（果树学专业论文）中国李‘nubiana’离体培养与再生研究.pdf

l l i l tl ll il t i ii ii i it li ii y 1812 5 5 5 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是如需保密，解密时间2 0 0 8 年1 2 月3 0 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 始裴竹 帆矽7 年莎川日 糊黼她摸索晦删名：彦峨y 肜 签名日期：p 一年6 月，6 日签名日期：& o 哆年占月f 易日 a l l a 离体培养与再生体系建立的研究 目录 a b s t r a c t 2 缩略词表3 l 前言4 1 1 问题的提出4 1 2 文献综述4 1 2 1 茎尖培养4 1 2 1 1 茎尖、茎段在核果类果树组织培养中的应用一5 1 2 1 2 影响茎尖培养的冈子一5 1 2 2 胚培养6 1 2 2 1 胚培养在核果类果树组织培养中的应用一7 1 2 2 2 影响胚培养的因子一7 1 2 3 叶片培养8 1 2 3 1 叶片培养在核果类果树组织培养中的应用。9 1 2 3 2 影响叶片培养的因子。9 1 2 4 原生质体培养10 1 2 4 1 原生质体培养在核果类果树组织培养中的应用。1 0 1 2 4 2 影响原生质体培养的因子。l l 1 2 5 其他培养方式12 1 2 6 核果类果树组织培养存在的问题及解决方法1 2 1 2 6 1 物种的局限性。12 1 2 6 2 外植体褐化。l3 1 。2 6 3 外植体污染。13 1 2 6 4 玻璃化苗1 4 1 3 研究目的及意义1 4 2 材料与方法15 2 1 n u b i a n a 李茎段离体培养1 5 2 1 1 试验材料15 2 1 2 试验方法1 5 2 1 3 初代培养培养基的筛选15 2 1 4 无菌苗增殖1 6 华中农业大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 2 2n u b i a n a 李叶片愈伤组织诱导 2 2 1植物生长调节剂对叶片愈伤组织诱导的影响 2 2 2 基本培养基对叶片愈伤组织诱导的影响。 2 2 3 柠檬酸对叶片愈伤组织诱导的影响 2 2 4 碳源对叶片愈伤组织诱导的影响 2 2 5 葡萄糖浓度对叶片愈伤组织诱导的影响。 2 2 6 不同抗氧化剂或抑制剂对愈伤组织生长的影响 2 3 叶柄再生不定芽 2 4 生根培养 2 4 1 生长素浓度的试验 2 4 2 基本培养基的筛选 2 4 3 碳源的筛选 2 5 炼苗与移栽 2 6 培养条件 2 7 试验观察结果及数据统计方法 2 7 1 继代和增殖 2 7 2 叶片愈伤组织诱导 2 7 3 生根培养 2 7 4 统计分析 3 结果与分析 3 1n u b i a n a 李茎段的离体培养。 3 1 1 基本培养基和植物生物调节剂对初代培养的综合影响 3 1 2 腺嘌呤对增殖的影响2 l 3 2n u b i a n a 李叶片愈伤组织的诱导2 1 3 2 1 植物生长调节剂对叶片愈伤组织诱导的影响2 1 3 2 22 ，4 d 对叶片愈伤组织诱导的影响2 2 3 2 3 基本培养基对叶片愈伤组织诱导的影响2 3 3 2 4 柠檬酸对叶片愈伤组织诱导的影响2 3 3 2 5 碳源对叶片愈伤组织诱导的影响2 4 3 2 6 葡萄糖浓度对叶片愈伤组织诱导及继代的影响2 5 3 2 7 不同抗氧化剂或抑制剂对愈伤组织生长的影响2 5 3 3 叶片( 柄) 再生不定芽2 6 3 4 生根培养2 7 3 4 1i b a 浓度对生根的影响2 7 3 4 2 基本培养基对生根的影响2 7 中国李n u b i a n a 离体培养与再生体系建立的研究 3 4 3 碳源对生根的影响2 8 3 5 炼苗与移栽2 8 4 讨论与小结3 0 4 1 讨论3 0 4 1 1 关于n u b i a n a 李茎段的离体培养3 0 4 1 2 关于n u b i a n a 李叶片愈伤组织的诱导。3 0 4 1 3 关于n u b i a n a 李叶柄不定芽的再生。3 1 4 1 4 关于今后研究的一点建议3 2 4 2 小结3 2 参考文献3 3 图版和图舨说明3 9 翌| 谢4 4 附录i q 5 附录课题资助项目4 6 附录i 硕士期间已发表和已接受论文4 6 1 1 1 离体培养与再生体系建立的研究 a 离体培养与再生研究 摘要 本研究以中国李( p r u u ss a l i c i n al i n d l ) 品种n u b i a n a 为材料，以茎尖和茎段为外 植体建立了快速繁育体系，探讨了最佳增殖培养基配方、影响生根的因素；以n u b i a n a 无菌苗叶片为材料，研究了植物生长调节剂种类及其浓度组合、培养基类型和碳源 等因素对愈伤组织诱导率的影响，以及初步探索叶柄再生途经。