（植物营养学专业论文）丛枝菌根真菌对蒺藜状苜蓿抗砷酸能力的影响及其机制.pdf

摘要 本研究利用盆栽和分室根箱培养方式探讨了由g l o m u sm o s s e a e 和m e d i c a g ot r u n c a t u l a 形成的 丛枝菌根共生体的抗砷酸毒害的机理；并在分室根箱试验中引入g l o m u si n t r a r a d i c e s ，以比较两 菌种在抗砷能力上的差异。 主要的研究结论如下： 1 与宿主植物m t r u n c a t u l a 相比，a m 真菌g m o s s e a e 的抗砷酸的能力较强。g m o s s e a e 的 侵染可提高mt r u n c a t u l a 的抗砷酸能力，表现为接种处理植株的e c 5 0 值提高了2 倍。在 砷酸毒害的条件下，接种gm o s s e a e 使得mt r u n c a t u l a 地上部的磷水平维持在较为稳定 的水平上，而不接种植物地上部的磷水平却随着土壤砷浓度的增加而急剧下降。在中、 高砷添加水平处( 5 0 ，1 0 0 和2 0 0n a gk g 1 ) ，接种gm o s s e a e 能显著的降低宿主地上部和 地下部的砷浓度。试验表明，gm o s s e a e 通过改善磷营养状况和限制砷吸收，达到提高宿 主mt r u n c a t u l a 的抗砷酸能力。 2 在低砷添加水平下( t o m g k g 1 ) ，接种g m o s s e a e 对m t r u n c a t u l a 的地上部和地下部的砷 浓度无显著影响；但在中、高砷添加水平f ( 5 0 ，1 0 0 和2 0 0m gk g 1 ) ，接种gm o s s e a e 可显著降低植物地上部和地下部的砷浓度。 3 gm o s s e a e 和gi n t r a r a d i c e s 对砷的转运能力均很有限，但两者之间仍在诸多方面有着 明显的差异。与gi n t r a r a d i c e s 相比，gm o s s e a e 的抗砷酸能力更强。虽然gm o s s e a e 和gi n t r a r a d i c e s 都能提高宿主植物mt r u n c a t u l a 的磷水平，但gm o s s e a e 对宿主的供 磷能力强于gi n t r a r a d i c e s 。两个菌种的根外菌丝的分布状况也很不相同：gm o s s e a e 的菌丝主要分布于其宿主根的附近，而gi n t r a r a d i c e s 的菌丝则均匀的分布于离宿主根 较远的土壤空间。 关键词：丛枝菌根，抗砷酸能力，蒺藜状苜蓿，磷吸收，菌丝密度 a b s t r a c l w eu s e dc o n v e n t i o n a lp l a n tp o t sa n dc o m p a r t m e n t e dr h i z o b o x e st oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so ft w o a r b u s e u l a rm y c o r r h i z a lf u n g io nu p t a k eo fa r s e n a t eb ym e d i c a g ot r u n c a t u l a i nt h ep o te x p e r i m e n tw e i n o c u l a t e dt h eh o s tp l a n tw i t hg i o m u sm o s s e a ea n di nt h er h i z o b o xe x p e r i m e n tw ec o m p a r e dg m o s s e a ew i t hg l o m u si n t r a r a d i c e s h y p h a ld e n s i t yw a su n a f f e c t e db ya se v e na tt h eh i g h e s ta p p l i c a t i o nr a t eo f2 0 0m gk g 1a s t ot h e s o i lw h i c hs t r o n g l yd e p r e s s e dt h eb i o m a s so fm y c o r r h i z a lp l a n t sa n dn o n - m y c o t r h i z a lc o n t r o l s m y c o r r h i z a li n o c u l a t i o ni n c r e a s e dt h ee c 5 0o fb o t hs h o o ta n dr o o td r yw e i g h t sa b o u tt h r e e f o l d ，p e r h a p s b ye n h a n c i n gh o s tp l a n tt