（化学工艺专业论文）PSTEPA、PSgPEGlt600gt树脂合成及其固载α淀粉酶研究.pdf

摘要 摘要 本论文以聚苯乙烯树脂球为对象，通过氯乙酰化后，分别接枝四乙烯五胺或聚乙二 醇链，合成两种新型树脂：p s t e p a 树脂、p s - g - p e g 6 0 0 树脂，用于o 【淀粉酶的固定化。 系统研究了树脂的接枝条件，固定化酶特性，采用荧光光谱分析方法考察了四乙烯五胺 与0 淀粉酶、聚乙二醇6 0 0 与仅淀粉酶相互作用。主要研究内容如下： 1 单因素扫描实验表明：以二氯甲烷作分散剂，分散8h ，在合成温度为8 5 ，反应时 间为1 2h ，投料比为3 2g 四乙烯五胺儋树脂条件下，从氯乙酰化聚苯乙烯树脂合成 p s t e p a 型树脂的增重率和氮元素含量最大，分别为7 5 和8 ；用1 ，4 二氧六环作 分散剂，分散4h ，在合成温度为3 5 ，合成时间为6h ，投料比为2 8 7 5g 聚乙二醇 钠儋树脂条件下，从氯乙酰化聚苯乙烯树脂合成p s g p e g 6 0 0 型树脂的增重率和氧元 素含量最大，分别为3 7 和1 3 。 2 固定化时间8h ，温度为3 0 ，p h 值为8 o 是p s t e p a 树脂对伐淀粉酶的最佳固载 条件，酶活吸附率和蛋白吸附率最高可分别达到8 3 和7 2 ；固定化时间1 0h ，温 度为4 0 ，p h 值为7 0 是p s - g - p e g 6 0 0 树脂对0 淀粉酶的最佳固载条件，酶活吸附 率和蛋白吸附率最高可分别达到6 0 和5 6 ；在一定的浓度范围内，添加戊二醛对 固定化酶的活性没有影响。 3 固定化酶与自由酶的催化动力学性能研究结果表明：酶在固定化后的米氏常数值 下降，对底物的亲和力上升：两种固定化酶的最大反应初速度1 j m a x 均比自由酶有所 提高；酶在固定后的最适反应温度从4 0 分别提高到5 0 ( p s t e p a 固定化酶) 和 6 0 ( p s - g - p e g 6 0 0 固定化酶) ，最适p h 值范围从p h5 8 变宽为p h7 8 ( p s t e p a 固定化酶) 和p h7 1 0 ( p s - g - p e g 6 0 0 固定化酶) ，增强了酶适应p h 值波动的能力； 固定化酶的抗沈脱和批式操作性能较好；酶的失活半衰期，l 2 在固定化后显著延长， 在7 0 下，t l 2 从lh ( 自由酶) 延长到4 5h ( p s t e p a ) 和7 5h ( p s - g - p e g 6 0 0 ) 。 4 应用荧光光谱、同步荧光光谱和紫外吸收光谱法分别研究了t e p a 和p e g 6 0 0 与仪淀 粉酶相互作用的机理。p e g 6 0 0 对0 c 淀粉酶有荧光敏化作用，斯卡查德( s c a t c h a r d ) 方程 离解常数随温度的升高而增大；t e p a 对a 淀粉酶有荧光淬灭作用，由s t e m v o l m e r 方程和l i n e w e a v e r - b u r k 双倒数函数方程计算得到的淬灭类型为动、静态淬灭的结合， 温度越高，静态淬灭越明显；t e p a 与0 c 淀粉酶之间存在非辐射能量转移作用，平均 结合位点数为1 3 l ；同步荧光光谱证明添加p e g 6 0 0 会对酪氨酸残基的微环境产生很 大的影响，添加t e p a 只改变了色氨酸残基的微环境。 关键词：p s t e p a 树脂，p s - g - p e g 6 0 0 树脂，合成，0 【一淀粉酶，固定化，荧光光谱 a b s t r a c t a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , c h l o r o a c e t y l a t e dp o l y s t y r e n em i c r o s p h e r e sw e r eg r a f t e dw i t l lt e p i aa n d p e g 6 0 0r e s p e c t i v e l y t h eo b t a i n e dp s t e p aa n dp s - g - p e g 6 0 0r e s i nw e r ea p p l i e di nt h e i m m o b i l i z a t i o no fi x a m y l a s e t h ec o n d i t i o n sf o rg r a f t i n g t h ec h a r a c t e r so fi m m o b i l i z e d e n z y m ea n dt h ef l u o r e s c e n c es p e c t r u mo ft h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n a m y l a s ea n dt e