（光学专业论文）基于拉曼光谱技术的抗血管生成药物对血管与组织损伤的研究.pdf

一一 福建师范大学硕士学位论文 。- - _ l i 二二二一_ ，一 摘要 a b s t r a c t a n g i o g e n e s i si st h es i g no ft u m o rg r o w t h , a n da n t i - a n g i o g e n i cd r u g sc a l lr e d u c et h e b l o o ds u p p l yo ft u m o ra n di n h i b i ti t sg r o w t h a n t i a n g i o g e n e s i st h e r a p yh a sb e c o m ea m a j o rf i e l do fs t u d yf o rt u m o rt a r g e t e dt h e r a p y i ti sv e r yc r i t i c a lt oa c c u r a t e l ya s s e s s a n g i o g e n e s i so ri n j u r ys i t u a t i o n a tp r e s e n t , av a r i e t yo fi m a g i n gt e c h n i q u e su s e dc a l ln o t d e t e c ta n g i o g e n e s i so rb l o o dv e s s e li m p a i r e df r o mt h em o l e c u l a rl e v e l t h e r e f o r e ，l o o k i n g f o ram o l e c u l a rd e t e c t i n gm e t h o da n da p p l i n gi tt ot h er e s e a r c ho fb l o o dv e s s e lg e n e r a t i n g o rd a m a g e d ，w i l lb eg r e a ts i g n i f i c a n tt o t h ec l i n i c a lt r e a t m e n to fc a n c e r i nt h i sp a p e r , f o rt h ea b o v ep r o b l e m ，r a m a ns p e c t r o s c o p yw a sa p p l i e dt ot h es t u d yo f a n t i - a n g i o g e n i cd r u g s o nt h ev a s c u l a ri n j u r y t h en o n - s h e l lc h i c ke h o r i o a l l a n t o i c m e m b r a n e ( c a m ) w a su s e da st h ee x p e r i m e n t a lm o d e l ，a n d7 8 5n n ls e m i c o n d u c t o rl a s e r w a su s e da st h ee x c i t a t i o nl i g h ts o u r c e w ea c c e s s e da n dr e l a t i v e l ya n a l y s i s e dt h er a m a n s p e c t r ao ft h ea n t i a n g i o g e n i ed r u g sb e f o r ea n da f t e ra c t i n go nv a s c u l a ri n j u r y , a n d p r e l i m i n a r yi n v e s t i g a t e d t h e a p p l i c a t i o n o fl a s e rr a n l a ns p e c t r o s c o p yi nt u m o r a n t i - a n g i o g e n e s i st h e r a p ya n da n t i - a n g i o g e n i cm e c h a n i s m f i r s to fa l l ，t h er e s e a r c hb a c k g r o u n da n dt h es i g n i f i c a n c eo ft h es e l e c t e dt o p i cw e r e e l a b o r a t e d ，a n dt h eb a s i cp r i n c i p l eo fr a m a ns