（药物化学专业论文）白念珠菌carck2基因的克隆与鉴定.pdf

中文摘要 酿酒酵母r e k 2 ( s c r c k 2 ) 是一个m a p k 调控的s e r t h r 类蛋白激酶，被h o g l 磷酸化而激活。酿酒酵母r c k 2 a 缺失株在c d 2 + ，z n 2 + 和t b o o h 等多种氧化胁迫 环境下存在生长缺陷，表明s c r c k 2 具有抗氧化胁迫功能。我们用s c r c k 2 p 的氨 基酸序列在白念珠菌基因组数据库( c g d ) 中进行b l a s t ，获得了白念珠菌中 与s c r c k 2 基因同源性最高的基因序列o r f l 9 9 8 0 8 。我们把这个同源序列克隆到 酿酒酵母单拷贝表达载体p r s 3 1 6 中，构建了重组质粒p r s r c k 2 。将重组质粒 p r s r c k 2 导入到酿酒酵母r c k 2a 菌株中，发现它能够互补酿酒酵母r c k 2 基因 在氧化胁迫过程中的功能。因此，我们将o r f l 9 9 8 0 8 命名为白念珠菌r c k 2 ( o 只c 黝) 基因。 关键词：白念珠菌；酿酒酵母；r c k 2 ；h o g m a p k ；氧化胁迫 a b s 瞰c t r c k 2i sam i t o g e n - a e t i r a t e dp r o t e i nk i n a s e ( m a p k ) a c t i v a t e ds e r t h rp r o t e i n k i n a s e ，w h i c hi sp h o s p h o r y l a t e da n da c t i v a t e db yh o g li ns a c c h a r o m y c e s c e r e y is i a e t h er c k 2 am u t a n ti ss e n s i t i v et om u l t i p l eo x i d a n t ss u c ha sc z n 2 + a n dt b o o h w h i c hi n d i c a t e sr c k 2h a sa na n t i - o x i d a t i v es l y e s sf u n c 6 0 n i nt h i ss t u d y , w e q u e r i e dt h ec a n d i d aa 舾c a r sg e n o m ed a t a b a s e ( c o d ) 谢t h 量c e r e v i s i a er c k 2 ( s c r c k 2 ) a m i n oa c i ds e q u e n c e a n do b t a i n e d 协eo r f l9 ，9 8 0 8 ，t h a th a st h eh i g h e s t s e q u e n c eh o m o l o gw i t hs c r e l ( 2 w jc l o n e dt h i sa l l e l ei n t oay e a s ts i n g l ec o p y e x p r e s s i o nv e c t o rp r s 31 6 w et r a n s f o r m e dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp r s r c k 2i n t o sc o r e v i s i a er c k 2 ac e l l sa n df o u n dt h i sa l l e l ec o u l de o m p l e m e mt h ea n t i o x i d a t i v e s t r e s sf u n c t i o no f s c r c k 2 t h e r e f o r ew en a m e dt h eo r f l g 9 8 0 8a sc a n d i d aa l b i c a n s r c k 2 ( c a r c k 2 、g e n e k e yw o r d s ：s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a 已, c a n d i d a a l b i c a n s ；r c k 2 ； h o g m a i d , k ；o x i d a t i v es t r e s s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得叁生盘茎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：詹、参，1 ) 签字日期：工。