（高分子化学与物理专业论文）表面糖修饰的受限接近分子印迹聚合物的制备.pdf

南开大学学位论文使用授权书 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位 获得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文 ( 包括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论 文，并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将 公开的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检 索、文摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向 教育部指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和 中国学术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文 数据库，通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 1 i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答 辩；提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字： 垄魁昌 2 0 1 0 年0 5 月2 7 日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目表面糖修饰的受限接近分子印迹聚合物的制备 姓名花魁昌学号 2 1 2 0 0 7 0 6 4 8 答辩日期2 0 1 0 年0 5 月3 0 日 论文类别博士口学历硕士团硕士专业学位口高校教师口同等学力硕士口 院系所化学学院专业高分子化学与物理 联系电话 l5 8 2 2 8 8 4 9 6 2e m a i l h k c 6 6 6 m a i l n a n k a i e d u c n 通信地址( 邮编) ：南开大学蒙民伟楼1 0 6 室 备注： 是否批准为非公开论文 否 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书 馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 南开大学学位论文使用授权书 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位 获得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文 ( 包括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论 文，并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将 公开的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检 索、文摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向 教育部指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所和 中国学术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文 数据库，通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文 论文电子版提交至校图二持馆网站：h t t p ：丘0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 v i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答 辩：提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存 作者暨授权人签字：也吕 2 0i o 年口稠o 日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目 渊力绛筋爱7 磊砑透弛占柏影印加荔惑 姓名 舰岛。 学号 司o5 单8 答辩日期 ) 加年硼扣日 论文类别博士口学历硕士囱硕士专业学位口高校教师口 同等学力硕士口 院系所 以，雾矽砀 专业 乍毛方j 允礞支矿袖彳墨 ， 联系电话 ，职2 砖g t z ， e m a i l k 匕t 。