（分析化学专业论文）有机聚合整体柱的合成及其在生物分析中的应用.pdf

摘要 摘要 本硕士论文分为四个部分，包括绪论、蛋白固载纳米二氧化硅的合成与表 征、杂化聚丙烯酰胺凝胶印迹整体柱合成优化条件研究、甲基丙烯酸缩水甘油 酯二甲基丙烯酸乙二醇酯( g m a e d m a ) 弱阴离子交换整体柱的合成、性能表征 与应用。 第一章为绪论部分：整体柱的研究进展。对整体柱的发展历史、不同种类 整体柱的制备方法、表征方法、特性，以及整体材料在疏水、亲水、离子交换、 亲和色谱等领域中的应用进行了综述。 第二章是蛋白固载纳米二氧化硅复合模板的合成及表征。实验以纳米二氧 化硅为固载蛋白的基质，在其表面修饰g m a ，然后采用环氧修饰( e p o x y ) 方 法，将蛋白分子固载在纳米级二氧化硅表面。分别利用紫外光谱、元素分析、 红外光谱及透射电镜表征，验证蛋白固载成功，并尝试将该复合模板应用于印 迹整体柱。 第三章是杂化聚丙烯酰胺凝胶整体柱的合成优化及色谱性质研究。实验以 丙烯酰胺为单体，以n n 亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，以l y z 为模板分子，添 加入无机纳米二氧化硅增容，优化单体和交联剂的比例，在低温下( 2 0 c ) 合成 了聚丙烯酰胺凝胶整体柱。合成的有机凝胶整体柱刚性得到改善，聚合基质均 匀，通透性好，在高达5 m l m i n 的流速下，背压仅为6 8 m p a ，并在该压力下可 以正常工作。 第四章是g m a e d m a 弱阴离子整体柱的制备、表征及应用。以g m a 为单 体，e d m a 为交联剂，环己醇和十二醇的混合溶液为致孔剂，在线修饰二乙胺， 合成了弱阴离子交换整体柱，研究了其修饰二乙胺前后的色谱填充性能差异， 包括柱渗透率和总孔率，并测定了二乙胺的修饰厚度，用该修饰柱在梯度下分 离了l y z 和o b ，分离时间仅为6 分钟。 a b s t r a c t a b s t r a c t t l l i st h e s i sc o n s i s t so ff o u rc h a p t e r s ，i n c l u d i n gt h ei n t r o d u c t i o n ，t h ep r e p a r a t i o n a n dc h a r a c t e r i z a t i o no f p r o t e i ni m m o b i l i z e ds i 0 2 ，t h es y n t h e s i sa n dc o l u m n p e r f o r m a n c er e s e a r c ho fp o l y a c r y l a m i d e ( p a a ) g e lm o n o l i t hc o l u m n ，a n dt h e s y n t h e s i s a n d c h a r a c t e r i z a t i o no f g l y c i d y lm e t h a c r y l e t e e t h y l e n eg l y c o l d i m e t h a c r y l a t e ( g m a - e d m a ) a n i o ni o n - e x c h a n g em o n o l i t hc o l u m n i nc h a p t e ro n e ，r e s e a r c ho nd e v e l o p m e n to fm o n o l i t h i cc o l u m nw a sm a i n l y s t a t e d t h eh i s t o r yo fm o n o l i t h i cc o l u m nr e s e a r c h m e t h o d sa n df e a t u r e so f p r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fm o n o l i t hc o l u m n ，a n dc o r r e s p o n d i n ga p p l i c a t i o n s i nh y d r o p h o b i c ，h y d r o p h i l i c ，i o n - e x c h a n g ea n da f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h yw e r e r e v i e w e d c h a p t e rt w oi sm a i n l yo ns y n t h e s i sa n dc h a r a c t e r i z a t i o no fp r o t e i ni m m o b i l i z e d n a n o - s i 0 2t e m p l a t e i nt h i se x p e r i m e n t ，n a n