一z 年 x 月列饲 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨壅盘鲎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：力、亟，1 签字日期：1 ”年土月 叶了 导师签名： 签字日期矽年夕月彩日 天津大学硕士学位论文白念珠菌c a r c k 2 基因的克隆与鉴定 1 1 酵母菌简介 第一章文献综述 1 1 1 酵母菌是一类单细胞真菌 酵母菌是一类主要以单细胞形式存在，以细胞出芽或横裂的方式进行繁殖的 真菌的统称【。 酵母菌有6 0 个属，约5 0 0 个种。酵母细胞一般呈卵圆形、圆形、圆柱形或 柠蒙形。茵落形态与细菌相似，但较大较厚，呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠， 易被挑起。酵母细胞一般直径为5 1 0 微米，由细胞壁、细胞质、细胞核、细胞 膜、液泡等构成，具有真正的细胞核和完整的细胞器【2 】。酵母菌属于兼性厌氧微 生物，在有氧或无氧的状态下都能够生存。酵母菌分布很广，在含糖较多的蔬菜、 水果表面分布较多，在空气土壤中较少。 酵母菌形态虽然简单，但生理却比较复杂，应用也是多方面的。在工业上用 于酿酒，酵母菌将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸入细胞内，在无氧的条件下， 经过内酶的作用，把单糖分解为二氧化碳和酒精，此过程称为发酵。在医药上， 因酵母菌富含维生素b 、蛋白质和多种酶，菌体可制成酵母片，治疗消化不良。 并可从酵母菌中提取生产核酸类衍生物、辅酶a 、细胞色素c 、谷胱甘肽和多种 氨基酸的原料。 酵母菌种类繁多，常用于科研的典型菌种有酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 、裂殖酵母( s c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e ) 、白念珠菌( c a n d i d a a l b i c a n s ) 等。 1 1 2 酿酒酵母：一种真核生物模式菌 酿酒酵母，又称啤酒酵母或芽殖酵母( b u d d i n gy e a s t ) ，属于半知菌亚门，芽 孢菌纲，隐球酵母目，隐球酵母科，酵母属。细胞呈圆形或椭圆形，以出芽方式 生长，能形成子囊孢子。在实验室培养时，绝大部份茵落呈乳白色，表面平滑， 稍显光亮，部份菌株菌落粗糙具皱折p 】。 早在二十世纪三十年代，w i n g s 和他的同事们就开创了酿酒酵母遗传学研 第一章文献综述 究，大约1 0 年以后，l i n d e g r e n 和他的同事们也开始了全面的研究工作，这两个 研究小组的工作揭示了酿酒酵母遗传学的基本原理和基本方法【3 】。1 9 9 6 年4 月， 在国际互联网的公共数据库中公布了酿酒酵母的完整基因组序列 ( h t t p ：w w w y e a s t g e n o m e o r g ) ，它被称为遗传学上的里程碑。酿酒酵母1 2 0 6 8 k b 的全基因组序列中含大约5 8 8 5 个o r f s ( o p e nr e a d i n gf r d m e ) 【4 】，它们分布在 1 6 条染色体上，这是人们第一次获得真核生物基因组的完整核苷酸序列。 今天，酿酒酵母被广泛认为是一种理想的用于生化和遗传学研究的真核微生 物，作为一种模式生物在实验系统研究方面具有许多内在的优势。首先，酿酒酵 母是一种单细胞生物，能够在基本培养基上生长，使得研究人员能够通过改变物 理或化学环境条件控制其生长【5 】。其次，酿酒酵母在单倍体和二倍体的状态下均 能生长，并能在实验条件下较为方便地控制单倍体和二倍体之间的相互转换，对 其基因功能的研究十分有利。如在单倍体状态下，只需一次基因替换，就能得到 某个特定基因缺失的菌株；而对于一些缺失后致死的基因，人们可以在二倍体菌 株中对其中一个等位基因进行基因替换，获得杂合子( h e t e r o z y g o t e ) 嘲。此外， 酿酒酵母繁殖一代大约需要2h ，很适合用于遗传学分析。更重要的是，目前已 发展了一些非常有效的技术使得酿酒酵母基因组中6 0 0 0 个基因中的任何一个基 因均能被突变的等位基因取代，甚至从基因组中完全缺失，这种方法具有很高的 效率和准确性【7 l 。 酿酒酵母作为高等真核生物特别是人类基因组研究的模式生物，其最直接的 作用体现在生物信息学领域。当人们发现了一个功能未知的人类新基因时，可以 迅速地从酿酒酵母基因组数据库中检索与之同源的功能已知的酿酒酵母基因，并 获得其功能方面的相关信息，从而加快对该人类基因的功能研究。研究发现，有 许多涉及遗传性疾病的基因均与酿酒酵母基因具有很高的同源性，研究这些基因 编码的蛋白质的生理功能以及它们与其它蛋白质之间的相互作用将有助于加深 对这些遗传性疾病的了解【8 】，【9 】，1 1 0 】，【1 1 】。此外，人类许多重要的疾病，如早期糖尿 病、小肠癌和心脏疾病，均是多基因遗传性疾病，揭示涉及这些疾病的所有相关 基因是一个困难而漫长的过程。酿酒酵母基因与人类多基因遗传性疾病相关基因 之间的相似性将为我们诊断和治疗这些疾病提供重要的帮助。 随着更多高等真核生物遗传信息的获得，人们将会发现有更多的与高等真核 2 天津大学硕士学位论文白念珠菌c a r c k 2 基因的克隆与鉴定 生物基因具有同源性的酿酒酵母基因，因此酿酒酵母基因组在生物信息学领域的 作用会显得更加重要，这同时也会反过来促进酿酒酵母基因组的研究。