1 6 6 国m ：f n 嚏n1 匕t ：l e w utp _ 、 通信地址( 邮编) ：南厨行磊膨箔械1 0 6 室 备注：是否批准为非公开论文 否 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书 馆，非公开学位论文须附 8 0 ) ； 乙醇( 分析纯，天津市化学试剂批发有限公司) 氢氧化钠( 分析纯，天津市化学试剂批发有限公司) 硼氢化钠( 分析纯，天津市化学试剂批发有限公司) ( 二) 测试仪器 核磁共振仪：美国的v a r i a n 公司的u n i t y - p l u s4 0 0m h z 核磁共振仪 红外光谱仪：美国的b i o r a d 公司的f t s l 3 5 红外光谱仪( 4 0 0 0 - - 4 0 0c m 。 k b r 压片法) ； 熔点测定仪：北京泰克仪器有限公司的双目显微x t - 4 型熔点测定仪 2 1 2 2 烯丙基葡萄糖酰胺的合成 参考m a r c e l l ac h i a r i 小组【删的工作，以葡萄糖内酯和烯丙基胺为原料，通 过葡萄糖内酯的胺解反应制备烯丙基葡萄糖酰胺。 ( 一) 实验过程( 如图2 1 ) ：取一定量的葡萄糖内酯加入到1 0 0m l 的烧瓶 中，再加入5 0m ld m f ，磁力搅拌使其溶解，然后加入过量的烯丙基胺，装上回 流冷凝，在水浴恒温5 0 下反应3h 。 h 2 n 形 od m f ，5 0 ，- h o o ho h o ho ho 图2 1 烯丙基葡萄糖酰胺的合成过程 h n a 反应液使用油泵减压，旋蒸仪旋出d m f 及过量的烯丙基胺，得到淡红色的 固体，用正己烷洗涤、抽滤，晾干，再用异丙醇重结晶两次，得到白色的固体 1 3 妥印迹聚合物的制备 1 3 c - n m r 和1 h - n m r 谱来表征。 应过程中，有两点值得注意：一 是，反应加料量，即烯丙基胺使用相对葡萄糖内酯要过量，在该实验中使用了 摩尔比大于2 ：l 的加料比，这样得到的产物中，葡萄糖内酯就可以完全反应， 而烯丙胺的沸点较低，很容易除去，为后处理带来方便；二是，反应过程中温 度要控制在5 0 以下，温度过高，低沸点的烯丙胺则因易挥发性而损失过多， 可能导致糖内酯反应不完全，产物纯化也较困难。 得到的最终产物通过熔点仪测得熔点是1 2 3 5 ( 熔程1 2 3 4 1 2 3 6 ) 与 文献值相一致。同时元素分析的结果为：n - - 5 9 7 6 0 6 ，c = 4 5 5 0 4 5 4 6 ， h = 8 0 1 8 0 9 ，与理论值：n = 5 9 6 ，c = 4 5 9 6 ，h = 7 2 3 符合性 较好； 图2 2 给出了葡萄糖内酯和烯丙基葡萄糖酰胺的瓜光谱图，从谱图对比中 可以看出，与原料葡萄糖内酯相比，1 7 3 2c m 1 处酯基的c = o 伸缩振动吸收峰消 失了，在1 6 5 0 和1 5 3 9 处分别出现了酰胺键的c = o 伸缩振动吸收峰和c - - c 的伸 缩振动吸收峰，表明葡萄糖内酯已经发生烯丙基胺发生胺解反应，开环形成了 烯丙基葡萄糖酰胺。 图2 3 是烯丙基葡萄糖酰胺的1 3 c - n m r ( d 2 0 ) 谱图，图中有九种c 的化学 位移值6 ：1 7 4 5 ，1 3 3 5 ，1 1 5 6 ，7 3 6 ，7 2 4 ，7 1 2 ，7 0 5 ，6 2 8 ，4 1 4 ，分别对应 于烯丙基葡萄糖酰胺分子结构中九种不同化学环境的碳原子，以此为即图中的 c 一4 ，c 2 ，c 1 ，c 5 ，c 8 ，c 6 ，c 7 ，c 9 ，c 3 。与文献【6 8 j 值相一致。 a 柏托勰烈2 o1 e 1 2 嘲4 0 0 w a v e n u m b e r s ( c m 1 ) 图2 2f t i r 谱图：a 葡萄糖内酯；b 烯丙基葡萄糖酰胺 1 4 霉蕃囊薯麓 叠i 舞譬 恻 l 一 i _ n -精 图2 3 烯丙基葡萄糖酰胺的1 3 c - n m r 谱图( c d c l 3 ) 图2 4 烯丙基葡萄糖酰胺i h - n m r ( d 2 0 ，2 5 ) 1 5 t量-ihe口l 妥印迹聚合物的制备 ) 谱图，其归属如下：8 3 6 8 3 8 9 ：8 4 7 5 7 ( m ，d 2 0 ) ； ( d d ，2 0 h ，c h 2 = ) ；8 5 8 8 5 ( s ，1 o h ，c h = ) 。综合以上结果， 合成了烯丙基葡萄糖酰胺。 5 5 1 5 6 5 2 4 6 表明成功的 2 1 2 3 烯丙基改性壳聚糖单体合成 参考本组前人的工作【6 9 1 ，制备烯丙基改性壳聚糖单体，其结构如图2 5 ( 一) 实验过程：称取一定量的m = 5 0 0 0 的壳聚糖，溶于一定量的水中，完 全溶解后加入到2 5 0m l 四口烧瓶中，加入适量的n a o h 和微量的n a b h 4 ，搅拌 下水浴至4 0 。缓慢滴加一定量的3 溴丙烯。滴加完后水浴升温到6 0 ，保 持此温度3h 。 h n b 2 c 岫 图2 5 烯丙基壳聚糖的结构简图 i v r l c o ch 3 ( 二) 产物处理：反应结束后，产物用醋酸中和至弱酸性。用旋转蒸发仪 蒸出大部分的水，搅拌下，将残液缓慢滴加到大量乙醇中沉淀。用离心分离， 得到粗产物；最后用水重结晶后，产物放入真空干燥箱内，室温干燥1 2h 。 