（化学工艺专业论文）具有生物农药功能的有机肥生产工艺的研究.pdf

郑州大学硕士学位论文 摘要 烟草青枯病和黑胫病是我国烟草两种主要的土传病害之一。目前生产上主要 采取综合防治措旖，包括栽培抗病品种、化学防治和生物防治等，但由于都存在 着各自的局限性而无法从根本上进行防治。生态防治将生态学原理应用于病害的 防治，是一种病害防治的新思维、新途径。本研究采用从原位土壤的细菌、放线 菌和真菌中筛选出对烟草青枯病、黑胫病等具有生物防治功能的高效拮抗菌株， 并将其接种于农业固体废弃物中，在将其制作成有机肥过程中拮抗菌大量增生。 合理施用有机肥或将有机肥与生物防治或抗性菌应用相结合，将可以起到改善和 修复土壤生态环境，提高土壤和烟株自身抗御病害的能力，减少肥料和化学农药 使用，改善烟叶品质和实现烟叶生产的可持续发展。 本文对烟草青枯病和黑胫病的拮抗菌进行筛选，获得6 株防治青桔病和2 株防治黑胫病潜能较大的拮抗菌，并以拮抗菌中抑制青枯病效果较好的菌株t 5 为考察目标，研究了其发酵条件和具有抑制烟草青枯病功能的烟草专用肥生产工 艺，包括适宜的接种时期、接种量和大量繁殖所需的时间等因素研究；拮抗黑胫 病的机理。研究结果如下： 1 、从福建烟田的病株中分离出烟草青枯病病原菌，从其原位土壤中经过分 离纯化得到4 0 种土壤菌株，经过平板拮抗法筛选后得到对青枯病菌有明显抑制 作用的5 株土壤细菌和1 株真菌，分别命名为t 1 、t 2 、1 3 、t 4 、t 5 和t 6 ，其 中菌株t 5 的拮抗带最大，菌落拮抗带达1 0 2 2 1 4 m m 。 2 、烟草青枯病拮抗细菌发酵条件的研究表明，抑制效果较好的拈抗菌t 5 在2 0 4 0 范围内均能生长，最适宜的生长温度为3 5 ；4 2 4 h 为对数生长期； p h 值为5 o 9 0 。进行该菌的液体培养与扩增时，在相同的接种量下，2 5 0 m l 三角瓶的最佳装瓶量为1 2 q m l 。通过正交试验法获较佳的液体培养基为蔗糖1 5 g ，i 一、牛粪堆肥2 0 0 9 ，l 、蛋白胨4g ，i 。、牛肉膏1 5 叽。 3 、以牛粪为原料生产抑制烟草青枯病的有机肥研究，选用了抑制烟草青枯 病效果较好的t 5 菌株作为生产用接种体，通过控制堆肥的温度和接种时问来生 产有机肥。在8 0 的水浴中连续加热堆肥2d 将堆肥中的土著细菌降低到 5 3 l 0 9 1 0 c f u 馆( 干基) ，冷却后立即接种，4 0 下培养3d ，得到约1 2 l o g l o c 兀j 悖( 干 基) 的高浓度堆肥产品。大用试验表明：该有机肥有一定的防病作用，青枯病防 郑州大学硕士学位论文 治率在3 5 。 4 、从河南省罗山县和舞阳县烟区采集土壤样品中，经分离纯化获得6 个真 菌菌株，采用平板对峙法发现其中2 株真菌对烟草黑胫病菌( 脚鲫琅珐口m ，l i 妇n 口g ) 有明显的抑制作用，分别将其命名t y 一1 和t y 3 。耐1 菌主要拮抗机 理为营养竞争和寄生作用而b 3 菌拮抗机理主要是拮抗作用、寄生作用和营养 竞争作用。 关键词：烟草青枯病、烟草黑胫病、拮抗菌、生态防治、有机肥 塑塑查堂堡圭兰垒笙壅 a b s t r a c t t o b a c c ob a c t e r i a lw j l ta i l db l a c ks h a n l 【a r ct h em o s tp o p u l a r 似os o i l - b o m e d i s e 弱e gi nt o b a c c ol e a fp r o d u d i o ni no l i rc o u n t r y a tp r c s e n t ，a l t h o u 曲s e v e r a l j m e 盯a t e da 鲥c l l l t u r a ls t e p si n c l u d i n gd i s e a s e - r e s i s t 姐tv a r j e t i e s ，c h e m j c a lf i i n 百c i d e s a n db i o l o 画c a lc o n t r o l 甜n ，a r et a k e nt oc o n 虹o lt h ed i s e a s e ，t h ed i s e 舔ec o u l dn o t b e c o n 仃0 1 1 e ds u c c e s s f i l l l y ，b e c a u s ee a c hs t e ph a ss o m el i m i t a t i o n so rw e a h c s s e si p r a c t i c e s e c o l o g i c a lp r o t e c t i o n 柚dc o m r o li s an e wt h o u g h ia n dm e t l l o d ，w h i c h a p p l i e sp r i i l c i p l e0 fe 0 0 l o g yt 0p k m td i s e a s ec o n 虹0 1 砸曲i y 胡k t i v ea n t a g o l l i s t