与酿酒酵 母相比，高等真核生物具有更丰富的表型，从而弥补了酿酒酵母中某些基因突变 没有明显表型改变的不足。 酿酒酵母作为模式生物的作用不仅是在生物信息学方面，它为高等真核生物 基因提供了一个可供检测的实验系统，即通过同源基因与酿酒酵母基因的功能互 补来确证该同源基因的功斛1 2 1 。在酿酒酵母中进行功能互补实验无疑是一种研究 人类基因功能的捷径。如果一个功能未知的人类基因可以补偿酿酒酵母中某个具 有已知功能的突变基因，则表职两者具有相似的功能。而对于一些功能已知的人 类基因，进行功能互补实验也有重要意义。例如与半乳糖血症相关的三个人类基 因o a l k 2 ( 半乳糖激酶) 、o a l t ( u d p 半乳糖转移酶) 和g a l e ( u d p - 半乳糖异构 酶) 能分别补偿酿酒酵母中相应的g a l l 、g a l 7 、g a l l 0 基因突变1 1 3 1 。在进行互 补实验以前，人类和酿酒酵母的乳糖代谢途径都已十分清楚，对有关几种酶的活 性检测方法也十分健全。随着人类三个半乳糖血症相关基因的克隆分离成功，功 能互补实验成为可能，从而在遗传学水平进一步确证了人类半乳糖血症相关基因 与酿酒酵母基因的保守性。人们又将这一成果予以推广，利用酿酒酵母系统进行 半乳糖血症的检测和基因治疗，如区别真正的突变型和遗传多态性，在酿酒酵母 中模拟多种突变型的组合表型，或筛选基因内或基因间的抑制突变等【1 3 1 。这些方 法也同样适用于其它遗传病的研究。 利用同源基因与酿酒酵母基因的功能，还能使酿酒酵母成为其它生物基因的 筛查工具。通过使用特定的酿酒酵母基因突变株，对人类e d n a 表达文库进行筛 选，从而获得功能互补的克隆。如t u g e n d r e i c h 等利用酿酒酵母的细胞分裂突变 型( c d cm u t a n t ) 分离到多个在人类细胞有丝分裂过程中起作用的同源基因。利用此 方法，人们还克隆分离到了农作物、家畜和家禽的多个基因【1 4 】。为了充分发挥酿 酒酵母作为模式生物的作用，除了发展酿酒酵母生物信息学和健全同源基因在酿 酒酵母中进行功能互补的研究方法外，建立酿酒酵母最小基因组( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a eb a r em i n i m a lg e n o m e ) 也是一个可行的途径。酿酒酵母最小基因组是指 允许酿酒酵母在合成培养基中生长所需的最小基因数目的基因组【1 5 】，f l 叼。人类 e d n a 克隆与酿酒酵母中功能已知基因缺陷型进行遗传互补可以确定人类新基 第一章文献综述 因的功能，但是这种互补实验可能会受到酿酒酵母基因组中其它丰余基因的影 响。如果构建的酿酒酵母最小基因组中所保留的基因可以被人类或者病毒的 d n a 序列完全替换，那么替换后的表型则完全依赖于外源基因的功能，这将成 为一种筛选抗癌和抗病毒药物的分析系统。 1 1 3 白念珠菌：人体内最重要的致病真菌 白念珠菌( c a n d i d aa l b i c a n s ) 是人体内最重要的机会型致病真菌，属半知菌 亚门，芽孢菌纲，隐球酵母目，隐球酵母科，念珠菌属，常存在于人体的皮肤及 口腔、胃肠道和阴道黏膜。在健康人体内一般不弓i 起疾病或仅引起轻微表皮感染， 但在a i d s 患者、器官移植病人以及经过化疗和理疗的癌症病人等免疫能力低下 的人群中，很容易引发严重的系统真菌感染，危及病人生命【堋。白念珠菌致病 能力与菌丝的形成和发育密切相关，近年来一直是人们研究的热点【i8 】。 白念珠茵是二倍体，能以酵母( y e a s t ) 、假菌丝( p s e u d o h y p h a e ) 和菌丝 ( h y p h a e ) 三种形态存在。酵母态是圆形或椭圆形单细胞；假菌丝是一串延长的 酵母态细胞，细胞间有缢缩；菌丝细胞间无缢缩( 图1 - 1 ) 。白念珠菌从酵母态向 假菌丝态或菌丝态的转换是通过细胞的极性生长实现的，菌丝态细胞更易于附着 和侵入宿主组织，逃避人体免疫系统的攻击。 图1 1自念珠菌血清诱导菌丝的发育过程【9 1 f i g 1 - 1c a n d i d aa l b i c a n sh y p h a ld e v e l o p m e n tp r o c e s si n d u c e db ys e r u m 注：i ，单细胞酵母状( 3 0 0 c y p d 培养基中) ；2 - 4 为白念珠菌细胞在类似于人体 4 天津大学硕士学位论文 白念珠菌c a r c k 2 基因的克隆与鉴定 条件( 3 7 0 c 含1 0 小牛血清) 的y p d 培养基中诱导菌丝的发育阶段，2 ，芽管 形成( 诱导1 小时) ；3 ，生长中的菌丝( 诱导2 小时) ；4 ，成熟的菌丝( 诱导5 小时) 。 p h 、温度、营养和诱导因子等多种环境因素都可影响白念珠菌形态的转换。 白念珠菌在p h4 5 和温度2 5 的条件下只形成酵母态，而在p h6 5 7 0 和温度 3 7 的条件下，或在氮源缺乏培养基上，或加入诱导因子如血清、l 脯氨酸和 n _ 乙酰葡萄糖胺等都可以诱导和促进菌丝的生长【2 0 】。