产物通过红外和核磁表征证明了得到了烯丙基改性的壳聚糖单体。瓜， v n l a x c m 一：3 0 7 7 ( v h c 。) ，1 6 5 8 ( v c - c ) ；1 h - n m r ( d 2 0 ，2 5 ) ：8 0 9 6 2 ( t ， n h 2 ) ；8 1 7 2 7 ( m ，n h a c ) 8 1 8 6 1 ( s ，c o c h 3 ) ；8 2 9 3 3 ( s ，h - 2 ，2 ) ，8 3 4 3 4 ( s ，2 o h ，c h 2 ) ；6 3 4 8 - 4 0 5 ( m ，h 一2 a ca n dh - 3 ，4 ，5 ，6 ) ；8 4 5 6 3 ( m ，h 一1 ) ； 8 4 7 5 7 ( m ，d 2 0 ) ；8 5 1 4 6 5 5 1 7 ( d d ，2 o h ，c h 2 = ) ；8 5 7 2 7 ( s ，1 0 h ，c h = ) 。 1 6 中的巴比妥类血药浓度是必要的。常用的方法有液液色谱，固相萃取液相色谱， 其中分子印迹聚合物固相萃取的应用最为广泛。 传统的分子印迹聚合物多由本体聚合法制备，产物需要经过研磨、筛分后 才能用于色谱填料，费时耗力。且其形状不规则，影响柱效。因此球形分子印 迹聚合物的合成受到关注。主要有沉淀聚合，悬浮聚合及种子溶胀悬浮聚合等 方法：沉淀聚合得到的聚合物微球单分散性好，但粒径较小，难以直接装柱； 悬浮聚合法能够得到大粒径的微球，但分散性较差，且在聚合过程中需要加入 大量的稳定剂，对分子印迹效果会产生影响。种子溶胀悬浮聚合法可以得到粒 径均匀的微米级的印迹聚合物微球，直接填装h p l c 柱子进行印迹分子的选择 性分析。 本章中，我们通过无皂乳液聚合法制得微米级的p s 微球，用其做为种子， 以m a a 为功能单体，e g d m a 为交联剂，苯巴比妥为模板，通过种子溶胀悬浮 聚合法合成分子印迹聚合物。同时，在反应过程中，以含糖单体为修饰剂，通 过原位接枝聚合法引入亲水修饰糖层，得到表面糖修饰的尺寸均一的苯巴比妥 分子印迹聚合物微球，并通过一系列的h p l c 表征确定了其对苯巴比妥及其类 似物戊巴比妥的分离选择性和印迹选择性。通过糖修饰改性的印迹聚合物与未 改性的印迹聚合物蛋白吸附量的对比，探讨了改性的印迹聚合物在生物样品分 离分析领域的应用前景。 2 2 2 实验部分 2 2 2 1主要试剂及测试仪器 ( 一) 主要试剂 二甲基丙烯酸乙二醇酯( e g d m a ，分析纯，上海和氏璧化工有限公司) ； 甲基丙烯酸( m a a ，分析纯，天津瑞金特化学品有限公司) ： 1 7 苯乙烯( s t ，分析纯，天津瑞金特化学品有限公司) ； 氯仿( c h c l 3 ，分析纯，天津石英钟厂霸州市化工分厂) ； 邻苯二甲酸二丁酯( d b p ，分析纯，天津市化学试剂批发有限公司) ； 十二烷基硫酸钠( s d s ，分析纯，天津市津科精细化工研究所) ； 聚乙烯醇( p v a l 7 8 8 ，分析纯，天津市津科精细化工研究所) ； 苯巴比妥( 分析纯，北京恒业中远化工有限公司) ； 戊巴比妥钠( 分析纯，南京奥多福尼生物科技有限公司) ； 甲醇( 色谱纯，天津市科密偶化学试剂有限公司) ； 色谱用水为商品化的娃哈哈纯净水，其余常用试剂均为分析纯。 牛血清蛋白( b s a ，北京鼎国生物有限公司) ； ( 二) 测试仪器 核磁共振仪：美国的v a r i a n 公司的u n i t y - p l u s4 0 0m h z 核磁共振仪： 红外光谱仪：美国的b i o r a d 公司的f t s l 3 5 红外光谱仪( 4 0 0 0 - 4 0 0e m - 1 ) ； 扫描电镜表征：岛津h i t a c h is 3 5 0 0 n ，微球样品以乙醇超声分散进行稀释， 将悬浮液滴加到盖玻片上； 紫外分光光度计：岛津肼2 5 5 0 型。 2 2 2 2 聚苯乙烯( p s ) 种球的合成 在本节我们通过传统无皂乳液聚合法和改进的无皂乳液聚合法两种方案合 成了p s 种球。 ( 一) 传统无皂乳液聚合法：2 5 0m l 四口烧瓶，抽真空，充n 2 ，反复3 次。加 入0 2 0gk 2 s 2 0 8 及2 0 0m l 水，调节搅拌在1 8 0r p m ，逐步升温到7 5 ，2 0 “苯 乙烯( s t ) 通过滴液漏斗逐滴加入到烧瓶中，7 5 下反应2 4h 。所得产物直接 用作种子乳液。 ( 二) 改进的无皂乳液聚合法 7 0 , 7 1 】： 通过调节体系的离子强度的方法来改变乳液粒子的尺寸，2 5 0m l 四口烧瓶， 抽真空，充n 2 ，反复3 次。苯乙烯，1 7 0m l 水，一定量的氯化钠转入烧杯中， 超声处理2 0m i n ( k q 3 2 0 0 超声波清洗器) ；k 2 8 2 0 8 用3 0m l 水配成溶液；在鼓 吹n 2 的情况下，将两溶液转入四口烧瓶中，2 7 5r m i n ，水浴恒温7 0 ，反应 1 8 印迹聚合物的制备 保护。