p a ( o r p e g 6 0 0 ) w e r es y s t e m a t i c a l l yi n v e s t i g a t e d 1 a f t e rd i s p e r s i n gi nm e t h y l e n ed i c h l o r i d ef o r8h ，t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rt h es y n t h e s i s o fp s t e p af r o mc h l o r o a c e t y l a t e dp o l y s t y r e n ew e r e8 5 。c ，12h ，t h ef e e dr a t eo ft e p at o r e s i nw a s3 2 ：1 t h ew e i g h tg a i nr a t ew a s7 5 a n dt h ec o n t e n to fn i t r o g e nw a s8 t h e o p t i m a lc o n d i t i o n sf o rt h es y n t h e s i so fp s - g - p e g 6 0 0f r o mc h l o r o a c e t y l a t e dp o l y s t y r e n e w e r e3 5 c ，6h ，w h e nd i s p e r s i n gi n1 , 4 - d i o x a n ef o r4h ，t h ef e e dr a t eo fp e g 6 0 0t or e s i n w a s2 8 7 5 ：1 t h ew e i g h tg a i nr a t ew a s3 7 a n dt h ec o n t e n to f n i t r o g e nw a s1 3 2 t h es u i t a b l ec o n d i t i o n so ft h ei m m o b i l i z a t i o no f0 【a m y l a s eo np s t e p aw e r e3 0 p h 8 0a n d8ho fr e a c t i o nt i m e t h em a x i m a la d s o r p t i o nr a t eo f a m y l a s eo np s t e i t w a s 8 3 ( e n z y m a t i ca c t i v i t y ) o r7 2 ( p r o t e i nc o n t e n t ) t h es u i t a b l ec o n d i t i o n so ft h e i m m o b i l i z a t i o no fi x a m y l a s eo np s - g - p e g 6 0 0w e r e4 0 。p h7 0a n d10ho fr e a c t i o nt i m e t h em a x i m a la d s o r p t i o nr a t eo f 0 【- a m y l a s eo np s - g - p e g 6 0 0w a s6 0 ( e n z y m a t i ca c t i v i t y ) o r5 6 ( p r o t e i nc o n t e n t ) t h ea d d i t i o no fg l u t a r a l d e h y d eh a dn oh a r m f u le f f e c to nt h e a c t i v i t yo fi m m o b i l i z e de n z y m e s 3 c o m p a r e dt ot h ef r e ee n z y m e ，t h ei m m o b i l i z e de n z y m e se x h i b i t e dah i g h e ra f f i n i t yt ot h e s u b s t r a t e s ，t h ev a l u e so fk mw e r ed e c r e a s e d ，t h ev a l u e so fv m 觚w e r ei n c r e a s e d t h e o p t i m u mr e a c t i o nt e m p e r a t u r e sw e r er a i s e df r o m4 0 ( f r e ee n z y m e ) t o5 0 ( p s t e p a ) a n d6 0 。