到本声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名 日期：巧年舌 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签 日期：沙夕年乡 日 中山大学硕士论文： r u ( d p p x h b i p y 2 + 的合成及其在d n a 检测中的应用 1 1引言 第一章绪论弟一早珀可匕 核酸是生物体的重要组成部分。研究配合物与d n a 的键合机理和作用规律 有助于阐明d n a 的结构与功能的关系。研究不同构型d n a 的检测方法有助于理 解生物体内核酸的复制、转录以及蛋白质的合成等生命过程。因而，研究d n a 的分析方法具有重要意义。荧光分析法因其具有灵敏度高、选择性好和无放射性 等优点而在核酸分析中占据重要位置。由于核酸无内源荧光，核酸分子的检测灵 敏度主要取决于核酸探针的检测灵敏度，寻找灵敏的核酸荧光探针是核酸分析的 重要内容。 1 2 研究背景 d n a 是重要的生物大分子，它是生命遗传信息的携带者和传递者，它不仅 对生物的生长发育、细胞分化、物种延续起着重要的作用，也与生物的变异密 切相关。d n a 是一种线性多聚核苷酸，名为脱氧核糖核酸，由脱氧核糖、磷酸 及碱基三部分组成，在所有的d n a 分子中，脱氧核糖、磷酸是相同的，不同 的是碱基。组成d n a 的碱基有四种，分别为腺嘌呤( a ) 、鸟嘌呤( g ) 、胞嘧啶( c ) 和胸腺嘧啶( t ) 。d n a 分子一般是以双螺旋结构存在，其中的碱基通过氢键两 两配对：a 配t 、c 配g ，在不同条件下，d n a 也会以单链和三螺旋的结构存 在。 由于d n a 含有生物物种所有的遗传信息，其定量分析与检测、特异性识 别，不仅对探究d n a 的结构与功能具有重要意义，而且对分子生物学、医学、 药物化学等相关学科的发展也具有十分重要的意义。 分析d n a 的方法有很多种，如光谱分析、波谱分析、表面等离子体基元 共振( s p r ) 、电化学分析【1 1 、亲和毛细管电泳分析1 2 ( a c e ) 、原子力显微镜( a f m ) 中山大学硕士论文# r u ( d p p x ) 2 b i p y 2 + 的龠成及其在d n a 检测中的威用 法和微量燕法等仪器分析方法。其中光谱法包括投曼光谱法翻、紫羚可见分光 光度法【4 】、荧光光度法【5 1 、红外光谱法、圆二色光谱法、x 射线衍射等，而其中 荧光光度法由于优点众多丽被广泛用于d n a 定量分析中。 1 3荧光光度法概述 当紫外光或可见光照射到某些物质的时候，这些物质会发射出不种颜色和不 同强度的可见光，两当紫外光停止照射的时候，激发光线又很快消失，这种光 线称之为荧光。荧光分析方法的发展与仪器的应用及发展是分不开的。近几十年 来，在其它学科的迅速发展和影响下，随着激光、微处理机和电子学等一些薪 的科学技术的弓l 入，大大推动了荧光分析法在理论研究方面的进展，并且相应地 加速了各式各样新型的荧光分析仪器的阕世，使得荧光分析方法不断朝着高效、 痕量、微观和自动化的方向发展，方法的灵敏度、准确度和选择性也日益提高。 荧光光度法在分析化学，特别是生物分辑中有着广泛的应用。荧光分析不仅 灵敏度高、选择性好，还具有方法简捷、重现性好、取样量少和仪器设备不太复 杂等优点，但由于d n a 内源荧光很弱，因而不能利用荧光技术直接测定d n a 含 量，必须引入荧光探针，利用d n a 对小分子荧光探针的荧光强度的增强或猝灭 来进行暇的测定。 1 。4d n a 荧光探针研究进展 d n a 探针一般分为放射性d n a 探针和非放射性d n a 探针两大类。放射性探 针因其检测灵敏度高，已被应用于分子生物学研究和临床诊断，但由于放射性探 针存在环境污染以及放射性废物处理等问题，使其进一步的应用受到了限制，因 此开发高灵敏度的非放射性探针来代替放射性探针成为了热门的研究课题。根据 发光机理及发光分子类型的差异，d n a 荧光探针可分为：( 1 ) 有机染料荧光探 针； ( 2 ) 稀土及稳土一配体荧光探针；( 3 ) 过渡金属络合物荧光探针；( 4 ) 分 子信标；( 5 ) 量子点；( 6 ) 核酸分子“光开关。 