（急诊医学专业论文）辛伐他汀对脓毒症大鼠肿瘤坏死因子、白介素6、白介素1及降钙素原的影响.pdf

目录 中文摘要l 英文摘要3 研究论文辛伐他汀对脓毒症大鼠肿瘤坏死因子、白介素6 、白介素 1 及降钙素原的影响 前言一一“一一”“”一“”“”“”“6月f j 舌”“”“一一”“”“”“”“”“”“o 材料与方法0 o oo oo 6 结果o o01oo oooooo oooioo ooo00 oooo d o o00o ”一一”1 l 附表“一”1 2 讨 仑“1 3 结论一”一”“”1 9 参考文献o qo ooo 2 0 综述他汀类药物与脓毒症2 5 致谢”一“”“”“0 0 oooo 一3 6 个人简历o ooooo ooo o oo oqo 3 7 中文摘要 辛伐他汀对脓毒症大鼠t n f a 、i l 6 、i l 1 及p c t 的影响 摘要 目的：脓毒症( s e p s i s ) 是感染引起的全身炎症反应综合症( s y s t e m i c i n f l a m m a t o r yr e s p o n s es y n d r o m e ，s i r s ) ，是严重创( 烧、战) 伤、休克、感 染、外科大手术患者常见的并发症之一，进一步发展可导致脓毒症休克、 多器官功能障碍综合征( m o d s ) ，是临床危重患者的最主要死亡原因之一。 最近十多年尽管新的治疗方法及重症护理技术不断改进，但脓毒症的发病 率逐年上升，病死率居高不下。原因是脓毒症发病机制复杂，随着对脓毒 症发病机制的不断深入研究，认识到脓毒症发生时，大量促炎细胞因子如 肿瘤坏死因子( t n f a ) 、白细胞介素( i l 1 ，i l 6 ) 的释放及降钙素原( p c t ) 水平升高，可进一步诱发失控性炎症反应，是脓毒症发生发展的重要环节。 他汀类药物除了降脂作用外，还具有多项抗炎特性，能够降低炎症因子的 水平。本实验将辛发他汀抗炎作用应用于盲肠结扎及穿孔( c l p ) 方法制 作大鼠脓毒症模型，检测脓毒症模型大鼠血清炎症因子及降钙素原水平， 用动物实验方法证实辛伐他汀也有抑制脓毒症大鼠炎症因子作用，进一步 证实辛伐他汀在脓毒症治疗方面的有效性，并为脓毒症的临床用药提供理 论依据。 方法：清洁级健康雌性w i s t a r 大鼠8 0 只，体重2 0 0 2 5 0 9 ( 河北医科 大学实验动物中心提供) 。将8 0 只雌性w i s t a r 大鼠随机分为4 组。分别为 i 组：健康对照组( 8 只) ；i i 组：假手术组( 8 只) ；i i i 组：脓毒症模型 药物未干预组( 3 2 只) ；组：辛伐他汀干预后造模组( 3 2 只) 。应用盲 肠结扎及穿孔( c l p ) 方法制造脓毒症模型，观察大鼠毛色，精神状态， 呼吸，体温等，在c l p 后大鼠可自由饮水，以大鼠出现精神倦怠、腹胀、 躁动、寒战、眼角分泌物增多、毛发凌乱，进食、进水减少等表现，处 死后可见腹腔有血性渗液，盲肠肿胀变黑、粘连，空肠肠管胀气，可闻 及恶臭等表现，确定脓毒症模型制模成功。喂药组( i v 组) 采用胃管给 药( 辛伐他汀2 0 m g k g d a y ) ，每日一次，连续灌胃2 周。其他三组同等 体积的生理盐水连续灌胃2 周。给药方法如下：i 组：无药物及手术干 中文摘要 预；i i 组：只做假手术，无药物干预；i i i 组：只做c l p ，无药物干预； 组：喂药2 周后行c l p 。出现死亡另行造模补充。i 组大鼠活杀留取 血液标本。i i 组术后6 h 留取血液标本。i i i 组及组分别于术后3 h 、6 h 、 2 4 h 及4 8 小时留取血液标本。应用酶联免疫吸附试验( e l i s a ) 方法检 测血液标本中t n f c 【、i l 1 、i l 6 、p c t 水平。 结果： 1 t n f q ：i i i 组3 ht n f 0 【水平即明显增高，6 h 达高峰，6 h 后较前减少； 组3 h 、6 h 、2 4 h 及4 8 ht n f ( i t 水平均低于i i i 组；且两组各时间点相比有 显著性意义( p o 0 5 ) 。i i i 组t n f a 明显高于与i 组和i i 组( p o 0 5 ) 。 2 i l 6 ：i i i 组造模后3 hi l 6 水平即有明显增高，2 4 h 达高峰，2 4 h 后有所 下降；组3 h 、6 h 、2 4 h 及4 8 hi l 6 水平均低于i i i 组( p o 0 5 ) 。i i i 组i l 6 明 显高于i 组和i i 组( p o 0 5 ) 。 3 i l 1 ：i i i 组3 hi l 1 水平即有明显增高，2 4 h 达高峰，2 4 h 后较前减少； 组3 h 、6 h 、2 4 h 及4 8 hi l 1 水平较i i i 组明显减少( p o 0 5 ) 。i i i 组明显高于 i 组和i i 组( p 0 0 5 ) 。 4 p c t ：i i i 组造模后3 hp c t 水平即有明显增高，6 h 达高峰，6 h 后较前减 少；i v 组3 h 、6 h 、2 4 h 及4 8 hi l 1 水平较i i i 组明显减少( p o 0 5 ) 。