p e c t r o s c o p ya n di t sr e s e a r c hp r o g r e s si n t u m o ra n t i - a n g i o g e n e s i st h e r a p ya n da n t i a n g i o g e n i cm e c h a n i s mo fd r u ga c t i o na th o m e a n da b r o a d ，w a sb r i e f l yi n t r o d u c e d s e c o n d ，e x p e r i m e n t a lm o d e lo ft h es h e l lc h i c kc h o r i o a l l a n t o i cm e m b r a n e ( c a m ) w a s e s t a b l i s h e da n dr a m a ns p e c t r o s c o p yw a su s e dt os t u d yt h ev a s c u l a rg r o w t ho ft h ec h i c k e m b r y oc h o r i o a l l a n t o i cm e m b r a n ea n da n t i - a n g i o g e n i cd r u g so nc h i c kv a s c u l a ri n j u r y ； f i n a l l y , t h em a m a ns p e c t r ao ft h ev a r i a n tn a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m ao r g a n i z a t i o n b e f o r ea n da f t e rt h ed r u g sw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：( 1 ) r a m a ns p e c t r o s c o p yc o u l db ea p p l i e dt ot h ec h i c k c h o r i o a l l a n t o i cm e m b r a n ev e s s e l sr e s e a c h ； ( 2 ) r a m a ns p e c t r o s c o p yc o u l da n a l y z et h e m e c h a n i s mo fa n t i a n g i o g e n i cd r u g sf r o mt h em o l e c u l a rl e v e l t h i sw o u l dp r o v i d ean e w r e s e a r c hm e t h o df o rt h er e s e a r c ho fa n t i a n g i o g e n i ct h e r a p y ；( 3 ) t h en o n - s h e l le m b r y o ，i n w h i c ha l l o g e n e i ct u m o rw a sp l a n t e ds i m p l y , w a sag o o da n i m a lm o d e lo fs t u d y i n gt h e r a m a n s p e c t r ao fn a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m aw i t l la n dw i t h o md r u g sa c t i n gi nv i v o 1 1 1 、 8舢0 4 洲60舢8 iiii哪y 卜i 福建师范大学硕士学位论文 k e y w o r d s ：c l l i c kc h o r i o a l l a n t o i cm e m b r a n e ；r a m a n s p e c t r o s c o p y ；p r i n c i p a l c o m p o n e n ta n a l y s i s ：a n t i a n g i o g e n e s i s ：t h a l i d o m i d e v a s c u l a ri n j u r y ；n a s o p h a r y n g e a l c a r c i n o m am o d e l i v - 中文文摘 中文文摘 自1 9 7 1 年f o l k a m 首次提出肿瘤生长和转移具有血管依赖性的观点，为以抑制 血管生成为靶点的肿瘤治疗奠定了理论基础。近年来，抗血管生成治疗已成为肿瘤 综合治疗的研究热点。