所得产物作为种子乳液 上述的两种方法得到的p s 种球通过扫描电子显微镜观测粒径大小，从s e m 照片中随机取1 0 0 个小球粒径作为样本来测量计算粒径分布；分别以上述p s 微 球为种球进行后续的实验。 2 2 2 3 亲水性糖修饰的苯巴比妥印迹聚合物的合成 苯巴比妥分子印迹聚合物合成设计过程如图2 6 采用两步溶胀【7 2 ，7 3 1 悬浮聚 合过程，反应过程中加入含糖单体通过原位接枝聚合法在聚合物微球外层共聚 上一层含糖聚合物。以p s 微球为种子，先用活化剂溶胀种球，然后将模板、功 能单体、交联剂等加入进行第二步溶胀，最后将溶胀液反应聚合脱模板，即可 得所需的印迹聚合物。 o n o o “? 一( ) 舰l 岫 一 从g 岛0 3 a l l yc h i t o s a n _ - _ _ _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ h y d r o # f i l i c m o d i f i c a t i o n t e m p l a t e 墨# y c o p o l y m m l p r o t e i n e g d m a h “溘 a ：泌n 图2 6 印迹聚合物的合成过程 采用两步溶胀悬浮聚合过程，首先取一定量的d b p 、s d s 、h 2 0 ，在冰水浴 条件下，通过超声处理，得到均匀细化的乳液，接着将适量的p s 种子乳液加入 到上述细化乳液中，低速磁力搅拌，开始第一步溶胀过程，直至细化液消失为 止。 1 9 兰 聚合物的制备 ，a i b n ，c h c l 3 ，m a a ， 超声处理，得到均匀的细 化液，将此细化液加入到第一步溶胀液中，继续磁力搅拌，进行第二步溶胀过 程，直至细化液消失。 取一四口烧瓶抽真空、充n 2 ，反复三次，除尽氧气，n 2 保护下，将上述两 步溶胀完成的溶胀液转入该烧瓶中，装上搅拌，调节转速1 4 0r p m ，水浴加热恒 温5 0 下反应4h ，再向反应瓶中加入一定量的烯丙基葡萄糖酰胺、烯丙基壳 聚糖和k 2 s 2 0 8 的水溶液，调节水浴温度为7 0 ，继续反应2 0h 。 反应液转入离心杯中，反复用热水洗，离心分离，抽滤、晾干；将得到的 产物依次用甲醇、t h f 、丙酮抽提抽提去模板，产物晾干，转入真空烘箱中，室 温下干燥，即得到含糖印迹聚合物( g l y c o m i p ) 。 不加模板苯巴比妥，其他条件不变情况下，即可得到含糖非印迹聚合物 ( g l y c o n i p ) ：同时，为了与含糖聚合物的性质进行对比，经过同样的过程，在 不加含糖单体的条件下，分别合成了不含糖印迹聚合物( m i p ) 和不含糖非印迹 聚合物( n i p ) 。所得到的四种聚合物粒子通过s e m 观察其粒径分布和形貌。 ( 一) 蛋白吸附实验 选用血液p h 条件，配制0 0 5mp h 为7 4 的磷酸缓冲溶液作为蛋白吸附实 验的缓冲液。取聚合物微球0 1 0g ，放入到2 5i i l l 的三角瓶中，用5 “的缓冲液 先润湿微球，再加入1 5 “的一定浓度的蛋白缓冲溶液( 实测初始浓度为0 5 2 5 m g m 1 ) ，水浴振荡器控温2 5 ，振摇2 4h ，离心分离，取上清液用紫外可见分 光光度计检测蛋白浓度。重复测试三次。蛋白质的静态平衡吸附量通过蛋白质 溶液浓度的变化得到，可由下列公式计算： q = ( c o c ) v m ( 2 1 ) 其中，c o 为蛋白溶液初始浓度( m g m 1 ) ，c 达到吸附平衡后蛋白溶液浓度 ( m g m 1 ) ，v 蛋白溶液体积( 叫) ，m 加入的聚合物的量( g ) 。 ( 二) 分子印迹选择性评价 聚合物微球填装入1 5 0 x 4 6m l n 的不锈钢柱中，甲醇异丙醇( 2 ：1 ，v v ) 为 匀浆液，甲醇为顶替液，柱填装时，设备压力为4 0 0 0p s i 。 色谱体系由w a t e r s5 1 0 的泵，u v - 6 0 0 0 紫外检测器，r h e o d y n e7 1 2 5 进样器， 2 0p l 定量环组成。色谱条件：流速1 0m l m i n ，检测波长2 2 5n l n ，室温，进样 量4 0 0n g ，流动相为甲醇水( 8 0 ：2 0 ，v ，v ) ，测量重复三次。 亲水性含糖单体修饰的苯巴比妥印迹聚合物的制备 留时间( 或死时间) ， 由公式 因子可由公式 k = ( t r t o ) t o ( 2 2 ) t o 分别是保留物质的保留时间和不保留物质在柱子上的保 死时间t o 通过注射甲醇来测量，印迹选择性因子【3 l 】( s ) s = k m n , k n n , ( 2 3 ) 算得，k i n , 和k n n , 分别是分析物在m i p 和n i p 上的保留因子。s 用来评价 分子印迹聚合物的印迹识别效果。 2 2 3 结果与讨论 2 2 3 1p s 种球的合成 p s 种球的s e m 照片如图2 7 所示： 图2 7 种球s e m ：a 传统无皂乳液聚合p s ib 改进无皂乳液聚合p s 传统无皂乳液聚合法合成的p s 微球的s e m 照片如图2 7 a ，尺寸均匀，平 均粒径为5 0 0n n l ：通过s e m 观测p s 种球的形态、粒径，s e m 照片如图2 7 b ， 尺寸均匀，平均粒径为1 3l a i n 。 