i i i 组明显 高于i 组和i i 组( p o 0 5 ) 。 结论： 1 应用c l p 的方法可成功制造出脓毒症模型。 2 脓毒症时血清t n f 0 【、i l 1 、i l 6 、p c t 水平明显升高。 3 应用辛伐他汀可明显降低脓毒症模型大鼠血清t n f 0 【、i l 1 、i l 6 、p c t 水平。 关键词：肿瘤坏死因子0 【；白介素1 ；白介素6 ；降钙素原；辛伐他 汀；脓毒症 英文摘要 e f f e c t “s i m v a s t a t i no nt n f a 、i l 6 、i l 1andcto ts ie t t e 一、- o 、i l 一 o fs e p t i cr a t s p r o c a l c l t o n i n s e p t i cr a t s 0 i a b s t r a c t o b je c t i v e s ：s e p s i si s t h es y s t e m i ci n f l a m m a t o r yr e s p o n s es y n d r o m e c a u s e db yi n f e c t i o n ，w h i c hi sac o m m o nc o m p l i c a t i o ni ni n j u r y ( b u r n i n g ， w a r f a r e ) ，s h o c k ，i n f e c t i o na n dm a j o rs u r g e r i e s s e p s i sc a nl e a dt os e p t i cs h o c k a n dm u l t i p l e o r g a nd i s f u n c t i o ns y n d r o m e ( m o d s ) ，a n di ti st h em a i nc l i n i c a l c a u s eo fd e a t hi nc r i t i c a li l l n e s s t h em o r b i l i t yi sr i s i n gy e a rb yy e a ra n dt h e m o r t a l i t ys t a y sa t ah i g hl e v e l ，a l t h o u g ht h en e wm e t h o do ft r e a t m e n ta n d i n t e n s i v ec a r et e c h n o l o g yh a v eb e e ni m p r o v i n gu n c e a s i n g l yi nr e c e n t10y e a r s t h er e a s o ni st h a tt h ep a t h o g e n e s i si sc o m p l e x w i t ht h ed e v e l o p m e n to f r e s e a r c ho ns e p s i sp a t h o g e n e s i s ，w er e a l i z et h a tt h er e l e a s eo fq u a n t i t i e so f p r o i n f l a m m a t o r yc y t o k i n es u c ha st n f - a ，i l - 1 ，i l 一6a n dt h eh i g hl e v e lo f p c tm a yi n d u c eu n c o n t r o l l e di n f l a m m a t o r yr e s p o n s ew h i c hi sai m p o r t a n t l i n ki nt h ed e v e l o p m e n to fs e p s i s s t a t i n sh a v em u l t i p l ea n t i i n f l a m m a t o r y f u n c t i o na n dc a nl o w e rt h el e v e lo fi n f l a m m a t o r yf a c t o rb e s i d e st h ee f f e c to f d e s c e n d i n gt h eb l o o df a t i no u re x p e r i m e n t ，w eu s e ds i m v a s t a t i no nr a ts e p t i c m o d e lw h i c hw a sm a d eb yc e c a ll i g a t i o na n dp u n c t u r e ( c l p ) t od e t e c tt h e l e v e lo fs e r u mi n f l