如图1 1 所示，在营养丰富 的y p d 培养基和3 0 条件下，白念珠茵只以酵母态芽孢繁殖。当y p d 培养基 中加入1 0 d 、牛血清且温度改变为3 7 时，1 h 后细胞便不再以芽孢方式生长， 而是形成菌丝的初期阶段一芽管，2 小时后芽管进一步延长发育成菌丝，5 小时 后便可见成熟的菌丝。以上外界环境因素通过不同的信号转导途径调节白念珠菌 细胞内转录因子的活性以控制一系列应答基因( 如菌丝特异性基因和细胞壁合成 基因) 的表达，最终实现对细胞形态转换的调控。随着现代分子生物学技术的发 展和白念珠菌基因组测序( h t t p ：w w w c a n d i d a g e n o m e o r g ) 的完成，人们对白念 珠菌菌丝发育遗传调控的研究已经发展到了全基因组水平。基因组测序结果显示 白念珠菌中大约含有6 3 5 4 个可能的基因【r 丌。目前已经发现和鉴定的信号转导途 径有m a p k 级联途径、c a _ m p p k a 途径、p h 应答途径、双组分( t w o - c o m p o n e n t ) 途径和t u p l 介导的负调控途径等多种信号转导途径等 1 s l ( 如图1 - 2 ) 。 1 2 酿酒酵母h o c r m a p k 级联途径与抗氧化胁迫 1 2 1 氧化胁迫与氧化损伤 氧是生命活动的物质基础，参与细胞的新陈代谢。细胞的有氧代谢会产生具 有强氧化性的活性氧( r o s ，r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ) ，主要包括超氧阴离子 ( 0 2 、) ，过氧化氢( h 2 0 2 ) 和羟自由基( o h ) 等。同时细胞内也存在多种抗氧 化系统协同作用清除活性氧，维持细胞内活性氧代谢的平衡。而当细胞处于环境 胁迫条件下，如重金属毒害，细胞内累积大量的活性氧，引起细胞内许多具有生 物活性的生物大分子包括核酸、蛋白质等结构和功能异常，造成氧化损伤。不同 的金属离子引起细胞氧化损伤的机制不同。其中，过渡态金属离子如f g ”、c r 第一章文献综述 通过f e n t o n 反应催化h 2 0 2 生成氧化性更强的o h ；而h 矿、c d 2 + 能够与具有催 化活性的巯基基团相结会，进而挪制具有重要生物功能的蛋白质及酶类，特别是 一些具有抗氧化活性的蛋白质的活性。z n 2 + 是许多酶类的辅助因子，z n 2 + 的缺乏 导致细胞对氧化胁迫进行应答所需的酶功能异常，进而造成氧化胁迫；高浓度的 z n 2 + 弓l 起哺乳动物细胞中的h 2 0 2 浓度上升口1 1 ，进而通过与c d 2 + 类似的机制抑制 谷胱甘肽还原酶和过氧化物酶引起氧化胁迫圆。 图1 2 调控白念珠菌菌丝发育的信号转导途径 f 远1 - 2s i g n a lt r a n s d u c f i o np a t h w a y sr e g u l a t i n gc a n d i d aa l b i c a n sh y p h a l d e v e l o p m e n t 1 2 2 酿酒酵母b o g - m a p k 途径与抗氧化胁迫 在长期的生物进化过程中，生物组织已经形成了精确而敏感的适应机制使其 能够准确地感受周围环境的变化并激活胞内信号转导途径，进而对外界环境刺激 作出准确的应答。m a f k ( 垦垂t o g e n - a _ c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s e ) 级联系统是细胞适 应外界环境过程中一个重要的组成部分。m a p k 级联系统由三个相继激活的激 6 天津大学硕士学位论文白念珠菌c 艘c = 2 基因的克隆与鉴定 酶组成：m a p k k k 磷酸化并激活m a p k k ，m a p k k 再激活m a p k ，将信号一 级一级传递到细胞核内并产生信号应答嘲。酿酒酵母至少存在五条m a p k 信号 转导途径：细胞壁结构维持的细胞完整性途径，孢子形成途径，菌丝形成和侵袭 生长途径，信息素应答途径以及h o g ( 野g ho s m o l a r i t yg l y c e r o l ，高渗透甘油) 途径【2 4 】。 h o g - m a p k 途径对于酿酒酵母在高渗透条件下的生长是必需的，酵母细胞 在高渗条件下可以通过合成以及贮存可溶性的渗透调节物如甘油来提高内部渗 透压，调控水的外流以及细胞循环嘲。其核心分子为m a p kh o g l ，受m a p k k ( m a p kk i n a s e ) p b s 2 的调控。丽p b s 2 受其上游两个分支途径的分别调控。其 中，一条分支途径是由膜蛋白s l n l 感受外界信号并激活m a p k k k ( m a p k k k i n a ) s s k 2 或s s k 2 2 。另一条途径是由跨膜蛋白s h o l 激活m a p k k ks t e l l 。 