i c s t 胁sw i t hb i o l o g i c a lc o n t r o lo ft o b a c c 0w i l t 姐db l a c ks h a l l ka ”s c r e e n c df 如mm e b a c t e r i a ，a c t 缸o m y c e t 髂皿df u n g io ft h ep a r e n ts o i l sa n di i l 仃i ) d u c e d 矗i t oa 酣c u l t i l r es o i i d w a s t e s ，i l l c r c 邪ec 0 璐i d e m b l yi nt i i e0 0 m p 0 s t sp r c p a r e dw i t ht h ew 舔t 鹪，i nt h es t u d y nc 托妇p v ea n di e s l o r em ee c o l o 每c a 量e n v i r o n m e n to fs o i l ，e n h 锄c et l l ea b i l i t i e so f s o i la n dt o b a ot 0s u p p r e s sp l a n td i s e 勰c s ，r c d u c et h eu s eo ff c n i l i 髓瑙a n dc h e m i c a l 如n 西c i d e s ，i 呻r o v c t h e q u a l i t yo ft o b a c c 0l e a fa n d a c h i e v et h cs u s t a i n 裔b l e d e v e l 叩m c n to ft o b a c c ol e a fp m d u c t i o nt h m u g ha p p l j c a t i o no fo 唱a 1 1 i cm 如u r eo r c o m b i n a t i o nw i 山b i o l o 西c a lc o n 打o l 釉du s eo f 孤t a g o n i s t i cb a c t e r i a 1 1 l ca n t a g o n i s t i cs t r a i l l s t o b a o c 0w i l ta n db l a c ks h a l l l 【w e r es c r e e n c dj nt l l i s s t u d y 6a n t a g o n i s 恤s t r a i l i so ft o b a c c 0w i l ta n d2s u p p 陀s s i v ef u n g io ft o b a c c ob l a c k s h a l i kw i t hg o o dp o t e t i a lb i o c o n 幻lo rs u p p r e s s i v ef u n c t i o nw 盯eo b t a i n e d ，s t r a i nt 5 ， h a v i n gab e t t e re 盘色c ta g a i n s tt o b a c c ow i l ti i lt l l e s ei n h i b i t o r ys 订a i n s ，w a su s e da sa o b j e c t i v cs t r a i l l 柚dt t l ep r o d u c t i o np r o c c s so fs p c c i a io 瑁a i l i cm 柚u r ew i t h s u p p r c s s i v ef u n d b nt ot o b a c c ow i l tw 舔e x p l o r e d ，i n c l u d i n gt h es t u d yo f 也e s ef a c t o i s s u c ha sf e a s i b l ei n o c u l a t j o nt h e ，洫) c u l a t i o nq u a n t i t y 柚da b u n d a n ti n c r e a s et i m e 甜 以m e a n w h i l et l l ei l l h i b i t o r ym e c h a n j s mo ft o b a c c ob l a c ks h 姐kw a ss t u d i e d r e s u i t s a r ea sf o l l o w s ： l 、t h ep a i h o 璺e n i cb a c t e r i ao ft o b a c c ow i l tw e r ei s o l a t e df r o mm ed i s e a s e 虹a i n si n t o b a c 。