（工业催化专业论文）微胶囊固定化培养重组盘基网柄菌生产人类可溶性Fas配体.pdf

摘要 摘要 近年来，盘基网柄菌已逐渐发展成为一个重要的真核生物表达系统，用于表达需要 翻译后修饰的药用蛋白。然而，其应用严重受到低生长速度( 世代时间为8 1 2h ) 以及低 细胞密度( 1 - 2 x 1 0 7 m l d l 的影响。为有效利用盘基网柄菌这一真核表达系统生产异源蛋白 诸如人类可溶性f a s 配体，有必要实现盘基网柄菌的高密度培养。 本文以表达人类可溶性f a s 配体的重组盘基网柄菌a x 3 p l u s 为研究对象，通过液 芯羧甲基纤维素纳海藻酸钙( c m c a l g ) 生物微胶囊的固定化培养，提高其细胞密度， 进而提高目标蛋白f a s l 的产量。分别采用了半自动装置和高压静电装置制各c m c - a l g 生物微胶囊，并优化了制备条件和培养条件。此外，还研究了微胶囊化重组盘基网柄菌 在自循环流化床中的生长情况，初步实现了放大培养。 以复合培养基h l 5 c 为起点，首先考察了半自动装置制备的c m c - a l g 生物微胶 囊的各制备组分对重组盘基网柄菌生长的影响并应用该微胶囊固定化培养盘基网柄菌。 结果表明c m c a l g 生物微胶囊与重组盘基网柄菌有着良好的生物相容性；通过考察不 同组分浓度制备而成的c m c a l g 微胶囊内重组盘基网柄菌的生长情况，得到较适的制 备组分配比为c m c1 2g l 1 ，s a 8g l 一，c a c l 21 0 0g l - 1 ，制备反应温度为2 0 1 2 ，阳离 子溶液滴加速度为6m l l n i n 1 ，凝胶反应时间为1 0 1 5 m i n ，培养基与微胶囊的体积比为 1 0 ：1 ，摇床转速为1 7 0rm i n i 。在以上较适条件下制备的微胶囊内重组盘基网柄菌的生 长得到了极大的改善，最大的细胞密度比游离培养时提高了3 倍，达到8 0 3 x 1 0 7 m l 一； 相应的人类可溶性f a s 配体( f a s l ) 的表达水平也提高了1 5 倍，达到3 1 5o g l 。此外， 开展了微胶囊化重组盘基网柄菌的二次重复发酵f a s l 的研究，结果表明，最大细胞密 度可达到1 2 4 x 1 0 8m l l ，为游离培养的8 l o 倍，f a s l 仍维持高水平表达( 2 8 0l a g l 。1 ) ， 为游离培养时的2 倍。 其次，开展了高压静电装置制备c m c a l g 生物微胶囊的研究，优化了其制备条件， 为电压2 9k v ，推进速度6 0i t l l n h 一，液面距2 0i t i i t i ；考察了采用高压静电法微胶囊 化的盘基网柄菌在合成s i h 培养基中的生长情况，获得的细胞最大密度可达9 0 5 x 1 0 7 m l 一，相应的f a s l 的最大产量为3 5 4 “g l 一；在s i h h l 5 c 配比为1 ：l 的混合培养基中， 三批重复培养微胶囊化盘基网柄菌，结果过程中细胞密度和代谢产物的量不断增大，长 摘要 时间维持在较高的细胞密度有利于f a s l 等代谢产物的积累，提高目标蛋白的产量。 自行制备了循环流化床装置，优化了微胶囊化重组盘基网柄菌在自循环流化床中培 养的重要参数：通气速度为0 4l m i n 1 ，循环培养基流速为5m l m i f f l ；微胶囊化的重 组盘基网柄菌在自循环流化床和外加循环流化床间歇培养时，最大细胞密度和f a s l 的 表达量均达到较高水平，而在其连续培养过程中，囊内的细胞密度和f a s l 的表达量略 低于间歇培养时的情况。 关键词：c m c a l g 微胶囊；微囊化培养；盘基网柄菌；人类可溶性f a s 配体；高压静 电装置；循环流化床。 i v a b s t r a c t a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，t h ec e l l u l a rs l i m em o u l dd i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u mp 矽h a se m e r g e da s ap r o m i s i n ge u k a r y o t i cs y s t e mf o rt h ee x p r e s s i o no fr e c o m b i n a n tp h a r m a c e u t i c a lp r o t e i n s r e q u i t i n gp o s t - t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n s h o w e v e r , i t sa p p l i c a t i o ni ss e r i o u s l ya f f e c t e db y s l o wg r o w t hr a t e s ( d o u b l i n gt i m eo f8 1 0h ) a sw e l la sl o wm a x i m a lc e l ld e n s i t i e s ( 1 - 2 x1 0 m l 吖) i nt h ep r e s e n