主要研究结果如下： 1 以n u b i a n a 李茎段或茎尖为试材，通过对试管苗增殖倍数，平均株分化芽数 分析表明，n u b i a n a 李的最适宜的初代培养基及其植物生长调节剂组合是：l p + 6 b a 0 4m g l + i b ao 0 8m g l ；并探讨了腺嘌呤( a d ) 对无菌苗增殖的影响，筛选出1 5 2 0m g l 的a d 对无菌苗的增殖有较好的效果。 2 从i b a 的浓度、基本培养基与碳源三个方面探讨了对无菌苗生根的影响， 结果表明，适宜的培养基配方是：1 2w p m + i b a0 5m g l + g l u1 5g l 。暗培养放置 7d 后转移到光下培养，能达到较好的效果。 3 从生长调节剂组合，基本培养基，不同的碳源及不同浓度的葡萄糖等几个方 面探讨了对n u b i a n a 李叶片愈伤组织诱导影响，筛选出最适宜诱导愈伤组织的培养 基配方是：w p m + 6 b a0 5m g l + 2 ，4 一d2 0m g l + g l u3 0 - - - 5 0g l ； 柠檬酸( c a ) 对无菌苗叶片愈伤组织诱导影响研究中，筛选出0 0 7 5 , - - , 0 i c a 对诱导叶片愈伤组织有显著的促进作用，最高达1 0 0 的出愈率； 通过对c a 与抗褐变剂( 包括聚乙烯吡咯烷酮、植酸，维生素c ) 效果的比较， 得出0 i l c a 抗褐变效果最好，且愈伤组织的增殖培数最多，外观颜色鲜艳。 4 通过对离体叶柄再生不定芽的研究，基本确定n u b i a n a 李叶柄再生不定芽较 适宜的培养基及其植物生长调节剂组合是：w p m + 6 b a2 0m g l + n a a0 5m g l 。在 叶柄处有少量的不定芽的产生，再生频率约为3 3 。 关键词：n u b a i n a 李；离体培养；再生 m u l t i p l i c a t i o n , t h eo p t i m a lm e d i u mw a sl p + 6 一b a 0 4m g l + i b ao 0 8m g l ；a n dt h r o u g h a n a l y s i so ft h ee f f e c to fa dc o n c e n t r a t i o n so ne x p l a n t sm u l t i p l i c a t i o na n dg r o w t h ，t h e o p t i m a lc o n c e n t r a t i o no f a dw a s1 5 2 0m g l s e c o n d l y ，t h r o u g ha n a l y s i so ft h ee f f e c to ft h ei b ac o n c e n t r a t i o n ，d i f f e r e n tb a s a l m e d i u ma n dc a r b o n so ns h o o tr o o t i n g ，t h eb e s tr o o t i n gm e d i u mw a s1 2w p m + i b a0 5 m e l + g l u c o s e15g l i tw a sb e t t e rt op l a c et h e mi nd a r k n e s sf o r7db e f o r et r a n s f e r i n gt o w h i t el i g h t t h i r d l y , t h ee f f e c t sp l a n tg r o w t hr e g u l a t o r sa n dt h e i rc o m b i n a t i o n ，b a s a lm e d i u m ， d i f f e r e n tc a r b o n sa n do t h e rf a c t o r so nc a l l u si n d u c t i o no f n u b i a n a l e a v e sw e r es t u d i e di n o r d e rt oe s t a b l i s ht h eo p t i m