0p l a n t sf 如mf u j i a p r o v i n c et o b a c c of i e l d a f f e rj s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，4 0 t r a i n so fs o i lb a c t e f i aw e f eo b t a i n e df r o mf h es a m et o b a c c o6 d d ，a n d6k i n d so ft h e s o i ls t r a i 璐，n 锄e dt 1 ，他，t 3 ，t 4 ，t 5a n dt 6 ，w e r ei d e n t i 丘e d h a v j n g o b v i o u s l y 郑州大学硕士学位论文 a n t a 9 0 n i s t i ce f f e c to np a t h o g e l l i cb a c t e i i ao ft o b a c c ow i nb yp l a t i n gc u l t u r em e t h o d a m o gt l l es i xs t m i n s ，t h ca i i t a g o n i s t i cz o n eo ft 5 ，b e j ga b o u t1 0 2t o2 1 4m m ，w a s t h ew i d e s t 2 、1 1 l ee x p e r i m e n to ff b l l l l e t a t i v ec u l t u r a lc o n d i t i o no ft h ea n t a 9 0 n i s t i cs t r a i n s j n d i c a t e dt h a tt l l eb a c a l 掣o w mt e m p e m t u r cf o rt 5w e r e2 0 4 0 ，t h eo p t j m 啪 t e m p e n t u r ew a s3 5 ，t l l el o g a r i t h mc j m eo fg m w t l lw 硒4 2 4 h ，p hr a n g e d5 o 9 0 t h eo p t i m 啪c i l l t u r em c d i u mv o l u m e 啪s1 2 0 r l i n2 5 0 i i l in a s ki nt h es 擒e j n o c l a t i o nl e v e lw h e nt h el i q u i db a c t 甜aw a sp m d u c c d t h eo r t h o 留o n a lt e s ts h o w e d t h a tt l l e o p t i m u mc o m p o s j t i o n so fl i q u i d c l l l t l i r cm e d i u mw e r cs u c r o s e ( 1 5 l ) ， c o m p o s tm a n u r e g ，l ) p e p t o n e ( 4g ：l ) ，b 戗| fp ( h e 坟1 5 l ) 3 、d a i r ym a n u r ec o u l db eu s e da st h er a wm a t e r i a if o rp r o d u c i i o no fs p e d a i o 玛a n i cm a n u r cw i t i ls u p p r e s s i v ef u n c t i o nt ot o b a c c ow i l t ，a d h et 5s t m i i l 勰t l l e i n o c u l u m b u t ，t l l et e m p a 衄ei nd a i 珂伽p c 融叠n di n o c u l a t i n gt i m es h o l db e c o n n d l l e ds t r i c l l yi nt l i ep m c e s so fo r g 趾i cm 如u f ep m d u c t i o n ka d d i t i o n ，t h e p o p u l a t i o d e n s i t yo fm c s o p i l i l i cb a c t e r i ai i lm e 锄p o s ts h o u l db er e d u c e dt oa r o u n d 5 3 l o g l o c f u ，g ( d r yw e i g h t ) b 了m a i m a i n b gt h ec o m p o s ta t8 0 f 讲2di nh o tw a t e r b a t l l ，趾dt h ej n o c u l 呦0 0 u l db ca p p l j e di 1 1 】匝e d i a t e l ya f c e rt l l et e i n p e m t u r ei nc o m p o s t d r o p p e dt o4 0 t h e nt h ei n o c t l l a t e dm a t 鲥a lw a sc i l l t u r e da t4 0 f