o s i 0 2w a st a k e na sm a t r i x ，g r a r e dg m a o ni t ss u r f a c e t h e l lp r o t e i nm o l e c u l ew a si m m o b i l i z e do ns u r f a c eo fn a n o s i 0 2v i a e p o x ym e t h o d i m m o b i l i z a t i o nw a sv a l i d a t e db ym e a n so fu ve l e m e n ta n a l y s i s ，i r a n dt e m s e p a r a t e l y i n c h a p t e rt h r e e ，r e s e a r c h w a sf o c u s e do n o p t i m i z i n gs y n t h e s i s a n d c h r o m a t o g r a p h yp r o p e r t yo fh y b r i dp a ag e lm o n o l i t h i nt h i se x p e r i m e n t ，t o o k a c r y l a m i d e a s m o n o m e r , n ，n - m e t h y l e n e - b i s - a c r y l a m i d e a s c r o s s l i n k ，l y z a s t e m p l a t e ，o p t i m i z e dt h er a t i oo fm o n o m e ra n dc r o s s l i n k ，a d d e dn a n o - s c a l ep a r t i c l e st o i n c r e a s et h ec o l u m nc a p a c i t y , a n dp o l y m e r i z a t i o ni n i t i a t e da tt e m p e r a t u r eo f - 2 0 c r i g i d i t yo fo r g a n i cg e lm o n o l i t hw a si m p r o v e d ，t h em o n o l i t hw a su n i f o r m ，w i t hb e t t e r p e r m e a b i l i t y , a n dt h eb a c kp r e s s u r ew a so n l y6 8m p a a ts p e e do f5 m l m i n c h a p t e rf o u ri so np r e p a r a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o na n da p p l i c a t i o no fo m a e d m a w e a ka n i o ni o n e x c h a n g em o n o l i t hc o l u m n t o o kg m a 嬲m o n o m e r , e d m aa s c r o s s l i n k ，c y c l o h e x a n o la n d1 - d o d e c a n o la sp o r o g e n , m o d i f i e dd i e t h y l a m i n ei n - s i t u ， w e a ka n i o ni o n e x c h a n g em o n o l i t hc o l u m nw a s s y n t h e s i z e d c h r o m a t o g r a p h y p e r f o r m a n c ed i f f e r e n c eb e f o r ea n da f t e rm o d i f i c a t i o nw e r es t u d i e d ，i n c l u d i n gc o l u m n p e r m e a b i l i t ya n dt o t a lp o r o s i t y , a n dt h em o d i f i e dt h i c k n e s so fd i e t h y l a m i n ew a s t t a b s t r a c t d e t e r m i n e d o ba n dl y zw e r es e p a r a t e du n d e rp r o g r e s s i v eg r a d i e n tc o n d i t i o ni no n l y 6m i n u t e s k e y w o r d s ：m o n o l i t h i cc o l u m n ；m o l e c u l a r