u mc o n d i t i o no fi n d u c i n ga n dg r o w t ho fc a l l u s t h er e s u l t s s h o w e dt h a t ：w p m + b a0 5m g l + 2 , 4 一d2 0m g l + g l u c o s e3 0 - 5 0g lw a st h eb e s t m e d i u mf o rt h ei n d u c i n ga n ds u b c u l t u r eo fc a l l u s ；o 0 7 5 - - 0 1 c i t r i ca c i dh a dr e m a r k a b l e r e s u l t so fi n d u c i n gc a l l u s ，t h ei n d u c t i v i t yr e a c h e d10 0 ，0 i c as h o w e dt h eb e s tr e s u l t i nc o n t r o l l i n gt h eb r o w n i n gc a l l u s ，c o m p a r e d 诵mo t h e rb r o w n i n g r e s i s t a n tm a t e r i a l s a tl a s t ，a d v e n t i t i o u sb u dw a sr e g e n e r a t e df r o mp e t i o l eo f n u b i a n a f o rt h ef i r s tt i m e ， a n dt h er e g e n e r a t i o n 仔e q u e n c yw a s3 3 o nw p m + 6 一b a2 0m g l + n a a0 5m g l k e yw o r d s ：n u b i a n a p l u m ( e r u n u ss a l i c i n al i n d l ) ；nv i t r oc u l t u r e ；r e g e n e r a t i o n 2 6 b a a c a d c a g a 3 i a a i b a k t l p l u x m s n a a p v p v c t d z 6 - b e n z y l a d e n i n e a c t i v a t e dc h a r c o l a d e n i n e c i t r i ca c i d g i b e r e l l i ca c i d i n d o l e 3 a c e t i ca c i d l n d o l e 一3 - b u t y r i ca c i d k i n e t i n l e p o i v e r , 19 7 7 i l l u m i n a n c e m u r a s h i g ea n ds k o o g ，19 6 2 a - n a p h t h y a l e n ea c e t i ca c i d p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e v i t a m i n e c t h i d i a z u r o n 6 苄基腺嘌呤 活性炭 腺嘌呤 柠檬酸 赤霉酸 3 - n ；l 哚乙酸 吲哚丁酸 激动素 l p 培养基 米一烛光 m s 培养基 奈乙酸 聚乙烯吡咯烷酮 维生素c 苯基噻二唑基脲 ； w p m w o o d y p l a n tm e d i a ，19 8 2木本植物培养基 3 华中农业大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 1 前言 1 1问题的提出 李( p r u n u s ) 是我国栽培历史悠久的果树之一，有着丰富的种质资源，据考证 共有8 0 0 多个品种和类型，值得推广的优良鲜食品种就有几十个，其作用除了作为 鲜食外，李还是食品加工、药用、油用和出口的重要原料( 李玉琴，2 0 0 6 ) 。李具有 多种优良的抗病、抗寒、抗旱等野生基因类型，可为我国将来李杂交育种和基因工 程育种提供丰富的基因种类。李可进行分株和实生苗繁殖，但李实生后代具有普遍 的性状分离和遗传变异现象。其品种的推广和其他果树一样以嫁接为主，也可扦插 繁殖( 李玉琴，2 0 0 6 ) 。