2 中山大学硕士论文： r u ( d p p x ) 2 b i p y 2 + 的合成及其在d n a 检测中的应用 1 4 1 有机染料荧光探针 有机染料荧光探针在d n a 定量分析中是研究最早，发展最快，应用最广的 一类探针，其主要原理是基于染料分子嵌入双链d n a 分子中与d n a 结合，通 过能量转移，使其中的染料分子的荧光强度发生改变来定量测定d n a ，这类探 针最常用的是溴化乙锭( e t h i d i u m b r o m i d e ) 、吖啶橙( a c r i d i n e o r a n g e ) 、耐尔蓝 ( n i l e b l u e ) 、碳菁染料等。 溴化乙锭( 结构如f i 9 1 1 ) 是应用最早，也是目前应用最广的荧光探针，其荧 光强度随d n a 浓度的增加而增强，于5 4 0 n m 处激发，在5 9 0 n m 处测量荧光强 度，测定范围为o 0 1 1 0i x g m l 【6 】。e b 是一个具有共轭芳香环的平面分子，在水 溶液中荧光非常弱，但当它插入到d n a 碱基对之间后，在d n a 的双螺旋内 部的疏水环境中，其共轭的平面芳香环受到一定程度的保护，减少了溶剂对它 的碰撞而引起的荧光猝灭，从而使得e b 的荧光得到增强，同时e b 本身所带的 正电荷与d n a 的磷酸基端的负电荷存在着一定的静电作用，这也对二者的结 合有一定的贡献。在琼脂糖凝胶电泳过程中用e b 染色来测定d n a ，能消除蛋 白质和r n a 的干扰 7 1 ，张平城等【8 1 还用e b 灵敏检测三链d n a ，刘雪平等【9 1 采 用e b 探针示踪劳氏青莲与d n a 分子的相互作用。e b 虽然与d n a 结合稳定， 但未与d n a 结合的染料自身的荧光也会造成很高的荧光背景，而且e b 具有诱 发癌变的作用，溶液放置也很不稳定，这给经常使用e b 的研究工作带来了很 大的不便。 h 2 n n h 2 c h a b r f i g l ls t r u c t u r eo fe t h i d i u m b r o m i d e 吖啶橙( 结构如f i g l 一2 ) 是一种荧光色素，溶于水或乙醇，溶液为橙黄色显绿 中山大学硕士论文： r u ( d p p x ) 2 b i p y 2 + 的合成及其在d n a 检测中的应用 色荧光，p h 值为8 4 1 0 4 时则无荧光。吖啶橙与细胞中d n a 和r n a 结合量存在 差别，可发出不同颜色的荧光( 即着色特异性) ，这是由于d n a 是个高度聚合物， 吸收荧光物质的位置较少，发绿色荧光，而r n a 分子聚合度低，能和荧光物质结 合的位置多，故发红色荧光。在阴离子表面活性剂存在下，吖啶橙通过嵌入或静 电吸引与d n a 分子结合后，会导致荧光强度急剧增强，最大发射波长为5 2 5h i d ， 用于测定c t d n a ，其线性范围为7 8 1 0 0l x g m l ，检测限可达3 9n g m l 【6 1 。江或等 研究了在水溶液中吖啶橙( a o ) 作为能量给体，酚藏花红( p f ) 作为能量受体的 能量转移体系，检出限为0 0 7 01 t g m l ，对0 8 0l x g m l 的d n a 进行8 次测定，相对 标准偏差为0 8 9 。 ( h a c ) 2 n h c l f i g l 一2s t r u c t u r eo f a c r i d i n e o r a n g e n ( c h 3 ) 2 耐尔蓝( 结构如f i 9 1 3 ) 是一种碱性吩嗪类染料，具有平面、刚性结构，本身 具有荧光，激发波长是6 2 7n i n ，发射波长是6 7 2n l i l ，加入d n a 后会导致荧光 猝灭，从而可测定d n a 含量【6 1 。陈秋影等【1 1 】基于d n a 对于耐尔蓝的荧光猝灭， 建立测定d n a 的新方法，测定c t d n a 的范围为0 0 0 3 - 2 0p g m l ，检测限达3 0 n g m l ，测定f s d n a 的范围为0 0 0 9 2 0 肛g m l ，测定6 次的相对标准偏差为2 1 。 