l yi m p r i n t e d ；a n i o n - e x c h a n g e m o n o l i t h i cc o l u m n ；p r o t e i ns e p a r a t i o n i i i 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名： 趣9 红莨 一轧孓夕涎 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名： 起彘淼 一翌曼一量一翌一 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月 日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 南开大学学位论文电子版授权使用协议 ( 请将此协议书装订于论文首页) 论文 系本人在 南开大学工作和学列期间创作完成的作品，并已通过论文答辩。 本人系本作品的唯一作者( 第一作者) ，即著作权人。现本人同意将本作品收 录于“南开大学博硕士学位论文全文数据库”。本人承诺：已提交的学位论文电子 版与印刷版论文的内容致，如冈不同而引起学术声誉上的损失由本人自负。 本人完全了解g 直五太堂幽盘绾差王堡在! 焦旦堂丝诠塞的笪理壶选! 同意 南开大学图书馆在下述范围内免费使用本人作品的电子版： 本作品呈交当年，在校园网上提供论文目录检索、文摘浏览以及论文全文部分 浏览服务( 论文前1 6 页) 。公开级学位论文全文电子版于提交1 年后，在校园网上允 许读者浏览并下载全文。 注：本协议书对于“非公开学位论文”在保密期限过后同样适用。 院系所名称： 作者签名： 学号： 日期：年月日 第1 章绪论 第1 章绪论 整体柱是一种新型色谱分离介质，其为改善色谱柱的性能及拓宽制备柱的 应用范围提供了广阔的前景。本章对整体柱的发展、特点及其在生物大分子分 离中的应用进行系统综述，同时阐明这种新型色谱分离介质潜在的应用价值。 第1 节整体柱技术的研究进展 对于液相色谱而言，高的柱效和柱空间利用率一直是研究工作者们追求的 目标。对于传统的色谱填充柱，人们为了提高柱效而使用越来越小的填料。但 是就高效液相色谱而言，柱压会随着填料粒径的减小而急剧上升。1 岬的填料 虽已出现，但是采用如此小的颗粒介质，目前在技术上要受到许多限制，如填 充问题( 操作压力很大) 、死体积( 要求很小) 等，因此，目前广泛使用的仍为3 - 5 1 a m 的填料。并且根据传统色谱理论，色谱柱塔板高度与流速的比值存在一个最小 值。由于分辨率随着塔板高度的减小而增加，这样分辨率便又存在一个最大值。 对于分离大分子物质时，在最佳分辨率下，所需采用的流速往往太小，分离时 间过长，于是，分辨率和分析流速成为一对矛盾。近年来，围绕着提高色谱柱 空间利用率及色谱效应，相继开发了单分散微粒以及连续棒状填料的新技术， 呈现出良好的色谱性能。但研究及应用实践结果表明，前者存在着合成及装填 过程复杂、不同批次合成的填料重现性差、装填的色谱柱仍有至少2 6 的柱空 间未得到充分利用的弊病。相比之下，整体柱有效克服了这些缺点，并且其简 单的制备工艺和优秀的重现性使之应用前景潜力不可小觑。最近，有多篇关于 整体柱在高效液相色谱及毛细管电色谱中应用的优秀综述被发表 1 】 2 】【3 】【4 】 5 】【6 】【7 】 8 1 。 整体柱的发明和发展是自一个世纪以前茨威特发明色谱法后，色谱技术方 面的一个重大创新。这种在色谱柱管内直接进行原位聚合( i n t up o l y m e r i z a t i o n ) 或 凝聚( c o n s o l i d a t i o n ) 展p 可获得的连续、均匀且多孔的整体材料，被称作第四代色 谱填料。在整体材料表面键合上适合的官能团后，能够用于不同的色谱分离模 式【9 】 1 0 】。与传统的颗粒填料相比，整体填料具有渗透性能好、溶质在填料孔道内 的扩散及传质速率高等优点，尤其适用于生物大分子物质的快速分离分析【l l 】【l 2 1 。 第1 章绪论 整体柱的鼻祖是k u b i n 1 3 j ，他发现了整体柱可以合成相对大的通孔，实现高 柱效。1 9 6 7 年，他以高度溶胀的聚2 羟乙基甲基丙烯酸酯凝胶为基质制备了整 体柱，代替了多糖凝胶，以低压柱色谱的方式分离了蛋白质。但是这种连续的 聚合物溶胀性很大，渗透性比较差，大孔的优势在溶胀后难以体现。 1 9 8 9 年，瑞典u p p s a l a 大学生物化学系的s n j e r t e n 提出了连续床( c o n t i n u o u s b e d ) 的概念【l4 1 ，通过在空管柱中加入单体、引发剂及致孔剂的混合溶液原位( i n s i t u ) 聚合后支撑聚丙烯酰胺凝胶，得到软基质色谱连续床，并成功应用于蛋白质 及多肽的分离。但是这种填料仅在溶胀的情况下才存在大孔结构，所以不能用 于流动相极性变化太大的分离过程。1 9 9 2 年，美国康奈尔大学化学系贝克实验 室f r a n t i s e ks v e c 小组【1 2 j 制备了一种与前者类似的色谱柱，他们称之为“连续棒”， 也是由大孔聚合物制得。