图2 8 给出了两种方法得到的p s 的粒径分布图，粒径分布较窄。p s 种子微 球的均匀性基本相同，改进的无皂乳液聚合法得到的p s 种球粒径相对较大，对 于合成大粒径的聚合物微球具有较大优势。 2 1 饰的苯巴比妥印迹聚合物的制备 0啪a1 图2 8p s 种球粒径分布图：a 传统无皂乳液聚合p s ；b 改进无皂乳液聚合p s 2 2 3 2 亲水性糖修饰的苯巴比妥印迹聚合物的合成 烯丙基葡萄糖酰胺作为修饰改性剂，以接枝聚合的方式参与共聚，为提高 引发效率加入少量的水性引发剂，并引入具有多官能度的烯丙基改性壳聚糖作 为共修饰剂，形成网状含糖聚合物，通过化学的、物理的作用包裹在印迹聚合 物外层，以提高糖修饰改性的效率。 图2 9 为印迹聚合物、非印迹聚合物及糖修饰的印迹聚合物、非印迹聚合物 的红外光谱，含糖修饰的聚合物谱图中羟基的特征峰不明显，可能原因是糖接 枝的量较少。 明了咖 3 0 0 0z 哪刁明 1 唧1 唧 啊 图2 9 聚合物的i r 谱图a ：n i p , b ：m i p , c ：g l y c o n i p , d ：g l y c o - m i p ( 一) 聚合物粒径形貌表征 分子印迹聚合物微球及糖修饰的分子印迹聚合物微球的s e m 照片如图2 1 0 所示，其粒径均匀，平均粒径为6 5l j a n 。微球表面可以观察到有多孔结构，这 2 2 的苯巴比妥印迹聚合物的制备 利场所。 图2 1 0 聚合物微球的s e m 照片：m i p ( a ) ；g l y c o - m i p ( b ) 同时通过氮气吸附法对印迹聚合物和改性的印迹聚合物微球的比表面进行 了测量，g l y c o m i p 比表面为7 3 7 4 士2 4 8m 2 g ，m i p 比表面为2 6 2 2 0 ：1 ：7 9 5m 2 g ， 结果表明合成的印迹聚合物微球具有较高的比表面，多微孔结构，这种结构有 利于形成更多的有效识别位点。此外，对比m i p 和g l y c o m i p 的比表面可知糖 修饰的印迹聚合物的比表面约为未修饰的印迹聚合物比表面的四分之一，可能 原因是聚合物用糖层修饰后，表面包裹上了一层糖层，掩盖了部分微孔结构。 ( 二) 蛋白吸附实验结果： 蛋白吸附实验数据如表2 1 ，从表中数据可以看出，表面糖修饰的聚合物对 蛋白的吸附量明显降低，约为未修饰的聚合物蛋白吸附量的四分之一，蛋白质 与聚合物基质问的疏水相互作用是蛋白吸附的主要动力，通过糖表面修饰后， 聚合物的表面亲水性增加，蛋白质与聚合物基质间的疏水相互作用明显降低， 因而蛋白质的吸附量明显降低了。表明糖修饰后印迹聚合物具有了蛋白质受限 接近功能，有利于该材料用于生物环境样品的分析。 表2 1m i p ，g l y c o - m i p 聚合物材料对b s a 蛋白的吸附量 壁曼g q ( 里型坐1 2竺( 尘世坐坠亟堡幽 m i p0 5 2 50 4 6 61 1 8 g ! z ! q ：丛! q ：主2 蔓 q ：! ! !呈：墨 注：c o 为初始蛋白浓度，c 为吸附平衡后上清液蛋白浓度，q 为吸附量 ( 三) 印迹效果评价 巴比妥和戊巴比妥的分离选择性，各类聚合物的色谱行为曲线详见附录a ( a 1 a 4 ) 。分子印迹效果表征参数保留因子k 、分离因子a 和印迹选择性因子s 数据如表2 2 和表2 3 所示。 表2 2 苯巴比妥、戊巴比妥在n i p ，m i p ，g l y c o - m i p ，g l y c o - n i p 柱上的分离情况 奠! 丛! 旦 g ! ! 璺q ：盟! g ! 逆旦：丛! t o m i n l - 7 21 7 4 1 7 31 7 2 t m m i n 3 0 0 3 6 62 8 23 3 5 t r 2 r a i n 2 2 12 4 62 1 6 2 3 2 k l 0 7 41 1 0 0 6 30 9 5 k 2 0 2 90 4 10 2 50 3 5 a ( k d k 2 ) 2 5 52 6 8 2 5 22 7 1 s 1 4 91 5 l 注：色谱条件：流动相为甲醇，流速：1 0m l m i n ，测试波长：2 2 5n m ，进样量：2 0i l l 约为 0 4l a g ；其中，t o 死时间用甲醇测定，t r l ，k 1 分别是苯巴比妥保留时间和保留因子，垃，k 2 分别是戊巴比妥保留时间和保留因子，s 印迹选择性因子。 表2 3 苯巴比妥、戊巴比妥在n i p ，m i p ，g l y c o - m i p ，g l y c o - n i p 柱上的分离情况 n i pm i p g l y c o - n i pg l y c o m i p t o m i n 1 4 91 5 61 6 0 1 5 7 t m r a i n 4 7 6 6 1 34 1 45 3 4 t m m i n3 6 84 0 33 213 5 8 k l 2 1 92 9 3 1 5 92 4 0 k 2 1 4 7 1 5 81 0 l1 2 8 a ( k d k , ) 1 4 91 8 51 5 71 8 8 s 1 3 41 5 1 注：色谱条件：流动相为甲醇：水= 8 0 ：2 0 ，流速：1 0m l m i n 。