o l e r a n c et oa r s e n a t e s h o o tpc o n c e n t r a t i o n sw e r em a i n t a i n e da tr e l a t i v e l y c o n s t a n tv a l u e sf o l l o w i n gi n o c u l a t i o nw i t hg m o s s e a eb u td e c r e a s e ds h a r p l yi nn o n - m y c o r r h i z a lp l a n t s w i t hi n c r e a s i n ga r s e n a t ea d d i t i o nl e v e l a ti n t e r m e d i a t ea n dh i g ha r s e n a t ea d d i t i o nl e v e l s ( 5 0 ，1 0 0a n d 2 0 0m gk g 。1 ) ，i n o c u l a t i o ns i g n i f i c a n t l yr e d u c e dt h es h o o ta n dr o o ta sc o n c e n t r a t i o n s t h u s ，a mf u n g a l c o l o n i z a t i o nm a yh a v ec o n f e r r e de n h a n c e dt o l e r a n c et oa r s e n a t eo nt h eh o s tp l a n tb ye n h a n c i n gp n u t r i t i o na n dr e s t r i c t i n gr o o t a su p t a k e a tl o ws o i la r s e n a t el e v e l sf 0a n dl om gk g 1a d d e da s ) t h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei na s c o n t e n tb e t w e e nm y c o r r h i z a la n dn o n - m y c o r r h i z a lp l a n t s h o w e v e r , a ti n t e r m a e d i a t ea n dh i g l la r s e n a t e a d d i t i o nl e v e l si n o c u l a t i o ns i g n i f i c a n t l yr e d u c e dt h es h o o ta n dr o o ta sc o n c e n t r a t i o n s a l t h o t i g hi n o c u l a t i o nw i t he i t h e rg m o s s e a eo rgi n t r a r a d i c e sr e s u l t e di nl i m i t e da st r a n s l o c a t i o n t ot h et w of u n g i g m o s s e a ea p p e a r e dt ob em o r et o l e r a n tt oa r s e n a t ea n dt op r o v i d em t r u n c a t u l aw i t h m o r ept h a nd i dgi n t r a r a d i c e s f u r t h e r m o r e t h eh y p h a ld i s t r i b u t i o n so ft h et w of u n g id i f f e r e dg r e a t l y w h i l em o s to ft h ee x t e r n a lh y p h a eo fg m o s s e a ew e r ef o u n dn e a rt h eh o s t o o t s ，t h ee x t r a m e t r i c a l h y p h a eo f gi n t r a r a d i c e st e n d e dt oe x t e n dg r e a t e rd i s t a n c e sa w a yf r o mt h er o o t s k e yw o r d s ：a r b u s c u l a rm y c o r r h i z a ，a r s e n a t et o l e r a n c e ，m e d i c a g ot r u n c a t u l a ，p h o s p h a t eu p t a k e ，h y p h a l d e n s i t y 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 珞鹏乳帆m 年莎胁日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：，许j i l 各雾山时间：娜年石月矽吝 导师签名：时间：洳r 年。