抗血管生成治疗研究是通过抑制促新生血管形成因子的作用 以及增强内源性抗新生血管形成因子的效果而实现。国内外围绕抗肿瘤血管生成的 研究主要是集中在以抑制血管外基质的降解为主要靶点、以抑制促血管生成因子为 主要靶点和以抑制促血管生成因子的细胞受体为主要靶点。目前用于评价血管生成 或损伤的方法主要是利用影像学方法，如正电子成像术( p o s i t r o ne m i s s i o n t o m o g r a p h y ，p e d ，核磁共振成像( m a g n e t i cr e s o i l ；a l c ci m a g i n g ，m r i ) ，光学多普 勒成像( o p t i c a ld o p p l e rt o m o g r a p h y ，o d t ) ，光声成像( o p t o a c o u s t i ci m a g i n g ) 等。 但这些方法尚不能从分子水平解释血管损伤的机制。而探寻一种无损、简便、可以 从分子水平上分析抗血管生成药物对血管作用的方法，将对肿瘤临床治疗具有重大 意义。 拉曼光谱是研究物质分子结构的重要手段之一，其特征峰位置、强度和线宽可 提供物质构成的分子振动、转动方面的信息，从而反映出分子中不同的化学键或官 能团。拉曼光谱是一种无损、信息非常丰富的光谱技术，可以应用于固态、溶液， 或液态的生物分子的结构分析，对样品不需进行特别的处理，可直接对生物样品， 如细胞、组织、d n a 和蛋白质等进行快速、非侵袭性的检测。拉曼光谱具有非破坏 性和精细如“指纹”的分辨能力以及不受水的干扰等优点，可给出高专一性的光谱 信息，使得在线分析，实地检测以及实时获取光谱成为可能，日益受到重视。由此 可见，拉曼光谱可以从分子水平上研究抗血管生成治疗，有望成为抗血管生成研究 的重要手段之一。 肿瘤的研究已成为国际上医学研究热点。肿瘤实验治疗的研究，无论在细胞还 是分子水平，最终都要依靠适宜的动物模型来进行。目前，人们主要利用裸鼠来进 行模型制备，但是由于裸鼠培养对设备环境要求极高，成瘤时间较长。本文选用鸡 胚绒毛尿囊膜( c h i c ke m b r y oc h o r i o a u a n t o i cm e m b r a n e ，c a m ) 模型，简称鸡胚尿囊膜 模型。鸡胚尿囊膜模型( c 触订) 是一种界乎于体内模型和体外模型之间的模型，具 有材料简便易得，操作简便，实验周期短，不需要特殊设备和结果易于观察等优点。 v 。 中文文摘 c a m 法已在肿瘤和e m s 研究中，尤其在血管形成与抗血管形成的研究中发挥着重要 作用，并且由于鸡胚的生物学特性使其日趋广泛地应用于各类研究中。所以，可通 过建立无壳鸡胚尿囊膜鼻咽癌组织模型来研究在体鼻咽癌组织的拉曼光谱。 绪论，首先介绍抗血管生成治疗的概况以及c a m 法在肿瘤和e m s 研究中的应 用，并概述了国内外用于评价血管生成的影像学方法。各种影像学的方法各有其特 点与优势，但它们都未能从本质上探查新生血管生长的分子特征，从分子水平上对 血管变化的机制做出解释。而拉曼光谱所具有的特点和优势，使它有可能成为一种 从分子水平上分析抗血管生成药物对血管作用的有效方法和工具。因此，本论文就 此问题提出利用拉曼光谱来研究抗血管药物的血管损伤以及对肿瘤的作用。 第一章，简要介绍鸡胚和鸡胚尿囊膜模型的结构，以及c a m 的制作方法和优缺 点。鸡胚是天然免疫缺陷宿主，可接受来自各种组织或物种移植而无特定或非特异 性免疫反应，可作为肿瘤侵袭、肿瘤新生血管形成和抗血管生成治疗的体内外实验 模型。当然c a m 作为实验模型也有一定的缺陷。 第二章，简要介绍拉曼光谱技术的原理、特点以及在生物组织中的应用。拉曼 光谱技术能从物质的分子振动光谱来识别和区分不同的物质结构，在生物学领域已 得到了广泛的应用。激光共焦显微拉曼光谱具有很好的空间分辨率，使拉曼散射光 谱检测的精度产生了飞跃。 第三章，基于共聚焦拉曼光谱仪设计了一套可以用于实时测量鸡胚血管拉曼光 谱的系统。本章利用该系统获取了不同日龄鸡胚尿囊膜的拉曼光谱以及鸡胚微血管 在抗血管生成药物沙利度胺作用前后的拉曼光谱，并结合主成分分析的方法对 拉曼光谱数据进行比较与分析。最后得出：不同日龄的鸡胚血管拉曼光谱具有较 好的聚类性，可被显著地区分开来。由拉曼峰归属可知7 日龄鸡胚尿囊膜血管中的蛋 白质含量达到稳定，血管发育已趋于完善。这一研究结果提示：拉曼光谱可以从分 子水平上研究鸡胚血管的生长发育；利用拉曼光谱来研究抗血管生成治疗将是种 可行的方法；抗血管生成药物作用鸡胚微血管后导致了血管内弹性蛋白、脂类及 核酸分子在结构和功能的改变。根据加药前后拉曼特征峰的变化，可以从分子水平 上分析引起鸡胚微血管损伤的可能原因，有助于我们进一步了解药物的作用机制。 拉曼光谱为研究血管损伤机制的提供了一种新方法。 第四章，基于无壳鸡胚尿囊膜鼻咽癌组织模型，研究在体鼻咽癌组织经药物作 用前后的拉曼光谱。