这些方法不仅繁殖系数低，影响优良品种的引种和推广，而 且长期的营养繁殖会引起品种种质退化，以及病毒、类菌原质体病毒的寄生蔓延， 使生产遭受严重的经济损失。李传统育种周期长、工作量大，如何缩短李的育种时 间和提高育种效率是李育种工作者长期追求的目标( 吴延军，2 0 0 4 ) 。现在生物技术， 特别是组织培养及基因工程技术为李树种质资源创新、缩短育种周期和培育无病毒 苗木等开辟了新的途径。 n u b i a n a 李( p r u n u s s a l i c i n a l i n d l c v n u b i a n a ) 于19 5 4 年杂交育成 ( g a v i o t axe l d o r a d o ) ，具有中国李的血统。果皮紫红色，酸甜适度，有玫瑰香味， 营养丰富，口感极佳。该品种由华中农业大学自美国引进，n u b i a n a 李适宜于湖北 省和我国南方果产区栽培。 与其他主要木本果树相比，李再生相对困难。但到目前为止，相关的研究工作 开展较少。本试验对中国李n u b i a n a 的离体培养和再生体系的建立进行初步的研究， 以期建立李茎段再生系统、叶片愈伤组织高频率发生体系，为中国李的苗木快速繁 育，愈伤组织不定芽再生，遗传转化及无性系变异筛选奠定基础。 1 2文献综述 园艺学上的核果类果树主要是指蔷薇科李属( 尸删n u s ) 、果实为核果的一类果树， 包括桃、李、杏、梅、樱桃等，在我国果树生产上占有重要的地位。目前国内外对 桃、杏、樱桃等核果类果树的组织培养研究进展较快，现就核果类果树的组织培养 研究综述如下。 1 2 1茎尖培养 1 9 5 2 年法国人m o r e l 等首先将感染病毒的大丽花茎尖切离培养，获得了去病毒 植株；1 9 6 0 年m o r e l 又采用兰花的茎尖进行组织培养，经原球途径培养成小植株， 同时实现了快速繁殖和脱毒两个目的( 徐启江和陈典，2 0 0 1 ) 。从此，茎尖培养技术 4 中国李n u b i a n a 离体培养与再生体系建立的研究 广泛用于植物脱毒，成为培育无病毒植株的一个重要途径。根据茎尖培养的目的和 取材大小可分为茎尖分生组织培养和普通茎尖培养两种类型。前者所取材料为茎尖 分生组织，严格地讲，茎尖分生组织仅限于顶端锥区内长度不超过0 1 m m 的范围内， 此处组织还无维管束分化、不带病毒( 陈振光，1 9 8 7 ) 。但在实际操作中这样小的茎 尖分生组织难以取得，也不容易培养成功。事实上从已有的文献看，绝大多数报道 中所取茎尖均超过了这个范围( 张宇和，1 9 8 4 ) 。这样就不能彻底去除病毒。2 0 世纪 9 0 代以后大量采用的热处理和茎尖培养相结合培育无病毒苗木的方法在核果类果树 上得n t 广泛的应用( 覃兰英等，1 9 9 7 ；伍克俊等，1 9 9 6 ) 。借助于热处理钝化病毒， 就可取较大茎尖，培育出无病毒苗木，用于生产。如欧美国家已有脱毒苗木应用于 生产( 钟晓红等，2 0 0 3 ) 。 1 2 1 1茎尖、茎段在核果类果树组织培养中的应用 在核果类果树的离体培养中，以茎尖、茎段作为外植体最为广泛。目前已在c o l t 、 s d 1 3 、g i s c l a 等樱桃砧木、甜樱桃红灯、莫利、大紫等1 5 个品种( 郑红军和刘庆 忠，2 0 0 5 ) ，乌克兰大樱桃( 刘翠兰等，2 0 0 0 ) ，中国樱桃乌皮( 谢永红等，2 0 0 3 ) ，中 华矮樱桃( 韩文璞和袁明莲，2 0 0 0 ) ，草原樱桃希望和阿泰斯卡娅( 代汉萍等，2 0 0 1 ) 及酸樱桃( 唐晓杰等，2 0 0 4 ) 上培养成功；y s a c m 在1 9 8 6 年首次利用茎尖培养获得 了李脱毒试管苗，并应用于生产( 李玉琴和张玉梅，2 0 0 6 ) 。胡博然和徐文彪( 1 9 9 9 ) 选用中国李“红美丽”和“晚红李”休眠枝条通过茎尖和带芽茎段培养成苗。杏品种龙 王帽( 孙清荣等，2 0 0 5 ) 、y y r i n t h o s 、青皮杏、水晶杏等l o 个品种获得了成功。 采用茎尖、茎段培养可以在短期内明显提高繁殖率。在m s 培养基上，乌克兰 大樱桃继代培养4 5 天左右，增殖系数可达1 1 ( 刘翠兰等，2 0 0 0 ) ，草原樱桃培养3 0 天后，增殖系数高达5 6 ( 代汉萍等，2 0 0 1 ) 。在果树育种中用茎尖培养的方法可缩短 育种年限。据研究，樱桃茎尖培养有5 7 的试管苗可以诱导发生变异( 张开春等， 2 0 0 0 ) ，利用这些变异进行果树营养系选种具有重要的意义。宁淑香等( 2 0 0 1 ) 已建 立了6 种樱桃砧木的无性系，高疆生等( 2 0 0 1 ) 进行了扁桃苗无性系研究。 