月幻t 7 门 中国农业大学硕士学位论文 第一章丈献综述 第一章文献综述 砷( a r s e n i c ) ，源自希腊文a r s e n i k o s ，意为“男性”，1 2 5 0 年发现。属于非金属而带有某些金属 特征，它以其毒性著称，是近百年来农药、医药和日用化工等的重要原料。近年来，随着砷化镓 制备技术的提高，在一定程度上促进了电子_ 丁业的发展。由于地质上和近几十年来人为的活动， 国内外对地方性砷中毒事件时有报道。砷中毒是危害严重，必须采取有效的防范措施，因此，对 砷与环境安全关系的研究日益受到备方人士的重视。 1 1 砷具有广泛的生物毒性 砷广泛分布于岩石圈、水圈和生物圈( c u l l e na n dr e i m e r , 1 9 8 9 ) 。它以四种价态( - 3 ，0 ，+ 3 ， + 5 ) 、两种形式( 有机和无机) 存在于自然界中。对绝大多数生物而言，砷不是必需元素，甚至 是有毒物质。世界健康组织( w o r l d h e a l t h o r g a n i z a t i o n ，w h o ) ( i n t e r n a t i o n a l a g e n c y f o r r e s e a r c h o nc a n c e r , 1 9 8 7 ) ，美国卫生及人类服务部( u sd e p a r t m e n to f h e a l t ha n dh u m a ns e r v i c e s ，d h i - i s ) 和美国环保署( u se n v i r o m e n t a lp r o t e c t i o n a g e n c y ，e p a ) 已认定无机砷为人类致癌物质( a g e n c y f o rt o x i cs u b s t a n c e sa n dd i s e a s er e g i s t r y ，2 0 0 1 ) 。长期处于无机砷污染的环境中，会对人体造成 的严重损害，如产生胃肠道、呼吸道、皮肤、肝、心血管系统、造血系统和神经系统方面的疾病 ( m a n d a la n ds u z u k i ，2 0 0 2 ) 。 砷的生物毒性体现在两个方面：其一，由于砷和磷在元素周期表中相邻，且同属于第v 主族， 使得砷与磷具有相似的化学特性。因此，进入原生质的砷酸盐会破坏了磷的代谢。如砷会取代 a t p 中的一个磷，形成不稳定的a d p - - a s ，这阻碍了a t p 的合成( m e h a r g ，1 9 9 4 ) ；砷还能取代 d n a 中的磷，影响d n a 正常的调控，甚至改变生物的遗传特性。其二，亚砷酸盐对生物体内的 一些功能基团，如半胱氨酸残基中的巯基( - - s h ) 和组氨酸残基中的咪唑氮，有着极强的亲和性， 这种亲和反应会使某些酶或组织蛋白丧失其功能，最终导致细胞功能受抑制，甚至是死亡 ( u h f i c h - e b e r i u s e t a l ，1 9 8 9 ；r o s e n ，2 0 0 2 ) 。 1 2 砷污染与植物修复 虽然砷在地壳中的丰度非常低( 0 0 0 0 1 ) ，但由于它分布的不均匀一性，会造成砷在生物圈 的局部污染，包括土壤、水体和食品的砷污染。对于土壤中砷的污染，其成因有二；一是自然原 因，即砷在生物地球化学过程中产生的区域性的高砷含量；其次是人类括动的影响，如采矿，冶 金，以及含砷杀虫剂、除草剂、杀菌剂和树木防腐剂等的使用( a d f i a n o ，2 0 0 1 ) 。砷的污染严重危 害了人类的健康和生态环境的安全。因此，对砷污染地区的环境生态修复就显得极为迫切。 在众多的污染修复方法中，生物修复有着非常广阔的前景。其中，植物修复的能源全部来自 太阳光，而且植物还具有自我设计( s e l f - e n g i n e e r ) 的能力( m c c u t c h e o na n ds c h n o o r , 2 0 0 3 ) 。这 赋予了它节能、环保和可持续性的特点，这是其它方法无法比拟的。因此，广大的相关研究人员 极为看好这一崭新的修复方法。可以说，目前植物修复已是环境工程这一崭新领域的重要组成部 分。 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献缘述 詈皇皇舅皇量鼍量鼍曼鲁| 奠皇一i i i 一 应用于砷污染治理的植物修复，基本上可以分为四类：植物提取( p h y t o e x t r a c t i o n ) ：利用 抗砷植物去除土壤中的砷；植物稳定( p h y t o s t a b i l i s a t i o n ) ：利用抗砷植物将土壤中的砷转变为 毒性较低的形态，但不能将其从土壤中移除；植物挥发( p h y t o v o l a t i l i s a t i o n ) ：利用抗砷植物 生成具有挥发性的砷形态，以去除土壤中的砷；根过滤( r h i z o f i l t r a t i o n ) ：利片j 抗砷植物的根 去除流动水体中的砷( c h a n e ye t a l ，1 9 9 7 ；f i t za n d w e n z e l ，2 0 0 2 ) 。