a m m a t o r yf a c t o r sa n dp c t t h i sc e r t i f i e dt h a ts i m v a s t a t i n c o u l di n h i b i tt h ei n f l a m m a t o r yf a c t o r sb ya n m i n a le x p e r i m e n ta n df u r t h e r c o n f i r m e dt h ev a l i d i t yi nt r e a t m e n to fs e p s i s s oi tc o u l dp r o v i d eat h e o r e t i c a l b a s i sf o rs e p s i si nc l i n i c a lm e d i c a t i o n m e t h o d s ：8 0c l e a na n dh e a l t h yf e m a l ew i s t a rr a t sw e i g h t2 0 0 2 5 0 9 ， ( s u p p l i e db yt h ee x p e r i m e n t a la n i m a lc e n t e ro fh e b e im e d i c a lu n i v e r s i t y ) w e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o4g r o u p s g r o u p i ：h e a l t h yc o n t r o lg r o u p ( 8r a t s ) ； g r o u p i i ：，s h a mo p e r a t i o ng r o u p ( 8r a t s ) ；g r o u p i i i ：m o d e lg r o u p ( 3 2r a t s ) ；g r o u p i v ：m o d e lg r o u pp r e t r e a t e db ys i m v a s t a t i n ( 3 2r a t s ) t h es e p t i cm o d e lw a s m a d eb yc e c a ll i g a t i o na n dp u n c t u r e w eo b s e r v e dt h ec o l o rp a t t e r n ，m e n t a l s t a t e s ，b r e a t h ，b o d yt e m p e r a t u r ea n ds oo n ，t h er a t sm a yd r i n kw a t e rf r e e l y 3 英文摘要 a f t e rc l p , a n dh a dt h ep e r f o r m a n c e so ft i r e ds p i r i t ，t h ea b d o m i n a ld i s t e n s i o n ， r e s t l e s s n e s s ，s h i v e r s ，i n c r e a s e dc a n t h a ls e c r e t i o n ，h a i r si nd i s o r d e r , r e d u c t i o no f e a t i n ga n dd r i n k i n ga n ds oo n a f t e re x e c u t e d ，w es a w t h eh a e m a t o d e ss e e p a g e i na b d o m i n a l c a v i t y , t h es w e l l i n gd a r k e n i n g a n da d h e s i v e c a e c u m ，t h e i n f l a t a b l eje j u n u ma n ds o m e t h i n gs m e l lf o u l a l lt h e s ec e r t if i e dt h a tt h er a t s e p t i cm o d e l sw e r em a d es u c c e s s f u l l y t h e r a t si ng r o u pi vw e r ea d m i n i s t r a t e d w i t hs i m v a s t a t i n ( 2 0 m g k g d a y ) f o r2w e e k sb yg a s t r i ct u b ec o n t i n u o u s l y , o n c e ad a y t h eo t h e rt h r e eg r o u p sw e r eg i v e ns a l i n eo ft h es a m ev o l u m ev i ag a s t r i c t u