该连续棒用于反相色谱分离蛋白质获得了与h j e r t e n 的 连续床相似的效果，并且因为其材质为刚性聚合物，可用于各种应用，从此整 体柱材料的研究进入了飞速发展的阶段【l 5 1 。 1 1 1 整体柱的制备 总体而言，高分子整体柱中的聚集体通常用原位聚合法制备，可把配置好 的单体、致孔剂和引发剂、溶剂等混合物装入空的色谱柱，通过热引发或光引 发在色谱柱中形成棒状的整体结构。 但是，对于不同的单体，其合成方法有一些差异，一般可就无机硅胶整体 柱、有机聚合物整体柱、分子印迹整体柱和颗粒固定化整体柱四类分别研究其 制备工艺和特点。 1 1 1 1 无机硅胶整体柱的制备 硅胶整体柱的制备方法通常采用溶胶凝胶法【l 6 j 【l7 j 【l 引。将四烷氧基硅烷、聚 环氧乙烷及催化剂在柱内水解缩聚成凝胶，经干燥、老化，制成硅胶整体柱， 可直接作为固定相或进行衍生化。该方法制成的色谱填料具有双峰( b i m o d a l ) 孑k 结 构，分别为微米级的通孔和纳米级的中孔，中孔有效地增大了柱内与流动相接 触的表面积，增加传质速度，而通孔的存在使得硅胶整体柱具有优异的渗透性。 改变反应物组成的比例，可独立控制通孔和中孔的孔径。t a n a k a 1 6 j 等人研究了两 种孔的孔径及硅骨架的尺寸对分离柱效的影响。发现理论塔板高度随流速的增 2 第1 章绪论 幅较小，显示出该柱在快速分离方面的潜能，并利用该柱对多肤进行了分离。 但溶胶一凝胶法制成的连续床在干燥和老化过程中易产生开裂，这会对柱效产生 严重影响并且制各过程较为复杂。 溶胶- 凝胶法具体操作的方法是 1 ”首先在p e o p o l y ( c t h y l e n e o x i d e ) 的水溶液 中加入四甲氧基硅烷( t e t r a m e t h o x y s i l a n e ，t m o s ) 及催化剂醋酸，在0 x 2 搅拌3 0 r a i n ， 然后将此混台液加入聚碳酸酯柱管中4 0 反应2 4 小时，待反应完成后，将所得 的硅胶整体柱浸泡在氨水中以产生中孔最后经热处理除去其中的有机组分， 完成后再用硅烷化试剂反应制得反相色谱柱。 由于硅胶在老化和干燥时会收缩，因此得到的硅胶整体柱必须放入聚醚醚 酮( p e e k l 柱管中用外压使管壁与柱体紧贴，以防止产生侧壁穿漏。采用这种方 法得到的硅胶整体柱的比表面积高达3 0 0 4 0 0 i r l 2 g 。这种柱子目前己被m e r c k 公司商品化。最近，d u l a y ”等在3 6 5 n m 紫外线照射下在毛细管中单步原位合成 了多孔硅连续床，此柱表现出了反相色谱的特性，可用于低分子量中性化合物 如p a h s ，烷基苯、烷基苯基酮及类同醇的分离分析。c h e r t 口”等则在溶胶- 凝胶 法制柱的基础上键台l - 苯丙酰胺，并在配体交换模式下成功拆分了十二对丹酰 化氨基酸消旋体。 8 ”叫 9 篙：慧” 目b 尉。崮 + 冒 吟 0 图1 1 无机硅腔整体柱台成过程示意图 当 第1 章绪论 1 1 1 2 有机聚合物整体柱的制备 聚合物整体柱的制备通常是将单体混合物及致孔剂注入到空柱中，经过热 引发、自由基引发和紫外光引发在柱内聚合，然后采用合适的溶剂并用机械泵 或电渗流驱动除去致孔剂和残余的单体。 1 1 1 2 1 聚丙烯酰胺类整体柱的制备 该类整体柱采用的功能单体有丙烯酰胺，n 异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酰 胺、n 烯丙基二甲胺，交联剂则为二丙烯酰基哌嗪、n ，n - 亚甲基双丙烯酰胺。 n j e r t e n 2 2 报道了高度交联聚丙烯酰胺整体柱，但最初的制备方法复杂，其 中包括毛细管内壁的处理、两步聚合及表面键合。使用该柱在c e c 模式下分离 芳烃，分离时间长达2 0 m i n 。用二丙烯酰基哌嗪代替n ，n 亚甲基双丙烯酰胺可 克服固定相的p h 值使用范围窄和流速不能过大等弊端。一般可通过超声和选择 合适的溶剂等方法将疏水的甲基丙烯酸烷酯引入到反应体系中以增加固定相的 疏水性。 p a l m 2 3 在反应混合物中加入甲基丙烯酸十八烷酯或甲基丙烯酸丁酯，因二 者均不溶于水，经超声处理形成乳液，再将乳液装入表面处理过的柱子中聚合 而成棒状整体。 x i e 2 4 】用丙烯酰胺与甲基丙烯酸丁酯共聚合成了聚丙烯酰胺甲基丙烯酸丁 酯疏水整体柱，并成功地用于蛋白质的分离。这种聚合物的疏水性可方便的通 过改变反应液中甲基丙烯酸丁酯的含量加以控制。 f u j i m o t o 2 5 】认为该种整体柱的主要分离机理为筛分而非溶质与固定相之间 的相互作用，他采用疏水性较强的n 异丙基丙烯酰胺替代丙烯酰胺，柱性能有 所改善。聚合物凝胶作为固定相分离疏水化合物显现出一些反相色谱的机理， 同最初的聚丙烯酰胺凝胶相比，体积排阻不再是唯一的分离机理，溶质与整体 固定相的疏水作用也有助于分离。但由于聚丙烯酰胺基质刚性不够的原因，聚 丙烯酰胺类整体柱多用于毛细管电色谱整体柱的制备【2 6 】【2 7 1 。 