c eo fc o m p l e xa x e n i cm e d i u m f o rt h ep r o d u c t i o no fh i g h - v a l u e h e t e r o g e n o u sp r o t e i np r o d u c t sl i k eh u m a ns o l u b l ef a sl i g a n d ( h f a s l ) i ns u b s t a n t i a lq u a n t i t i e s ，i t w o u l d r e p r e s e n tac o n s i d e r a b l ea d v a n t a g e ，i fd d c o u l db ec u l t i v a t e da th i g hc e l ld e n s i t y i nt h i st h e s i s ，ad i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u ma x 3s t r a i l l ，a x 3 - p l u 8w a su s e df o r e x p r e s s i n gt h es o l u b l eh u m a nf a sl i g a n d a x 3 - p l u 8w a si m m o b i l i z e di nc m c - a l g b i o m i c r o c a p s u l ei no r d e rt oi m p r o v et h ep r o d u c t i o no ff a s l 而ca u t o m a t i o np r e p a r a t i o n e q u i p m e n ta n dt h ee l e c t r o s t a t i cm i c r o e n c a p s u l a t e de q u i p m e n tw e r eu s e df o rt h ep r e p a r a t i o n o fc m c - a l g m i c r o c a p s u l er e s p e c t i v e l y t h ec o n d i t i o n so fp r e p a r a t i o na n dc u l t i v a t i o nw e r e i n v e s t i g e t e d m o r e o v e r , t h ec u l t i v a t i o no fm i c r o e n c a p s u l e dd i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u mi na r e c y c l ef l u i d i z e db e dw a sa l s oi n v e s t i g a t e d s t a r t i n g 、 ，i t l lh l 5 cm e d i u m ，t h eb i o c o m p a t i b i l i t yo fd i f f e r e n tc h e m i c a lc o m p o n e n t sf o r t h ep r e p a r a t i o no fc m c - a l g m i c r o c a p s u l e st ot h eg r o w t ho fd i a y o s t e l i u md i s c o i d e u m a x 3 - p l u 8w a sf i r s te v a l u a t e d t h e nt h eg r o w t hb e h a v i o ro fd d i s c o i d e u mi nd i f f e r e n t m i c r o c a p s u l e sp r e p a r e db yu s i n gd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so ft h ec o m p o n e n t sw a sf u r t h e r e x a m i n e d c m c - a l gm i c r o c a p s u l e ss h o w e dag o o db i o c o m p a t i b i l i t y a c c o r d i n gt ot h e r e s u l t sf r o mt h ea b o v ei n v e s t i g a t i o n , o n eo p t i m a lf o r m u l a t i o nf o r t h ep r e p a r a t i o no f c m c - a l g m i c r o c a p s u l e sw a sd e v e l o p e d ，w h i c hw a sc o m p o s e do f ( g 。l 。