b ef o r2w e e k s t h em e t h o da s f o l l o w ：g r o u pi ：n o tb e i n gt r e a t e dw i t h a n y t h i n g ；g r o u p l i ：o n l ys h a mo p e r a t e d ；g r o u pi l l ：o n l ym a k i n gc l pb u tn o m e d i c i n ei n t e r v e n t i o n ；g r o u pi v ：m a k i n gc l pa f t e rs i m v a s t a i nf o r2w e e k s s u p p l i e dw i t hn e w o n e sw h e nm o d e lr a t sd i e d t h eb l o o ds p e c i m e n so fg r o u p l w e r et a k e na f t e rb e i n gk i l l e d t h eb l o o ds p e c i e m e n so fg r o u p l lw e r et a k e n a f t e rs h a mo p e r a t i o nf o r6 ha n da f t e rc l pf o r3 h ，6 h ，2 4 h ，4 8 hr e s p e c t i v e l yi n g r o u p l i ia n dg r o u p i v t h el e v e l so f t n f u 、i l - 1 、i l - 6a n dp c t i nt h eb l o o d s p e c i e m e n sw e r em e a s u r e db ym e a n s o fe l i s a r e s u l t ： 1t n f 一0 【：t h el e v e lo ft n f - 0 【i ng r o u pi i ii n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya t3 h a f t e rc l p , t h ep e a kw a sa t6 hp o i n ta n ds h o w e dd o w n w a r dt r e n da f t e r6 h ；t h e v a l u e si ng r o u pi vw e r ea l ll o w e rt h a nt h o s ei ng r o u pi i ia t3 h 、6 h 、2 4 ha n d 4 8 hr e s p e c t i v e l y ；t h e r ea r es t a s t i cs i g n i f i c a n c eb e t w e e nt h e2g r o u p sa te v e r y p o i n t ( p o 0 5 ) t h ev a l u e so ft n f qi n g r o u p1 1 1w e r eh i g h e rs i g n i f i c a n t l yt h a ng r o u p ia n dg r o u pi i ( p 0 0 5 ) 2i l 一6 ：t h ev a l u e so fi l - 6i ng r o u pi i ii n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya t3 ha f t e r c l p , t h ep e a kw a sa t2 4 h ，a n ds h o w e dd o w n w a r dt r e n da f t e r2 4 h ；t h ev a l u e si n g r o u pi vw e r ea l ll o w e rt h a nt h o s ei ng r o u pi i i a t3 h 、6 h 、2 4 ha n d4 8 h r e s p e c t i v e l y ( p 0 0 5 ) t h ev a l u e si ng r o u p1 1 1 w e r eh i g h e rs i g n i f i c a n t l yt h a ng r o u pia n dg r o u pi i ( p o 0 5 ) 3i l 一1 ：t h ev a l u e so fi l - 1i ng r o u pi i ii n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya t3 ha f t e r 4 英文摘要 c l p , t h ep e a kw a sa t2 4 h ，a n ds h o w e dd o w n w a r dt r e n da f t e r2 4 h ；t h ev a l u