1 1 1 2 2 聚苯乙烯类整体柱的制备 聚苯乙烯类整体柱功能单体比较单一，仅为苯乙烯、乙烯基苄氯( 氯甲基苯 4 第1 章绪论 乙烯，v b c ) ，交联剂大多为二乙烯基苯( d v b ) ，以引发剂偶氮二异丁腈( a i b n ) 为引发剂，致孔剂为正丙醇、环己醇、1 ，4 丁二醇、十二醇、甲苯中的一种或 者几种的混合。 聚苯乙烯类整体柱多采用反相色谱分离模式，s v e c 等在该领域做了很多工 作2 8 】 2 9 】，基本的操作过程是以体积比1 ：1 混合苯乙烯和二乙烯基苯，加入致孔 剂十二醇( d o d e c y l a l c o h 0 1 ) ，单体加交联剂与致孔剂的体积比为4 ：6 ，并加入 1 ( w w ) 的a i b n ，除去溶液中的空气后密封两端，在7 0 下反应2 4 小时，再 用四氢呋喃( t h f ) 除去致孔剂和未反应的单体。后来p e t r o 3 0 使用了相同的方法， 只是减少了致孔剂的用量，制备出了一种大孔的整体柱用于苯乙烯低聚物分离 的沉淀溶解色谱中。 由于聚苯乙烯表面为疏水性，没有其他活性官能团，通常情况下改性困难。 而以氯甲基苯乙烯为单体的整体柱，不仅具有聚苯乙烯整体柱的机械强度和化 学稳定性，其含有的氯甲基活性官能团更使得柱表面容易改性；且通过调节氯 甲基苯乙烯的比例，可以改变配体的键合密度。w a n g 3 1 对氯甲基苯乙烯整体柱 进行了两步修饰，先用二乙胺与氯甲基作用，再加入1 , - g l u c o n o l a c t o n e 反应，得 到了有亲水性能的整体柱。 1 1 1 2 3 聚丙烯酸酯整体柱的制备 聚丙烯酰胺或聚苯乙烯整体柱类的整体柱可选择的单体都比较有限，并且 改性的余地都不是很大，相比较而言，有更多种材料可用于合成甲基丙烯酸酯 类整体柱以获得具有不同选择性的整体柱 3 2 】 3 3 1 。聚丙烯酸酯类整体柱常用的单 体有甲基丙烯酸缩水甘油酯( g m a ) 、甲基丙烯酸丁酯( b m a ) 、2 丙烯酰胺基- 2 一 甲基丙磺酸( a m p s ) 、烯丙基缩水甘油醚( a g e ) 等，常用的交联剂为：二丙烯酰 基哌嗪( p d a ) 、n ，n 亚甲基双丙烯酰胺( b i s a a ) 、二甲基丙烯酸乙二醇酯( e d m a ) 、 异丁烯酸酯( t r i m ) 、三聚异氰尿酸三烯丙酯( t a i c ) 。引发剂通常为偶氮二异丁 腈( a i b n ) ，致孔剂为烷醇、烷烃、苯、甲苯中的一种或者混合醇，该类柱在p h = 2 1 2 范围内均具有良好的稳定性。 聚甲基丙烯酸酯类整体柱的性质因酯基部分的组成变化而不相同。若酯基 部分是烷基，则其具备了一定的疏水性，并且疏水性质是可以通过调节甲基丙 烯酸酯的比例和烷基链长来调整的。例如，l e e 在毛细管中合成聚甲基丙烯酸丁 5 第1 章绪论 酯整体柱，增加了单体b m a 的比例，获得了较强的疏水性，在反相色谱模式下， 在4 0 s 内成功的分离了4 种蛋白。 以甲基丙烯酸缩水甘油酯( g m a ) 为单体的整体柱，因其再聚合后仍含有活 泼的环氧基，可以进行二次改性修饰，将其改性为不同色谱分离形式的整体柱， 故而应用最为广泛。s v e c 3 4 】用二乙胺与聚甲基丙烯酸缩水甘油酯整体柱反应制 得弱阴离子交换柱，可用于分离蛋白质。谭天伟【3 6 】的小组里，将二乙胺及不同 分子量的聚二乙胺( p e i ) 接枝到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯类整体柱表面，使之具 有阴离子交换的能力。发现随着p e l 分子量的增大，对b s a 的动态吸附能力也 增大，证明在整体柱的表面上被修饰上更多的阴离子交换基团，接枝了p e i 的 阴离子交换柱在3 分钟内以梯度方式成功分离了3 种蛋白。邹汉法的小组在合 成的g m a t r i m 整体柱上固定了蛋白a ( 如图1 2 ) ，并用该柱检测人血清中的 h l g g ，校准曲线相关系数达到0 9 9 4 2 。 ，队尹? 玎 一二h ，嬖；0 溉t f | 嚣一品一怎：型虬n a t 嘲一锄f i 警一c 封一e h 2 t = - 溉t f l 鬟一朋一e 硅2 二斗f l x e 明 业! 1 2 = 甄瓤i 一卜p f o t e i n 坐加i 篡一翳l 卜嘲e i n 图1 2 在g m a t r i m 整体柱上固定蛋白a 过程示意图 1 1 1 3 分子印迹整体柱的制备 分子印迹技术( m o l e c u l ei m p r i n t i n gt e c h n i q u e ，m i t ) 是2 0 世纪末兴起的一项 具有高选择性分子特异识别特性的分离技术。简单的说，其过程是将模板分子、 功能单体、交联剂、引发剂、溶剂( 致孔剂) 以一定的比例混合引发，形成高分子 聚合物( m i p ) ，再将模板分子洗脱后，这样就在高分子聚合物中留下一个与模板 分子在空间结构上完全匹配，能与模板分子专一结合的三维孔穴，其过程如图 1 3 所示，其实质就是制备对客体特定分子具有特异识别孔穴的主体聚合物。 