得到如下结果：药物作用后肿瘤的拉曼光谱在有些波段强度 v i l】|jljj 中文文摘 变强，而在有些波段却变弱；位于1 6 6 0c m 1 和1 4 4 9c m 1 的拉曼峰的强度比值 1 1 6 6 0 1 1 4 4 9 可用于区分癌变组织和正常组织。药物作用后1 4 4 9c m 1 和1 6 6 0c m - 1 处的拉 曼峰强度比值1 1 6 6 0 i l “9 发生了明显的变化。没有药物作用时肿瘤的1 1 6 6 0 i i 4 4 9 小于l ， 药物作用后1 1 6 6 0 1 1 4 4 9 趋于1 。通过主成分分析( p c a ) 方法论证实验的有效性和可靠 性。p c a 的结果表明，有无药物作用的肿瘤拉曼光谱可以很好地被区别，区分度大 于9 0 。 第五章，对全文进行总结，同时展望未来拟展开的工作。 总之，基于无壳鸡胚尿囊膜模型，拉曼光谱技术可用于抗血管生成治疗以及在 体肿瘤模型的研究，从而为评价肿瘤综合治疗提供一种新的方法。 v i i il卜 目录 目录 中文摘要。i a b s t r a c t 中文文摘。 。v i i l 录 绪论1 第一章鸡胚绒毛尿囊膜模型。 第一节鸡胚结构简介。5 第二节c a m 的制作方法。7 第三节c a m 模型的优缺点。9 第四节本章小结。1 0 第二章拉曼光谱技术。1 l 第一节拉曼散射原理与特点1 1 第二节拉曼光谱在生物组织中的应用。1 3 第三节拉曼光谱仪器1 3 第四节本章小结。1 4 第三章抗血管药物对鸡胚血管损伤的拉曼光谱1 5 第一节不同胚龄鸡胚的血管拉曼光谱1 5 第二节抗血管生成。2 1 第三节鸡胚血管损伤的拉曼光谱。2 2 第四节本章小结。 第四章抗血管药物对鼻咽癌组织模型作用的拉曼光谱3 l 第一节无壳鸡胚尿囊膜肿瘤模型。3 1 第二节鼻咽癌组织模型的拉曼光谱3 2 第三节本章小结。3 8 第五章结论。3 9 参考文献4 1 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果。4 5 i x 夕o 目录 致谢 一4 7 一 个人简历。4 9 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明- 5 1 - x 柚 绪论 绪论 一、课题背景及选题意义 肿瘤是目前威胁人类健康的重大疾病之一，人们一直在寻找各种方法来预防和治疗肿瘤。 1 9 7 1 年f o l k a m 提出肿瘤转移和生长具有血管依赖性的观点，为以抑制血管生成为靶点的肿瘤 治疗奠定了理论基础【l j 。 肿瘤生长一般要经历两个阶段：非血管期、血管期。在非血管期，固体肿瘤的体积通常 小于4 r a m 3 。但由于肿瘤细胞会不断地增殖，以致肿瘤组织的p h 值改变、出现缺氧以及代谢产 物堆积的现象，从而刺激肿瘤细胞、淋巴细胞和周围间质细胞分泌促血管生长的刺激因子， 诱导内皮细胞增殖以及血管基底膜降解，形成新生血管。在血管期，肿瘤的生长速度加快， 容易发生转移。由此可见，血管生成既是肿瘤迅速增殖的前提条件，也是肿瘤生长和转移的 必要条件，对肿瘤的转移和生长有着关键的作用。大量研究证实：生长速度，未血管化的肿 瘤明显小于血管化的肿瘤。转移率，低血管密度的肿瘤也明显低于高血管密度的肿瘤；抑制 肿瘤的血管生成，可抑制肿瘤的转移和肿瘤的生长。 肿瘤要经过一个复杂的病理生理过程才能生成血管，这其中涉及到一系列精细而复杂的 细胞和分子机制，如细胞外基质的降解、细胞间基质的活化、内皮细胞向肿瘤组织内的迁移、 新生血管管腔的形成、毛细血管环的出现和血管壁的形成等，同时还会受到多种抑血管生成 因子、促血管生成因子以及相关基因的调控。肿瘤组织和损伤组织的血管生成之间既有共同 点，也存在着差异。共同点是：血管生成的起始因素都是缺氧。区别是：首先，促血管生成 因子的起源和产量不同。肿瘤组织中是由肿瘤细胞产生的，产量是无限的。而正常组织中则 是由正常组织产生的，产量是有限的。其次，血管生成的性质和功能不同。在肿瘤组织中， 血管生成是无终止的，所产生的血管内皮细胞在基因、形态、功能特性和表型上都与正常的 血管结构和血管内皮细胞不同【2 习；在正常组织中，血管生成在损伤组织完成修复，便会自动 停止，所形成的毛细血管内皮细胞和血管结构都是正常的。 抗血管生成治疗试图通过破坏和抑制肿瘤血管生成来治疗肿瘤【4 ，5 】，已成为肿瘤综合治疗 的研究热点。理论上，肿瘤的抗血管生成治疗有许多优点：首先，肿瘤的抗血管生成治疗的 靶细胞不是肿瘤细胞，而是不容易发生突变、不产生抗药性、在遗传学上是稳定的促血管生 成因子及其相关受体或肿瘤血管内皮细胞：其次，肿瘤的抗血管生成治疗药物的靶细胞是肿 瘤血管内皮细胞本身，无需通过肿瘤组织的血管内皮屏障，不必受血管内皮屏障的影响；再 者，肿瘤血管内皮细胞是制约肿瘤细胞生长的关键，杀伤少量的肿瘤血管内皮细胞，即可导 福建师范大学硕士学位论文 致大量肿瘤细胞缺血死亡；最后，由于肿瘤血管内皮细胞在基因、功能和表型上都与正常血 管内皮细胞存在显著的差异【6 ，7 ，8 】，是低分化、高增殖率的细胞，所以肿瘤的抗血管生成治疗 对肿瘤具有高选择性。