1 2 1 2 影响茎尖培养的因子 大多数植物组织培养时外植体的诱导及试管苗生根，不同种类品种、不同无性 系间均存在一定差异。李孟玲( 1 9 9 8 ) 等发现9 个杏品种在相同的培养条件下，茎 尖的增重速率不同，芽增殖倍数有一定差异。 不同取材时期及接种时期影响茎尖培养成活率。覃兰英等( 1 9 9 7 ) 试验表明：樱 桃和桃休眠后取材，其成活率均高于生长期、休眠前期。b u z k a n 等( 1 9 9 7 ) 的研究结 果显示，春季茎尖分生组织成活率最高，夏季细菌污染率比较高，秋季的成活率最 华中农业大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 低。 外植体的消毒方法影响芽的成活率。f o u a d 等( 1 9 9 5 ) 研究表明，外植体采用0 5 次氯酸钠表面杀菌比用1 0 次氯酸钙或0 2 升汞处理的成活率高。h a m m e r s c h l a g ( 1 9 8 7 ) 比较了5 种消毒方法的消毒效果表明，0 5 次氯酸钠+ o 0 1 吐温浸泡1 5 2 0 m i n ，然后加1 0 0m g l 青链霉素处理1 5 m i n ，最后用无菌水冲洗3 次的消毒方法污 染最轻。消毒效果则由于消毒剂对材料的伤害太重使外植体变褐而成活率明显降低。 尚敏克等( 2 0 0 2 ) 用浓度o 1 升汞消毒3m i n 左右，桃即可达到较好的灭菌效果， 且成活率高。 在离体培养条件下，不同的植物要求不同的培养基，同一种培养物在不同的培 养基上有不同的表现。茎尖培养芽的分化多为m s 为基本培养基( 吴霞等，2 0 0 2 ； 李孟玲等，1 9 9 8 ) 。但有人认为f 1 4 培养基更适合核果类果树的组织培养，因为f 1 4 培养基的成分与m s 培养基的成分比较其氨态氮含量较低( 何碧珠和陈振光，1 9 9 5 ) 。 李离体培养主要用m s 或改良m s 为基本培养基( 张宇和，1 9 8 4 ：刘用生等，1 9 9 1 ； 马锋旺等，1 9 9 9 ) ，但也有用l s 培养基( 孙清荣等，1 9 9 9 ) 。液体培养比固体培养 往往生长量大、成活率高。覃兰英等( 1 9 9 7 ) 将大紫樱桃茎尖分别接入f 1 4 液体和 固体培养基中发现，采用液体培养的茎尖成活率为2 9 3 ，是固体培养期茎尖成活 率的3 4 倍。 影响芽生长分化的生长调节物质有b a 、i b a 、g a 、t d z 和k t 等。不同品种、 不同外植体类型所适合的生长调节物质种类和浓度不同。从李茎尖培养的增殖倍数 和生长两方面来看，b a1 0m g l 和i b a0 0 5 0 1m g l 最适用。若单独用b a 时增 殖倍数较低，伸长生长很差。在b a1 0 m g l 和i b a0 0 5 m g 1 的基础上，附加g a 30 5 2 0m g l ，可促进新梢的伸长生长，但对于增殖无明显影响，其中以1 0 m g l 效果最 好( 张宇和，1 9 8 4 ) 。 在培养瓶内补充外源乙烯，当浓度达到1 0 m l l 时，桃茎尖培养生成的芽最多 且芽比较长。在试验浓度范围内，芽分化数和芽长度与培养瓶内乙烯浓度成直线正 相关( d i m a s ia n de c o n o m o u ，1 9 9 5 ) 。此外培养基的碳源、p h 值、母树的树龄等都 会影响茎尖培养的效果( 钟晓红等，2 0 0 3 ) 。 1 2 2胚培养 在种间杂交和属问杂交时，杂种的合子和胚乳含两个遗传结构不同的基因组， 在形成胚和胚乳的过程中，两个基因的表达不协调，导致杂种胚和胚乳发育不正常， 不能形成有萌发能力的种子；核果类果树的一些早熟及特早熟品种在调节市场果品 周年供应方面发挥了重要作用，但这些早熟及特早熟品种，果实发育期往往不足3 0 d ( 大樱o g ) 或6 0d ( 桃、李、杏) ，种胚发育不全，此时进行离体胚培养，可以将幼 6 中国李n u b i a n a 离体培养与再生体系建立的研究 胚培养成植株，称之为胚抢救( e m b r y or e s c u e ) ( 王鸿，2 0 0 5 ) 。核果类果树胚培养 始于1 9 3 3 年，t u k e y ( 1 9 3 3 ) 以甜樱桃幼胚为材料开创了果树胚培养的新时代。目 前，胚培养在克服果树远缘杂交种胚的早期败育、胚抢救、诱导体细胞胚发生和形 成诱变植株、作为基因转移的受体、生产无病毒苗木等研究领域发挥着重要作用。 1 2 2 1 胚培养在核果类果树组织培养中的应用 一些核果类果树由于果实发育期太短，种胚难以发育成熟，从而导致难以直接 播种萌发成苗。