0 2 h 5 n i c 2 h 5 n o f i 9 1 3s t m c t l l r eo f n i l e b l u e 4 中山大学硕士论文： r u ( d p p x ) 2 b i p y 2 + 的合成及其在d n a 检测中的应用 碳菁染料是一类很有价值的荧光剂，是目前d n a 分子荧光探针研究中比 较新的一类，目前已有几十种之多，分为t o t o 、y o y o 、b o b o 、p o p o 、t o t a b 等系列。它具有一定的水溶性，对d n a 有很高的亲合作用而与其他的生物大 分子几乎不染色，在不与d n a 结合时荧光量子产率小于o o l ，与d n a 结合后 荧光强度大大增加，荧光量子产率可高达0 9 。同时，此类探针还可以借助荧光 显微镜来检测单分子核利1 2 】。噻唑橙二聚体( t o t o ) 与恶唑黄二聚体( y o y o ) 在游离时没有荧光【1 3 1 4 1 ，但与d n a 结合后荧光显著增强，且与d n a 的结合物 异常稳定，以至于t o t o d n a 的缔合物即使在电泳时也不分离，因此在电泳 前样品染色浓度可小至n m o l 级峨15 1 。此类探针性能虽好，但由于价格相对比 较贵，广泛应用受到了限制【l 引。 i n l n = 0 ，y - - s ，t o t o ；，两。y 釜0 y o y o 露= l ，y - - 5 ，t o t a b 糟石苫 p y - - s ，b o b o y 釜谯p o p o t o t o 可高选择性地用于非序列特异性的d s d n a 的检测，它对所有的 d s d n a 表现出极高的亲和作用，但更易嵌入d s d n a 的( 5 c t a g 3 ) 2 位，大约 是1 0 0 倍的选择性，其次是( 5 c t g a 一3 ) 2 位，大约5 0 倍的选择性1 1 。j a s o n 等 【1 7 1 用溶液粘度测定法和原子力显微镜解释了t o t o 与d n a 的双嵌入作用。 y o y o 1 可以作为新的d n a 缩合作用探针，弱酸性( p h 5 7 ) 条件下，y o y o 嵌入的单个d n a 分子( 4 8 5k b p ) 被破坏成直径为1 0 0 1 5 0n m 的环状结构，用 光捕捉可观察到单个与缩合d n a 分子之间的构象变化，达到1 5 0m s 的时间分 中山大学硕士论文： r u ( d p p x ) 2 b i p y 2 + 的合成及其在d n a 检测中的应用 辨。c l a i r e 等【1 9 】发现，在d n a 存在时，y o 和y o y o 会产生光漂白，其原 因主要在于氧化的碱基8 氧代7 ，8 二羟基脱氧鸟嘌呤，能使嵌入的y o y o 荧光 猝灭。 苯酚基双( 苯并咪唑) ( h o e c h s t 3 3 2 5 8 ) 和苯乙氧基双( 苯并咪唑) ( h o e c h s t 3 3 3 4 2 ) 的水溶性较好，相对无毒，可渗透入细胞并通过小沟槽键合到 d n a 染色，发射蓝色荧光，适宜作多色标记，但这类探针灵敏度不是很高1 2 】。 h o e c h s t 3 3 2 5 8 与d n a 结合后量子效率可提高4 0 0 倍；r i l e y 等口1 1 以之为探针， 采用荧光微滴定技术建立了精确测定d n a 的方法；l a b a r c a 等【2 2 】则成功地将 h o e c h s t 3 3 2 5 8 用于细胞和粗处理组织匀浆中d n a 的测定，可测定低至1 0 n g 的 d n a ；s o u t 等为了直接检测碱性洗脱液中的d n a ，建立了用h o e c h s t 3 3 2 5 8 检 测单链d n a 的新方法；何品刚等人2 4 1 采用荧光光谱法对d n a 与h o e c h s t 3 3 2 5 8 的 作用机理进行了研究，证实了h o e c h s t 3 3 2 5 8 与d n a 的相互作用除嵌入作用外， 还存在非特异性的静电作用。 h 3 c n 令 i i v n 3 h c l f i 9 1 4s t r u c t u r eo fh o e c h s t 3 3 2 5 8 h 已报道的其他有机染料探针还有很多，谢飞等口5 1 用s y b rg r e e ni ( i i ) 高通 量测定d n a 并有很高的灵敏度，郭良洽等| 2 6 1 用甲苯胺蓝荧光淬灭灵敏测定 d n a ，基于同样原理，陈芳等【2 7 1 用硫酸喹啉在p h = 2 4 时测定d n a ，检测限 达5 9 “g l 。