针对土壤的砷污染，以植物提 取和植物稳定这两种方法最为常用( m c g r a t ha n dz h a o ，2 0 0 3 ) ，二者之间具有相互补充的作用a 近儿年，在自然界中。发现了多种砷的超积累植物，如p t e r i sv i t t a t a ( m ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 和 p i t y r o g r a m m ac a l o m e l a n o s ( f r a n c e s c o n i ，2 0 0 2 ) 。这些植物除地上部可积累极高砷的含量以外，还 具有生长快、生物量大的特点，这可以满足从土壤中提取砷的要求( i ( 蕴r e n l a m p ie t a l ，2 0 0 0 ) ，因 而使得植物提取砷的可行性大大提高。在某种程度上，这些植物的发现促进了对植物提取方法的 研究。在对这些植物进行了大量的研究工作后，取得了一定的认识( z h a n g e t a l ，2 0 0 2 ；w a n g e t a l ， 2 0 0 2 ；t ua n d v i a 2 0 0 3 a ，b ) 。但这些植物对砷超积累的机理( 包括植物根吸收砷的机制和地下部向 地上部转运砷的机制) 及其意义还不是十分了解( m e h a r ga n dh a r t l e y - w h i t a k e r , 2 0 0 2 ) ；尤其是菌 根在砷超积累的过程中所起的作用目前还不清楚( f i t za n dw a n z e l ，2 0 0 2 ) 。 虽然对有关砷超积累植物的机理的认识有限，但令人振奋的是，d h a n k h e 等( 2 0 0 2 ) 通过对 模式植物拟南芥的转基因，得到了能够抗砷，并且超积累砷的植株。这无疑加速了砷的植物 修复从理论研究到实际应用的进程。 1 3 土壤中砷的形态与性质 砷在土壤中的平均含量为5 6m gk g 1 ( m a n d a la n ds u z u k i ，2 0 0 2 ) ，非污染土壤的砷含量通 常低于1 0 m g - k 茸1 ( f i t za n d w e n z e l ，2 0 0 2 ) ，主要以无机态的形式存在。在通气良好的条件下，砷 酸盐( a s o + 3 ) 存在形式稳定；还原条件下，则以亚砷酸盐( a s o ，) 为主( m a n d a l a n d s u z u k i ，2 0 0 2 ) 。 在与人类密切相关的陆地生态系统中，土壤多处丁二氧化环境。因此，砷酸盐应为土壤的主要的砷 污染形态。 砷与磷的相似性，使得它们在士壤中的行为特性也极为相似。例如，在通气良好的土壤中， 无机态的砷和磷均以+ 5 价的酸根形式存在，它们均可被土壤粘粒，铁、锰氧化物或水化物及有 机质强烈吸附( m a n d a la n ds u z u k i ，2 0 0 2 ) ，而且，砷与磷之间存在着拮抗作用( l i v e s e ya n dh u a n g ， 1 9 8 1 ；g a oa n dm u c c i ，2 0 0 1 ；t ua n dm a ，2 0 0 3 a ) 。 1 4a m 共生体陆地生态系统中的重要组成部分 据统计，8 0 的陆地植物可以形成菌根共生体，6 0 形成的是丛枝菌根( a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a ， a m ) 共生体( t r a p p e ，1 9 8 7 ) ，即绝大多数为a m 共生体。可见，a m 共生体在陆地生态体系中 的重要性。 a m 共生体是基于植物与丛枝菌根真菌( a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a l f u n g i ，a m f ) 之间互惠互利关 系的一种共生生命形式。a m p 的能量供给来自于植物，即取得植物的部分光合产物：植物则利 用a m f 庞大而且有效的菌丝网络来获取其必须的矿质营养。在这些矿质营养中以磷的供应最为 重要( s m i t ha n dr e a d ，1 9 9 7 ) 。这是因为：对于植物的生长和发育来说，磷是一种非常重要的矿 2 中国农业太学硕士学位论文 第一章文献综述 ii 皇 物元素。但由于磷元素自身的物理和化学性质的限制，如无机磷( p i ) 的可溶性和移动性较低， 以及植物很难直接利用有机磷，造成了它在土壤中的生物有效性非常低。因此，在植物根的周围， 往往存在磷的严重亏缺。