c ( p s - g - p e g 6 0 0 ) r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m u mr e a c t i o np hr a n g e sw e r ew i d e n e d f r o mp h7 - 8 ( f r e ee n z y m e ) t op h7 10 ( p s t e p a ) a n dp h 5 - 8 ( p s - g - p e g 6 0 0 ) s e p a r a t e l y t h ed e s o r p t i o nr a t eo fi x a m y l a s ef r o mt h ec a r r i e r sw e r er e l a t i v e l yl o w e r t h eh a i fl i r e t i m e so fi x - a m y l a s et l 2w e r ep r o l o n g e da f t e rt h ei m m o b i l i z a t i o n ，f r o m1h ( f r e ee n z y m e ) t o 4 5h ( p s t e p a ) a n d7 5h ( p s - g - p e g 6 0 0 1a t7 0 4 t h ei n t e r a c t i o n so f 一a m y l a s e 、v i t ht e p aa n dp e g 6 0 0w e r ei n v e s t i g a t e db yf l u o r e s c e n c e s y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c ea n du va b s o r p t i o ns p e c t r o m e t r y p e g 6 0 0s e n s i t i z e dt h e f l u o r e s c e n c eo f 仅- a m y l a s e t h ed i s s o c i a t i o nc o n s t a n ts o l v i n gs c a t c h a r de q u a t i o nw a s i n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s e d t e m p e r a t u r e t e p ah a daq u e n c h i n ge f f e c t o nt h e f l u o r e s c e n c eo f 仪一a m y l a s e t h eq u e n c h i n gt y p ew a sac o m p l e xo fd y n a m i ca n ds t a t i c q u e n c h i n ga c c o r d i n gt ot h ef i t t i n gr e s u l t so fs t e m - v o l m e ra n dl i n e w e a v e r - b u r ke q u a t i o n t h ee f f e c to fn o n - r a d i a t i o ne n e r g yt r a n s l o c a t i o ne x i s t e db e t w e e nt e p aa n d 仅a m y l a s e t h ea v e r a g en u m b e ro fb i n d i n gs i t ew a s1 31 t h es y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c es p e c t r u m s h e wt h a tt h ea d d i t i o no ft e p av a r i a t e dt h em i c r o e n v i r o n m e n to f t r y p t o p h a nr e s i d u ea n d p e g 6 0 0h a ds i g n i f i c a n ti n f l u e n c eo nt h em i c r o e n v i r o n m e n to ft y r o s i n er e s i d u e k e y w o r d s ：p s t e p a ，p s - g - p e g 6 0 0 ，s y n t h e s i s ，0 c a m y l a s e ，i m m o b i l i z a t i o n ，f l u o r e s c e n c e s p e c t r u m i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是誉人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名： 基兰量 日 期： 关于论文使用授权的说明 卯g 7 岁d 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：浆弓璺 伽留。