分子印迹聚合物通常使用本体聚合方法，之后需要进行研磨、筛分得到一 定粒度的颗粒，费时费力并且容易损失一些识别位点。分子印迹整体柱是在不 锈钢色谱柱中直接聚合制得棒状m p 分离介质，具有连续性和均一性。1 9 9 3 年， m a t s u i 3 刀首次连续报道了在不锈钢柱中制备分子印迹聚合物连续床( c o n t i n u o u s p o l y m e rr o d s ) ，并用这种新型m i p 整体柱分析t - - 氨基萘【”j 、茶碱【3 引、尼古丁【鲫j 、 6 第1 章绪论 e 竺各 国1 3 分子印迹过程示意蚪。 辛可纳生物碱1 等，显示出一定的分析能力。之后1 0 年内该领域并没有更大的 进展，但是近年来，有关m i p 整体柱的工作开始快速增长。z o l 4 2 讣组在中 草药成分分析和环境样品分析中应用m i p 整体柱，取得了一定的效果；后又以 l 一四氧巴马亭为模板分子制作整体柱【4 ”，以反相色谱模式对中药延胡索中的d ， l - 四氢巴马亭进行了分析。 4 颗粒固定化整体柱的制备 在毛细管电色谱整体柱制各中除有机聚合物和无机硅胶聚合物外还包括一 种特殊的整体柱形式：颗粒同定化整体柱( p a r t i c l ef i x e dm o n o l i t h i cc o l u m n ) 。它是 将传统固定相颖粒用溶胶一凝胶技术q _ 1 、烧结方法”1 【8 ”或利用有机聚合 物聚合”使其固载到毛细管内形成颗粒同定化整体柱。此方法制备得到的整体 柱同样具有粜合物型整体柱无塞子的优点，在电色谱中得到了较广泛的应用。 烧结法无塞电色普整体柱( p a r t i c l e - s i n t c r e dm o n o l i t h i cc o l u m n ) e ”1 是将色谱用硅 胶微球固定相装入毛细管柱，然后经过n a h c o ，及丙酮冲洗，氮气吹干处理， 最后在高温下加热使硅球熔结在一起。此法的缺点是硅固定相表面在颗粒加热 烧结过程中遭到破坏，需对其进行重新硅烷化处理，操作步骤太多、耗时。 溶胶- 凝胶法是在传统溶胶一凝胶混合液中加入待填充的电色谱固定相颗粒， 形成含有此颗粒的悬浮溶液然后将其充入毛细管中，在经过干燥处理后，颗 粒固定相将通过硅氧键紧密结合在一起，形成无塞子电色谱整体柱m “。但是这 第1 章绪论 种柱子和填充柱相比柱效较低，这可能是由聚合的不均匀造成一些固定相颗粒 被包结所引起。 另外一种固定化方法( p a r t i c l e e 1 1 t r a p p e dm o n o l i t h i cc o l u m n ) 4 7 4 8 1 1 4 9 1 是先将填 料装入毛细管内，干燥处理后，再将溶胶一凝胶溶液或者聚合物单体溶液充入管 内，聚合后形成整体柱。溶胶凝胶法制得的整体柱不仅不需塞子来固定颗粒填 料，而且还可避免颗粒填充时在柱内形成空隙。但是，这些方法都会不可避免 地使固定相表面受到影响，降低其表面性能。 1 1 2 聚合物整体柱的表面二次修饰 近年来，新型的聚合物整体柱开始采用表面接枝的方法来适应不同的分离 模式，整体柱材料多用于反相色谱、疏水色谱、离子交换色谱和亲和色谱等模 式，多种模式的作用机理不同决定于整体柱的表面化学和物理性质不同。为使 得整体柱材料具备上述功能，合成整体柱通常要经过二次修饰进行表面改性， 改性的方法一般涉及水解、缩合和氧化还原等一系列化学反应。 整体柱材料的孔结构主要应满足两个条件：一是足够多的大孔使流动相传 质阻力减小，柱压降低；另一个是要有足够大的表面积和足够多的功能基团来 满足后续的化学修饰以适应多种不同色谱分离模式。s v e c 等【5 0 】和t a n a k a 等【5 l 】【5 2 j 通过改变和寻找合适的单体、交联剂、致孔剂，选择合适的比例与条件来改善 材料的孔结构，得到了大的孔隙率以达到降低柱压的目的，同时又有很大的表 面积。但是，过大的表面积又引起了渗透性能的降低。因此，人们希望能够通 过在表面接枝聚合物长链来增加官能团的密度，增大孔容量；而接技的聚合物 链在孔中会像“触角 一样通过改变构象与溶质产生最有效的作用，提高柱容 量，同时也不会影响渗透性。 这类接技反应常用的引发方法主要有c e i v 5 3 引发、光引发阱】、氧化还原 引剔5 5 】【5 6 】【5 7 1 等。s a v i n a 等网用k 5 c u ( h 1 0 6 ) 2 作为氧化还原引发剂在聚丙烯酰胺 水凝胶( p a a ) 上通过自由基聚合接枝甲基丙烯酸二甲氨基乙酯( d a e a ) 构成阴离 子交换色谱柱，接枝率可以达到1 1 0 。进一步的实验表明，牛血清白蛋白( b s a ) 的键合容量与接枝过程有关，先用引发剂产生自由基而后接枝的两步反应【5 刨会 产生长链，能够更有效地与b s a 结合。同样，应用这种类型的整体柱可快速地 从细菌的酶解液中捕获脱氧核糖核酸( d n a ) 质粒体【5 。另外，他们【5 驯还在p a a 8 第1 章绪论 水凝胶上接枝丙烯酸构建成阳离子交换柱，接枝后的p a a 凝胶对p h 敏感，而 且当接枝率从6 0 升高到7 0 的时候，溶菌酶的结合容量提高了3 倍。