1 ) c m c1 2 ，s o d i u m a l g i n a t e ( s a ) 8a n dc a c l 210 0 mp r e p a r a t i o nt e m p e r a t u r ew a s2 0 ，t h ed r o p p i n g v e l o c i t yo fc a t i o nl i q u i d ( m l 。m i n ) 6 ，t l l eg e l a t i o nt i m e1 0 1 5m i n , t h em a s so fm e d i u m1 0 t i m e sa sm i c r o c a p s u l e ，a n dt h er o t a t i o nr a t e17 0m i n 1 i nt h i st y p eo fc m c a l gc a p s u l e s ， t h ec e l ld e n s i t yu pt o8 0 3 10 7 m l w a sa t t a i n e d ，w h i c hw a sa b o u t5t i m e sa sm u c ha st i l a t c o u l db eo b s e r v e di ns u s p e n s i o nc u l t u r e c o r r e s p o n d e n t l y , h i g hc o n c e n t r a t i o no fs o l u b l e h u m a nf a sl i g a n d ( s h f a s l ) ( 315l a g l 。) w a sd e t e c t e di nt h em i c r o c a p s u l e s ，w h i c hw a sa b o u t 2 5t i m e sh i g h e rl o c a l l yt h a nt h a ti nt h es u s p e n s i o nc u l t u r eu n d e rt h es a m ec u l t u r ec o n d i t i o n s i na d d i t i o n , t h ei m m o b i l i z e dc e l l sc o u l db ee f f e c t i v e l yu s e df o rr e p e a t e db a t c hc u l t i v a t i o n mr e s u l t ss h o w e dt h a tv e r yh i g hc e l ld e n s i t y ( u pt o1 2 4 x10 8m l - ! ) w a so b t a i n e di nt h e v a b s t r a c t s e c o n dr e p e a t e db a t c hc u l t i v a t i o n , a n dh i g hl e v e lo ff a s l ( 2 8 0l a g 。l 1 ) w a ss t i l la c h i e v a b l e u s i n gt h ee l e c t r o s t a t i cm e t h o df o r t h ep r e p a r a t i o no fm i c r o c a p s u l e s ，t h eo p t i m a l p r e p a r a t i o nc o n d i t i o n sw e r ev o l t a g e2 9k v ，p u s hs p e e d6m i l l h ，t h ed i s t a n c ef r o ml i q u i d s u r f a c e2 0n l l n t h eg r o w t ho fm i c r o e n c a p s u l e dd i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u mp r e p a r e db y e l e c t r o s t a t i cm i c r o e n c a p s u l a t e de q u i p m e n ti ns i hm e d i u mw a si n v e s t i g a t e d t h ec e l ld e n s i t y o fu pt o9 0 5x10 7 m l w a sa t t a i n e d c o r r e s p o n d e n t l y , h i g hc o n c e n t r a t i o no fs o l u b l eh u m a n f a sl i g a n d ( s h f a s l ) ( 35 4l a g 。