当其中任意一条分支途径被激活均可引起h o g l 的t h r l 7 4 和t y r l 7 6 双磷酸化， 并从细胞质向细胞核转移，调控核转录因子h o t l ，m s n 2 ms i l = 4 ，s k o l 和s m p l ， 进而调节胁迫响应基因的表达嘲。利用d n a 微阵列分析技术表明在高渗胁迫下， h o g l 进入细胞核内后可以调控6 0 0 多个基因的表达 2 7 1 。 研究发现裂殖酵母( s c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e ) 中也存在与酿酒酵母 h o g m a p k 途径同源的s t y lm a p k 的途径，易被渗透胁迫，热休克，d n a 损 伤和氧化胁迫所激活嘲。以往的研究只发现酿酒酵母h o g - m a p k 途径能被渗透 胁迫激活，但最新研究发现h o g l 也能被氧化胁迫激活，并通过r e k 2 起作用。 1 2 3 酿酒酵母戤2 配基因研究进展 酿酒酵母胄e 融和尺c 豳基因最初由瑞典科学家d a h l k v i s t 等在研究酿酒酵母 对紫外线的敏感性时发现的。r c k l 基因位于酿酒酵母第7 号染色体l 臂上，其 o r f 包含1 5 3 6 个碱基，编码一个5 8 k d a 的蛋白，在细胞中微量表达。r c k 2 基因位 于酿酒酵母第1 2 号染色体上，其o r f 包含1 8 3 0 个碱基，编码一个6 5 k d a 的蛋白， 在细胞中丰量表达。r c k l 和r c k 2 所编码的蛋白都属于受胞内第二信使调控的 s e r t h r 蛋白激酶家族，僵它们跟c a 2 + c a m ( c a m o d u l i n ) 调控的蛋白激酶家族的 同源性也非常高。在酿酒酵母中分别缺失这两个基因后，细胞仍能够存活，说明 它们均属于非必须基因。最初的研究表明r c 列和r c 配基因可能与细胞的生长和 分裂有关。d a h l k v i s t 等在研究中发现酿酒酵母r c k l 和r c k 2 基因能抑止裂殖酵母 7 第一章文献综述 ( s c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e ) 的细胞周期关卡基因突变1 3 0 】。裂殖酵母关卡基因 突变造成的紫外线敏感可以被r c k l 和矗c 怼的过量表达所弥补，而且在裂殖酵母 中表达r c 耵和r c k 2 能够导致细胞延长及减速生长，这种现象可能是由于表达 r c 斛和r c 豳基因能够导致裂殖酵母细胞周期中的g 2 期造成的。e - 【a m _ q e 等人的研 究还发现r c k l 和r c k 2 能够抑止酿酒酵母的减数分裂【3 l 】。r c k l r c k l 缺失株( 双倍 体菌株) 在标准孢子分生培养基上进入减数分裂所需要的目寸间大约是野生型细胞 的一半，r c k 2 r c k 2 缺失株也有类似但相对较弱的表现，同时双敲除了r c k l 和 r c k 2 基因的菌株与r c k l r c k l 缺失株有类似的表形。在减数分裂关卡基因m e c l 或 r a d 2 4 的完全缺失株中，过量表达置c 幻或r c k 2 ，特别是足c 纪，熊够有效地降 低细胞减数分裂的能力。 b i l s l a n d 等在2 0 0 0 年发表的研究中指出，r e k 2 p 属于m a p k 激活的蛋白激酶 ( m a p k a p k ) ，作用于h o g m a p k s 径的下游，是h o g l 的底物 3 2 1 。他们通过免 疫共沉淀分析和以h o g l 为“饵”的酵母双杂交分析发现h o g l 能与r c k 2 p 的c 端结 合。h 0 9 1 在胞内和胞外都可以磷酸化r c k 2 p 的s s j 9 ，j i $ 5 1 9 的磷酸化能够导致r e k 2 p 激酶活性增加。过量表达r c k 2 p 可以部分抑制矗叫4 或p 撕勿细胞对外界高渗透环 境的敏感。h o g m a p k 途径过渡激活造成的细胞毒性反应可以被r c 也的敲除所 压制。在野生型酿酒酵母细胞中过量表达r c k 2 p 的激酶缺陷型突变体r c k 2k 2 0 1 r 能够降低细胞对外界高渗环境的耐受程度，而在h o g l a 细胞中却无此现象。t e i g e 等的研究也表明r c k 2 p 需要经磷酸化而被激活1 3 3 】。在渗透胁迫条件下或 h o g - m a p k j 金径过度激活的的条件下，r c k 2 p 的磷酸化水平瞬间增加。他们的实 验证明磷酸化的r c k 2 p 可以激活翻译延长因子2 ( e f - - 2 ) 的活性。 在细胞中过量表达m a p k k ( m a pk i r l a s ek i n a s e ) p b s 2 的持续激活型突变体 p b s 2 p d d 可以过渡激活h o g m a p k 途径，导致细胞致死表型，而缺失r c k 2 基因 可使细胞对这种毒性作用有所抵抗1 3 4 1 。这种作用可能与r c k 2 p 的激酶活性有关， 而与其c 末端自主抑制序列无关。