这可能 是由于蛋白质像触角一样与接枝后的凝胶相互结合，增加了可结合位点的数量。 v i k l u n d 掣5 9 】在聚苯乙烯二乙烯基苯柱体上用2 ，2 ，6 ，6 四甲基哌啶氮氧自由 基( t e m p o ) i j i 发稳定的自由基聚合反应，接枝上甲基丙烯酸羟乙酯( h e m a ) 亲水 基质，增加了其表面极性。而接枝a m p s 后，整体柱由原来的的疏水介质变为 强阳离子极性的亲水介质。用其分析了3 种蛋白质，所得峰形很尖锐。但同时 由于接枝使孔容减小了1 1 5 ，这就需要原基质要有良好的通透性。另外，t r i p p 【6 u j 发现，通过增加交联剂d v b 的含量，可使聚合物溶胀相应减小，从而不至于堵 塞孔，使其仍有良好的通透性。 在传统球形聚合物介质上的一些接枝和修饰工作也为整体介质的改性提供 了有价值的思路。例如，u n s a l 等【6 l j 以单分散微球g m a e d m a 为基质，将3 一( 三 甲氧基硅烷) 丙基丙烯酸酯( t m s p m ) 配基接到聚合物表面，引入双键后引发自由 基聚合，分别接枝了a m p s 、甲基丙烯酸、n ，n 一二甲氨基乙酯( d m a e m ) 和甲 基丙烯酰胺丙基二甲基胺( d m a p m ) ，得到强阳离子和弱阴离子交换柱，并用来 分离4 种标准蛋白质。t m s p m 在反应过程中起到了间隔臂的作用，减小了溶质 与配基的空间位阻，使二者相互作用更加直接。但由于其反应效率不高，影响 了后续的接枝效率。虽然通过自由基聚合的接枝能够达到很好的分离效果，但 由于其反应的不可控性，导致接枝的内部结构不均匀而影响分离。为了解决这 一问题，他们 6 2 采用了原子转移自由基聚合( a t r p ) 技术，通过对接枝单体含量 和反应时间的考察，在柱体表面接枝了一部分链长可控的聚合物长链甲基丙烯 酸磺酸丙酯( s u l f o p r o p y lm e t h a c r y l a t e ，s p m ) ，使表面呈现阳离子交换的性质，对 蛋白质的分离性能得到改善。这些基于单分散微球的表面改性工作，同样可以 引入到整体型有机聚合物基质的表面接枝和修饰中。 1 1 3 整体柱的表征 整体柱材料的表征主要分为孔的物理结构表征和色谱性表征能两部分，整 体柱的结构表征主要有扫描电子显微镜( s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ) 、压汞法 ( m e r c u r yi n t r u s i o np o r o s i m e t r y ) 和等温氮气吸附法( n i t r o g e na d s o r p t i o ni s o t h e r m ) ， 色谱填充性能通常用柱总孔率( t o t a lp o r o s i t y ) 、柱压力降( p r e s s u r ed r o p ) 弄f l 柱渗透 9 第1 章绪论 率( c o l u m np e r m e a b i l i t y ) 表示。 g u s e v 等【6 3 】用了三种方法测定溶剂化态的整体柱的孑l 隙度。第一种方法利用 在g - h p l c 模式下不保留小分子的洗脱时间计算孔隙度，第二种方法则利用导电 率比，分别将整体柱与空柱充满电解质测量各自的导电率，最后一种为重量分 析法，由干燥状态和充满丙酮色谱柱的重量计算得到孔隙度。 1 9 8 9 年h j e r t e n 掣1 4 】在空柱管内利用n n 亚甲基丙烯酰胺为交联剂，丙烯 酸为单体聚合，首次合成了用于阳离子交换层析的凝胶型整体柱，有较高分辨 率，但凝胶型连续床不具有永久性的孔结构，应用范围及使用寿命有限。1 9 9 2 年s v e c 等【1 2 】以有机溶剂为致孔剂，利用单体、交联剂和引发剂在空柱管内聚合， 制备了永久性结构的大孔型整体柱。这种整体柱为高度交联的、坚硬的聚合物 单块，由球形束和束间不规则的孔组成，完全充满柱管空间。形成聚合物主体 的球形束尺寸在1 0 3 0 n m ，由高度交联的、致密的核以及围绕核的一层低交联的 聚合物链组成。束间的孔相互贯通，可以通过流动相。孔尺寸与反应物的组成 有关，主要受交联剂百分比、致孔剂类型和含量以及引发剂浓度等因素的影响。 大孔型连续床的孔呈双峰分布。例如s v e c 等【3 5 】所制g m a e d m a 整体柱中的孔 主要为1 0 0 0 n m 以上的大孔( 占总体积的7 5 以上) 和5 0 n m 以下的小孔组成，流 动相以对流方式通过大孔，消除了内扩散阻力，因而具有极好的通透性，传质 速率高。张敏莲畔】等还考察了流速与背压的关系、流速对理论板当量高度的影 响，发现在流速为3 6 0 1 8 0 0 c m h 范围内，整体柱的流速与背压呈线性关系，理 论塔板高度基本不变。连续床具有大量不规则的无孔渠道，粗糙的渠道内表面 提高了蛋白质的吸附容量，张敏莲等利用等温氮气吸附法测得聚 ( g m a d v b t a l c ) 型整体柱的比表面积为2 2 6 5 m 2 g ，利用在整体柱中不发生吸 附的溶菌酶测得该柱的孔度为6 5 。