l q ) w a sd e t e c t e di nt h em i c r o c a p s u l e s t h eg r o w t ho f m i c r o e n c a p s u l e dd i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u mi nr e p e a t e d b a t c hc u l t i v a t i o ni nt h em i x e d m e d i u mo fs i h h l 一5 c = l ：1w a ss t u d i e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ec e l ld e n s i t ya n df a s l c o n c e n t r a t i o nw e r ei n c r e a s e dd u r i n gt h ew h o l ep r o c e s s t h er e c y c l ef l u i d i z e db e dw a sa d o p t e df o re n l a r g e dc u l t i v a t i o n t h er e l a t e dp a r a m e t e r s o fr e c y c l ef l u i d i z e db e dc u l t i v a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d ，w h i c hw e r eg a sv e l o c i t y0 4l 。r a i n - a n dr e c y c l e m i d i u mv e l o c i t y5m l m i n 1 t h eb a t c hc u l t i v a t i o no fm i c r o e n c a p s u l e d d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u mo ns e l f - r e c y c l ef l u i d i z e db e da n de x t r a - r e c y c l ef l u i d i z e db e dw a s s t u d i e d t h eh i g hm a x i m a lc e l l d e n s i t ya n dh i g hl e v e le x p r e s s i o no ff a s lw a sa t t a i n e d h o w e v e r , d u r i n gc o n t i n u o u sc u l t i v a t i o no fm i c r o e n c a p s u l e dd i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m0 1 1 r e c y c l ef l u i d i z e db e d ，t h em a x i m a lc e l ld e n s i t ya n dt h ee x p r e s s i o no ff a s lw a sl e s st h a nt h e p r o c e s so fb a t c hc u l t i v a t i o n k e y w o r d s ：c m c - a l gm i c r o c a p s u l e ；m i c r o e n c a p s u l a t e dc u l t i v a t i o n ；d i c t y o s t e l i u m d i s c o i d e u m ； s o l u b l eh u m a nf a sl i g a n d ；e l e c t r o s t a t i cm i c r o e n c a p s u l a t e de q u i p m e n t ； f l u i d i z e db e d 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利 和责任。 声明人c 签孙豸氖杰多 琊年彦月厂日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦 f - ：j c 学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸 质版和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允 许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关 数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密 的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( ) ( 请在以上相应括号内打“”) 篡撇 导师虢f 拳千 日期：力嘭年汐月i 丘厂日 日期：b 舞蝻7 日 第一章文献综述 第一章文献综述 基因技术的进步使利用重组蛋白开发和生产药物及疫苗以治疗各种疾病如癌症、肿 瘤、高血压和艾滋病成为可能。应用基因工程技术构建重组细胞并通过重组细胞生产目 标产物已成为现代生物技术中最活跃的研究方向之一，广泛应用于生产异源蛋白质及代 谢工程等领域【i l 。近年来，在悬浮培养中单细胞生长的盘基网柄菌阿米巴变形虫已发展 成为一个前景广阔的表达重组蛋白的真核表达系统【2 1 。 