o r3d ，t l l e p o p u l a t i o nd e n s i t yo ft h es u p 舯瑚i v eb a c t e r i u mc o u l di n c r c a s et o1 2 l 0 9 1 0 c f u ，g ( d r y w e i g h t ) i nt h ec 嘞p o s t 1 1 l e 丘e l de x p 咖e n t ss h o w e dt h a tt l l i so r g a i cm a n u r eh a d s o m ee 妊e c to nt o b a c c ow j l tc o n 仃o l ，t h em t eo ft o b a o w i l tc o n t r o lw a sa b o u t3 5 4 、a f t c ri s 0 1 a t i o na n dp u r i f k a t i o n ，6f u n g u ss 俩n sw e r co b t a i l l e df 如ms o i l s 锄p j e sc o l l e c t e df l d mt o b a c c o 矗e l di nh o s h a na n dw u y 姐gc o u n t d e s ，h e n a n p r o v j n c e ，p a j 血gc u l i u f ee x p e r i m e n t si n d i c a t e dt 量l a t2f i l n g t l sa m o n gt h c6s t r a i f l s ， n 8 m c dt y 一1 衄dd - 3r e s p c c t i v e l y h a d 印p a r e n ta i l t a 9 0 i s t i ce f f c c to nt o b a c c ob l a c k s h a n ki 砌y 锄胁d ，。口n f c d 靠口甩4 已) ，a dt h ea n t a g o n i s t i cm e c h a n i s ma p p e a r e d ob e p a r a s i t i s ma n dn u t r j e n tc o l n p e t i t i o nf o rd 1 ，a i l t i b i o s j s ，p a r a s j t j s ma j l dn u 仃i e n t c o m p e t i t i o nf o r1 y 一3 k e yw o r d s ：t o b a c c ow j l t ，t o b a c c ob l a c ks h a n k ，a t a 9 0 n i s l j cs t r a i n s ，e c o l o 西c a l p r o t e c t i o na n dc o n t r o l ，o r g a i l i cm a i l u r e t v 邦州大学硕士学位论文 1 前言 由于全球生态环境破坏的严重性和能源短缺，已促使人们抛弃“石油农业” 逐渐走向对环境友好和资源循环利用型的“生态农业”或“有机农业”，即可持 续发展农业。可持续农业的发展要求减少化肥和农药施用，尽可能利用自然的、 生态的、生物自身的和资源循环利用等方式来获取人们所需的农产品。我国烟叶 常年种植面积为1 ，5 0 0 万亩左右，虽然只占我国耕地面积的很小一部分，烟草和 其它的轮作作物生产也会对我国的农业生态环境都会产生影响。另外，我国人均 土地面积少，合理轮作制度得不到有效推广，严重的重茬现象导致烟草病虫害加 重，加大了化学农药的使用量、病虫害抗药性增强、天敌减少、烟叶生产对农药 的依赖性加强等，这不仅降低了土壤自然生态环境的自我调节功能，而且由于烟 叶中化学农药残留量增加，为我国烟叶和卷烟的出口设置了“绿色壁垒”，同时 也会引起社会对吸烟与健康关系问题新的纠缠。 烟草青枯病和黑胫病是一类重要的烟草土传病害，它们通常侵染烟草根部， 引起作物根部乃至全株的病害，造成重大的经济损失。生产上主要采用抗病品种 和作物轮作等农业措施来防治烟草土传病害病，但是由于抗病品种需要抗病基因 多样化，并且受环境的影响比较大，防治效果不理想。作物轮作也是防治烟草青 枯病和黑胫病的有效方法之一。但是由于我国人多地少，生产中正常的轮作措旖 无法实现。大量使用化学药剂来防治烟草青枯病和黑胫病会造成环境污染，药物 残留对人体身体健康有害。同时，化学农药的长期使用，病原菌易对其产生抗药 性，因而导致防治效果下降甚至防治失败。大量研究表明，烟田土壤中不仅存在 引起烟草病害的微生物而且也存在多种多样的非致病性的、提高烟草健康的有益 微生物，因而烟草的生物防治以及生态防治日益受到重视。生物防治措施是利用 有益微生物降低植物病原菌对植物的危害。生态防治则是通过向土壤引入拮抗微 生物、培肥土壤和提高土壤中生物多样性等措施，进而使土壤微生态达到平衡， 最终通过土壤中不同生物之间的拮抗与竞争实现对土壤病害的防治。 