因为在r c k 2 a 缺失株中表达全长或c 末端缺失 1 2 3 个氨基酸残基i 拘r c k 2 p 能够互补上述毒性降低的过程而其激酶缺陷型突变体 r c k 2k 2 0 1 r 则不能。r c k 2 pc 末端存在着一个潜在的m a pk i n a s e 结合位点 ( t i l q r s s 9 r 5 9 0 k k v q ) ，r c k 2 pr 5 8 9 a r 5 9 0 a 突变体不能与h o g l p 结合。 b i l s l a n d 等继续对r c k l 基因和r c k 2 基因的功能进行研究并在2 0 0 4 年发表 8 天津大学硕士学位论文自念珠菌c a r c k 2 基因的克隆与鉴定 的文献中指出，r c k l 、五c 2 和h o g - m a p k 途径共同作用于酵母细胞对外界氧 化胁迫应激的应答嘲。酵母细胞处于氧化胁迫环境下时，h o g l 和r e k 2 的磷酸化 水平上升，h o g l 从细胞质迁移到细胞核，而且这个过程与r e k 2 有一定的关联。 r c k 2 , j 缺失株在c d 2 + ，z n 2 + 和t b o o h 等多种氧化胁迫环境下存在生长缺陷。此外， 他们还利用r e k l p 和r c k 2 p 为“饵”进行酵母双杂交分析鉴定了多种与抗氧化胁迫 有关的蛋白，例如r e k l p 能和转录因子y a p 2 相互作用而r e k 2 p 则可以与z n 2 + 转运蛋白z r e l 相互作用。s w a m i n a t h a n 等研究发现了r c k 2 p 在高浓度z n 2 + 条件 下的迅速降解i 蚓。在正常条件下r e k 2 p 在酵母细胞内的半衰期为6 0 m i n 以上， 而当酵母细胞暴露于5 m mz n 2 + 条件下时，r e k 2 p 在5 r a i n 内完全降解。这个过程 可以被p e p 4 缺失或外加的p m s f ( p h e n y lm e t h y ls u l p h o n y l _ f l u o r i d e ) 所造成的 囊泡降解途径的抑制所阻止。该研究还发现r c k 2 p 的降解只由z n 2 + 造成的氧化 胁迫引起，而与由c d 2 + 和t b o o h 造成的氧化胁迫无关。 酿酒酵母r c k 2 发挥抗氧化胁迫功能可能是通过调节氧化胁迫造成的蛋白 质翻译过程中核糖体解离这一过程，进而调控其翻译后表达实现的 3 7 1 。在氧化胁 迫条件下r c k 2 a 细胞中多核糖体的解离程度要远高于野生型细胞。过量表达激酶 缺陷型r e k 2 p 突变体r e k 2k d 能够导致细胞对氧化胁迫的高度敏感，而且细胞 中多核糖体解离程度降低，但是细胞内蛋白质表达水平却与野生型细胞相似，说 明此时的多核糖体为非活化状态。在r c k 2 z l 细胞中进行微阵列分析显示总m r n a s 和多核糖体相关m r n a s 的转录水平明显下降。上述结果表明细胞在氧化胁迫条 件下的多核糖体重组需要r e k 2 的参与。 1 3 本论文的研究内容与意义 白念珠菌和酿酒酵母的很多生物学过程非常相似，基因组的同源性也非常 高。酿酒酵母作为真核生物模式菌，遗传分析手段非常完善，对白念珠菌生物学 和致病机制研究提供了非常有利的手段。我们对于白念珠菌c a r c k 2 基因的研究 基本上是在和酿酒酵母r c k 2 基因相比对的基础上进行的。 1 3 1 本论文的研究内容 本论文研究的内容主要涉及两个方面，一是克隆了白念珠菌c a r c k 2 基因， 9 第一章文献综述 二是将其导入酿酒酵母r c k 2 ：k a n r 缺失株，研究了它对酿酒酵母r c k 2 基因的功 能互补情况。具体包括： ( 1 ) 白念珠菌c a r c k 2 基因的克隆 我们通过生物信息学的手段在白念珠菌基因组数据库中查找到了与酿酒酵 母r c k 2 同源的基因c a r c k 2 ，通过a l i g n 分析了它们之间的同源性。我们提取 了白念珠菌野生型菌株s c 5 3 1 4 的基因组d n a ，通过p c r 反应扩增了c a r c k 2 基因( 共2 8 4 8 b p ，其中包含p r o m o t e r7 3 6 b p ，o r f1 7 7 0 b p ，t e r m i n a t o r3 4 2 b p ) ， 并将它连接到酿酒酵母表达载体p r s 3 1 6 上，构建了重组质粒p r s r c k 2 。通过 酶切和测序检测了插入片断的正确性。 ( 2 ) 白念珠菌c a r c k 2 基因对酿酒酵母r c k 2 基因的功能互补 我们将重组质粒p r s r c k 2 转化到酿酒酵母r c k 2 ：k a n r 缺失株，在含氧化剂 的培养基上观察它能否使r c k 2 ：k a n r 缺失株重新获得在氧化剂培养基上的生长 能力。 1 3 2 本论文的研究意义 众所周知，氧化损伤是人体衰老的主要因素，是当科研的重要靶标。酿酒酵母 和白念珠菌都是真核生物的模型菌，其抗氧化损伤机制可能与人的非常相似。我 们深入研究白念珠菌氧化损伤的机制可使人们更好的理解人体衰老的原因，且对 现代医疗和保健品的开发也具有非常重要的意义。 