与植物的根系统相比，菌根系统对土壤磷的吸收和转运更为有效。所以 说，菌根共生体能够有效地克服产生于根际的磷亏缺障碍( z h u d a l ，2 0 0 1 ) ，进而改善植物的生 长状况。这种改善不仅是基于a m f 扩大了共生体的吸磷范围，而且，还在于它高效的磷转运速 度。在a m f 菌丝中，磷可能是以p i 或聚磷酸盐，甚至是有机磷( 磷胎) 的形式参与长距离运输 的( e z a w a e t a l ，2 0 0 2 ) 。在磷的长距离运输过程中，定向移动的液泡系统和细胞质流可能起着重 要的作用( s m i t ha n dr e a d 1 9 9 7 ) 。 丛枝菌根真菌不仅可以改善植物的营养状况，还能够提高植物的抗逆性，包括对重金属和非 金属毒害的抗性( f i t za n dw a n z e l ，2 0 0 2 ) 。菌根真菌可能是以吸收屏障的方式减轻金属对宿主植 物的毒害，即限制污染物向宿主植物的转移，同时提高植物的营养水平( l e y v a le t a l ，1 9 9 7 ) 。 由于砷酸根与磷酸根的化学相似性，a s 极有可能是通过磷的吸收系统进入生物体的( a s h e r a n dr e a d y , 1 9 7 9 ；m e h a r ga n dm a c n a i r , 1 9 9 0 ) 。但在砷进入a m f 体内后，其转运过程是否与磷相类 似，目前还没有报道。这可能是因为土壤系统的复杂性，使得砷与磷对于七壤吸附的竞争关系， 及它们对植物的有效性的竞争关系十分复杂，导致了对土壤生物抗砷机理的进步研究的困难。 对于a m f 在其宿主植物抗砷方面起的作用，以及a m f 可能存在的抗砷机理，目前还不为人知。 1 5 生物的抗砷机制 从细胞层次上讲，生物对砷的抗性可能体现在三个方砸( 图1 - 1 ) 。一是拒砷：通过改变 周围环境的物理化学特性，降低砷的生物有效性。如分泌h + 来改变环境的口 i 。但该类过程也可 能会导致砷的生物有效性的提高。将砷吸附并固定于细胞壁上，以降低砷的生物有效性。质 膜的选择性吸收。这体现在膜在砷毒条件下的稳定性，以及膜上转运蛋白的高度特异性，特别是 磷的转运蛋白对磷特异性识别的程度。二是排砷。它包括两个步骤：舢”在砷酸还原酶的作用 下转变为a s 的过程。该过程的目的可能在于对砷的识别。此后，通过特定的转运蛋白将其 转运至细胞外。排砷过程广泛存在于细菌、真菌，甚至是人类的细胞中( r o s e n 2 0 0 2 ) 。最后是 耐砷。它与排砷过程有一定的相似性，即具有a s 。还原和a s 日1 转运过程。所不同的是，耐砷是将 a s 哪区隔于液泡中( 图1 - 1 ) ，而不是释放到环境中。因此，该抗砷机制局限在具有液泡的植物 和真菌细胞中。值得注意的是，在耐砷过程中，需要植物螯合肽( p h y t o c h e l a t i n ，p c ) 的参与。p c 通过将自身携带的巯基与a s 结合，弱化其毒性。金属硫蛋白( m e t a l l o t h i o n e i n ，m t ) 也可能具有 此功能。与排砷和耐砷相对比，拒砷较为被动，后者则为积极主动的抗砷机制，更具适应性。 对于功能器官明显分化，进化级别较高的陆生植物，能将那些己吸收的来自土壤的砷固定于 根系中，以限制其向地上部迁移，这可能也是种抵抗砷毒害的有效策略。 1 6a m 共生体的抗砷潜力 生长于砷污染土壤中的植物趋于形成菌根( m e h a r ga n dc a i m e y , 1 9 9 9 ；g o n z a l e z - c h a v e z 2 0 0 0 ； s h a r p i e se ta 1 ，2 0 0 0 a , b ) 。对于生长在污染土壤上的抗砷和非抗砷植物，a m f 的侵染均可提高它们 的抗砷能力( g o n z a l e z - c h a v e z , 2 0 0 0 ) 。但是耳前还不清楚a m f 影响宿主植物抗砷能力的机制 3 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 ( m e h a r ga n dh a r t l e y - w h i t a k e r , 2 0 0 2 ) 。 a s v a s v a s v a s ” a s 图1 - 1 细胞抗砷机制示意图( m a r s h n c r , 1 9 9 5 ) t a b l e1 - 1d i a g r a ms h o w i n g t h em e c h a n i s m so f a r s e n a t et o l e r a n c e 从某种意义上说，a m f 在a m 共生体中的抗砷作用可能类似于植物的根，即将其吸收的砷 固定于自身体内，几乎不转移给宿主植物。a m f 也可能会把一部分已吸收的砷排除体外。对于 微生物来说，这是可行的( r o s e n ，2 0 0 2 ) 。这可能是因为它们所有或者是绝大多数的细胞都与外 界环境毗连，有利于排砷。然而，对于细胞排列紧密的植物，排砷的可行性大大降低。