本文首先筛选高效抗烟草青枯病和黑胫病的菌株，进而研制具有生物防治功 能的专用有机肥，通过向烟田施用这种功能性有机肥起到为烟株生长发育提供全 面营养、提高烟叶品质、改良土壤、改善和修复土壤生态环境、提高士壤和烟株 自身抵御土传病害的能力，从而达到减少化肥和农药用量的目的。 郑州大学硕士学位论文 2 文献综述 2 1 烟草青枯病的研究概况及其防治措施 烟草青枯病是一种由布可氏杆菌( 血厶渊胁s d 肠，l 口c 印删埘) 引起的系统性侵 染病，烟株一旦染病往往造成整株死亡，其危害往往是毁灭性的，因此常常给烟 草生产造成重大经济损失。多年来，该病在我国南方烟区普遍发生，发病面积达 1 6 ，5 1 3 h m 2 ，造成的损失多达2 ，3 6 6 万元【1 】a 高温、高湿和多雨的天气导致的潮湿 植地环境有利于该病害的大面积流行。烟草青枯病病原菌主要随植物残体遗落于 壤中越冬，也能在种子内或田间其它寄主体内越冬，带菌的土壤、病残组织和 有含有病菌的有机肥料等是本病的主要初染源，病害的传播主要靠灌溉水、雨水、 带病苗、农具、病土以及人畜的活动等陋3 1 。目前在生产中尽管采用化学药剂防 治卜q 、生物防治【7 、合理轮作鸭埔，u l 、种植抗病品种【1 2 鹕和调整烟苗移栽期 等综合措施加以防治，但也无法杜绝该病的发生。 2 1 1 青枯病发生原因及其生态分析 烟草青枯病的病原菌是细菌，病菌以腐生或存活于土壤、肥料和病株株体中 越冬，由流水、雨水、昆虫和被污染的肥料、病菌、农具、人畜及含菌的泥土传 播，从寄主的根部或茎部伤口侵入。在福建、湖南等地5 月中、上旬初见病株， 6 月上、中旬为发病高峰期，整个发生期4 0 5 0d 。决定烟草青枯病始发期和消 长动态的主要生态因子有很多，但最为主要的是当地的气温、湿度和土壤因子。 当久雨和大雨后转晴，气温急剧升到2 8 以上时开始发病，气温回升越早、越 高，始发期越早；当久雨后转晴，气温急剧上升到3 0 以上时，田问病情进入 加剧期。通常情况下，土壤粘重且排水不良的烟田最早出现病株，但发病较轻， 而土壤孔隙度大，升降温快，晴天日夜温差大的砂质土、砂壤土和土层浅薄的烟 田，因5 月下旬至6 月上旬大阵雨、暴雨或大暴雨的高温高湿天气多，雨后转晴 气温一般都在2 8 3 2 ，加上地膜覆盖烟畦，膜下土温高达3 3 3 6 ，最适宜 该病菌的侵染，所以发病率也最重。 除上述诱发烟草青枯病发生的自然因素外，该病能够大面积流行并造成严重 损失的更为重要原因则是我国烟田土壤微生态系统的破坏。长期以来烟硐不良的 耕作、施肥和管理方式，如大量化肥和农药的施用、有机肥施用量减少、长期连 该内容已和 4 南农业科学2 0 0 6 年第2 期发表，见j f 什件。 2 郑州大学硕士学位论文 作等导致土壤微生态系统遭到严重破坏、微生物区系失调，土壤失去了自身的调 节能力，因而无法抑制某些病原菌的大量滋生，从而造成病害的严重发生。这一 论点已被许多研究所证到1 5 。 2 1 2 当前烟草青枯病主要防治措施及存在的问题 在病害发生期采用化学防治方法防治青枯病，有时可以迅速控制病害的流行 【9 ，铡。化学药剂防治见效快、方法简单易行，但农药的施用易产生农药残留而降 低烟叶的安全性，长期使用化学药剂也会增强烟草青枯病病原菌的抗药性，并使 土壤的微生态系统更加失调，因而不利于烟叶生产的可持续发展。 生物防治主要是利用微生物来防治植物病害，即利用有益微生物来影响或抑 制病原菌的生存及其活力，从而降低植物病害的发生率或发病程度等。其防病机 理主要包括利用抗菌素、细菌素或噬菌体杀死病原菌或抑制病原菌的增殖；拮抗 菌与病原菌之间的位点及营养竞争；诱导寄主抗性：通过控制环境条件降低病原 菌的密度等【2 1 侧。目前用于烟草青桔病生物防治的抗性菌大部分是从土壤、根 际或植物体表分离而得。通常这些菌在室内或者小区试验时表现出一定的拮抗作 用，但在大田条件下成功的例子尚不多见脚删。其中的原因可能有以下几点： ( 1 ) 复杂的土壤生态环境，常使拮抗菌在土壤中不能大量繁殖，因而无法发挥 抑制病原菌的作用1 7 ，现勰l ；( 2 ) 抗性菌在寄主体表或体内不能正常定殖m 冽： ( 3 ) 抗生菌在数量和获得的营养等方面与土壤微生物竞争处于劣势，因而无法 成为优势菌p 0 埘i ：( 4 ) 拮抗菌抑菌范围窄【3 3 】等。 烟草生产中实行作物轮作制度也是防治烟草青枯病的另一途径，国内外对此 有着一致的意见【1 1 m3 列。烟叶青枯病的病原菌能够在土壤中存活数年，如果连 作，病菌就可以有丰富的食料和熟悉的生活环境而得以大量繁殖，使其侵害烟草 的强度和频度大大提高。轮作的好处是尽可能地不给病原菌的取食和繁殖留下适 宜的生态环境条件，使土壤中有害生物的群体得以迅速衰减，达到减少或者减轻 烟株发生土传病害的目的。用不易感病的作物轮作能够降低病原菌的数量，如与 禾本科作物进行轮作或采用水早轮作等都能抑制烟草青枯瘸的发生杠1 0 1 。但 是，由于我国人多地少，存在严重的粮烟争地现象，因此在通常情况下合理轮作 难以实现，并且这一措旋也只能在一定程度上对青枯病进行控制而无法彻底消 除。 郑州大学硕士学位论文 种植抗病品种是防治烟草青枯病的经济而有效的理想途径【1 1 t1 2 1 。但是，一般 来说，要选育和引起具有抗病基因多样化、品种抗性不过早和过快丧失等多种优 良性状的品种并非易事。