1 1 盘基网柄菌表达系统 盘基网柄菌( d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m ) 属于真菌界的粘菌亚界的聚粘霉纲 ( a c r a s i o m z c e t e s ) 【3 1 。1 8 6 9 年真菌学家o s k a rb r e f e l d 首次描述了盘基网柄菌【4 1 。盘基网柄 菌属d d i s c o i d e u m 由r a p e r1 9 3 5 年于n o r t hc a r o l i n a 发现嘲，在土壤中它以腐败有机物 质如树叶上的细菌为食。只要土壤中细菌充足，细胞就以单个个体的方式进行生长和分 裂。处于对数生长期的盘基网柄菌直径约为1 0 岬，它没有细胞壁，可通过伪足在固体 表面移动。盘基网柄菌有7 个染色体，每个染色体的d n a 数量只比细菌ec o i l 稍多一 些【6 i 。基因组测序初步表明盘基网柄菌与原生动物的相似性要大于与植物和真菌的相似 性川。由于盘基网柄菌具有相对简单的多细胞发育过程、容易在实验室中培养、已筛选 出突变株，以及转化技术、分离和鉴定不同细胞类型技术、生化和分子生物学技术的具 备，使盘基网柄菌一方面被广泛用作模型系统( m o d e ls y s t e m ) 研究生物医学、细胞生物 学、发育生物学( d e v e l o p m e n tb i o l o g y ) 中基础问题如细胞的信息传导、趋化性 ( c h e m o t a x i s ) 、细胞粘附、细胞分裂、细胞聚集、细胞变异、细胞骨架( c y t o s k e l e t o n ) 、胞 质分裂( c y t o k i n e s i s ) 、形态发牛_ ( m o r p h o g e n e s i s ) 等f 调，并与酿酒酵母| s ：c e r e v i s i a e 一起， 于2 0 0 0 年被n i h 选为标准微生物模型系统。 1 1 1 盘基网柄茵的( 无性_ ) 生命周期 盘基网柄菌的( 无性) 生命周期可分为两个不同的阶段，即单细胞营养生长( v e g e t a t i v e g r o w t hp h a s e ) 和多细胞发育阶段( d e v e l o p m e n tp h a s e ) 。在单细胞阶段细胞生长并通过简单 的细胞分裂而增殖，在随后的多细胞阶段则发生形态形成和分化。在单细胞阶段的单核 变形细胞被原生动物学家称为阿米巴变形虫( a m o e b a e ) 。单个的阿米巴既能通过吞噬 ( p h a g o c y t o s e ) 细菌快速生长，也能在廉价的无菌培养基( a x e n i cm e d i u m ) 上通过胞饮作用 ( p i n o c ”o s i s ) 摄取营养和繁殖1 1 。当营养物质耗尽时，进入一个从非分化的阿米巴变形 虫到分化的、多细胞阶段的无性发育周期( 图1 1 ) 。 1 辩章文献综述 g f 垒 弋= 二= 二= 1 勖 凝 割譬 图l ，l 盘基网柄菌的无性生命周期i ”i f i g1 1t h e ( a s e x u a l ) l i f ec y c l eo f ) d i s c o i d e u m ( 崮中德语s p o r e n k e i m u n g = s p o r eg e r m i n a t i o n 孢r 发芽，v e m h “g s 曲a 趾= g r o w t hp h 强e 生k 阶殷， a g g r e g a t i o n = a g g r e g a t i o n 聚集c o n u s b i l d u n g ；c o n h sf or t t l a t i o n 假台胞体形成，m i g r a t i o n s p h a s e 2 m i g r a t i o np h a s e 移动阶段，c u l m i na t i o n = c u l m i n a t i o n 顶点形成，f c h t k 6 r p e r - f r u i t i n gb o d y 子实体) 存发育周期中，1 0 0 到1 0 5 阿米巴聚集在一起形成个多细胞的塔状物。在这个过程中 环腺苷酸c a m p 作为信息物质起着十分重要的作用。c a m p 的脉冲波趋化性地调节阿米巴 的聚集”】。通过进步的分化，细胞聚集体形成肉眼可见的长为l - 2m m ，直径为o 1m m 的假合胞体f p s e u d o p l a s m o d i a ，也称s l u g ) 1 1 3 1 。这个假合咆体可定向移动。在外部条 牛刺徽 f ( 如光、p h 、湿度、温度) 假合胞体趋向于基质表面，并在基质表面移动。这个过程称 为迁移阶段( m i 掣a t i o “p h a s e ) 。迁移阶段后是形成顶点阶段( c u l m i n 撕o np h a s e ) 。在此阶段假 台胞体分化成一个子实体( f r u i t i n gb o d y ) 。子实体由高度液泡化的、死亡的茎细胞和有发芽 能j j 的孢子细胞组成。不同细胞类犁的分化由特定的细胞类型基冈诱导。