a m f 的 存在可能会弥补植物在这一方面的不足。目前，还未见任何报道证明a m f 有排砷和耐砷过程。 a m f 也可以通过影响宿主植物的蛋白表达水平来提高其抗砷能力。 几种g l o m u s 属的a m f ( 包括gm o s s e a e 和g i n t r a r a d i c e s ) 的侵染可下调宿主植物高亲合力 磷转运蛋白( 如m e d i c a g ot r u n c a t u l a 的m t p t l 和m t p t 2 ，它为磷饥饿诱导表达蛋白，m t p t l 表 达部位在根表的质膜上，二者的功能在于吸收土壤中的磷) 的表达水平( i s ue l a l ，1 9 9 8 ；c h i o ue t a 1 ，2 0 0 1 ；b u r l e i g h 。2 0 0 1 ) ；与此同时，上调了宿主植物低亲和力磷转运蛋白( 如腻t r u n c a m l a 的 m t p t 4 ，它为a m f 诱导表达蛋白，其表达位于含有发育良好的a m 丛枝的细胞的质膜上，功能 在于吸收来自于a m f 释放的磷) 的表达水平( h a r r i s o ne ta l , ，2 0 0 2 ) 。如上所述，土壤中的砷酸 根可通过该转运蛋白进入植物体，那么，m t p t l 表达量的下降，虽然减少了植物对磷的直接吸收， 但这可能会大大降低砷直接进入植物体内的几率；m t p t 4 表达的出现，既可以避免植物直接吸收 土壤中的砷，又可以改善植物的磷营养状况。”p 同位素试验表明，宿主植物体内的磷几乎可全 部来自于a m f ( s m i t he t a l ，2 0 0 3 ) ，但这要依a m f 和宿主植物的种类而定。 此外，a m f ( gi n t r a r a d i c e s ) 侵染腻t r u n c a t u l a 后，上调了宿主植物谷胱甘肽s 一转移酶 r n a ( m t g i m 2 9 ) 的转录水平( w u l f e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。该酶具有解毒的功能，它可能会提高宿主植物 的抗砷能力。 概括起来，a m f 可通过以下几个方面改善宿主植物抗砷能力： 减少植物对砷的吸收； 增加植物对营养元素的吸收； 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 曼曼笪舅皇曼皇量| 舅詈岂e 黑曼皇蔓蔓毫曼曼曼曼! 曼曼皇奠| 量曼皇曼蔓篁曼曹舅曼曼曼曼鼍皇! 量量置一i i 目一 改善植物的代谢状况，提高植物对体内砷的抵抗和解毒能力。 1 7a m f 能缓解宿主植物改善磷营养与抵抗砷毒性的矛盾 止像上面所提及到的那样，砷与磷在某些化学特性上非常相似，但两者在本质上是不同的。 在漫艮的生命进化过程中，磷元素承担了行使多种生命功能的角色。这是由磷元素内在特性决定 的。砷虽然与磷相近，如：h 2 a s 0 4 一和h 2 p 0 4 - 在土壤中相互有拮抗作用，而且它们均通过磷的转 运蛋白进入生物体中，但实际上砷无法替代磷的功能，如：砷干扰了a t p 的形成。在某种意义上 讲，正是由于砷与磷之间的这种相似而迥异的关系决定了要清楚砷的生物毒害机制和生物的抗砷 机制，不可避免的要谈到磷。 缺磷时植物会分泌质子、有机酸、氨基酸，甚至是多肽，提高根冠比，上调根表质膜上高 亲合力的磷转运蛋白，以此来获得足够的磷供其利用。但在砷污染土壤中，砷的有效性极有可能 会相应的提高。在多数情况下，植物迫于砷较高的生物毒害性，不得已减少磷的吸收。因此，这 也是生长在砷污染土壤上的植物出现缺磷症状的重要原因。 在这种情况下，a m f 的侵染会改善这种对植物生长不利的局面。因为，a m f 可在不同程度 上取代宿主植物根吸收磷的功能，以避免植物直接受到砷的胁迫。这类似于植物器官层次上区隔 化作用。另一方面，在磷吸收功能转嫁的同时，宿主植物也将砷直接进入细胞内的可能性转嫁给 a m f 。因此，a m f 必需具有相应的抗砷能力。由于砷必定要进到a m f 体内，所以说，a m f 体 内在很大程度上必需具有耐砷或( 和) 排砷的能力。如果a m f 体内存在耐砷过程，即将吸收的 砷转运至液泡中，那么，液泡中的砷很有可能会在菌丝中发生转运。因为这种转运方式是磷在菌 丝中运输的重要途径。 1 8a m f 在植物修复的作用和地位 a m 共生体参与的生物修复应从属于植物修复的范畴。因为，该共生体的主体是具有光合自 养能力的植物，而专性异养共生的a m f 则处于从属地位。但这并不意味可以忽略a m f 的作用。 与此相反，在特定的修复过程中，a m f 有时也可以发挥巨人的作用，甚至是决定性的作用。这 是基于a m f 能提高宿主植物抗性为基础的。正是这种抗性的提高，保证了宿主植物能在污染十 壤上存活，这恰恰是植物修复的前提。 在过去的几十年中，虽然对土壤一植物系统中砷的认识和理解取得了重要的进展，但是，目 前还没有文献阐明苗根共生体，特别是a m 共生体在植物( 包括砷的超积累植物) 砷的抗性方面 所起的作用，以及a m f 在植物修复中的作用和地位。