e si n g r o u pi vw e r ea l ll o w e rt h a nt h o s ei ng r o u pi l l a t3 h ，6 h 、2 4 ha n d4 8 h r e s p e c t i v e l y ( p 0 0 5 ) t h el e v e li n g r o u p1 1 1w a sh i g h e rs i g n i f i c a n t l yt h a ng r o u p ia n dg r o u pi i ( p 0 0 5 ) 4p c t ：t h el e v e lo fp c ti ng r o u pi i ii n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya t3 ha f t e r c l p , t h ep e a kw a sa t6 h ，a n ds h o w e dd o w n w a r dt r e n da f t e r6 h ；t h el e v e l si n g r o u pi vw e r ea l ll o w e rt h a nt h o s ei ng r o u pi i i a t3 h ，6 h ，2 4 ha n d4 8 h r e s p e c t i v e l y ( p o 0 5 ) t h el e v e li ng r o u p1 1 1w a s h i g h e rs i g n i f i c a n t l yt h a ng r o u pia n dg r o u pi i ( p o 0 5 ) c o n c l u s i o n ： 1a s e p t i cr a tm o d e lc o u l db em a d es u c c e s s f u l l yb yc l e 2t h el e v e l so ft n f g t 、i l 一1 、i l 一6a n dp c to ft h es e p t i cr a t si ns e r u m i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y 3s i m v a s t a t i nc o u l dl o w e rt h el e v e l so fs e r u mt n f a 、i l 1 、i l 6a n d p c to f s e p t i cr a t ss i g n i f i c a n t l y k e yw o r d s ：t n f - q ；i l - 1 ；i l 一6 ；p c t ；s i m v a s t a t i n ；s e p s i s 5 研究论文 辛伐他汀对脓毒症大鼠肿瘤坏死因子、白介素6 、 白介素1 及降钙素原的影响 u ! 。 刖罱 脓毒症病情进展迅速、病死率高，治疗上仍然没有突破性的进展， 是危重症救治的攻关难题。脓毒症发生时，机体各种促炎症介质，如t n f a 、i l 一6 、i l 一1 、i l 一2 、i f n y 大量释放，可进一步诱发炎症瀑布 反应。在脓毒症病理生理过程中起重要作用。因此应用抑制脓毒症炎症 因子释放、阻断炎症级联反应的方法，为脓毒症的治疗提供了新的思路。 辛伐他汀是传统调脂药物，近年研究显示，他汀类药物除调脂外作用， 还有多种生物学作用，如减少血管炎症的氧化应激反应，增加n o 的生物 活性，改善内皮细胞功能，调节细胞免疫功能等作用，应用他汀类药物抗 炎特性治疗脓毒症已成为近年研究的热点课题。国外研究，能改善脓毒 症动物模型的预后，提高生存率。本实验拟对辛伐他汀对脓毒症大鼠模型 的抗炎作用应用进行研究，观察脓毒症大鼠炎症因子t n f 一0 【、i l 一6 、i l 一1 、p c t 水平的变化，进一步探索他汀类药物治疗脓毒症的机理和效果， 为临床治疗脓毒症提供理论基础。 材料与方法 l 实验材料 1 1 实验动物： 清洁级健康雌性w i s t a r 大鼠8 0 只，体重2 0 0 2 5 0 9 ( 河北医科大学实验动 物中心，合格证编号：9 0 9 0 9 4 ) 。饲养于恒温( 2 0 ) 清洁饲养室，1 2 h ：1 2 h 光暗周期，给予经高压灭菌处理的标准大鼠饲料，充足水分，通风良好， 温度适宜。所有大鼠实验前均于饲养室适应性饲养5 天。实验前禁食16 h ， 自由饮水。 实验分组：8 0 只大鼠随机分为4 组，分别为i 组：健康对照组( 8 只) ； i i 组：假手术组( 8 只) ；i l l 组：脓毒症模型药物未干预组( 3 2 只) i v 组： 辛伐他汀干预后造模组( 3 2 只) 。 研究论文 1 2 主要仪器： 动物手术操作台、手术器械、离心试管、注射器( 1 m l 、2 m l 、5 m 1 ) 、 2 4 群静脉穿刺套管针、动脉夹、纱布等。 