因此，抗血管生成治疗的关键是寻找新的肿瘤血管特异性靶分子，这 也是肿瘤抗血管生成治疗研究的一大难点。 肿瘤的实验治疗研究，无论是在细胞水平还是分子水平上都应依靠合适的动物模型。现 在越来越多的学者已开始关注人类肿瘤动物模型的建立，其中裸鼠是主要的模型之一。但培 养裸鼠对设备环境要求极为苛刻，成瘤时间也较长。而本文所选用的鸡胚绒毛尿囊膜( c h i c k e m b r y oc h o r i o a l l a n t o i cm e m b r a n e ，c a m ) 模型具有丰富的血管网，对抗血管生成药物敏感，实 验操作简单，结果直观，是一种研究血管生成和抗血管生成的最佳体内模型【9 】，也是研究抗 血管生成药物的理想筛选模型。国内外已有很多利用c a m 方法来做实验研究。 k n i g h t o n 【1 0 】曾观察c 劁m 中种植瘤的生长及血管形成的全过程，该结果对鸡胚模型构建具 有重要的指导意义。a m i i l 【l1 】等在k r l i 曲t o n 实验的基础上，利用c a m 研究甘氨酸的作用，同时 a m i n 又用骨肉瘤o s 7 2 3 细胞构建鸡胚的异种肿瘤模型，研究抗v e g f 抗体在肿瘤治疗中的作 用机制。结果发现：甘氨酸可抑制损伤修复，抑制胚胎血管形成以及肿瘤生长；阻断肿瘤血 管形成可促进肿瘤细胞的凋亡，从而达到抑制肿瘤生长的目的。 2 1 世纪初，鸡胚子宫内膜异位症( e m s ) 模型已开始应用于相关的研究。m a a s 1 2 】等首先通 过鸡胚模型研究子宫内膜细胞的种植侵袭过程，结果提示血管形成在e m s 形成过程中可能起 到一定作用。于是m a a s 等又以c a m 作为e m s 的体内模型研究血管形成，提出抑制血管形成可 为e m s 治疗提供一种新的方法。d r e n k h a l m 1 3 1 等利用c a m e m s 模型来研究子宫内膜细胞异位种 植血管形成中血管形成蛋白l ，2 ( a n g p t l a n g p 佗) 的作用，结果表明在内膜异位的形成 中血管形成蛋白可能充当重要角色，a n g p t 2 可能是血管形成中的优势蛋白。w o l b e r 1 4 1 ，r i a t l 5 】 等分别采用不同的方法，利用c a m 研究e m s 中基质金属蛋白酶( m m p s ) 的作用。w o l b e r 的实验 结果提示：m m p 1 和m l v l p 2 在异位内膜碎片的血管形成和种植过程中可能发挥着不同作用； r i a 的实验结果发现：定位在异位内膜细胞附近的微血管会随着分期的增加，浸润深度也会明 显增加，内膜异位囊肿的m v d 计数明显高于正常内膜。 由此可见，鸡胚独特的生物学特性使其在各类的研究中都发挥着重要的作用，特别是血 管形成与抗血管形成的研究。 二、国内外的研究现状 抗血管生成已是肿瘤综合治疗的研究热点，而目前国内外主要是应用影像学的方法来评 价血管生成。下面就关几种影像学的方法作简单介绍： ( 一) m 对在实验或临床中，m r i 均是用于评价肿瘤的血管生成状态，其观测的参数包 2 f ， 口 绪论 括：组织的血容量或血浆容量、组织的灌注或血流、血管内皮对水或溶质的通透性【1 6 1 。 ( 二) c t由于静脉注射对比剂后，小分子碘对比剂会在血管内、外之间扩散，导致组 织和血管也会随着时间变化而增强，c t 增强扫描就是用于观测这种增强的情况，通过定量地 观测组织的血流、血容量、以及平均通过时间，来研究肿瘤血管生成。而定量性c t 技术可用 于测量与人类肿瘤血管生成相关的血容量、灌注量、平均通过时间和毛细血管通透性等生理 参数，但无法确定肿瘤血管生成的生理参数和c t 影像参数之间的相关性以及无法有效地评价 抗血管治疗1 1 7 l 。 ( 三) 超声基于所采用的技术手段，超声能在不同的分辨水平上识别肿瘤血管的特征 【l 引。超声主要有以下三种：普通多普勒超声，主要是用于评价直径大于l c m 以及可触及的肿 瘤血管生成研究；高频多普勒超声的分辨率有极大改善，能测量微血管血流和形态，进而揭 示出新生血管生成的独特性，但其图像在成像深度和分辨能力方面还不够完善，无法确定 1 5 2 0 1 a n 的血管位置，不能真正观察到直径低于4 0 1 t m 的血管，因此对肿瘤的临床研究也仅限 于眼球和皮肤：靶对比剂增强超声，由于能选择性地增强病变组织，有望在发现分子抗原决 定簇的基础上早期诊断肿瘤，使肿瘤在现有影像技术无法发现时即被确诊。 ( 四) p e tp e t 有两种方法用于观察肿瘤血管生成。第一种是通过测量生理和功能变化， 组织缺氧、氧代谢以及糖利用的情况，从而明确肿瘤的血管生成和代谢表型的目标。另一种” 则是通过显示新生血管细胞膜上肿瘤生长因子受体的表达或血管生成的基因表达，从而明确 启动血管生成的特定分子机制和生物途径【1 9 1 。 