a m f 作为生态系统中的重要组成部分，是 绝对不能被忽略的。因此，针对这些亟需回答的关键性问题，还需要开展大每而深入的研究工作。 为此，本课题针对a m f 提高宿主抗砷酸能力的主要机制；a m f 是否具有较强的抗砷酸能力； a m f 对砷转运能力这些的关键性问题，拟定了一套相应的研究方案。 5 中国农业太学硕士学位论文 第二章研究思路 2 1 问题的提出 第二章研究思路 砷是一种具有强烈毒性的污染物，其造成的环境污染影响了世界范围内百万以上的人口 ( n r i a g u ，1 9 9 4 ) 。中国卫生部于1 9 9 2 年认定地方性砷中毒是一种新的严重危害人民健康的地方病 ( 金银龙等，2 0 0 3 ) 。土壤的砷污染是主要的砷污染形式之一，它严重威胁了环境安全和人类健 康。 磷是生物必需的大量元素之一。由于在土壤中的移动能力极差，它经常是限制农作物品质和 产量的主要元素。a m f 的侵染能够提高宿主植物的磷水平，原因在于它的生物学功能，即通过 对土壤中闭蓄态的磷酸根进行有效的活化、吸收和转运，向其宿主植物提供充足的磷营养，以满 足其生长的需要。 砷和磷有着许多的相似性，如在土壤中，它们的无机存在形态均为五价阴离子；而且都结合 于相同的土壤吸附位点；进入生物体内的转运途径也都相同。 这就产生了以下问题： a m f 是对这两种相似的元素在功能上能否加以识别? a m f 的侵染会对宿主植物的抗砷酸能力有何影响? 这种影响对砷污染士壤的利用和修复有何意义? 2 2 研究目标 明确a m f 提高其宿主植物抗砷酸能力的主要机制 判定a m f 是否具有较强的抗砷酸能力 初步判定a m f 对砷转运能力 通过对以上问题的回答，为最终阐明a m 共生体在砷污染土壤修复方面的实践提供理论依 据。 2 3 研究内容 6 利用盆栽方法，研究不同砷水平下，接种a m f 对蒺藜状苜蓿抗砷能力的影响； 利用三室根箱培养装置研究a m 共生体中a m f 菌丝对砷的转运功能及菌种间差异。 中国农业大学硕士学位论文第二章研究思路 2 。4 技术路线 蛋2 - 1 匍f 究技术路线喇 f i g u r e2 - 1t h ed e s i g no f t h ee x p e r i m e n t 7 中国农业大学硕士学位论文 第三章材料与方法 3 1 宿主植物 第三章材摹荨与方法 蒺藜获骜饕( 拉t 名m e d i c a g o 挑a t c a t u l a g a e r t n ；荚文窝b a r r e l m e d i c ) ，豆麓，蝶彩藐耍辩， 茵蓿属。本试验选用的栽培种为“模范”( p a r a g g i o ) ( 由澳洲良种公司提供) ，一年生。 该植物在分子遗传学和经典遗传学方筒蕻备良好的特性，如：双倍体，自交，较小的基因组 ( 5 0 0 6 0 0m b p c ) ( b l o n d o ne ta l ，1 9 9 4 ) ，快速的繁殖周麓，较高的生物多样性。而且豆辩檀物 鑫身在骚缝生悉系统及謇晁经游中其毒 # 常鬟要箨臻。毽就，蒺藜获曹蓿巍基残蔻遣赛公汲的薅 = f 研究豆科、a m f 共生体和根癯菌及某些致病菌侵染作用的模式植物( c o o k ，1 9 9 9 ；t h o q u e t , 2 0 0 2 ) 。由于对谈模式植物的研究很多，所以关于它的生物学信息也较为全面，这利于对研究结 聚静解释，也刹予进一步的深入研究。 3 2a m 菌种 g l o m u sm o s s e a eb e g1 6 7 和g l o m u si n t r a r a d i c e sb e g1 4 1 ，该两个菌种属于广布型，晟来源 于无碑污染逸嚣。嚣蓥静均必本试验室扩繁熬蕊秘，扩繁掰臻静密主植秘为玉米( z e a m a y s 王 ， 和红三甘草( t r i f o l i u m p r a t e n s el ) 。扩繁新褥的菌裁舍有摭棱菌根真菌孢予、菌丝、根段投土壤 的混合体。 3 3 供试土壤 非砷污染的低磷唐山甘薯田土壤。p h 一7 4 ；含有机碳8 2 4gk g 1 ，垒氯0 8 3gk g _ 1 ，速效磷 6 4 m g k g 1 ，垒砷9 8 7r a g k g 1 。向该土壤添加2 0 0 m g k g 1 n ( n t t 4 n 0 3 ) ，1 7 1 m g k 9 1 k ( k 2 s o , ) 作为底肥。分别加入4 4r a gk g - 1 秘8 8m gk g 1p ( k h 2 p 0 4 ) ，即获得毫、低两个磷本乎戆土壤。 3 4 基质的制备 将土壤和溯沙及接种对照所用的菌剂在1 2 1 下灭菌2 小时，灭菌艏将其晾晒一周，褥进行 淫瓣蓉l 杰爨薅。辩堙添热子壤孛，淫汐与鏊雾l 不薛搬礁熊壤。燕砖嚣懿壤在装筮蔻藏鬟3 舞， 以保证添加的砷能够充分的被土壤颗粒吸附圈定。 土壤中砷的添加形式为砷酸钠( n a a a s 0 4 1 2 h 2 0 ) 。