r i c h a r d 等( 1 9 9 2 ) 认为果实生长发育期少于9 0 d 的杏品种作为母本 时，杂种需要胚培养才能提高成苗率。杨增海等( 1 9 8 3 ) 以新端阳为材料，果实发 育天数为6 5d ，胚发育指数为0 4 2 ，经胚抢救后萌芽率达8 7 5 ，移栽成苗率为试 管萌芽数的8 5 7 。l a n e 等( 1 9 8 6 ) 取甜樱桃未成熟胚进行离体培养，7 0 的胚可以再 生植株，但是完全成熟的特别幼小的胚不能再生。i l i v e a 等( 1 9 9 5 ) 对酸樱桃、酸樱桃 和甜樱桃的杂交后代未成熟的胚进行培养，5 0 的外植体有愈伤组织的形成和次生 茎的形态发生，在弱的愈伤组织上能诱导出茎芽，并认为胚培养能为有用的杂交材 料提供一种迅速的微繁途径。 石荫坪等( 1 9 9 7 ) 、陈学森( 1 9 9 6 ) 等利用胚培养技术，培育出了红丰、新世纪 以及极早熟试管杏系列优系。山东省果树研究所于1 9 9 0 年建立了特早熟杏胚培养育 种技术体系，获得了4 0 0 株杂种胚培养苗，并从中选育出首批特早熟杏系列优系， 现已在生产中推广应用( 王玉柱，1 9 9 5 ) 。 在克服远缘杂交育种困难的工作进展中，刘焕芳等( 2 0 0 0 ) 得到了大樱桃中国 樱桃种间杂种试管植株，并进行了李与杏、桃等远缘杂交及杂种胚的培养试验。 k u r s a k o v 得到黑刺李8 9 ，黑刺李杏，杏巴旦杏等种间和属间的杂交种( 刘焕芳 等，2 0 0 0 ) 。 刘用生等( 1 9 9 3 ) 采用硬熟期的李种胚，不经过低温处理直接接种于含有b a 、 g a 3 和a c 的培养基中培养，成功获得了试管苗。赵淑清等( 2 0 0 1 年) 用焦家杏胚 为试材，研究了植物生长调节剂对离体培养早熟杏休眠的影响，打破了早熟杏的休 眠，并获得了试管苗。从而大大缩短了育种周期，提高了育种效率。山东农业大学 在杏杂交育种研究中发现胚培养苗童期缩短l 2 年( 刘焕芳等，2 0 0 0 ) 。 1 2 2 2 影响胚培养的因子 不同核果类果树的树种、品种对培养基、所需要生长调节剂及培养条件都不尽 相同，因此在进行胚培养时，需要选择合适的时期，培养基种类和生长调节剂组合， 以及适宜的环境条件。 h e s s e 等( 1 9 5 5 ) 研究结果表明，桃胚的发育指数接近0 7 时，是胚培养成功的 7 华中农业大学2 0 0 7 届硕：l 研究生学位论文 最低值，而果实硬熟期取胚培养成苗率高。经研究胚发育指数在0 1 - - 一0 4 2 的桃 也培养成苗( 杨增海等，1 9 8 3 ) 。刘用生等( 1 9 9 1 ) 培养胚发育指数分别为o 1 0 4 0 的桃幼胚各获得了7 7 8 和1 0 0 的成苗率，克服了桃幼胚的早熟萌发、成 低等问题。陈学森等( 1 9 9 6 ) 认为杏胚培养时期的选择与培养紧密相关，可以 硬核期的胚。 t u k e y 培养基是最早用于核果类果树胚培养的培养基( t u k e y , 1 9 3 3 ) 。t u k e y 及 其改良培养基至今仍然是核果类果树胚培养常用的培养基。不同发育时期，不同品 种的核果类果树胚培养需要不同的培养基。h o u g h 等( 1 9 6 9 ) 用s b h 培养基培养6 个 果实发育期7 0 - - - 7 2d 的早熟桃品种的胚，选出了优良后代，但发现s b h 不适于发 育指数小的桃幼胚，后来改用m s 培养基能使发育指数仅为0 2 5 的桃幼胚培养成功。 b u r g o s 等( 1 9 9 3 ) 用c 2 d 、s b h 和w p m 对凯特等三个杏品种在不同胚发育阶段培养， 发现三种培养基均可使胚成苗，c 2 d 最佳。桃p 5 1 4 品种在w p m 上培养，萌发效 果比在m s 、c 2 d 、c h e e 培养基上的好( s c o z z o l ia n dp a s i n i ，1 9 9 2 ) 。另有研究表明： m o n n i e r 、w p 、c 2 d 、s h 和w h i t e 培养基适于桃属、李属等核果类果树的胚抢救( 上 海市农业科学院园艺研究所，1 9 7 8 ： r o g e r sa n db y m e ，1 9 9 4 ) 。 提供含有碳源的培养基对胚的生长有明显的促进作用，在培养基中加入蔗糖最 适宜，有时也可用葡萄糖、果糖或甘露糖作为碳源。它能提供幼胚发育所需的能量 及增强培养基的渗透压。一般来说，在胚抢救的开始阶段和胚珠培养中，蔗糖起始 浓度应该高些( 王鸿，2 0 0 5 ) 。