酿酒酵母抗氧化损伤是通过h o gm a p k 信号转导途径实现的，r c k 2 作为 h o g l 的底物起着非常重要的作用【3 2 】，【3 3 1 - 【3 5 】。本论文在与酿酒酵母r c k 2 基因相比 对的基础上，研究了白念珠菌c a r c k 2 基因的抗氧化损伤功能，希望能够加深人 们对真核生物抗氧化损伤机制的理解。 l o 天津大学硕士学位论文白念珠菌c a r c k 2 基因的克隆与鉴定 2 1 实验材料 2 1 1 菌种 第二章实验材料与方法 本实验中用到的菌种见表2 - 1 。 表2 1 本实验中用到的菌株 1 h b l e2 1s w a i n su s e di nt h i sw o r k 菌株类别菌株名称基因型来源 e c o l i t o p l 0 sc e r e v i s i a e f m 。r a ( “”h 8 d i t m s m 晌c ) 8 0 i a c z 本实验室 m 5 1 ：础r p s l l ( s “t r r l 3 ) e 9 n 墨d a1 呻n u p 7 g 6 9 7 删u 保存 g a l k 1 ， m a t aa d e 2 1l e u 2 - 3 ，1 1 2u r a 3 1h i s 3 1 1t r p l l a w 3 0 3 1 a e a n l 0 0 & c e r e v i s i a eb y 4 7 4 1 m a t ah i s 3a 1l e u 2 a om e t l 5 a ou r a 3a o b y 4 7 4 2 m a t ah i s 3 1l e t t 2a om e t l 5a ou r a 3a o 最c e r e v i s i a er c k l ：k a n r & c e r e v i s i a er c k 2 ：k a n r cd i b i c a n ss c 5 3 1 4 r m l o o o m a t a h i s 3 1l e u 2 a o m e t l 5 a o u r n 3 a o r c k l ：k a n m x 4 m a t ah i s 3 1l e u 2 a 0 m e t l 5 0 u r n 3 a o r c k 2 ：k a n m x 4 u r a 3 fu r a 3 u t a 3 ：i m m 4 3 4 a u m 3 ：i m m 4 3 4a h i s l ：h i s g 1 1 i s l ：h i s g 本实验室 保存 本实验室 傈存 本实验室 保存 l j i a n g 2 0 0 4 l j i a n g 2 0 0 4 本实验室 保存 本实验室 保存 第二章实验材料与方法 2 1 2 质粒 本实验中用到的质粒见表2 - 2 。 表2 - 2 本实验中用到的质粒 1 i a b l e2 - 2p l a s m i d su s e di nt h i sw o r k 2 1 3 主要实验仪器 本实验中用到的主要仪器见表2 - 3 表2 3 本实验中用到的主要仪器 t a b l e2 - 3 i m p o r t a n ta p p a r a t u su s e di nt h i sw o r k 1 2 天津大学硕士学位论文白念珠菌c a r c k 2 基因的克隆与鉴定 2 1 4 培养基 l b 培养基：蛋白胨1 0 9 ，酵母提取物5 9 ，n a c l1 0 9 ，溶于1l 双蒸水，ln n a o h 调p r t 至7 0 。0 1 m p a 灭菌2 0 m i n 。配固体l b 时外加1 2 9 琼脂粉。 l b + a m p 培养基：1 ll b 培养基中加入1m l5 0 m g m l 的a m p 母液。 l b + a m p + x - g a l 培养基：+ 在事先制备好的l b + a m p 平板表面加4 0 m l x - g a l 储液和4 r ai p t g 储液，用无菌玻棒将溶液涂匀，置于3 7 c t 放置3 - 4h ，使培 养基表面的液体完全被吸收。 y p d 培养基：蛋自胨2 0 9 ，葡萄糖2 0 9 ，酵母提取物1 0 9 ，溶于1l 双蒸 水。固体培养基外加2 0 9 琼脂粉。o 1 m p a 灭菌2 0 m i n 。 y p d + 5 m m z n c l 2 ：预先配制2 5 m z n c l 2 母液，高压灭菌。每1 l 配好的 y p d 培养基加入2m lz n c h 母液，高压灭菌。 y p d + 2 0 0 p mc d c l 2 ：预先配制o 1mc d c h 母液，高压灭菌。每1l 配好 的y p d 培养基加入2m lc d c h 母液，高压灭菌。 y p d + 2 5m mh 2 0 2 ：将新鲜购买的1 5 的h ：0 2 母液用0 2p m 滤膜过滤除 菌，每1l 灭菌后的y p d 培养基5 5 恒温后加入5 7 0 “i h 2 0 ：母液。 s d - - l e u 培养基：酵母氮源6 7g ，葡萄糖2 0g ，加双蒸水至9 0 0m l ，固体 培养基外加琼脂粉2 0 9 。