不同的形态发生 i ! j 子，如由茎前体( p r e s t a l k ) 特定基因诱导表边的分化诱导因子d i f ( d i f f e r e n t i a t i o ni n d u c i n g f a c t o t ) 、c a m p 、腺苷( a d e n o s i n e l 和氨f a r n m o n i u m ) 均起若作用【1 4 - 1 7 1 。孢子包裹在个由半纤 维素、纤维素和蛋白质组成的壳中，可保藏很长时间。在适宜的环境条件下，孢子可释放 出束，发芽生成竹个的阿米巴，从而丌始新的生命估j 期。 缚圜 第一章文献综述 这个特别的( 无性) 生命周期使盘基网柄菌同时具有类似酵母和类似哺乳动物细胞的特 征，这两个特征使它具有了作为外源蛋白表达宿主的潜力。盘基网柄菌的生命周期还与分 化期间多种蛋白的调控表达有关。这种调控机制可有助于调控重组蛋白的表达【1 引。 1 1 2 盘基网柄菌表达系统的优越性 随着可靠的基因转化技术的建立，盘基网柄菌作为一个真核生物表达新系统在表达 复杂糖蛋白方面具有很多的优越性： 盘基网柄茵是一种单倍体基因组为5 x1 0 7b p 的简单真核微生物，拥有一个单胞 阿米巴变形虫营养生长和多细胞发育阶段转化的生命周期； 盘基网柄菌是少数几种拥有环状核酸质粒的真核生物之一，与高等生物的染色 质组织相似【1 9 1 ； 盘基网柄茵拥有许多与哺乳动物细胞相似的复杂特征，能进行各种翻译后修饰， 如磷酸化、酰基化，形成糖基磷脂酰肌醇锚点( g l y c o s y l p h o s p h a t i d y l i n o s i t o la n c h o r s ) ， 特别重要的是，它能进行氮和氧结合的简单和复杂的糖基化，而且其糖基化机制与高等 生物非常相似【2 瑚2 1 1 ； 作为广泛被研究的模式生物，盘基网柄菌的遗传背景较清楚并已完成了部分基 因组测序工作，并发展了不少表达载体和简单的转化技术，为这一真核表达新系统建立 提供了良好的前提条件； 盘基网柄菌质粒的高拷贝数可使蛋白质在可调节的启动子的严格控制下以胞 内、膜结合或胞外分泌的形式大量表达，并且盘基网柄菌阿米巴变形虫没有细胞壁，可 在温和的条件下快速溶解细胞瞄1 ； 在细菌或简单、廉价培养基上单细胞阶段的阿米巴变形虫能够以较快速生长和 以较高的密度悬浮培养，细胞密度可达到1 - 2 x1 0 7m l l ，易于扩大生产瞄1 。 盘基网柄菌可方便地以孢子形式在低温下保存数年，重新培养时孢子只需数小 时就可发芽活化，因此无需长期培养以维持细胞系【矧。 由于该系统表达糖蛋白具有很多优越性，且利用该系统表达动植物基因能在相当大 的程度上阐明高等真核生物乃至人类基因表达调控的基本原理以及基因编码产物结构 与功能之间的关系【2 1 ，因此，盘基网柄菌的基因工程研究不仅具有重要的科学意义，而 且在生物制药工业上具有巨大的开发潜力。 3 第一章文献综述 1 1 3 重组盘基网柄菌基因表达异源蛋白研究进展 目前利用盘基网柄菌真核表达系统已成功表达的重组蛋白有多种，主要为复杂的病 毒蛋白、寄生生物糖蛋白和人类蛋白质，如表1 1 所示。 表1 1 盘基网柄菌成功表达的重组蛋白 t a b1 1h e t e r o l o g o u sr e c o m b i n a n tp r o t e i n ss u c c e s s f u l l yp r o d u c e di nd d i s c o i d e u m 其中，2 0 0 4 年卢英华等在盘基网柄菌中分泌性表达了人类可溶性f a s 配体 3 1 】，产 率达到0 2m gl d 以上。 尽管，盘基网柄菌作为一种复杂的糖蛋白表达系统取得了巨大的进步，但仍然存在 不少重组糖蛋白的高表达机制不够清楚，以及通过重组粘菌培养工程研究以实现高密度 培养等问题。此外，低细胞密度和低生长速度( 即代时长) 也是限制该表达系统应用的一 个主要因素。 4 第一章文献综述 1 2 人f a s 配体及其功能的介绍 f a s 配体( f a sl i g a n d , f a s l ) 于1 9 9 2 年分别由德国和r 本研究人员独立发现：它是3 7k d a 的三聚体n 型跨膜蛋白f 3 2 捌，由一个胞内n 端、一个跨膜片断和一个胞外c 端组成，是一 种细胞凋亡因子，属于肿瘤坏死因子家族( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r s ，t n f ) 成员 3 2 , 3 4 。f a s l 通过 与细胞表面的f a s 受体( f a sr e c e p t o o 结合可引起f a s 表达阳性的细胞凋亡( a p o p t o s i s ) ，或称 之为程序性细胞死亡( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ) ，从而杀死病变细胞 3 5 - 3 叼。f a s l 的凋亡作用 在治疗肿瘤、a i d s 、癌症、关节炎等疾病方面有极其重要的作用：它可作为肿瘤生长的抑 制因子，并在通过诱导细胞的凋亡来保持体内环境的平衡和淋巴细胞的自身忍耐力及免疫 力的免疫调节中担当着重要的角色。f a s l 的缺失将导致淋巴增生及自身免疫疾病 3 9 - 4 。