这些方法各有特点，但均未能从本质上探查新生血管生长的分子特征，从分子水平上对 血管变化的机制做出解释。 拉曼光谱是研究物质分子结构的重要手段之一，其特征峰位置、强度和线宽可提供构成 物质的分子振动、转动方面的信息，从而反映出分子中不同的化学键或官能团。拉曼光谱是 一种无损、信息非常丰富的光谱技术，可以应用于固态、溶液或液态的生物分子的结构分析， 并且可以直接对生物样品，比如细胞、组织、d n a 、蛋白质等进行检测，对样品不需进行特 别的处理，能提供快速、非侵袭性的检测。拉曼光谱具有非破坏性和精细如“指纹的分辨 能力以及不受水的干扰等优点，给出高专一性的光谱信息，使得在线分析，实地检测以及实 时获取光谱成为可能，日益受到重视1 2 0 。但到目前为止，国内外还未见有利用拉曼光谱来研 究血管损伤的机制。拉曼光谱所具有的特点，使它有望成为一种能从分子水平上分析抗血管 生成药物对血管作用机制的有效方法和工具。 因此，本论文基于上述问题以及拉曼光谱的特点与优势，以鸡胚尿囊膜模型为实验模型， 采用拉曼光谱来初步研究抗血管药物的血管损伤以及对肿瘤的作用。 3 。 福建师范大学硕士学位论文 三、本论文主要完成的工作 本课题依托国家自然科学基金项目( 6 0 7 7 8 0 4 6 ，6 0 9 1 0 1 0 6 0 1 6 ) ，卫生部基金项目 ( w k j 2 0 0 8 2 0 4 6 ) ，福建省科技项目( 2 0 0 8 1 0 0 1 5 ，2 0 0 8 j 0 0 1 6 ) ，福建省教育厅科技计划项目 ( j a 0 7 0 4 0 ) ，主要完成以下工作： ( 1 ) 获得不同日龄鸡胚尿囊膜血管的拉曼光谱，并结合主成分分析( p c a ) 的方法比较分 析其差异。 ( 2 ) 基于无壳鸡胚模型，利用拉曼光谱研究抗血管生成药物诱导血管损伤。 ( 3 ) 建立无壳鸡胚尿囊膜鼻咽癌组织模型。 ( 4 ) 研究在体鼻咽癌组织模型经药物作用前后的拉曼光谱，并初步分析其产生差异的原 因。 4 l i h 证 第一章鸡胚绒毛尿囊膜模型 第一章鸡胚绒毛尿囊膜模型 第一节鸡胚结构简介 鸡胚有3 套循环系统：卵黄囊血液循环、绒毛尿囊膜血液循环以及胚内血液循环；3 种 胚外膜：卵黄囊、羊膜、绒毛尿囊膜【2 。鸡胚模型示意图及实物图( 见图1 - 1 ) 。中胚层的双层 结构由尿囊膜和绒毛膜组成，并在这两层中形成丰富的血管网【2 2 】。鸡胚绒毛尿囊膜，简称鸡 胚尿囊膜( c a m ) 是胚胎外的一层透明的薄膜，是界乎于体内模型和体外模型之间的一种模 型，可用于观察单一的血管或测量血管结构在接受不同治疗之后的改变，由广泛的毛细管网 支持其功能，能进行气体交换。胚龄( e m b r y oa g e ，e a ) 五天( e a - 5 ) 的鸡胚形成鸡胚尿囊 膜( 如图1 2 ) ；e a - 7 天的鸡胚胚膜和血管网的发育已趋稳定；e a - 9 时形成典型的血管生长 因子。鸡胚在发育过程中能形成大量尿囊膜血管，可成为研究血管发生和形成的良好模型。 c a m 中血管网的发育分为2 个阶段：6 - - 一9 d 的快速生长期和随后的缓慢生长期。在后一时期 中，只有极微量的血管生长【2 3 l 。一个鸡胚最多可以孵化2 0 天，但到第1 7 天的时候，小鸡的 免疫系统功能健全，观察一般也到此结束 2 4 1 。 y i 1 1 1 i a e 阢e | i l b r 枷盼c b r 岫蛐细衄i i c 妇姗一 图1 - 1鸡胚模型示意图及无壳鸡胚实物图【2 5 1 f i g 1 - l s k e t c hm a pa n di l l u s t r a t i o no f c h i c ke m b r y o 5 福建师范大学硕士学位论文 图1 2 鸡胚生长过程图 f i g 1 - 2 t h eg r o w t h p r o c e s so f c h i c ke m b r y o 6 。1 i j 第一章鸡胚绒毛尿囊膜模型 e a 7 天，鸡胚的血管网和胚膜发育基本稳定，但机体还没建立完善的免疫系统，一般不 排斥各种异物，因此能用于观察各种抑制剂或诱导剂对血管生成的影响。e a - 11 天的鸡胚有 胸腺细胞，e a - 1 3 1 4 天的鸡胚会出现细胞介导的免疫反应，此时鸡胚免疫系统发育完善， 会明显地排斥各种异物【2 6 】。所以，若是观察药物引起的新生血管，促进血管生长的药物宜在 1 1 d 以后施用；若是抑制血管生长的药物应在7 9 d 施用为宣，否贝j j l o d 以后血管发育已趋稳定， 药物的抑制作用就不能有效发挥。 鸡胚由于其独特的生物学特性，被广泛地用于生物医学研究。