o 1 m p a 灭菌2 0 分钟。5 5 c ；b n 过滤除菌的1 0 x a r n i n oa c i d m i x - - l e u1 0 0 m l 。 s d u m 培养基：酵母氮源6 7 9 ，葡萄糖2 0 9 ，加双蒸水至9 0 0 m l ，固体培 养基外加琼脂粉2 0 9 。0 1 m p a 灭菌2 0 分钟。5 0 c ；b n 过滤除菌的1 0 a m i n oa c i dm i x 1 3 第二章实验材料与方法 一u m1 0 0 m l 。 c m s d 培养基：酵母氮源6 7 9 ，葡萄糖2 0 9 ，加双蒸水至9 0 0 m l ，固体培养 基外加琼脂粉2 0 9 。o 1 m p a 灭菌2 0 分钟。5 0 加过滤除菌的1 0 x a m i n oa c i dn f i x 1 0 0 m l 。 2 1 5 试剂 本实验中用到的主要试剂见表2 - 4 表2 - 4 本实验中用到的主要试剂 t a b l e2 - 4 i m p o r t a n tm a t e r i a l su s e di nt h i sw o r k 1 4 天津大学硕士学位论文 白念珠菌c a r c k 2 基因的克隆与鉴定 a r ：分析纯，b r 卑：生化试剂 2 1 6 常用溶液与缓冲液 a m p i e i l l i n 母液( 1 0 0 m g m 1 ) ：溶解1 9 a m p i c i l l i n 于足量的水中，最后定容 至1 0 r a l 。使用0 2 2 t a m 滤膜、注射器在超净台上进行滤膜过滤灭菌。分装成小份 于- 2 0 贮存。 5 m 氯化钠( n a c l ) ：溶解2 9 2 9 氯化钠于足量的水中，定容至1 0 0 m l 。 1 0 n 氢氧化钠( n a o h ) ：溶解4 0 0 9 氢氧化钠颗粒于约0 9 l 水的烧杯中( 磁 力搅拌器搅拌) ，氢氧化钠完全溶解后用水定容至1 l 。 i o s d s ( 十二烷基硫酸钠) ：称取1 0 0 9 s d s 慢慢转移到约含o 9 l 的水的 烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至1 l 。 1 m 氯化镁：溶解2 0 3 9m g c l 2 6 h 2 0 于足量的水中，定容到1 0 0 m l 。 1 m 氯化钾：溶解7 4 6 9 氯化钾于足量的水中，加水定容到1 0 0 m l 。 3 m 乙酸钠：溶解4 0 8 9 的三水乙酸钠于约9 0 m l 水中，用冰乙酸调溶液的 p h 至5 2 ，再加水定容到1 0 0 m l 。 2 5m 氯化锌：溶解3 4 1 9 的氯化锌于足量的水中，加水定容到1 0 0 m l 。高 压灭菌。 o 1 m 氯化镉：溶解1 1 3 9 的氯化镉于足量的水中，加水定容到5 0 m l 。高压 灭菌。 1 0 m g i n l 溴化乙锭：小心称取1 9 溴化乙锭，转移到广口瓶中，加1 0 0 m l 水， 用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解。用铝箔包裹装液管，于4 c 贮存。 t r i s 缓冲液：将1 2 1 9 的t r i s 碱溶解于约0 9 l 水中，加4 6 m l 浓盐酸( 1 1 6 n ) ， 用水调整终体积至1 l ，则p h8 0 ；加6 6 m l 浓盐酸( 1 1 6 n ) ，用水调整终体积至 第二章实验材料与方法 1 l ，则p h 7 6 。 0 ，5 me d t a ：配制等摩尔的n a 2 e d t a 和n a o h 溶液( o 5 m ) ，混合后形成 e d t a 的三钠盐。或称取1 8 6 1 9 的n a 2 e d t a 2 h 2 0 和2 0 9 的n a o h ，并溶于水 中，定容至1 l 。 t e 缓冲液( 用于悬浮和贮存d n a ) 成分及终浓度配制1 0 0 m l 溶液各成分的用量 1 0 m mt f i s h c l l m me d ，i a 才( 1 m l1 mt r i s - h c l ( p h 7 4 - 8 0 ，2 5 c ) 2 0 0 t t l 0 5 m e d t a ( p h8 0 ) 9 8 8 m l 5 0 x t r i s - 乙酸( t a e ) 缓冲液( d n a 电泳用) 成分及终浓度配制1 l 溶液各成分的用量 2 m t r i s 碱 i m 乙酸 1 0 0 m v l e d t a 水 2 4 2 9 5 7 1m l 的冰乙酸( 1 7 4 m ) 2 0 0 m l 的0 5 m e d t a ( p n8 0 ) 补足l l 碱裂解液i ：5 0 m m 葡萄糖，2 5 m v l t r i s c 1 0 h 8 0 ) ，1 0 m m e d t a ( p h 8 0 ) 。 溶液i 可成批配制，每瓶1 0 0 m l ，高压灭菌1 5 分钟，储存于4 4 c 冰箱。 碱裂解液i i ：0 2 m n a o h ( 临用前用1 0 m n a o h