f a s l 也以可溶性形式存在，并具有生物活性，可与它的膜结合形式竞争性调节细胞的凋亡【4 2 】。 在诱导程序性细胞死亡时，三聚体形式的f a s l 先诱发三个f a s 分子预聚集形成三聚体， 之后f a s l 再与f a s 三聚体相结合【4 3 l 。随后死亡信号的传导包括两个阶段。f a s 分子胞质区 含有一段约8 0 个氨基酸序列的“死亡区域”( d e a t hd o m a i n ) 。在第一阶段，f a s 相应的细胞 效应蛋i 刍( e f f e c t o rp r o t e i n ) ，即f a s 死亡区域相关蛋白f a d d ( f a sa s s o c i a t i n gd e a t hd o m a i n ， 也称为m o r t i ) 4 4 , 4 5 】通过其c 末端的死亡区域快速结合到f a s 的死亡区域上，而其n 末端 的死亡区域又可激活e a s p a s e8 ( 半胱氨酸蛋白酶8 ) 前体，从而形成死亡诱导信号复合物 ( d e a t h - i n d u c i n gs i g n a l i n gc o m p l e x ，d i s c ) ，它包括f a s 、f a d d 和c a s p a s e8 前体。在第二 个阶段，由于f a s f a d d c a s p a s e8 前体相互作用的结果，相应的蛋白酶级联( p r o t e a s ec a s c a d e ) 被激活。c a s p a s e8 也称为f l i c e ( f a d d l i k ei n t e r l e u k i n e11 3 - c o n v e r t i n ge n y z m e ，类似f a d d 的白细胞介素ld 转换酶) ，它在信号传导链和蛋白酶水解活性之间起着连接作用。通过结 合到f a d d 上，c a s p a s e8 前体发生寡聚化，进而引起该酶的自催化反应，活性的c a s p a s e 从d i s c 中释放出。然后激活的c a s p a s e8 可催化激活其它的c a s p a s e s ( c a s p a s e 3 , - 6 ，7 等) ， 这就激发了蛋白酶水解级联反应，从而导致细胞凋亡 4 6 , 4 7 ( 图1 2 ) 。 5 第章立献综述 。黔l 卫 d 雌r 口- o f c h i d n 图1 _ 2f a s l 诱导的凋亡信号传递过程1 4 卅 f i g1 2a p o p t o f i cs i g n a lt r a n s d u c t i o ni n d u c e db yf a sl i g a n d f a s l 十要表达十活性t 淋巴细胞、n k 细胞及l a k 细胞等免疫细胞的细胞膜上l ”i ， 此外在免疫豁免组彭【( j | 【 _ 、睾丸、眼啪细胞膜上也有f a s l 的天然表达1 4 95 3 】。人f a s l | 一般用 动物细胞和人体细胞表达，山于这些细胞培养成本很高，且表达量小高，脚m 人f a s l 产品 的价格昂贵。利用擞基l 叫柄荫乍产重组人f a s l 蛋白，不仪- 】r 以更好地了解f a s l 的牛物功 能，而f l 。u 能大大降低生产戚奉，”发它在曲物治疗方面的作川。 1 3 盘基网柄菌的培养 1 31 以细菌为培养基质 在白然羿叶 盘基叫柄茼通过备噬l 壤表面的细菌摄取营养和繁趴。野生型盘丛旧柄菌 株可很容易在4 实验室中以节! ! 氏阴降细苗为营养物质，p 长。r a p e r 5 15 2 】指山箍摹嘲柄苗可利 用很多种细菌，如b w h e r i c h i ac o l i ，k l e b s i e l l ap l a n t i c o l a ，肌 i u sr u b l i l i f ，a e r o b a c t e r a e r o g e n e s 等。其t p 盅基网柄菌对某此细苗比刘其它细菌消耗得更为迅速1 f r 【彻底。他们发现 ec o i lh 不会聚集成链，可以根容易被阿水巴吞噬摄墩，盟适jl 。用j 培养盅牡网柄菌。 在含活细菌的琼脂或足液体培养基上，通常细胞密度【】r 达到1 2 x 1 0 1 m l “f 约o8 m g 干重1 ， 6 第一章文献综述 世代时间约为3 _ 4 小时1 5 3 , 5 4 1 。g e z e l i u s 5 5 l 确认盘基网柄菌也可在死细菌上生长，但速度较慢； 若在液体培养基中补充葡萄糖、凝胶、色氨酸、酵母粉和无机盐，以及降低初始p h ，经过 连续的传代培养，其生长速度及细胞浓度与在活细菌上培养相当。 1 3 2 无菌培养基 在细菌上培养盘基网柄菌有诸多不便，如收集和清洗细菌很容易染上空气中的杂菌等。 为使盘基网柄菌在细胞分化和发育研究中更好地发挥作用，有必要实现盘基网柄菌的无菌 培养。无菌培养还有另一优点，即有可能获得一些营养缺陷突变株以用于基因研究。上世 纪六七十年代各种可在非细菌培养基上生长的纯种突变株( a x 菌株) 相继被分离出。用于培 养这些突变株的无菌培养基可分为三类，即复合培养基、半合成培养基和合成培养基。