盆簸试验的砷添加水平：0 ，1 0 ，5 0 ，1 0 0 芹鞋2 0 0n a gk g 1 ；根箱试验的砷添加水平：0 ，2 5 ，5 0 和1 5 0 嬲k f l 。 3 5 菌种滤液的躺备 取1 0 0g 娃m o s s e a e 的黼荆，溶解于1l 去离子水中。过滤三次后，所得到的滤液即为饿种 滤滚。撩入嫠静滤渡的目的疑谈不接种处理与搂静处理之蠲尽量具舂共嬲豹微生物群落。 8 中国农业大学碰士学位论文 第三章材料与方法 # , i , p l i i ,i i 魍自皇奠蔓皇皇曼喜奠嘲糌鼍皇曼曼皇邑量量罾舞獬舞鼍鼻置| 暑等皇删_ 3 6 催芽 选取饱满的苜蓿种子。用自来水冲洗干净。将其浸泡于1 0 过氧化氯溶液中进行消毒，1 0 分钟后取出，用去离子水冲洗3 次后，均匀的铺在覆有吸水纸的托盘中，溉于阴暗湿暖的环境中 进行徨芽。特长出1 的髓摄蓐瘸子播静。 3 7 试验实施 3 7 1 盆栽试验 基质装盆及播种 本试验所用的培养装置为1 0 0 1 2 0 n l l n 塑料盆，所用的土壤为低磷土壤。基质按照一定次序 装入盆中( 霓圈3 一1 ) 。先装入8 g 相应嬲垂枣处理的灭莲土壤，再装入l g 灭蔼( 接种处理) 或未灭菌( 不攘菌豹对照殛璇) 的菌裁，之艏装入1 0 0 9 与先前嗣# 静十壤。诧时，浇2 0 9 去离 子冰，播入1 5 粒带有1a n 聪根的种子，辫覆1 2 0g 河沙。在第一次浇水游张中向不接种处理 的盆中浇入2 0 l i l l 的菌种滤液。 ：- ： ：- ：- ： - ：- ： ：，：- ： 8 0 0 9 壤：； ：- ：- ：，：- ：- - ：一：- ：- ： ：- ：，： 霭3 + 1 靛裁试验麓萎蓑瓣次 f i g u r e3 - 1d i a g r a m s h o w i n gt h cl a y e r so fm e d i ai nt h ep o t s 渡验警瑾 培养时间：2 0 0 3 年i l 月6 日2 0 0 4 苹2 月1 1 日。 定萤：撩糖一周蜃定蘸，翊剪刀将1 5 抹萤中7 拣的媳上邦藓去，整下8 撩。 光照温度：本试验布簧于中国农业大学科学园玻璃瀛熬，主要采用翻光进行光照；从天黑至 夜间2 1 点前。利用卤化物照明灯进行补偿光照，光照强度为2 0 0 z m o i i l 2s 。 9 中国农业大学硕士学位论文 第三章材料与方法 燃麓掣量置曼皇皇舅尊i ii i 一一 i , 鼎刿篁曼曼量| 皇一 湿度：室内滋度保持在2 2 2 8 之闻。 水分管理；利用称重法j | 蠡控并及时补充土壤含水量，使篡维持在1 2 2 0 ( w w ) 之间。 3 7 。2 根箱试验 蕊质装盆及播种 本试验所用的培养装置为三室有机玻璃根箱( 图3 2 ) ，尺寸为高1 2 宽1 0 长( 3 + 2 + 3 ) c m ，植物生长煮表侧有3 0 # m 网眼的尼龙嘲以阻止檀甥壤的穿过，薅允许a m f 莛丝穿邋。植物 生长室与菌丝童之闻设缓冲羹，其作用是转止植物根直接吸收来自蔼丝室的砷。 本试验所俐的士壤分为商磷和低磷两种，所有的低磷土壤不加砷，将旗甓于植物生长寰和缓 冲室；所有加砷处理均由向高磷壤加砷得到，高磷的砷游染土壤均置于馘丝污染室。将两种士 壤_ 嚣l 蓥裁按篷3 - 2 嚣示装入凝戆中，浇蜮去蕤子瘩，均麓凌”f 鹱芽匏l # 簸秘子，再甏上援渗。 在第一次浇水过程中，向不接种处理的植物生长室中浇入2 0 棚的菌种滤液。 试验管理 培养薅阉：2 0 0 3 年l l 辩1 2e t 2 0 0 4 攀2 旁1 3 蠢。 定苗：播种周后定苗，用剪刀将1 0 株苗中5 株的地上部剪去，留下5 株。 毙惩：本试酸布置于中瓣农蝗文学资嚣与琴壤学院毽耪蝰莽室，全聱袋用杰佳劈嚣溺灯遴靠 室内光照培养，光照强度为2 5 0u m o l 程1 2 一。 温度：室内漏度保持在2 0 2 5 c 之间。 隶努警毽：司“盆簸试骏”。 3 8 根长 取0 2 0 5 9 薪鳝静掇，姆其剪成1 l 灰矗黥裰段。骢蕤至予2 0 2 0 c m 謦毒攀整专乏嶷湾1 c l n 网格的有梳玻璃扳上，记下报段与潮格的交叉点数。 根长计算公式： 根长( m ) 一1 1 ，1 4 交叉点数x 网格单元格长废 3 9 侵染率 围3 - 2 根箱试验的培养装置 f i g u r e3 - 2d i a g r a ms h o w i n gt h ed e s i g no ft h er h i z o b o x e s 取0 2 0 5 9 新鲜的根，剪成1 t i l l 左右的根段。先置于1 0 氢氧化钾溶液中，在9 0 水浴加 热3 0 分钟。之后将碱液倒掉，用自来水冲洗3 次，再用2 的盐酸溶液浸泡5 分钟。再将酸液 倒掉，直接加0 5 的锥虫蓝染色溶液，在9 0 水浴加热3 0 分钟。将染色液倒掉，仍用自来水冲 洗3 次，用乳酸甘油水溶液( 1 ：1 ：1 ) 浸泡脱色。处理后的根段置于带有等间距方格的9c r n 培 养皿，利用网格交叉法算出侵染率。 侵染率的计算公式： 侵染率( ) = 被侵染的根长( m ) 总根长( m ) 1 0 0 3 1 0 菌丝密度 称5g