大鼠灌胃针( z h 0 6 1 6 ) 电子体温计( 欧姆龙m c 一1 4 0 ) 酶标仪( b i o t e ke l x 8 0 0 美国) 微量振荡器( 无锡县金城仪器厂w e s i i i a 型) 台式高速冷冻离心机( n e o f u g e l 3 r ) 超低温保存箱( d m 8 6 l 3 8 6 ) 制冰机( a f l 0 0 ) 扭力天平( t n 1 0 0 f 扭力) 电热恒温水浴箱( 6 0 c m ) 三通及测压装置 1 3 主要药品及试剂： 水合氯醛( 天津市大茂化学试剂厂) 大鼠t n f 仅试剂盒( 美国r & ds y s t e m s ) 大鼠i l 1 试剂盒( 美国r & ds y s t e m s ) 大鼠i l 6 试剂盒( 美国r & ds y s t e m s ) 大鼠p c t 试剂盒( 美国r & ds y s t e m s ) 辛伐他汀片( 杭州默沙东制药有限公司，国药准字h 1 9 9 9 0 3 6 6 ) o 9 氯化钠注射液( 石家庄四药有限公司) 2 实验方法： 2 1 大鼠模型制作： 2 1 1 麻醉：1 0 水合氯醛3 5 0 m g k g 腹腔麻醉，腹腔注射时将大鼠头部 放低，尾部抬高，选择在下腹部靠外侧进针，针尖通过腹肌后抵抗力消失 回抽无回血注射麻药后仰位固定于手术台上。 2 1 2 应用盲肠结扎及穿孔( c l p ) 方法制造脓毒症模型，本实验参照 h u b b a r d 1 1 、姚咏明【2 】和k o od j t 3 】字艮道的c l p 制作方法，动物麻醉后刮除 腹部备皮，消毒，在无菌状态下开腹手术，取腹部正中切口，约1 5c m ， 逐层打开腹腔，找到盲肠，用4 号丝线在距离回盲瓣l c m 处，避开盲肠 动、静脉，在血管弓内侧结扎，结扎完毕应仔细检查，保持肠道通路正常。 研究论文 以1 8 号针头在距盲肠末端约l c m 处穿刺3 次，见少量肠内容物流出，留 置一条宽2 m m 的橡皮条，防止针孔闭合。将盲肠放回腹腔，关腹。术毕 皮下注射生理盐水2 m l 1 0 0 9 以补充体液丢失。之后将动物放回饲养笼中， 麻醉清醒后自由活动、进食、饮水。假手术组仅开腹后翻动盲肠，而不 穿孔结扎、穿孔，然后关腹。正常组大鼠不作任何处理。实验大鼠出现 精神倦怠、腹胀、躁动、寒战、眼角分泌物增多、毛发凌乱，进食、进 水减少等表现，处死后可见腹腔有血性渗液，盲肠肿胀变黑、粘连，空 肠肠管胀气，可闻及恶臭等表现，确定脓毒症模型制模成功。 2 2 药物干预：将动物放置在台面上，用左手拇指和食指抓住大鼠双耳及 头部皮肤，向上提起头部，向右倾斜，前肢抬起，后肢接触台面，使动 物口腔朝上，右手持已溶解辛伐他汀的5 m l 注射器，将灌胃针头由动物 口腔侧面插入食管，缓慢注入药物，防止呕吐，操作过程中避开牙齿， 避免损伤咽喉。给药方法如下，组：采用胃管给药( 辛伐他汀 2 0 m g k g d a y ) ，每日一次，连续灌胃2 周。i 、i i 、i i i 组给予同等体积的 生理盐水连续灌胃2 周。 2 3 标本收集： 2 3 1 颈动脉插管： 剪去大鼠颈部被毛后，在颈中部作一皮肤切口。拉开皮肤后可见颈 前部肌肉，用血管钳逐层钝性分离颈部肌肉。用玻璃针成功分离出颈动 脉后，用动脉夹将近心端及远心端夹闭，用2 4 舟静脉穿刺套管针行颈动脉 穿刺，穿刺成功后拔出针芯，用l 号丝线将外套管固定，用一次性5 m l 加肝素抗凝注射器抽血，避免溶血。i 组大鼠活杀留取血液标本。i i 组 术后6 h 留取血液标本。i i i 组及组分别于术后3 h 、6 h 、2 4 h 及4 8 小时 留取血液标本。 2 3 2 血液标本： 操作过程中避免任何原因细胞破坏。使用不含热源和内毒素的试管。 从颈动脉抽取2 - 3 m l 血液，离心机3 0 0 0 r p m ，10 m i n 取上清，并放于7 0 。c 冰箱保存。 2 4 实验指标： 应用e l i s a 方法检测血液标本中t n f 一0 【、i l 1 、i l 6 、p c t 水平。 2 5 实验步骤及原理： 研究论文 2 5 1 实验原理： t n f c t 、i l 1 、i l 6 、p c t 试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附试验。 已知t n f 扒i l 1 、i l 6 、p c t 浓度的标准品、未知浓度的样品加入微 孔酶标板内进行检测。先将t n f 0 【、i l 1 、i l 6 、p c t 和生物素标记的 抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的h r p 。再经过温育和洗涤， 去除未结合的酶结合物，然后加入底物a 、b ，和酶结合物同时作用，产 生颜色。颜色的深浅和样品中t n f 0 c 、i l 1 、i l 6 、p c t 的浓度呈比例 关系。 2 5 2p c t 检测步骤： 2 5 2 1 使用前，将所有试剂充分摇匀。不要使液体产生大量的气泡，以 免加样时加入大量气泡，产生加样上的误差。 