7 弓9 导师签名： 日 期： 第一章绪论 第一章绪论 酶作为生物催化剂，具有大多数化学催化剂所不具备的优点。酶具有专一性强，催 化效率高和作用条件温和等显著特点，在医药、食品、工业、农业、环境保护和科学研 究等方面的应用均己取得了显著的成划。在使用酶的过程中，人们注意到酶的一些不 足之处：( 1 ) 酶的稳定性较差，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素 影响下，都容易变性失活；( 2 ) 酶的一次性使用，不仅使生产成本提高，而且难于连续化 生产；( 3 ) 产物的分离纯化较困难。 鉴于此，人们在不断寻求克服这些不足过程中发展起来一项技术，即固定化酶技术。 用物理、化学等方法将水溶性的酶固定到特定的载体上使之成为水不溶性的酶称为固定 化酶( i m m o b i l i z e de n z y m e ) 2 。与自由酶相比，固定化酶具有容易回收、可连续操作、后 加工过程简化、酶稳定性增强等特点【3 j 。基于这些优点，固定化酶己广泛应用于食品技 术、生物工艺学、生物医学和分析化学等领域【4 j 。 1 1 酶固定化方法 酶的催化作用主要由其活性中心完成，酶蛋白的构象也与酶的活性密切相关，因此 在制备固定化酶时，必须注意使酶活性中心的氨基酸残基不发生变化，避免那些导致酶 蛋白高级结构破坏的操作( 例如高温、强酸、强碱等) 。根据这个原则，酶的固定化方法 主要有吸附法、交联法、包埋法、结合法和热处理法等。 1 1 1 吸附法 吸附法分为物理吸附法和离子吸附法，是利用离子键、物理吸附等方法，把酶固定 在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。工艺简便 及条件温和是其显著特点，其载体选择范围很大，涉及天然或合成的无机、有机高分子 材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化，酶失活后可重新活化，载体廉价易得且可以 重复使用。用物理吸附法制成的固定化酶，酶活损失少，但酶附着在载体上，易于脱落， 缺乏使用价值。离子吸附法是将酶与含有离子交换基的水不溶性载体相结合，酶吸附于 载体上较为牢固，在工业上用途颇广。 吸附法也有许多不足，如酶量的选择全凭经验，p h 值、离子强度、温度、时间的 选择对每一种酶和载体都不同，酶和载体之间结合力不强易导致催化活力的丧失和玷污 反应产物等【5 j ，因此其应用受到限制。为提高其适用性能，此法与其它方法联用。有人 采用先吸附后交联的固定法，固定酶效果较好，其酸碱稳定性及热稳定性好。 1 1 2 交联法 交联法是借助多功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的 方法【6 1 。酶分子和多功能试剂之间形成共价键，除了酶分子之间发生交联外，还存在着 一定的分子内交联。常用交联试剂有戊二醛、双重氮联苯胺2 ，2 二磺酸、l ，5 二氟2 ，4 二硝基苯、己二酰亚胺酸二甲酯等。 交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶 分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶的颗粒较小，给 江南大学硕士学位论文 使用带来不便。科研工作者一般都将其作为其它固定化方法的辅助手段，以达到更好的 固定效果，这种固定化方法称为双重固定化法。 1 1 3 包埋法 将酶、细胞或原生质体包埋在各种多孔载体中，使其固定化的方法称为包埋法【6 j 。 其基本原理是单体和酶溶液混合，再借助引发剂进行聚合反应，将酶固定于载体材料的 网格中，酶活回收率较高。包埋法通常采用惰性的载体材料【2 1 。惰性载体的孔将保留一 定数目的产品，因此需要一些洗脱步骤，从而导致稀释作用并增加生产成本。 1 1 4 共价结合法 共价结合法是将酶与聚合物载体共价结合的固定化方法，此法的研究较为深入。与 载体共价结合的酶的功能基团有1 ) 氨基；2 ) 羧基；3 ) 酚基；4 ) 巯基；5 ) 羟基；6 ) 咪唑基； 7 ) 9 1 哚基等。其中以氨基和羧基结合法为最常用。 此法的优点是，酶与载体的结合较为牢固，酶不易脱落，但因反应条件较为剧烈， 酶活易损失，且制备手续繁杂。 1 1 5 热处理法 将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定 化菌体。热处理法只适用于哪些热稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格控 制好加热温度和时问，以免引起酶的变性失活。热处理也可与交联法或其它固定化法联 合使用，进行双重固定化。 