c a m 除用于胚胎的发育、 致畸研究或提供有关组织、器官的研究外，由于鸡胚具有丰富的营养，且基本无菌，曾被广 泛应用于细菌、病毒培养；由于发育初期的免疫系统还不健全，可用于移植异种肿瘤，观察 其侵袭；鸡胚发育初期血管丰富，生物学特点与肿瘤血管生成类似，即毛细血管缺乏外周细 胞，内皮细胞胞浆少，基底膜物质少，线粒体丰富，生长迅速，c a m 法已广泛应用于微循 环、药物对血管生成影响、肿瘤诱发的淋巴管以及血管生成、肿瘤治疗等方面的研究，成为 药物对血管生成影响的经典体内实验之一口7 】；将肿瘤细胞接种到c a m 上，标记特异性的淋 巴内皮细胞抗原，可以研究肿瘤诱导的淋巴管生成【2 8 】。 第二节c a m 的制作方法 鸡胚尿囊膜模型有多种制作方法，主要分为无壳培养法和有壳培养法，两种方法各有其 优缺点【2 9 】。 有壳c a m 法是：孵育至e a - 8 天左右，对蛋壳磨切开窗，植入移植物，封闭窗口。优 点是：较小改变鸡胚生存的外环境，存活率较高。 其缺点是： ( 1 ) 窗口较小，难于全面、动态地观察受精卵存活情况以及植入物对鸡胚的影响： ( 2 ) 开窗前需用检卵灯判断受精卵存活情况，因此宜选用白壳种蛋； ( 3 ) 因照蛋后决定开窗位置，而蛋壳厚度、颜色等因素影响，不可能将植入物位置统一， 使观察结果及与对照比较很困难； ( 4 ) 孵育第9 天时c a m 紧贴在壳膜上，揭开壳膜时c a m 易破裂出血； ( 5 ) 会有壳渣掉落在c a m 上，产生不良刺激影响实验。 无壳培养的优点： ( 1 ) 可以通过观察心搏直接判断其存活情况； ( 2 ) 移植物植入位置可实现相对统一； 、 福建师范大学硕士学位论文 ( 3 ) 可在直视下操作，便于加药、摄影、取材； ( 4 ) 可用于胚胎发育的示教： ( 5 ) 可以清楚、动态地研究血管发生和血管新生两种类型的血管生成。 其缺点是： ( 1 ) 改变外环境，降低鸡胚的存活率； ( 2 ) 移植时有一定的破膜率； ( 3 ) 鸡胚胚胎在破壳时有时会位于卵黄侧面或下方，导致整个血管网或鸡胚胚胎被挤压 到容器壁上，增大鸡胚的死亡率。 基于以上各因素考虑，无壳培养法可以使以后的肿瘤种植，加药以及拉曼测量更为简便， 所以本文采用无壳培养法。 无壳培养法按所采用的容器可分为非培养皿法和培养皿法f 3 0 】。非培养皿的方法是通过采 用模拟鸡胚蛋壳内环境的弧型表面，以达到减小c a m 的张力；培养皿的方法比较简便，易 于操作，但在鸡胚移入培养皿时，卵黄膜会由于所承受的张力突然加剧而容易破裂，造成鸡 胚死亡；在鸡胚的生长后期，位于培养皿内的整个尿囊膜由于会随鸡胚的生长而长大，也面 临承受张力过大的问题，易于破裂导致鸡胚死亡。无壳培养法所用的移植方法主要有以下几 种： c 型钳法【3 0 1 、直接敲破法【3 1 1 、双窗法等；无壳培养法的培养条件：有时需加c 0 2 ，制 霉菌素、培养基、庆大霉素等。 本文采用非培养皿法，首先在一次性塑料杯中加约5 0 m l 的蒸馏水，以较小地改变鸡胚 的内环境，并保持一定的湿度；接着用一枚种蛋使覆盖在一次性塑料杯口的保鲜膜内陷成一 弧形表面，形成类似于鸡胚的蛋壳内环境。然后将一次性塑料杯再套入另一个塑料杯中以承 托鸡胚的重量，容器如图1 3 所示。利用自制的容器进行鸡胚培养，种蛋移植成功率约为8 5 ， 存活到e a 1 2 天的鸡胚约占7 0 一8 0 。 图1 - 3 自制的容器 f i g 1 3 t h ec o n t a i n e ru s e di nt h ee x p e r i m e n t 8 ，攀1 鬻 第一章鸡胚绒毛尿囊膜模型 根据研究表明，应采用不同的移植方法移植不同品种的种蛋 2 7 1 。本文利用直接敲击法， 移植成功率可达8 0 以上，而且若有在移植后l 2 天中出现卵黄囊裂隙的鸡胚，只要其周 围蛋清尚未混浊，可继续存活，我们仍然采用。由于本文所用鸡胚只需最多生长到1 2 天，而 大多数鸡胚可活到1 2 天以后，所以无加其它的培养条件。 第三节c a m 模型的优缺点 用于研究癌症的大多数动物模型是作为人类肿瘤细胞的异位或原位移植的免疫功能低下 的裸鼠和老鼠。鸡胚是天然免疫缺陷宿主，可接受来自各种组织或物种移植而无特定或非特 异性免疫反应，可作为肿瘤新生血管形成、肿瘤侵袭和远处脏器转移潜能的体内外实验。c a m 仍是一种模型，其必存在着一些优点与局限。 c a m 方法的优点【3 2 1 ： ( 1 ) 操作方便、快捷，且价廉又人道； ( 2 ) c a m 是一种天然的免疫缺陷宿主，可接受各种组织的移植； ( 3 ) e a 7 - - 一1 0 d 的鸡胚绒毛尿囊膜血管丰富，有利于肿瘤细胞的粘附、生长与侵袭，便于直接 观察； ( 4 ) 鸡胚可以耐受一定的温度变化，有利于检测某些对温度敏感的肿瘤细胞的生物学行为。 c a m 方法的不足【2 3 】： ( 1 ) c a m 对任何刺激都极为敏感，如蛋壳碎屑、血凝块、药物载体等，因此容易出现非特异 性炎症反应，致使非特异性血管增生： ( 2 ) c a m 本身具有丰富的血管，难以与新生血管区分； ( 3 ) c a m 为胚胎组织，其生理特点与成体有所不同，可能会影响某些药物的效果判断； ( 4 ) c a m 是非哺乳动物组织，与人体差异较大； ( 5 ) 无法评价需代谢激活的药物。