2 5 2 2 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个样 品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。 2 5 2 3 加入稀释好后的标准品5 0 9 l 于反应孔，加入待测样品5 0 9 l 于反应 孔内。立即加入5 0 9 l 的生物素标记的抗体。盖上模板，轻轻震荡混匀， 3 7 。c 温育4 5 分钟。 2 5 2 4 甩去孔内液体，每孔加满沈涤液，震荡3 0 秒，甩去洗涤液，用吸 水纸拍干。重复此操作4 次。如果洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。 2 5 2 5 每孔加入1 0 0 u l 的亲和链霉素h r p ，轻轻震荡混匀，3 7 温育3 0 分钟。 2 5 2 6 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，震荡3 0 秒，甩去洗涤液，重复 此操作4 次。如果洗板机沈涤，沈涤次数增加一次。 2 5 2 7 每孔加入底物a 、b 各5 0 u l ，轻轻震荡混匀，3 7 。c 温育5 分钟。避 免光照。 2 5 2 8 取出酶标板，迅速加入5 0 u l 终止液，加入终止液后应立即测定结 果。 2 5 2 9 在4 5 0 n m 波长处测定各孔的o d 值。 2 5 2 1 0 沈板机清洗5 次，每次静置1 0 2 0 秒。 2 5 2 1 1 在标准孔中和样品孔中加入5 0 9 l 的酶标记溶液。 2 5 2 1 23 7 。c 水浴孵育反应3 0 分钟。 2 5 2 1 3 洗板机清洗5 次，每次静置1 0 2 0 秒。 研究论文 2 5 2 1 4 每空加入底物呈色剂a 、b 液各5 0 1 t l 。 2 5 2 1 53 7 水浴孵育反应1 5 分钟。 2 5 2 1 6 每孔加入5 0 1 a l 的终止液，终止反应。 2 5 2 1 7 在3 0 m i n 内，将标准品及样品置于波长为4 5 0 n m 的酶标仪上读 取各孔的o d 值。 结果判断与分析： 于波长为4 5 0 n m 的酶标仪上读取各孔的o d 值。以吸光度o d 值为 纵坐标( y ) ，相应的p c t 标准品浓度为横坐标( x ) ，描绘相应曲线，样 品的p c t 含量可根据其o d 值由标准曲线换算出相应的浓度，再乘以稀 释倍数；或用标准物的浓度与o d 值计算出标准曲线的回归方程式，将样 品的o d 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的 实际浓度。 2 5 3t n f 0 t 、i l 1 、i l 6 检测步骤： 2 5 3 1 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。每- 孑l d h 样1 0 0 此。 ( s t a n d a r d 的稀释请严格按照英文说明书中稀释方法进行；标准品及样品 的稀释均使用d i l u e n tb u f f e r 稀释) 2 5 3 2 紧接步骤1 ，每孔加入d e t e c t i o na n t i b o d y 工作液5 0 1 上l ，覆膜后 室温孵育2 小时。 2 5 3 3 洗涤：弃反应液，使用w a s hb u f f e r 洗涤反应板( 每孔加液不少 于4 0 0 i - t l ) ，反复洗涤5 次。 2 5 3 4 每孔加入s t r e p t a v i d i n h r p 工作液10 0 此。覆膜后室温( 2 5 ) 反应3 0 分钟。 2 5 3 5 洗涤：同步骤3 。 2 5 3 6 显色：每孔依次加入c o l o rr e a g e n ta 和c o l o rr e a g e n tb 各5 0 1 x l 。 室温( 2 5 ) 避光显色3 0 分钟( 请勿覆膜) 。 2 5 3 7 终止：每孔加入s t o ps o l u t i o n5 0p l 终止反应( 此时蓝色立即转 黄色) 。 2 5 3 8 用酶联仪在4 5 0a m 波长下测量o d 值。 结果计算： 以标准品的浓度( p g m l ) 为横坐标，o d ( 4 5 0 ) 值为纵坐标，绘制出标 准曲线。根据样品的o d ( 4 5 0 ) 值由标准曲线计算出相应的浓度；再乘以稀 研究论文 释倍数即可得到样品中待检物质的实际浓度。 3 全部数据采用s p s s l 3 0 统计软件包进行统计，计量资料数据以均数土 标准差( x 士s ) 表示，组间差异采用单因素方差分析，两两比较采用q 检 验，p 0 0 5 有统计学意义。 结果 1 大鼠一般表现： 在c l p 后大鼠出现精神倦怠、躁动、寒战、腹胀、眼角分泌物增多、 竖毛等表现，术毕观察腹腔有脓液渗出，恶臭，盲肠肿胀变黑，发生坏疽、粘 连的认为模型复制成功。 2 t n f 0 【：i i i 组3 ht n f g t 水平即明显增高，6 h 达高峰，6 h 后较前减少； 组3 h 、6 h 、2 4 h 及4 8 ht n f 0 【水平均低于i i i 组；且两组各时间点相比有 显著性意义( p 0 0 5 ) 。