测试波长：2 2 5n m ，进样 量：2 0 p l 约为0 4 l a g ： 由表2 2 可知，以甲醇为流动相时，苯巴比妥和戊巴比妥分离因子在m i p 上与g l y c o m i p 上基本相同，同时两种印迹聚合物的印迹选择性因子s 也相近， 物的制备 表面糖修饰过程中没 表2 3 给出了m i p 和g l y c o m i p 在含水流动相甲醇水( 8 0 ：2 0 ，v ) 环境下 的分离因子a 及印迹选择性因子s 。数据表明在含水环境下，g l y c o m i p 的分离 选择性比m i p 高，糖修饰后，g l y c o m i p 的表面具有一定的亲水性，增强了聚合 物与水环境的相容性，在水相环境中能够保持印迹位点的选择识别特性，而m i p 则由于材料基质有强的疏水性质，在水环境下分析物与基质间的疏水相互作用 显著表现出来，掩盖了印迹位点的特异性识别，识别选择性降低，因此在水相 环境中印迹选择性g l y c o m i p 要好于m i p 。 对比表2 2 和表2 3 中的a 和s ，可以看出流动相的组成对聚合物的选择性 有一定的影响，对m i p 而言，在水相环境( 甲醇水) 中的分离选择性较差( s 为1 3 4 ) ，在有机环境( 甲醇) 中的分离选择性较好( s 为1 4 9 ) ；对g l y c o m i p 来说，在水相环境下和有机相环境中均显示了较好的分离选择性( s 均为1 5 1 ) 。 原因可能是不同流动相条件下聚合物基质与分析物间的疏水作用强弱变化。对 于m i p ，聚合物基质本身具有强的疏水性，在水存在环境下基质与分析物间疏 水相互作用突出，因而特异性的印迹识别性能受到掩盖，表现为印迹选择性较 差；在有机环境下疏水相互作用较弱，印迹选择性表现突出，因而识别效果较 好。对于g l y c o m i p 而言，由于糖的引入，使得聚合物的表面亲水性增加，在水 环境下聚合物与环境间能够有达到较好的亲水疏水平衡，分析物与聚合物基质 的疏水相互作用较弱，因而印迹选择性与在有机环境中相同，选择性较好。 此外，对比分析物在m i p 和g l y c o m i p 上的保留因子( k ) 可以看出，在同 一环境条件下，分析物在g l y e o - m i p 上的k 都要明显小于在m i p 上的k 。原因可 能是g l y c o m i p 比表面( 7 3 7 4 + 2 4 8m 2 儋) 明显比m i p 比表面( 2 6 2 2 0 - 土：7 9 5m 2 g ) 小，因而保留作用要弱于m m ，k 降低。 在水相环境( 甲醇水) 中，分子印迹聚合物的印迹选择性要小于在有机相 ( 甲醇) 中的印迹选择性，糖修饰改性的印迹聚合物在两种环境中的印迹选择 性则相同。这表明糖的引入，印迹聚合物的识别位点没有改变，同时印迹聚合 物具有了一定的水相容性，在有水存在的情况下也能保持较高的分子识别能力， 这为改性分子印迹聚合物用于生物样品、富水环境样品的分离分析提供了可能。 以其为种球， 致孔剂，通过 苯巴比妥印迹 烯丙基改性的 壳聚糖单体，通过原位接枝聚合的方法得到了表面糖修饰的苯巴比妥印迹聚合 物。所得聚合物微球直接填入h p l c 柱，通过色谱法评价该聚合物的印迹选择 性。此外，还进行了b s a 蛋白的等温吸附实验研究。结果表明糖修饰改性的苯 巴比妥印迹聚合物在有机环境和含水的环境下都具有较好的印迹选择性，同时 其蛋白质吸附量也明显低于未修饰的m i p ，说明糖修饰改性的分子印迹聚合物 具有了蛋白受限功能，在富含水和蛋白的生物样品分离分析领域具有较好了应 用前景。 修饰的苯巴比妥印迹聚合物的制备 修饰的苯巴比妥印迹聚合物的制 备 直接共聚后醇解脱保护基法 上一章我们采用亲水性糖接枝共聚的方法在印迹聚合物微球的表面形成亲 水糖层，以求达到降低聚合物基质对蛋白质的吸附，同时还能够实现对目标分 析物的选择性分析。从实验结果上看基本能够实现设计思想。但在实验的过程 中也存在一定的问题：糖单体接枝聚合时，自身容易产生均聚，使得接枝的糖 含量降低，或者是物理形式的包裹在聚合物的表面，在使用的过程中可能会脱 落，影响使用效果。本章使用了羟基保护的含糖单体作为修饰剂，聚合反应在 均相下进行可以避免含糖单体均聚反应的发生，相当于增加了聚合物中糖含量 提高糖改性效率，聚合结束后，通过甲醇钠甲醇溶液室温条件下脱去羟基的保 护基团就可得到表面含有亲水性糖基的印迹聚合物。 