综上所述，五种酶固定化方法各有所长，但几种方法联用，往往效果更好。无论采 用何种方法，固定化酶的稳定性是首要考虑的因素。酶、载体及试剂的费用、操作难易 等与工业化有关的因素也必须考虑。科研人员在研究时，应尽量选用价格低廉、易得的 载体和试剂，载体最好是己在其他工业生产中大量使用的材料，同时也要考虑其应用时 的安全性。 1 2 固定化酶载体的研究 自从酶固定化技术兴起以来，其载体的研究就备受关注，取得了不少成就，但在实 际应用中还有很多问题需要解决，如：使用寿命较短，操作半衰期不够长；载体价格较 高，而且对底物和产物存在扩散阻力，所以新载体的研制和应用一直是该领域的研究热 点【2 1 。 1 2 1 裁体的种类 固定化酶的载体主要有以下几种【7 】：1 壳聚糖及其改性材料：因为壳聚糖具有良好 的生物相容性和易于改性的特点，这使其在酶固定化技术中倍受青睐，研究较早；2 纤 维素及其衍生物：纤维素结构中存在大量的羟基，可通过各种反应，如氧化、酯化、醚 化、亲核取代、接枝共聚和交联等，制成多种纤维素衍生物而带有各种活泼基团，可用 于酶固定化的研究；3 有机合成聚合物：离子聚合物、接枝聚合物以及其它具有特殊结 构的有机聚合物；4 凝胶材料：凝胶具有良好的生物相容性，与疏水聚合物相比，同被 固定化的酶之问只有弱得多的相互作用，固定在凝胶中的酶活性能够保持较长时问：5 磁性微粒：具有磁性、有很好的生物相容性、其表面含有大量功能团、分散性好；6 无 2 第一章绪论 机材料：7 丝素和甲壳素。 近年来，国内酶固定化载体的研究取得了很大的进展，载体材料研究范围从传统的 以聚合物材料为主发展到聚合物材料和无机材料共同发展的局面；聚合物载体材料的研 究向功能化和精细化方向发展；固定化酶朝着高活力保持率、长使用寿命、易于分离和 可再生等方向发展；酶固定化新方法新技术发展迅速，如磁性聚合物微球、酶定向取向 技术和基因重组等技术开始应用到酶固定化中【8 j 。但也存在一些不足之处，如一种载体 很难集各种优良性能于一体，往往是在一些方面具有优势，在另一些方面性能不够理想。 随着新技术新材料在酶固定化中的应用，以及载体性质和固定化方法与固定化酶性 能之间关系研究的更深入，固定化酶研究一定会取得更大的成果，其应用范围会不断扩 大【7 1 。 1 2 2 有机聚合物载体 酶固定化对载体材料具有很高的要求，如要有良好的机械强度，良好的热稳定性和 化学稳定性，良好的抗微生物特性及酶的结合能力等。我国的固定化酶研究工作始于7 0 年代初，在这一领域的研究具有相当高的水平，但我国尚未见商品的固定化酶专用载体。 因此近十年来，我国酶学专家与国外专家学者一样把酶固定化技术的研究重点集中于固 定化方法和载体材料的开发上，以便找到更简便实用的固定化方法和性能优良的载体。 据报道，用来吸附蛋白的聚合物载体主要有聚乙烯( p e ) 、聚四氟乙烯( p t f e ) 、咖啡 酸( c a ) 、聚偏二氟乙烯( p v d f ) 和聚苯乙烯( p s ) 等。z h e n g f az h o u 等人【9 】合成了羧基丙烯 酸树脂，并研究了合成条件；s a t i s hd s h e w a l e 1 0 】用自己制备的坚硬的超多孔的纤维素组 织为载体，研究其吸附性；a l ik a r a 等人【l l 】将甲基丙烯酸乙二醇酯n 乙烯基咪哗聚合物 水凝胶颗粒螯合c u 2 + 做为载体，吸附固定化淀粉酶蛋白。 酶固定化对载体材料具有很高的要求，要有良好的机械强度，良好的热稳定性和化 学稳定性，良好的抗微生物特性及酶的结合能力等。载体材料的价格还直接影响固定化 酶能否真正用到实际生产中。由于难以找到理想的载体材料，再加上酶在固定化过程中 不可避免地损失部分活力，甚至当固定方法不得当时会损失绝大部分活力，酶被固定于 载体上时，载体材料的物理、化学性质对固定化酶的性能也有重要的影响等原因，载体 材料的研究与丌发成为酶固定化技术的核心内容之一。 随着高分子化学技术的发展，合成有机高分子材料由于其化学、物理性能都有很大 的可变性，而且它们对微生物的腐蚀也有较强的抵抗力等优点，已经逐渐被人们用作固 定化酶的载体材料。 聚苯乙烯材料是世界上第一个被用来担当固定化酶载体材料的合成有机高分子，它 主要通过吸附作用来固定化酶，但在固定化过程中，由于聚苯乙烯本身的疏水性经常导 致酶在一定程度上失去活性。为了解决这个问题，人们想了很多办法，如通过对疏水性 材料的表面进行化学修饰，或者加入一种亲水性单体与之共聚等等，可以在很大程度上 改变基体材料的表面性质l l2 。，提高其亲水性，从而增加载体对蛋白的吸附量。 k a t j ah e n z l e r 等人【1 3 j 在聚苯乙烯表面接枝聚丙烯酸链，增强了树脂的亲水性，并用 该树脂吸附p 葡萄糖苷酶；胡杰等人【1 4 1 采用疏水性较弱的聚甲基丙烯酸甲酯微球作载体 3 江南大学硕士学位论文 吸附牛血清蛋白；n b e l a t t a r 1 5 j 和t m e k h a l i f m 】通过磺化聚苯乙烯制得氯磺化聚苯乙烯树 脂( p s s 0 2 c 1 ) ，再通过反应制得磺酸钠聚苯乙烯树脂( p s s 0 3 n a ) 和半胱氨酸磺化聚苯乙 烯树脂( p s s 0 2 c y s ) ，并比较了两种树脂对人血清蛋白的吸附情况。