r a m r n i n g ( 1 9 8 5 ) 进行早熟李属植物的胚珠培养时发现6 的蔗糖对于油桃成苗效果最好，而n j n 5 5 油桃幼胚培养以2 蔗糖浓度比较合适。 刘用生等( 1 9 9 1 ) 研究结果表明l 果糖或葡萄糖均可显著提高西农早露桃幼胚的成 苗率和正常苗率。 不同的果树品种及胚的发育时期，胚培养所需的生长调节剂种类和水平有所不 同。庄恩及等( 1 9 9 1 ) 认为，1 0m g lb a + 1 0i a a m g r l 有利于桃胚发育，而4 0m g l i b a 、0 2 5m g lk t 及4 0m g lk t 抑制桃胚发育。韩礼星等( 1 9 9 9 ) 对早中熟甜樱 桃莫莉、红蜜的胚进行离体培养，其中t u r k e y + g a l 5 1 0 m g l 可获得较高的发芽率。 赵淑清等( 2 0 0 1 ) 研究1 0 m g l 6 一b a 、5 m g l i a a 和0 0 2 a c 配合使用对打破早熟 杏休眠更为理想。桃幼胚培养基中附加0 i a c 可提高成苗率与正常苗率。 1 2 3 叶片培养 自从1 9 5 3 年s t e e v e s 和s u s e x 开展紫箕叶培养取得成功以来，叶片成为研究叶 的形态建成和组织快繁的重要手段。随着生物技术的不断发展，离体叶片再生技术 已在果树细胞水平的诱变育种、变异筛选、嵌合体分离及遗传转化等方面得到广泛 应用( 周瑞金和刘孟军，2 0 0 3 ) 。 8 中国李n u b i a n a 离体培养与再生体系建立的研究 1 2 3 1叶片培养在核果类果树组织培养中的应用 核果类果树叶片再生较为困难，近年来，随着研究的深入，离体叶片再生也取 得了较大进展。樱桃、杏、桃、欧洲李等树种均有离体叶片再生的报道。 黄文江等( 2 0 0 2 ) 9 马哈利樱桃的无菌苗为试材，研究得出3 次继代培养的不定 梢的叶片再生不定芽的频率高达5 2 4 。他们以甜樱桃矮化砧木的组培苗的叶片为 外植体，研究建立了叶片的离体再生体系。刘彦泓等( 2 0 0 2 ) 研究了樱桃砧木c o l t 离 体叶片再生，通过先诱导愈伤组织分化不定芽以及叶片直接分化不定芽两种途径诱 导再生。结果表明，叶片愈伤组织不定芽分化率为2 1 3 ，叶片、叶柄不定芽诱导 率可达4 8 3 。g e n t i l e 等( 2 0 0 2 ) 以p 1 6 c 1 5 幼年自根苗和b a b y g o l d 6 8 4 2 ，s t a n d a r d ， s a ng i o r g i o ，y u m y e o n g 成年自根苗为试材，叶片在叶柄基部生成的愈伤组织，在光 下无生长素的培养基中培养2 1 d 后生成不定芽。王关林等( 2 0 0 3 ) 9c o l t 、大青叶、9 8 1 为试材进行叶片离体再生及根癌农杆菌介导遗传转化，建立了高频率再生系统，并 获得抗菌肽转基因植株。l a i m e rd ac a m e r am a c h a d o ( 1 9 9 2 ) 用杏品种k e c e m e t e r 的叶 片进行再生，并分离了李痘病病毒( p p v ) 外壳蛋白基因，通过根癌农杆菌成功得 到转化植株。 1 2 3 2 影响叶片培养的因子 基因型是决定离体叶片再生的关键因素。不同的基因型在同样条件下具有不同 的再生效率。黄文江等( 2 0 0 4 ) 在甜樱桃砧木研究中发现g i s e l a 5 的最高分化频率为 7 5 1 ，g i s e l a 6 为1 0 0 。孙仲序等( 2 0 0 2 ) 认为大青叶与大叶的再生能力有一定的 差异，大叶品种叶片再生芽的频率最高可达4 4 ，而大青叶叶片高达6 7 。 叶片的发育程度和叶龄是影响离体叶片再生的一个因素，一般是从梢上取顶部 完全展开的2 3 片嫩叶，这类叶的愈伤组织发生率最高。李梦玲( 2 0 0 0 ) 研究指出， 叶龄过大或过小都不适合培养。叶龄稍老的叶片愈伤组织诱导只有2 3 3 远远低于 幼叶的愈伤组织诱导率。叶片的生理状态对叶片愈伤的诱导有很大的影响。因叶片 组织再生能力一般低于叶片基部，故接种时去掉叶顶部1 3 。生根培养3 0 - - 4 0 天龄 的马哈利樱桃叶片最适宜离体再生，其再生频率高，再生不定芽数多( 黄文江等， 2 0 0 2 ) 。 对于叶片再生而言，外植体确定后，影响其再生率的最关键因素为生长调节剂。 在许多果树组织培养中t d z 效果优于6 - b a 。o l y a y ap e r a t o m e r o 等( 2 0 0 0 ) 的研究 结果表明，t d z 对促进杏叶片再生的效果明显好于6 - b a ，这与h a m m a m t 等( 1 9 9 4 ) 对黑樱桃和野生樱桃为试材的研究中得到的结果一致。