就抗病品种而言，烟草对青枯病的抗性是由多基因控制 的，其抗性水平也易受许多环境因素的影响l ，我国曾经引进美国一些抗病品种， 经过一定时间的种植后有，这些品种的抗性大大减低。因此，单独使用抗病品种 往往无法满足我国烟草行业的稳定生产。 另外，加强烟田管理如及时清理发病烟田病残体以减少初染源、适时排灌、 合理密植改善通风透光条件以提高抗病能力等，但这些措施只能在一定程度上减 缓病害的发生，并不能根除。适时早播、适时移栽，避开病害高发期也可以在一 定程度上防止青枯病的发生，但该措施常因烟株生长发育期的要求而受到很大限 制。 2 1 3 调节土壤微生态平衡和作物自身抗病机制防治烟草青枯病害 烟草青枯病害是一种典型的土传病害，以往防治土传病害的方法主要是进行 土壤灭菌。灭菌的方法通常有2 种，一种是药剂灭菌如采用氯仿及其替代品进行 土壤灭菌( 氯仿因与大气层臭氧消失有关，已被禁止使用) ，但药剂灭菌易造成 土壤残留而影响苗的生长。另一种方法是采用热水灭菌【朔，该方法虽然不残留 药害，但非常耗能。除上述缺点之外，这2 种方法更为严重的后果是灭菌后形成 了一种土壤生物真空，因而一旦土壤受到病原菌侵染，会导致病原菌的大爆发而 造成更为严重的后果p 8 l 。因此，人们在总结过去防治士传病害的成功与失败的 基础上，已逐步转向生态防治【1 7 ，铷。 土壤中存在着各种各样的生物，在肥力较好的土壤中各种生物之问存在着一 种平衡，由于它们之间在营养、生存空间等方面的存在着激烈的竞争，使得每种 生物都不容易过分滋生，从而呈现出较强的自我调节能力。因此，通过调节土壤 微生态，利用土壤自身的调节起到抑制土传病害的目的，这已有较多成功的例子 【柏郴】。 如前所述，由于我国多年来大量化肥和农药施用、有机肥施减少、单一种植 等已导致土壤微生态严重破坏，从而失去了自我调节能力。因此，我们就必须采 取措施恢复土壤的微生态平衡。 4 郑州大学硕士学位论文 合理施用有机肥是有效改善土壤微生物平衡的最佳方式之一。通过施有机肥 可以提高土壤中有机质含量，恢复被破坏的土壤生态，创造一个更加稳定和适宜 各种生物生长繁殖的环境，从而建立起复杂的土壤生物体系。这样，通过生物之 间的竞争来抑制有害生物的大量繁殖，达到控制土传病害的耳的。 传统的生物防治方法是将拮抗菌直接施入土壤中，而土壤微生物对外来“入 侵者”有强烈的排斥作用，拮抗菌进入土壤中以后，由于环境不适、营养不足等 原因无法充分繁殖而成为优势菌，因而发挥不出应有的拈抗作用【3 0 ，3 剖。所以， 根据土壤微生态原理的营养抗性理论，应该在抗生菌的使用和生产方法上加以改 进。改进的方法之一是应尽量从原位土壤进行抗生菌的筛选，以便于该微生物施 入土壤后能较快适应当地的生态环境；改进之二就是在应用抗生菌的同时配合充 分的营养，让抗生菌在营养上处于优势，从而保证其在数量上也处于优势。改进 之三就是抗生菌的施用量要大，使其一开始就占据有利的生态位。改进之四就是 生物农药或抗生药剂的生产方法。由于以往的生物农药或抗生菌剂的生产价格较 高，在田间施用量上往往受到限制。因而在生产上必须采用廉价原料，如采用农 业生产中的有机固体废弃物，就像生产堆肥那样进行大量生产、降低生产成本以 利于推广应用。这样就可以在施用有机肥的同时也带入大量的抗生菌。由于为拮 抗菌提供了良好的营养和环境条件，因而可促进其大量生长繁殖而达到抑病的目 的。 生态防治与植物诱导抗性相结合。植物体内系统存在多种抗性机制，但植物 在未受到病原菌的威胁时一般不表达。当人为地向植物根际接种一种弱毒性病原 菌时，就会诱导植物潜在的抗病基因转为抗病表达型，从而对将来更有毒性的病 原菌产生一种有效的抵抗力。因此，抗性诱导将病害控制对策由病原一寄主互作 的外系统转向互作的内系统，增强了对病害的可控性和预防性明。由于诱导 抗性具有非专化性、系统性和持久性以及无公害性等特征，其应用可达到多抗、 高抗和环境保护等多种目标。 诱导因子多种多样，因而也便于生产和推广利用。m u l l i n s 等人【4 8 】采用一种 h r 诱导物，可以激活许多重要作物的生长和保卫系统，用该诱导物喷施于植物 叶片或进行浸根处理，不仅可以使植株获得对几种主要病害的系统抗性，还可以 提高植株的根系活力。h a j s o n 【4 9 】的研究表明在烟草根部接种青枯病菌的死菌能 郑州太学硕士学位论文 诱发植物体的抗性，这些经诱导的植株对于致病性青枯病菌有强烈的抑菌作用。 g o l d s t e i nf 5 0 1 也证明在田间施用堆肥和堆肥发酵液可以激活植物的许多抗病基 因。 总之，生态防治是一种病害防治的新思维、新途径，它将生态学原理应用于 病害防治，克服了以往“末端治理”的缺点。而通过旌用有机肥改善和修复土壤 生态环境，创造出适宜于丰富多样的土壤生物生长的环境，提高土壤和烟株自身 抗御病害的能力、减少肥料和化学农药使用，改善烟叶品质，从而实现烟叶生产 的可持续发展。 当然，正如通常的生物防治一样，生态防治也不像化学农药、杀菌剂那样见 效快，它需要较长的时间培养才能建立一个健全的生物防控体系，这种体系一旦 建立就可以长期抑制或者减少病害发生。 2 2 烟草黑胫病的研究概况及其防治措旌 烟草黑胫病是由烟草疫霉菌( 矾伊t d 加d m 玎f c d 砌n 口eb r c d ad eh a 柚t 1 l k c r ) 引 起的一种毁灭性土传真菌病害1 5 n 。