此外，还有光色素口引、氨基放线菌素d 【2 9 1 、荧光素一异硫氰酸酯口0 1 、 小檗碱【3 1 i 、异羟基洋地黄毒苷元【3 2 1 、碱性品红【3 3 1 等在d n a 分析中均有报道。 1 4 2 稀土及稀土一配体探针 6 中山大学硕士论文： r u ( d p p x h b i p y 2 + 的合成及其在d n a 检测中的应用 稀土离子也是一种可用于检测d n a 的探针试剂，目前作为d n a 荧光探针的 金属离子绝大多数是稀土离子，这主要是由于稀土离子与d n a 分子间的亲和力 大，作用后能发射稀土离子的特征荧光，具有光谱线宽窄、激发态寿命长和s t o c k s 位移大等优点，其中最常用的离子是t b ( i i i ) 、e u ( i i i ) 。 对于稀土离子，在水溶液中只有t b ( i i i ) 、e u ( i i i ) 是有荧光性且与d n a 配合 后仍具有荧光性能，t b ( i i i ) 的最大荧光发射波长位于5 4 5n l n ，相应于4 d 4 7 f 5 跃迁，而4 8 8n l t l 则相应于5 d 4 - 7 f 6 跃迁；e u ( i i i ) 的最大荧光发射波长是6 1 2n l n ， 相应于5 d o 一7 f 2 跃迁，而5 7 5n l - n 则相应于5 d o 7 f o 跃迁。利用t b ( i i i ) 或e u ( i i i ) 与d n a 结合后的荧光增强可特异检测d n a 。t b ( i i i ) 可与核苷、核苷酸、聚核 苷酸等形成络合物，多数该类配体能使t b ( i i i ) 荧光增强，r i n g e r 等【3 4 】对核酸中 各碱基对t b ( i i i ) 荧光敏化的研究表明，荧光敏化大小为：鸟嘌呤( g ) 胞嘧啶 ( c ) 胸腺嘧啶( t ) 腺嘌呤( a ) ，而且t b ( i i i ) 还是核酸单链区的选择性探针【3 5 】。慈 云祥等【3 6 】利用t b ( i i i ) 在天然状态下能敏化r n a 而对d n a 敏化不大，在酸变性 时d n a 对t b ( i i i ) 的荧光增强变化很大而r n a 的荧光增强变化相对较小的特 性，研究在r n a 的浓度低于d n a 的3 5 时用差减法测定d n a 含量。 当t b ( i i i ) 或e u ( i i i ) 与小分子配体形成配合物后，若其他分子的吸收光谱与 这些配合物的荧光光谱重迭，并共存于溶液中，则该稀土离子配合物可作为无 辐射能量转移的有效能量给体，大大增强稀土离子的的荧光强度，该方法叫荧 光能量共振转移法( f r e t ) ，其机理主要是偶极一偶极相互作用。基于该原理， 慈云祥等【3 7 3 8 1 发现，当向t b ( i i i ) d n a 的体系中加入邻菲罗啉( p h e n ) 时体系 的荧光会大大提高，并将t b ( i i i ) p h e n 作为一个整体荧光探针应用于测定热变性 c t d n a 、f s d n a 、y e a s t r n a 及各种核苷酸和多聚核苷酸，显著提高了稀土探针 测定核酸的灵敏度。利用e u ( i i i ) g a t i f l o x a c i n d n a 3 9 1 、t b ( i i i ) 环丙沙星d n a 【4 0 1 、 l a ( i i i ) 8 。羟基喹啉d n a 4 1 1 、p r ( h i ) 一杯 4 】芳烃d n a 4 2 1 、e u ( i i i ) 。土霉素d n a i t 3 】 等三元络合物测定d n a 都是基于f r e t 致使荧光增强而建立的。然而t b ( i i i ) 一 钛试剂( 1 ，2 - - 羟基苯3 ，5 - - - 磺酸钠) d n a u i 测定d n a 则是由于d n a 的磷酸 根竞争结合到t b ( i i i ) 上形成不发荧光t b ( i i i ) d n a 二元络合物，猝灭t b ( i i i ) 一钛 试剂的荧光，根据荧光猝灭的强度与加入的d n a 成正比关系而测定d n a 含量。 