t a n g 等( 2 0 0 2 ) 报道在w p m 培养基上，甜樱桃和酸樱桃不同品种的叶片再生不定芽，附加2 m g l 6 b a 比使用 t d z 的效果好。马哈利樱桃离体叶片再生诱导时t d z 不如6 - b a 有效( 黄文江等， 9 分离原生质体，并获得再生植株。m a t s u t a 等( 1 9 8 6 ) 从桃树叶片愈伤组织来源的悬 浮细胞分离出原生质体，研究得出5d 龄的原生质体得率较高，而7d 龄的细胞分裂 更旺盛。c h i a r i o t t i 等( 1 9 9 1 ) 使用2 5 种酶组合均可从杏、桃、扁桃的4 个品种的叶 肉细胞中得到原生质体，但酶组合中只有8 种可以从扁桃m n 5 1 t 和杏t h y r i n t o s 的 悬浮细胞中分离得到原生质体。 核果类果树原生质体与同科( 蔷薇科) 但不同属的植物进行体细胞杂交，也可 以获得再生植株。如o c h a a 等( 1 9 8 9 ) 将野生梨砧木品种( 砂u sc o m m u i sv a r p y r a s t e r l ) 叶肉原生质体和樱桃砧木品种c o l t ( p r u n sa v i u m x p s e u d o c e r a s u s ) 的悬浮细胞系 原生质体细胞电激融合，原生质体培养在改良k 8 9 培养基上形成了愈伤组织，并在 1 0 中国李n u b i a n a 离体培养与再生体系建立的研究 加玉米素的m s 培养基上获得了属间体细胞杂种植株。m o r l e y 等1 9 9 5 、1 9 9 6 年报 道f r e n s h a m ( 玫瑰杂交种) 愈伤组织来源的原生质体和来自c o l t 樱桃的原生质体用聚 乙二醇( p e g ) 诱导融合，获得了体细胞杂种植株。 迄今核果类果树原生质体培养涉及的基因型较少，原生质体来源也较局限，原 生质体分离和培养的影响因素研究还处于不断探索之中。 1 2 4 2 影响原生质体培养的因子 从核果类果树原生质体分离的例子看，选择分离原生质体的材料是原生质体培 养能否成功的重要因子之一，主要包括材料的基因型、材料的类型及材料的生理状 态3 个方面。基因型不同对原生质体的游离培养及再生成植株具有很大的影响。 同为核果类果树，樱桃原生质体培养成植株的例子较多，而桃原生质体至今尚 未得到再生植株。这一遗传性差异也表现在同一树种的不同品种间。如o c h a t t 等研 究酸樱桃c a b 4 d 、c a b 5 h 、c a b l1 e 三个品种中，其中c a b 4 d 和c a b 5 h 可以成 苗，而c a b l l e 却不能( 吴延军等，2 0 0 2 ) 。目前果树原生体培养时有用幼叶、子叶、 愈伤组织、胚性细胞悬浮物等作为原生质体游离的起始材料，不同的材料各有利弊， 并因树种、品种而异有所不同。马锋旺等用中国李和山杏的无菌苗叶片、种胚愈伤 组织和悬浮培养物三种材料类型为起始材料分离原生质体，结果表明悬浮培养物的 原生质体得率和活力最高。此外，材料的组织和细胞生理状态同样会影响原生质体 的产率。较小的桃叶片是原生质体分离的最好材料，如果叶片增大，分离效果明显 下降( m i l l s 等，1 9 9 4 ) 。 酶是原生质体分离的必须物质。正确选择酶制剂的种类、浓度及各类酶制剂的 组合，可以提高原生质体产量及活性和稳定性。广泛应用的酶有纤维素酶r - 1 0 、半 纤维素酶、果胶酶y - 2 3 和离析酶及崩溃酶等，其中纤维素酶r - 1 0 和果胶酶y - 2 3 最 为常用。r e v i l l a ( 1 9 8 7 ) 在甜樱桃和酸樱桃叶肉原生质体分离中使用了1 0 的纤维 素酶r - 1 0 、1 0 的半纤维素酶和o 1 的果胶酶y - 2 3 ，认为一般木本植物原生质体 分离需要这三种酶组合。1 0 m g l 纤维素酶+ 5 m l 离析酶( m a c e r o z y m er - 1 0 ) 酶解 中国李，具有活力的原生质体得率最高( 马锋旺等，1 9 9 9 ) 。m i l l s 等( 1 9 9 4 ) 认为 不同的酶组合对桃叶原生质体分离的影响不同，2 纤维素酶+ 0 5 离析酶组合分离 效果最好，原生质体活力达9 0 ，而果胶酶( v 2 3 ) 不好。用0 5 纤维素酶+ 0 7 5 果胶酶酶液组合酶解桃胚愈伤组织的原生质体得率最高( 甘霖和邓秀新，1 9 9 4 ) 。 渗透压调节剂具有