该病属于维管束系统性病害，在我国北方烟 区普遍发生，一旦发生，就很难控制，我国每年平均因烟草黑胫病造成的经济损 失达1 亿元以上【5 2 1 ，严重阻碍了我国烟草行业的可持续发展。植物病理学家认 为植物发病与寄主、病原菌和环境这三个因素有密切关系，当病原菌与易感寄主 相遇在适宜的环境中，植物就开始发病，如果修改或根除这三者中的任何一个， 就可以减轻或控制植物病害【5 3 】。而目前生产上一般通过采用抗病品种烨5 6 1 ，作 物轮作p 7 堋】、化学防治【捌、诱导抗性m6 1 j 以及生物防治【6 2 6 5 】等综合防治措施来 防治烟草黑胫病。但是由于种种条件的限制，无法根除该病。本研究在分析当前 主要防治措施的基础上，结合生物防治以及施用有机肥来调节土壤微生态环境来 防治该病。 2 2 1 烟草黑胫病的发生原因与分析 烟草黑胫病是一种真菌性的土传病害，带菌的土壤、粪肥及灌溉水是烟草黑 胫病的主要初侵染源，其次为带病烟茁。黑胫瘸病菌以土传为主，由风雨、流水、 灌溉水、粪肥、病士、病苗、农事操作为传播途径，从烟草根部和茎基部入侵， 瘸株上产生的孢子囊和游动孢子借雨水或灌溉水传播，可引起再侵染。烟草黑胫 病菌主要集中在距土表0 5 c m 的范围内活动，以在土壤、粪肥中的病残体上的 郑州大学硕士学位论文 厚垣孢子和休眠菌丝体越冬，可以在土壤中存活3 年左右陋6 7 】。其发生流行与温 湿度有密切关系【删，高温、高湿有利于该病害的发生。平均气温在2 4 5 3 2 最 适合病菌侵染，在2 8 3 2 发病最快，湿度是烟草黑胫病流行的限制因子1 6 9 1 ，雨 后相对湿度保持在8 0 以上3 5d ，田问会出现发病高峰，加上地膜覆盖可保温 保湿，地膜土温升高，田间湿度大，加快了病菌侵染和病害发生。 除上述诱发烟草黑胫病发生的自然因素外，作者认为该病能够大面积流行并 造成严重损失的更为重要原因则是我国烟田土壤微生态环境遭到破坏。在造成烟 草土传病害严重发生的因素中，土壤因子和农业措施( 耕作制度、施肥和管理方 式) 所占比重较大，如偏施化学肥料和农药，缺乏有机肥，长期连作和复种，导 致土壤生态肥力下降、养分失调、形成不利于作物健康生长而有助于病原菌侵染 的土壤微生态环境，导致病菌的大量滋生，影响烟草生长发育，从而制约了其产 量和品质。 2 2 2 当前防治烟草黑胫病主要措旌及存在的阃题 种植抗病品种是控制烟草黑胫病最经济有效的措旆，它具有经济有效、效果 稳定、不会出现人畜中毒和污染环境的优点。但是采用抗病品种防治烟草黑胫病 不但考虑品静的抗病水平与稳定性。还要顾及其产量和质量，以及适应不同的环 境的能力，这样会给选育品种增加压力：另外，该病菌的游动孢子在适宜的环境 中能够快速大量繁殖，迅速侵染烟草根部和茎基部，而使烟草可以在一个季节中 多次侵染发病并且还可以与其它病害混合发病，常导致抗病品种抗性丧失，从而 影响烟草的稳定生产。 化学防治可以在短期内快速有效地防治该病的有效措施。种植烟草时，利用 土壤熏剂( 如溴甲烷、氯化苦、威百亩等) 能够成功地降低土壤土传病原菌的数 量，但这种方法成本高，长期反复使用会导致农药残留而污染土壤环境以及病菌 的抗药性等问题，并且还会杀死促进植物生长的有益微生物，从而灭菌后形成的 “生物真空”，一旦病原菌入侵会造成严重的后果。在烟草发病期使用化学农药 短期内有效果的，但黑胫病侵染期长，化学防治难以长期奏效。并且烟草是叶用 作物，施用化学农药后会影响其品质而阻碍烟草的可持续发展。 作物轮作亦是防治烟草黑胫病的另外一个有效途径i 。在烟草生产中采用作 物轮作制度可以避免黑胫病害积累，在同一块地里连作同作物数年，许多植物 郑州大学硕士学位论文 疾病因熟悉土壤环境而大量繁殖并且在土壤中积累，用不易感病的作物轮作能够 打破这种循环，从而减少病原菌的数量。如重病区可与水稻、高粱、玉米、甘薯、 大豆等作物实行3 5 年轮作能够控制和减轻黑胫病害【5 8 j ；轮作的另一个好处可 以有利于恢复和调节土壤肥力，可做到合理地用地养地，以保持和提高土壤肥力， 从而使烟草能够茁壮生长，增强其抑制病害的能力l 川。但是，由于我国人多地 少，存在严重的粮一烟争地现象，因此在通常情况下合理轮作难以实现，并且这 一措施也只能在一定程度上对青枯病进行控制而无法彻底消除。 另外，加强烟田管理如及时清理发病烟田病残体以减少初染源、适时排灌、 合理密植改善通风透光条件以提高抗病能力等，但这些措施只能在一定程度上减 缓病害的发生，并不能根除。适时早播、适时移栽1 7 ”，避开病害高发期也可以 在一定程度上防治黑胫病的发生，但该措旌常因烟株生长发育期的要求而受到很 大限制。 生物防治烟草黑胫病是病原菌与拮抗微生物之间的相互作用的结果。拮抗性 细菌、真菌或放线菌能够产生抑制病原菌的生长、孢子萌发或孢子形成的抗生素 或有毒的代谢产物；直接寄生病原菌；与病原菌营养竞争。不论是那种抑常5 病害 机理，有必要确定和维持拮抗菌的抑制病害的极限水平，如果拮抗菌的数量或活 性低于这一极限，那么烟草疫霉菌可能发展而引发病害。