第一节实验部分 3 1 1 主要试剂及测试仪器 ( 一) 主要试剂 乳糖( 分析纯，天津市北方化玻采购销售中心) ； 甲基丙烯酸羟乙酯( h e m a ，天津化学试剂研究所，使用之前减压蒸馏) ： 乙酸酐( 分析纯，天津市化学试剂一厂) ； 三氟化硼乙醚( ( c 2 h 5 ) 2 0 b f 3 ，化学纯，中国医药集团上海化学试剂公司) ； 二甲基丙烯酸乙二醇酯( e g d m a ，分析纯，上海和氏璧化工有限公司) ； 4 乙烯基吡啶( 4 v p ，分析纯，a l f a a e s a r ) ； 偶氮二异丁腈( 砧b n ，分析纯，天津福晨化学试剂厂) ； 甲苯( 分析纯，天津市化学试剂批发有限公司) ； 邻苯二甲酸二丁酯( d b p ，分析纯，天津市化学试剂批发有限公司) ； 的含糖单体修饰的苯巴比妥印迹聚合物的制备 北京恒业中远化工有限公司) ； ，南京奥多福尼生物科技有限公司) ： 市彪仕奇科技发展有限公司) ； 甲醇( 色谱纯，天津市科密偶化学试剂有限公司) ； 色谱用水为商品化的娃哈哈纯净水，其余常用试剂均为分析纯。 牛血清蛋白( b s a ，北京鼎国生物有限公司) ； 小牛血清( 细胞培养用，北京鼎国生物有限公司) ( 二) 测试仪器 核磁共振仪：美国的v a r i a n 公司的u n i t y - p l u s4 0 0m h z 核磁共振仪； 红外光谱仪：美国的b i o p a d 公司的f t s l 3 5 红外光谱仪( 4 0 0 0 - - - 4 0 0c m _ 1 ) ； 熔点测定仪：北京泰克仪器有限公司的双目显微x t - 4 型熔点测定仪； 质谱：美国热电菲尼根公司的t r a c ed s q 的直接进样质谱仪； 扫描电镜表征：岛津h i t a c h is 3 5 0 0 n ； 紫外分光光度计：岛津u v - 2 5 5 0 型。 3 1 2 七酰基乳糖单体含糖单体的制备 h e m - - _ - l _ - _ - - - - _ b f ，e t z o g j 图3 1 七酰基乳糖单体的合成路线 参考本组前人工作【7 4 1 ，合成保护的糖单体( 如图3 1 ) 。 ( 一) 八乙酰基乳糖的制备：将适量的乳糖加到醋酐和无水醋酸钠中，混 合物在回流温度下反应2h 。反应结束后将产物冷却，倒入冰水中。搅拌，得到 2 8 合物的制备 过夜后，用乙醇重结晶， m p 9 1 - 9 2 c 。 ( 二) 含七乙酰基乳糖的糖酯的合成【叫：在2 0 m l 的二氯甲烷中，加入适 量的八乙酰基乳糖和甲基丙烯酸羟乙酯( h e m a ) 及少量的三氟化硼乙醚，反 应在冰水浴中反应2h ，然后在室温下反应1 2h 。往反应液中加入冰水，将c h 2 c 1 2 层依次用水、饱和n a h c 0 3 溶液和水洗至中性，无水n a 2 s 0 4 干燥后，减压蒸除 溶剂得到黄色粘稠物。粗产品用柱色谱进行分离，流动相为丙酮：石油醚= l ： 1 4 ( v v ) ，得到白色粉末状的含糖单体，产率5 0 2 。 所得含糖单体通过核磁、红外和质谱表征了其结构，1 hn m r ( c d c l 3 ) ，6 p p m ： 6 1 3 ( s ，1 h ) ，5 6 0 ( s ，1 h ) ，5 3 8 4 8 5 ( m ，5 h ) ，4 5 8 3 6 0 ( m ，1 3 h ) ，a n d2 2 0 1 9 3 ( m ，2 4 h ) 。i r ，v m a x c m 一：2 9 6 3 ( v c - h ) ，1 7 5 4 ( v c 旬) ，1 6 3 8 ( c ) ，1 4 3 6 ， 1 3 7 1 ( 8 c h ) ，1 2 2 4 ，1 0 5 1 ( v c 批) 。m s f a b ，m z ：c a l c df o rc 3 2 h 4 4 0 2 0 n a ，7 7 1 5 7 ； f o u n d ，7 7 1 5 3 m + n a + 。 3 1 3 七酰基乳糖单体修饰的苯巴比妥印迹聚合物的合成 惦e g d m _ a d b p 舞躲p ，o ：- 啪l i z 曲n t e m p i a 细h 笔。- r 呵硼m 甄姗 黝叫f飞一，。：dglycomenomer 1 。：乙气叫 m a d 、+ “ 气o ：。-， - - 。“o 。 l r t r s t 啪m 吣 s e c o n dm l u a a - ；o d e p r e t e a i e n ， t e m p l a t e -g t y c o p o l y a m r 菩p r e t e i a 图3 2 分子印迹聚合物的合成过程 x 程的进行，不同极性的单体在溶胀液滴中会出现不均匀分布，极性大的单体会 更多的存在于溶胀液滴外层，保护的糖单体仍具有很大的极性，在本实验体系 条件下，会更多才分布于溶胀液滴靠近水的外层，因而聚合后糖组分多数分布 在聚合物微球外层，最后再脱去糖羟基的保护基团，即可得到表层是亲水性糖 组分的苯巴比妥印迹聚合物。 3 1 3 1实验过程 经过一系列的实验条件探讨最终确定了溶胀过程的优化配方，在此条件下 进行苯巴比妥分子印迹聚合物的合成。 将一定量的d b p ，s d s 通过超声乳化的方法制成细化乳液，粒径在0 5l a i n 左右，加入一定量的种子乳液，磁力搅拌下进行第一步溶胀。