i i i 组t n f 0 【明显高于与i 组和i i 组( p 0 0 5 ) 。 3 i l 6 ：i i i 组造模后3 hi l 6 水平即有明显增高，2 4 h 达高峰，2 4 h 后有所 下降；组3 h 、6 h 、2 4 h 及4 8 hi l 6 水平均低于i i i 组( p o 0 5 ) ；i i i 组i l 6 明 显高于i 组和i i 组( p o 0 5 ) 。 4 i l 1 ：i 组3 hi l 1 水平即有明显增高，2 4 h 达高峰，2 4 h 后较前减少； 组3 h 、6 h 、2 4 h 及4 8 hi l 1 水平较i i i 组明显减少( p o 0 5 ) 。i i i 组明显高于 i 组和i i 组( p o 0 5 ) 。 5 p c t ：i i i 组造模后3 hp c t 水平即有明显增高，6 h 达高峰，6 h 后较前减 少：组3 h 、6 h 、2 4 h 及4 8 hi l 1 水平较i i i 组明显减少( p o 0 5 ) 。i i i 组明显 高于i 组和i i 组( p o 0 5 ) 。 研究论文 附表 t a b l e1r e s u l t so ft n f a 、i l 一1 、i l - 6 、p c ti ne a c hg r o u p ( x i s ) 组别絮 t n f - - a ( p g m l ) i l 6 ( p g m l 。1 ) i l 1 ( p g m l 1 ) p c t ( n g 。m l 1 ) i 组 i i 组 1 4 9 7 士2 5 4 2 0 4 9 士1 3 8 1 5 13 士4 2 0 0 2 0 4 - 0 0 4 1 5 4 0 a ：1 7 1 2 2 6 1 + 3 4 2 1 6 2 6 4 - 3 2 30 3 5 士0 0 6 3 04 1 1 2 士2 0 4 * 5 0 8 8 士4 2 1 3 9 0 2 士4 3 4 1 0 3 + 0 0 9 6 06 2 9 4 + 7 0 8 6 9 3 2 士4 1 0 4 0 0 7 4 - 5 1 0 1 3 1 士0 3 l i i i 组2 4 o 4 4 0 8 + 4 41 4 # 8 4 2 5 + 4 12 * 5 2 3 6 ：1 ：3 19 * 1 0 9 0 3l 组 4 8 o2 4 5 5 “0 5 6 3 5 1 4 - 5 6 5 3 5 2 0 j ：2 3 0 * 1 0 4 士o 1 5 3 o 2 4 8 9 - 士6 9 5 3 3 2 删j 5 4 2 6 1 7 3 2 4 0 7 1 4 - 0 1 2 6 o 3 4 5 2 4 - 8 2 2 5 4 0 4 + 6 5 6 3 0 8 4 + 2 3 4 1 0 6 4 - 0 19 2 4 0 2 9 2 8 4 - 3 7 7 *6 0 9 8 士6 9 9 3 3 2 0 士1 3 0 0 7 3 4 - 0 11 4 8 02 0 6 9 士1 4 5 4 3 4 2 0 a ：5 1 3 2 4 4 8 4 - 3 2 0 0 6 9 - 3 ：0 1 5 c o m p a r e d t og r o u pi ：p 0 0 5 ：c o m p a r e dt og r o u pi i ：p 0 0 5 ；c o m p a r e d t og r o u p l i i p 0 0 5 。 1 2 研究论文 讨论 1 脓毒症模型的建立 建立标准化的脓毒症动物模型是探索脓毒症病理生理学机制和防治 措施的重要环节，在脓毒症研究领域具有举足轻重的作用。脓毒症动物 模型目前常用的有内毒素诱导、细菌注射、腹膜炎模型即盲肠结扎穿孔 模型。使用c l p 的方法使大鼠盲肠穿孔后，炎症部位是否被大网膜包裹 关系到脓毒症动物模型的成功与否，并与实验者手术方法( 如穿孔大小、 盲肠结扎程度) 和动物的种系、年龄、性别有关，人为控制存在一定困难， 但是该模型操作起来相对简便，通过外科手术而引起腹腔感染，这与临 床上化脓性阑尾炎穿孔形成的腹膜炎相似。本实验采用c l p 法复制大鼠 脓毒症模型，通过盲肠的结扎和穿孔，使有菌的肠内容物污染腹腔造成 弥漫性腹膜炎，诱发广泛的全身性炎性反应。根据术后大鼠的表现及处 死后解剖所见，符合脓毒症动物模型的基本要求【4 】，更能够反映脓毒症的 病理生理变化，因此，利用此模型进行的研究应该更具说服力，更贴近 于临床。 2 他汀类药物的抗炎作用。 他汀类药物是羟甲基戊二酸单酰辅酶a 还原酶抑制剂，他汀类药物目 前因其具有明显的降低胆固醇作用而广泛应用于临床。大量临床试验已 经证实，他汀类药物能显著降低冠心病患者的病死率【5 】。随着对他汀类药 物的深入研究，逐步了解到除了其调脂作用外，还表现出了多效性，包括 抗炎、调节细胞免疫、稳定动脉粥样硬化斑块、改善内皮细胞功能、促 进新生血管生成、提高一氧化氮( n i t r i co x i d e ，n o ) 生物活性、抗氧化应激反 应等效应