复 合培养基由碳源( 葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖、果糖、蔗糖或甘露糖) 、提取物( 蛋白胨、 酵母粉、胰蛋白胨) 和用于稳定培养液p h 的磷酸盐( n a e h p 0 4 和k h 2 p 0 4 ) 组成。半合成培养 基则由提取物和已知成分组成。合成培养基由各种成分已知的化学物质组成，主要是葡萄 糖、氨基酸、维生素、无机盐、微量元素。 六十年代末和七十年代开发了以下一些复合培养基：a 培养基【瑚，c f 培养基【s 6 1 ，h l 5 培养基【5 7 - t o ，l p p 培养基【6 1 1 和h l 5 c 培养基1 6 2 1 。在复合培养基中，盘基网柄菌以世代时间 为8 1 2 h 的速度生长至1 - 2 x 1 0 7m l 。复合培养基中提取物的质量对细胞的生长最为关键 f 1 1 6 3 1 ，尤其是蛋白胨的质量。同种蛋白胨即使只是批次不同，盘基网柄菌的生长行为也会 相差很大。m a e d a 6 4 1 曾报道蛋白胨的种类对野生型n c 4 细胞的无菌生长至关重要，o x o i d 公司的细菌用蛋白胨支持n c 4 细胞的无菌生长，d i f c o 公司的细菌用蛋白胨则无此效果。 m a x i n 6 5 】报道了一种用于培养盘基网柄菌a x 3 菌株的半合成培养基，其主要成分为酵 母粉、葡萄糖、无机盐、氨基酸和维生素。在这种半合成培养基中盘基网柄菌以世代时间 1 2 1 4 h 长至1 5 x 1 0 7m l 一。m a e d a 6 4 为无菌培养盘基网柄菌野生型菌株n c - 4 设计了一种命 名为m a 的半合成培养基，由细菌用蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、磷酸盐、各种维生素、无 机盐组成。在m a 培养基中，n c - 4 细胞经过8 h 的延滞期，以世代时间为l l h 的速度生长， 稳定期细胞密度达到4 x 1 0 6m l ，而a x 2 菌株则以世代时间约8 h 的速度生长至 1 6 1 0 7 m l 一。 f r a n k e 和k e 站i l l 【6 6 1 在复合培养基h l 5 的组成的基础上发展了一种命名为f m 的合成 培养基，由氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、微量元素和链霉素硫酸盐组成，即以多种 7 第一章文献综述 氨基酸和维生素分别取代复合培养基中的蛋白胨和酵母粉。比起复合培养基h l 一5 ，在f m 培养基中盘基网柄菌株a x 2 虽然生长较为缓慢( 世代时间为1 2 1 4h ) ，但最终的细胞密度达 到2 - 3 x 1 0 7m l 。除了a x 2 菌株，a x 3 菌株也可在f m 培养基中生长良好。此合成培养基 常用于盘基网柄菌的转化以及其基因组的研究。 盘基网柄的营养需求相当复杂，尽管f r a n k e 和k e s s i n 提出了限定培养基f m ，但对生 长必需的一些成分仍很难确定。w a t t sa n dg u e s tf 6 7 j 和w a t t s 【6 8 1 曾揭示了a x 2 对维生素的生 长需求，各种维生素中叶酸被认为是粘阿米巴变形虫生长所必需的物质f 6 8 1 ，因此对盘基网 柄菌也亦然【6 6 1 。一些培养基中含有叶酸和维生素b 1 2 6 9 1 ，但也有报道不添加维生素b 1 2 时， 盘基网柄菌也可以生长【6 6 6 7 1 。此外f r i e d m a n 和c a g e n 7 0 1 发现在ec o l i 上生长良好的盘基网 柄菌不能合成维生素b 1 2 。因此维生素b 1 2 的缺少是否就是造成蛋白胨质量多变的原因尚不 清楚。 盘基网柄菌生长所必需的氨基酸，据m a r i n 6 5 】报道，为精氨酸、甘氨酸、组氨酸、异 亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸。f r a n k e 和k e s s i n 6 6 1 证实了这一结论，他们的实验结果还表明丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和酪氨酸 为非必需氨基酸，培养基中若缺少这些氨基酸，盘基网柄菌的生长速度或细胞产率没有显 著变化。他们还发现，若培养基中缺少半胱氨酸和胱氨酸，或者缺少脯氨酸和羟基脯氨酸， 生长速度和细胞产率均降低，导致最大细胞密度只有3 1 0 6m l 左右。天冬酰胺和谷氨酸 均促进细胞生长，但将天冬酰胺和谷氨酸替换为等摩尔浓度的天冬氨酸和谷氨酰胺或者葡 萄糖和氯化铵，则不能取得这种促进作用。b e n d e r 7 1 1 对此则有不同的结论，认为精氨酸、 甘氨酸是非必需氨基酸，还进一步指出除丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和酪氨酸 之外，天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、脯氨酸也属于非必需氨基酸。 1 3 3 限制细胞密度的自分泌因子 盘基网柄菌无论是在细菌上或是在复合培养基培养，悬浮液中所能获得的最大细胞密 度通常都落在l 一2 x1 0 7 m l d 范围内【7 2 1 。通常认为处于饥饿状态的盘基网柄菌产生的一些自 分泌因子限制了细胞密度。这些自