7 中山大学硕士论文： r u ( d p p x h b i p y 2 + 的合成及其在d n a 检测中的应用 1 4 3 过渡金属络合物探针 作为过渡金属络合物探针的中心离子，已报道的有p t ( i i ) 、r u ( i i ) 、r h ( i i i ) 、 o s ( ) 、m n ( i i i ) 、z n ( i i ) 、c u ( i i ) 、f e ( i i i ) 、c o ( i i i ) 、n i ( i ) 以及i n ( i i i ) 等【1 2 】，而 配体则有邻菲罗啉、2 ，2 。联吡啶、喹啉、二吡啶【3 ，2 2 ，3 c 】吩嗪和卟啉等。这 些络合物颜色较深，最大吸收波长位于可见光区，在一些有机溶剂中表现出较强 的发光效率和较长的荧光寿命。此类探针主要是通过嵌入方式键合到d n a 或 r n a 中，因此也常常被称为金属嵌入剂。随着人们对此类探针的不断探索，越来 越多的新型配合物被合成和研究。不完全统计有： r u ( p h e n ) 3 2 + 、 r u ( t m e p h e n ) 3 】2 + 、 r u ( p h e n ) 2 ( d p p z ) 2 + 、 r u ( b p y ) 2 ( d p p z ) 2 + 、 r h ( p h i ) 2 ( b p y ) 3 + 、 r h ( p h e n ) 2 ( b p y ) 】3 + 、 r h ( e n ) 2 ( p h i ) 3 + 、 o s ( p h e n ) 2 ( d p p z ) 2 + 、 o s ( p h e n ) 3 2 + 、 o s ( p h e n h ( m e d p p z ) 2 + 、 r e ( d p p z ) ( c o ) ( 4 m e p y ) + 、 z n ( p h e n ) 3 2 + 等2 0 余种，都分别应用于 d n a 结构与性能的研究【1 2 】。其中 r u ( p h e n ) 2 ( d p p z ) 2 + 【4 5 1 、 r u ( b p y ) 2 0 p p z ) 2 + 4 6 1 等配合物由于其特殊的荧光特性又被称为d n a 分子“光开关”。 庄惠生等4 7 】以o 1 m o l l 而s _ h c l ( p h = 7 4 ) 作为缓冲溶液，研究d n a 对 n i ( p h e n ) 2 p h p i p ( p h p i p 为对羟基苯基咪唑并 f 】邻菲咯啉) 和n i ( p h e n ) 2 i p ( i p 为 咪唑并 q 邻菲咯啉) 的荧光增强作用，检测限为4 5p g l ，从而建立测定d n a 的 新方法。林旭聪等【4 8 】应用i n ( i i i ) 一8 一羟基喹啉为荧光探针，研究了铟( i i i ) 一8 羟基喹 啉与核酸的作用，在最佳条件下，c t d n a 、h s d n a 、s m d n a 和y r n a 的线性范围分 别为0 2 0 1 4 0l - l g m l 、o 2 0 1 6 0 “g m l 、o 1 0 - 1 4 0g g m l 和0 2 0 - 1 2 01 t g m l 、检 出限分别为0 0 0 4i a g m l 、0 0 0 2p g m l 、0 0 0 2g g m l 和0 0 0 2p g m l 。慈云祥等【4 9 】 研究m n ( i i i ) m e s o 四( 4 氨基苯基) 卟啉( t a p p ) 与固定在硝酸纤维素膜上的单链 脱氧核糖核酸( s s d n a ) 的相互作用情况，发现m n ( i i i ) 一t a p p 可将s s d n a 染成绿色， 低至1 0 p g d o t 的s s d n a 也可以被检出。 1 4 4 分子信标 分子信标技术( m o l e c u l a rb e a c o n ) 是一种基于荧光共振能量转移现象 8 中山大学硕士论文：f r u ( d p p x ) z b i p y 2 + 的合成及其在d n a 检测中的应用 ( f r e t ) 和碱基互补配对原则建立起来的一种分析技术。