水有利于烟草疫霉传播， 烟草疫霉孢子能够在水中萌发( 如图2 1 m 】) ，产生的孢子囊释放游动孢子并且能 图2 - 1 在适宜的环境中疫霉菌的孢子囊释放孢子 够通过流动的水转移到新的感染地；烟草感病组织可能产生孢子囊和游动孢子并 且这些孢子通过水传染其它烟株，从而引发大面积烟草黑胫病害。但是如果生物 控制有效，在发病的关键时期，拮抗微生物有效地阻碍了病原菌发展，从而防止 郑州大学硕士学位论文 病害的发生。在某些情况下，拮抗菌通过产生的拮抗物质溶解病原菌的菌丝、孢 子或抑制病原菌的孢子形成而降低病原菌菌的数量( 图2 2 1 7 2 】) 。研究表明m 7 4 l ， 图2 - 2 树皮堆肥发酵液破坏疫霉菌孢子 对于抑制烟草疫霉的土壤来说，增加有益微生物数量与降低病害发生率或严重性 有一定的相互关系，这些有益微生物由土壤中起营养作用的高度有机物质所维 持。 目前防治烟草黑胫病菌的生防菌主要是从根围分离的真菌、细菌和放线菌 【7 4 f7 5 1 ，这些根围拮抗菌生活在烟草根圈内、与烟草有密切关系，可在烟草根部定 殖和存活并可通过多种机制来减轻或防治烟草病害，从而减少烟叶产品的损失。 但是目前许多利用拮抗菌生物防治烟草黑胫病的研究主要集中在土壤中反复使 用单一菌来抑制烟草病害，这种方法在实验室或小区内防治效果较好，在大 田中成功的不多，这可能是因为拮抗菌株在土壤不具广泛的适应性、不能有效利 用土壤中各种营养、在变化的环境中不能正常定殖烟草根围【删和产生抑制病害 的代谢产物等，很难大面积推广应用。与之相对应的是h o i t j k 【4 1 ，4 2 j 等人运用多种 拮抗菌的混合制剂和通过有机堆肥管理和运用拮抗微生物体系来已经成功地防 治园艺业、苗圃中的一些土传植物病害，但是利用这一措施在我国防治烟草黑胫 病方面还没有引起足够的重视。 2 2 3 利用有机堆肥管理拮抗微生物体系防治烟草黑胫病 在园艺业、高价值的作物和盆基质中，合理使用有机肥已经成功地防治了根 腐土传病害f 柏 4 2 5 0 ，7 7 9 1 有机肥之所以能够抑制土传病害是因为它培育了个 有大量有益微生物存在的多样化的土壤环境，并为那些与植物病原菌竞争、寄生 于病原菌或以病原菌为食和产生抗生素的有益微生物提供了个营养来源和避 9 郑州大学硕二l 学位论文 难场所，使有机肥中多样化的有益微生物在土壤中大量增生、调节了土壤微生态 平衡，从而抑制了孢子萌发和防止植物染病。研究表明【舯】，土壤中有益微生物 的生物防治功能大小或强度与土壤中微生物的总活性宣接相关。土壤活性微生物 量越大。它们对土壤中有机碳、营养元素和能量的竞争利用能力就越强，因而对 土壤病原菌的抑制能力就越强。向田间施入大量的有机肥能够降低一些病菌的发 病率和严重性，这就是因为土壤中微生物的活性增加，提高了与病原菌竞争碳、 氮的能力，并且产生拮抗物质使病原菌细胞溶解或促使病原菌的繁殖体休眠，最 终使病原菌致死等的结果，从根本上抑制了植物病害。 为了利用有机堆肥成功地生物防治烟草疫霉，必须考虑向土壤中引进拮抗微 生物或增强土著拮抗菌，但这很少能够成功，这是由于外来微生物与土著微生物 竞争或者不适应土壤环境而无法生存。通过向土壤中施入大量的有机堆肥来促进 拮抗微生物的大量繁殖，但是并非所有的有机堆肥都具有这样的功能p 。在土 壤表面积累的有机物质刺激烟草根向腐殖质生长，即使在土壤有机物质层下面出 现病原菌，但其并不能使“受保护”的烟根感染病害。在这种情况下，在有机质 中似乎没有引进拮抗菌而是在营养上刺激了其繁殖。利用高纤维素的有机堆肥物 质( 如牛粪) 会促进能够溶解疫霉菌菌丝或孢子的产纤维素酶的微生物大量繁殖。 如果土壤中土著拮抗菌的数量本身就不高，那么有机堆肥就很难在较短的时间内 提高其数量，也就无法提高土壤抑制病害的能力。 利用诱导抗性防治土传病害是一条利用自然微生物资源，充分发挥植物抗病 潜力的重要生防途径。诱导抗病性是利用生物、物理或化学因子处理植株，启动 植物的防卫反应，加快和增强抗菌物质的代谢活动，使植物产生局部的或系统的 抗病闱。有机肥也能诱导植物系统抗性，z i l a n g 等人【8 2 】已证明有机肥和有机肥浸 出液能够激活植物中的抗病基因。当病原菌出现时，这些抗病基因由植物“打开”， 动员植物体内的化学物质抵御病原菌入侵。但是，g o l d s t e i n 5 0 j 研究表明生长在有 机肥中的植物就已启用了这种抗病系统，所以利用有机肥改良土壤能够成功地抑 制土传病害。 针对目前防治烟草黑胫病存在的问题，依据土壤微生态原理的营养抗性理 论，我们在生产和使用生物有机肥的方法上进行调整：( 1 ) 尽量从原位土壤进行 抗生菌的筛选，以便于该微生物施入土壤后能较快适应当地的生态环境；( 2 ) 多 1 0 郑州大学硕士学位论文 种拮抗菌混和使用，这样就能够实现多种生防机制( 拮抗、竞争、诱导抗性、寄 生1 同时起作用，从而更好地抑制烟草黑胫病； ( 3 ) 降低生产生物制剂成本，象 以农业生产中的有机固体废弃物为原料作为固体培养基来大量生产拮抗菌，这样 可使生产成本降低以利于推广应用；( 4 ) 合理应用生物有机肥的浸出液，在烟草 黑胫病发病前期用于灌根处理以诱导烟草抗病，效果可能会更好( 图2 - 3 ) 。 图2 _ 3 牛粪堆肥发酵i i 芟破坏烟草疫霉孢子 ( 5 ) 向腐熟的有机肥中引入拮抗微生物，这样向土壤中施入大量有机肥同时