在应用时要选择合适的检测条件，并与其他评价方法互相 参照。 总之，采用c a m 作为实验模型时，应充分利用其优点避免其不足的地方。 9 幡 i；0， 福建师范大学硕士学位论文 第四节本章小结 本章首先介绍了鸡胚以及鸡胚尿囊膜的结构和特点。鸡胚是天然免疫缺陷宿主，胚龄低 于l o d 的机体免疫系统尚未完全建立，对各种异物几乎不产生排斥反应。鸡胚绒毛尿囊膜模 型( c a m ) 具有丰富的血管网，可用于观察各种诱导剂或抑制剂对血管生成的影响。到目前 为止，鸡胚绒毛尿囊膜模型( c 气m ) 的制作方法主要有有壳培养和无壳培养两种。通过对两 种培养方法的比较可知，无壳培养法更有利于今后所开展的研究。c a m 法具有很多优点但 也有其不足之处，在应用时应尽量避免其不利的因素。 1 0 第二章拉曼光谱技术 第二章拉曼光谱技术 第一节拉曼散射原理与特点 当频率为v o 单色光射入介质时，可看作是具有能量h v o 的光子与物质分子相互作用，发 生非弹性碰撞和弹性碰撞。在非弹性碰撞过程中，光子的运动方向发生改变，同时与分子发 生能量交换，即光子的一部分能量传递给分子，或分子的振动和转动能量传递给光子，从而 光子的频率发生改变，这种散射过程称为拉曼散射【3 3 1 。在弹性碰撞过程中，光子的运动方向 发生改变j 但光子与分子间没有能量交换，只发生散射而不改变频率，这种散射过程称为瑞 利散射( r a y l e i g hs c a t t e r i n g ) 。 拉曼散射又可分为斯托克斯散射( s t o k e sr a m a r ls c a t t e r i n g ) 和反斯托克斯散射 ( a n t i - s t o k e sr a m a ns c a t t e r i n g ) 。对于斯托克斯( s t o k e s ) 拉曼散射，处于基态e o 的分子被 激发至受激虚态，由于受激虚态是不稳定的，分子可以跃迁到电子基态中的振动激发态e l ， 得到的能量与光子失去的能量相等( 见2 1 图) ： ae = e l - - e 0 其相对应的光子频率改变量为a v - v = ae h 斯托克斯散射光的频率为v ： 吁v o a e h ，v = v o v - 同理，反斯托克斯( a n t i s t o k e s ) 散射光的频率为v + ： v + - - - - - v 0 + ae h ，v 诎一v o 其中v 为拉曼位移，即拉曼散射光和瑞利散射光的频率之差值。斯托克斯散射通常要 比反斯托克斯散射强得多，所以实验检测到的是斯托克斯散射【3 3 1 。对于拉曼散射来说，拉曼 位移v 取决于分子振动能级的改变。而不同的化学键或基团有不同的振动能级，光子失去 的能量与分子得到的能量e 正反映了特定能级的变化，与之相对应的光子频率变化也是具 有特征性。因此根据光子频率变化，可判断出分子中所含有的化学键或基团。 1 、 福建师范大学硕士学位论文 r e e ls t a t 抽 真鳓鹭级 s t o k e sr a r f l a n r a y b i g h a n t i - s t o k e sr a m a n 撕托壳撕控曼瑞利敌射反斯托克斯拉曼 _ -_ _ j 图2 - 1 拉曼散射能级 f i g 2 - 1e n e r g y - l e v e ld i a g r a m so f r a m a ns c a t t e r i n g v 拉曼效应普遍存在于一切分子中，无论是气态，液态还是固态。拉曼光谱的特征峰位置、 强度和线宽可提供物质构成的分子振动、转动方面的信息，从而反映出分子中不同的化学键 或官能团。拉曼光谱是一种无损、信息非常丰富的光谱技术，可以应用于固态、溶液，或液 态的生物分子的结构分析，对样品不需进行特别的处理，可直接对生物样品，如细胞、组织、 d n a 和蛋白质等进行快速、非侵袭性的检测，甚至可以用拉曼光谱检测活体中的生物物质。 拉曼光谱具有非破坏性和精细如“指纹 的分辨能力以及不受水的干扰等优点，可给出高专 一性的光谱信息，使得在线分析，实地检测以及实时获取光谱成为可能。而拉曼光谱的缺点 是：会受荧光干扰。样品一旦产生荧光，拉曼光谱会被荧光所湮灭而检测不到样品的拉曼信号； 检测灵敏度低。 激光共焦显微拉曼光谱不仅具备常规拉曼光谱的优点，而且还有其独特的优势： ( 1 ) 可以使用较低功率的激光器进行激发，并且样品用量可进一步减少； ( 2 ) 具有很好的空间分辨率，样品分析时可以精确获得所照样品微区的有关化学成分、 分子结构等各种拉曼光谱信息： ( 3 ) 能有效排除来自焦平面之外的其他信号干扰，消除溶液本体信号和物镜本身所产生 的光谱对分析层信号的影响，从而具有更高的纵向分辨率 2 7 1 。 1 2 第二章拉曼光谱技术 第二节拉曼光谱在生物组织中的应用 细胞和组织是生命基本单元