s v e c 进一步用前沿分析法以鸡卵清蛋白测 得该聚g m a e d m a 整体柱的动力学负载量为4 0 0 m g g 。卫引茂【6 5 j 以溶菌酶测 得所制聚g m a e d m a 型弱阳离子交换柱的动力学负载量为7 1 l m g g 。在逐渐 增大进样量时，蛋白质在柱上保留时间基本未变，也是表明整体柱具有较大的 柱负载量的一个特征。 m i l a v e c 等【6 6 】研究了整体柱上蛋白质梯度色谱下的物质传输，认为 y l i l l 锄o t o 【6 7 】关于不同尺寸色谱柱上梯度模式下物质传输理论仍可以很好地在离 子交换整体柱上应用。g r i t t i 等【6 8 】利用甲基苯甲酸盐在反相整体柱上通过平台微 扰法研究了整体柱上的物质传输动力学。h a h n 等【6 9 】提出了判断整体柱整体性的 1 0 第1 章绪论 非破坏性的方法：在假设其它条件均正常的条件下，通过观察色谱柱的突破曲 线( b r e a k t h r o u g hc u r v e ，b t c ) 是否背离正常s 形曲线，来判断色谱柱的整体性。 m i h e l i c 7 0 等在离子交换柱上考察了温度对整体柱负载蛋白质能力的影响，发现 随着温度升高，柱负载能力升高；但当温度升高到2 0 以后，柱负载量反而随 温度升高而下降。g h o s e 7 l 】在离子交换色谱固定相上介绍了描述和模拟预分离的 方法学，讨论了在该固定相上盐浓度的增加在顶替色谱中对模拟的蛋白质混合 物的顶替分离能力的影响，证明在顶替色谱中盐浓度是非常重要的变量。席琛 等 _ 7 2 】以推导改进的l a n g m u i r 模型过程中的总热力学平衡常数的表达式为基础， 考察了卵清蛋白在疏水作用整体柱上的吸附行为，发现蛋白在保留情况下能很 好地符合l a n g m u i r 模型，且其吸附量的对数与流动相中置换剂的浓度之间呈线 性关系。 第2 节整体柱的特性及优缺点 整体柱内部孔结构是由大孔和微孔两种孔互相联结而成的网状结构。大孔 又称为通孔，孔径大于5 0 r l r n ，大孔网络占总空隙率的约8 0 2 9 】【7 3 】【1 9 】【7 4 】【7 5 1 。密 集的大孔网络使整体柱具有很高的空隙率，为流动相流经色谱柱提供了通道并 且保证了样品分子能够到达中孔及微孔网络。整体柱的高空隙率配合相对较大 的平均孔径使之具有很高的渗透性7 4 】【7 5 】【7 6 】 7 7 】。中孔占总空隙率的1 0 1 5 ，它们 的孔径一般在5 0 n m 左右，整体柱的活性表面主要是由微孔网构成的，但微孔( 孔 径小于2 n m ) 对孔隙率也即渗透性的贡献非常小，因此，要兼顾柱压低和柱表面 积大两方面，就要求在微孔和中孔范围内的孔尽可能多，t e n n i k o v 等【7 副研究了 孔结构对柱效的影响( 经过二乙胺修饰的2 m m 厚的聚丙烯酸酯类整体盘) 。表明 孔径以大于1 0 0 0 n m 的大孔为主的整体柱分离效果并不好，因为蛋白质在柱体中 保留时间太短。分离效果比较好的整体柱，孔径大小以7 0 0 n m 为主，可以实现 在高流速及梯度条件下的高分离度，且分离时间显著减少。 整体柱实质上是吸取了无孔填料和膜的快速分离能力，以及h p l c 多孔填 料的高容量，又没有增加柱阻力这两方面的优点而发展出的一个很有意义的新 产物。综合起来，整体柱具有以下几个优点： ( 1 ) 整个床层高度均匀，分辨率高，不存在粒子间空隙体积，没有颗粒粒度 大小不均匀或填充不均匀造成的峰展宽。 第1 章绪论 ( 2 ) 可在高流速下操作。连续床具有大量不规则的无孔渠道，粗糙的渠道内 表面提高了蛋白质的吸附容量，再加上消除了内扩散阻力，所以即使在高流速 下仍能达到很高的动态吸附容量，明显优于目前常用的s e p h a r o s ef a s tf l o w ，并 且解决了传统柱层析中理论等板高度与流速之间的矛盾。 ( 3 ) 制备成本低。可直接在层析柱内交联，省去了复杂的传统颗粒制备工艺 及层析柱填充工艺。同时，降低了有机溶剂的消耗，实现了在水溶液中的进行。 ( 4 ) 使用寿命长，稳定性好。由于整个床层结构均匀，即使使用一年以上仍 可保持很高的分辨率和可重复性。既可用于蛋白质的分离制备，又可用于生化 分析。 ( 5 ) 简化了介质的衍生。传统色谱介质通常分两步合成，首先是颗粒介质的 制备，然后与配基固定衍生。而连续床介质的合成和衍生是一步完成，如在一 种阳离子交换剂的制备中，就是直接将丙烯酸加入到含有丙烯酞胺、交联剂和 盐的水溶液中来完成的。 ( 6 ) 分辨率、吸附容量、流速( 给定压力下的运行时间) 都可通过改变制备过 程中单体溶液的组成来调节。 尽管整体固定相具有优异的性能，但它也存在一些缺点。对于聚合物整体 柱，其溶胀效应使固定相的稳定性和机械性能受到负面影响【8 3 】。此外，在制备 聚合物整体固定相时，由于聚合是放热效应，很难获得孔径分布非常均一的连 续床，从而影响柱效和色谱峰对称性，因此小分子化合物很难得到较高的柱效【州。 与传统的填料相比，聚合物的比表面积较小，从而导致其柱容量较低，这主