t y a g i 和i k r a m m e r l 5 0 1 于 1 9 9 6 年设计了一种可以特异性识别核酸序列的新型荧光探针，这种荧光探针通过 与核酸靶分子进行杂交后发生构象的变化而发出荧光，他们将其命名为分子信 标。分子信标具有背景信号低，灵敏度高、特异识别性强、操作简单，不必与未 反应的探针分离即可实时检测，可用于活体分析等优点。但分子信标技术易受环 境温度、p h 以及信标纯度等因素影响，且信标制备也较复杂，因此分子信标也 在不断改进和发展中。 分子信标( 结构图如f i 9 1 5 ) 是一种呈发夹结构的核酸探针，根据f o e r s t e r 理论，只有荧光基团与猝灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。自由状 态时，分子信标呈发卡式结构，从而荧光基团和猝灭基团相距较近( 约7 l o n m ) 。此时发生荧光共振能量转移，使荧光基团发出的荧光被猝灭基团吸收 并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝灭，荧光本底极低。当分子信标与靶分 子结合时，荧光基团和猝灭基团之间的距离加大，从而，分子信标的荧光几乎 1 0 0 恢复。而且所检测到的荧光强度与溶液中靶标量成正比。分子信标技术最 初被用作p c r 的荧光探针，它既可以对扩增产物进行定量检测，又可以对扩增 过程进行实时的检测【5 1 1 。近年来，随着分子信标技术的发展和成熟，人们不断 拓展其应用领域，目前，分子信标法主要应用于以下几个方面【5 2 1 ：( 1 ) 核酸的检 测分析；( 2 ) 实时定量p c r 测定靶标浓度；( 3 ) 活体内核酸的动态检测；( 4 ) 同时 检测多个靶核苷酸；( 5 ) 研究d n a - 蛋白质的相互作用；( 6 ) 用于核酸酶的研究等 方面。 一乏 杂交h 二 分子信标 靶序列猝灭基团荧光基团 f i gl - 5p r i n c i p l eo fl i g h t e m i t t i n gm o l e c u l a rb e a c o n 9 中山大学硕士论文： r u ( d p p x ) 2 b i p y 2 1 的合成及其在d n a 检测中的应用 p e r l e t t e 5 3 1 利用微注射法在袋鼠肾细胞质中引入分子信标，对单个活细胞中 的r n a 进行了检测，并利用i c c d 成像系统得到了一系列反应分子信标与r n a 结合的荧光图像。结果表明，利用分子信标可以实时检测活细胞中的r n a ，研究 r n a d n a 的杂交过程。 f a n g 5 4 1 等以s s b 、组蛋白、牛血清蛋白为对象研究了三者对分子信标的不同 影响。结果表明，分子信标能够很好地区分这三种类型的d n a 结合蛋白：分子信 标与s s b 具有很高的亲和力，其结合引起的荧光上升与完全互补的靶相近。并且 他们进一步研究了s s b 与分子信标的结合动力学，得出其结合常数与已经报道的 结合常数相符。 分子信标技术自其诞生以来，由于它极高的特异性、灵敏度等特点迅速进入 生物学、基础医学、临床医学等各个相关领域。人们对分子信标的结构也进行了 数次改进和发展，使之可以在更广的范围内发挥更大的作用。以分子信标技术为 基础人们开发出可进行高通量筛选的芯片。如果该技术与纳米技术、激光共聚焦 技术等其他先进技术相结合，也必然会促进分子信标技术的发展。毫无疑问的是 分子信标技术有着广阔的应用空间。随着制备技术的发展，设计方法的改进，分 子信标技术必将更加完善。 1 4 5 量子点 量子点是由半导体材料( 通常由元素周期表的i i 一或i i i v 族原子组成) 制 成的稳定、溶于水、尺寸在2 ，- - - 2 0n m 的晶体。由于它的物理尺寸小于激子的玻尔 半径，从而导致了一种量子限制效应，使其具有独特的光线和电子学性质。1 9 9 8 年，a l i v i s a t o s t 5 5 1 和n i e 5 6 】研究小组同时突破性地解决了量子点作为生物探针的生 物相容性问题，标志着量子点的生物学应用开始起步。从此，