大约进行1 8h ， 第一步细化液完全消失，此时，将由七酰基乳糖单体，苯巴比妥，甲苯，e g d m a ， 4 v p ，a i b n ，与一定量s d s ，p v a ，h 2 0 经过超声乳化所得的乳液加入到第一 步溶胀液中，磁力搅拌下，开始第二步溶胀，待第二步细化液滴消失后，将整 个溶胀好的乳液转入到已除氧的四口烧瓶中，氩气保护，水浴恒温5 0 ，反应一 2 4h 。所得产物离心热水洗，再用甲醇洗，抽滤、晾干，用t h f 抽提，干燥。 最后用甲醇钠甲醇溶液在室温搅拌下脱去羟基的保护基团即可得到含糖印迹聚 合物( 百y c o m i p ) 。 用同样的过程，在没有苯巴比妥的情况下合成含糖非印迹聚合物 ( g l y c o - n i p ) ，不加糖的情况下合成印迹及非印迹聚合物( m i p ，n i p ) 。所得聚 合物微球通过s e m 表征其形貌、粒径。 3 1 3 2 聚合物印迹选择性评价 聚合物微球填装入1 0 0 x 4 6m l r li d 的不锈钢柱中，甲醇异丙醇( 2 ：1 ，v v ) 为匀浆液，甲醇为顶替液，柱填装时，设备压力为4 0 0 0p s i 。 色谱体系由w a t e r s5 1 0 的泵，w - 6 0 0 0 紫外检测器，r h e o d y n e7 1 2 5 进样器， 2 0 山定量环组成。色谱条件：流速1 0m l m i n ，检测波长2 1 0n l n ，2 5 ，进样 2 0 “l ，流动相为乙腈水，重复测量三次。 待分析物的保留因子可由公式： 章保护的含糖单体修饰的苯巴比妥印迹聚合物的制备 k = ( t r - t o ) t o( 3 1 ) 和t o 分别是保留物质的保留时间和不保留物质在柱子上的保 ) ，死时间t o 通过注射甲醇来测量，印迹选择性因子( s ) 由 公式： s = k m , k n n , ( 3 2 ) 算得，k u l p 和k n m 分别是分析物在m i p 和n i p 上的保留因子。s 是分子印 迹聚合物的印迹识别效果评价指标。 3 1 3 3 蛋白恢复率实验 配制2 0m g m l 的b s a 磷酸盐缓冲溶液( p h7 0 ) 为测试液，色谱条件为： 乙腈磷酸盐缓冲液( 1 0 ：9 0 ，v v ，p h7 0 ) 流动相，流速1 0r n l m i n ，检测波长 2 8 0n i n ，2 5 ，进样2 0 “l 。 在该流动相条件下，不连柱子时，进样后所得色谱峰面积a 0 记为1 0 0 ； 色谱柱子连入分析体系中时，进样后所得色谱峰面积为a ，与a 0 对照即得到蛋 白的恢复率。重复测量三次。 ”“一： 一 、 3 1 3 3 血清样品分析 。r 购置的血清保存在2 0 ，使用时放置室温下缓慢解冻达到室温。取1 o m g m l 的苯巴比妥乙腈溶液储备液2 5 0 山，用0 2 2i x r n 的醋酸纤维素针式滤器滤 过的血清定容于5 皿容量瓶中，即得到含苯巴比妥5 0t t g m l 血清样品。 分别研究血清样品中苯巴比妥在g l y c o - n i p 柱和g l y c o m i p 柱上的分离保 留；分析h p l c 条件：乙腈磷酸盐缓冲液( 2 0 ：8 0 ，v v ，p h7 o ) 流动相，流速 1 0m l m i n ，检测波长2 1 0r l l t l ，2 5 ，进样2 0 “i 。 第二节结果与讨论 3 2 1聚合物的ir 谱图分析 图3 3 是非印迹聚合物( n i p ) 、印迹聚合物( m i p ) 、含糖非印迹聚合物 ( g l y c o - n i p ) 和含糖印迹聚合物( g l y c o - m i p ) 的i r 光谱。对比a 、b 和c 、d 可以明显看出c 和d 在3 5 0 0 3 3 0 0c m 1 处有宽的吸收峰，这是羟基的伸缩振动 3 l 物的制备 表明聚合物通过糖共 物。 w a v e n u m b e r s ( c m 。1 ) 图3 3 聚合物i r 谱图：a ：n i p ，b ：m i p ，c ：g l y c o - n i p ，d ：g l y e o m i p 3 2 2 聚合物形态表征 s e m 照片如图3 4 所示，粒径均匀，平均粒径为6 0 微米。糖改性的和未改 性的分子印迹聚合物的微球两者的表面形貌基本相似，表面都有明显的多孔结 构，这样的结构有利于印迹位点的可接近性。 3 2 3 2 3 聚合物的印迹选择性评价 在不同的温度、不同的流动相比例的条件下，分别对印迹聚合物进行了色 谱评价，各聚合物的色谱行为曲线详见附录b ( b 1 b 6 ) ，测得各聚合物的分离 因子a 和印迹选择性因子s ，数据如表3 2 和表3 3 所示。 3 2 3 1色谱条件对m ip 选择性的影响 表3 1 列出了m i p 在不同h p l c 条件下测得的印迹选择性评价参数分离因 子a 和印迹选择性因子s 。从中可以看出，在相同的温度下，流动相组成由乙腈 水( 6 0 ：4 0 ，v v ) 转变为乙腈水( 4 0 ：6 0 ，v v ) 时，聚合物的印迹选择性因子s 明显增大，在水含量较高的情况下，m i p 的印迹选择性较好，说明种子溶胀悬 浮聚合法制备的印迹聚合物在水环境中也能有