h o n g t a oz h a n g 等人【1 7 j 分别用丙烯酸( a a ) 和丙烯酸7 , - - 醇f l p s ( e g d m a ) 交联聚苯乙烯树脂，并研究了合成条件。 j e a n m i c h e lb e c h t 等人【1 8 】用两步反应合成了硫醇聚苯乙烯树脂。j i a n h a nh u a n g 等人【1 9 】合 成了聚苯乙烯基苄基苯胺( p v b a ) ，并比较了其在水与j 下己烷中对苯酚的吸附等温线。 o s a m us h i m o m u r a 等人【2 0 】用聚四氢呋喃接枝聚苯乙烯树脂，合成了聚四氢呋喃聚苯乙烯 树h 旨( p s p t h f ) 。a y u m e n s h i k o v a 等人【2 1 】用聚乙烯吡咯烷酮接枝聚苯乙烯羧基树脂， 研究了其吸附性能；贺锐【2 2 j 等人用自己合成的有2 丙烯酰胺基2 甲基丙磺酸链的聚苯乙 烯( p s t ) 功能微球为载体，研究其对牛血清蛋白的吸附效率；魏荣卿等人1 2 3 j 羧基化聚苯乙 烯( p s c o o h ) ，形成弱酸型离子交换树脂，并研究了其吸附性能；范云鸽等人【2 4 j 研究了 聚苯乙烯型双季铵树脂的制备方法，并研究了其吸附性能。 本论文中采用f r i e d e l c r a f t s 酰基化方法，对聚苯乙烯微球进行氯乙酰化【2 副；然后在 氯乙酰化聚苯乙烯树脂上接上四乙烯五胺( t e p a ) 或者聚乙二醇6 0 0 ( p e g 6 0 0 ) 长链，制得 p s t e p a 和p s - g - p e g 6 0 0 树脂。工业化生产中常用的是用甲醚或双氯甲醚与芳烃反应引入 氯甲基，导入的氯甲基再转变为c h 2 0 h 、c h o 、c h 2 c n 、c h 2 n h 2 、c h 3 、c h 2 r 及其它 基团，从而能容易地制得一系列新的衍生物1 2 引。虽然氯甲醚和双氯甲醚活性高、反应选 择性好，但是它们不稳定、易挥发、刺激性大、有腐蚀性、有剧毒、致癌、贮存运输困 难，且氯甲基化反应常有多取代问题。所以在研究中采用先合成氯乙酰化聚苯乙烯的方 案。氯乙酰化聚苯乙烯的酰基使苯环钝化，不会发生多取代，其次酰基的强吸电子性， 使得下步与t e p a 或p e g 6 0 0 的亲核取代反应更容易进行。 1 3 蛋白质的荧光光谱分析法 1 3 1 荧光光谱法简介 研究蛋白质分子构象的方法可以概括为两大类【27 j ：一类是测定溶液中的蛋白质分子 构象，如核磁共振法、圆二色谱法、激光拉曼光谱法、荧光光谱法、紫外差光谱法以及 氢同位素交换法；另一类是测定晶体蛋白质的分子结构，如x 射线衍射分析法和小角中 子衍射法。x 射线衍射分析法虽然可以较准确地测量晶态蛋白质分子的空问结构，但有 许多蛋白质不能培养出单晶，方法也很复杂，而且生命体中的蛋白质多数以溶液状态存 在，与晶体中的结构往往有一定的差别。中子衍射法由于仪器昂贵等原因，目前该方法 应用于蛋白质分子的构象研究才刚起步。 在蛋白质分子中，能发射荧光的氨基酸有色氨酸( t r p ) 、酪氨酸( t y r ) 以及苯丙氨酸 ( p h e ) 。个别蛋白质分子含有的黄素腺嘌呤二核苷酸( f a d ) 也能发射荧光。t r p 、t y r 以及 p h e 由于其侧链生色基团的不同而有不同的荧光激发和发射光谱。其中t r p 的荧光强度最 大，t y r 次之，p h e 最小。因为蛋白质的荧光通常在2 8 0n n l 或更长的波长被激发，p h e 在 绝大多数实验条件下不被激发，所以很少能观察到p h e 的发射。这样蛋白质的内源荧光 主要来i 兰l t r p 和t y r 残基。t r p 残基对微环境的变化很敏感，并且大多数蛋白质都含有几个 不同的t r p 残基，因而常作为内源荧光探针来研究溶液状态下蛋白质的构象。 4 第一章绪论 1 3 2 荧光淬灭法 当荧光物质分子与药物分子相互作用时，就可能引起其荧光强度的降低，称为荧光 淬灭1 2 引。许多过程可引起荧光淬灭，如：激发态反应、能量转移、配合物形成和碰撞淬 灭。荧光淬灭的机制主要有两种：静态淬灭和动态淬灭。 动态淬灭，淬灭剂必须在激发态寿命时间内扩散到蛋白质的荧光发色基团，一旦接 触，荧光发色团不发射光子，返回到激发态。静态淬灭，荧光发色基团和淬灭剂形成了 复合物，该复合物是不发荧光的。由于这些特点，荧光淬灭研究可以揭示荧光发色基团 在蛋白质中的位置以及淬灭剂对它们的渗透程度，同时因淬灭剂对荧光物质分子的淬灭 作用是有选择性的，淬灭作用还可以被用来研究蛋白质分子在溶液中的构象。 可淬灭蛋白质中t r p 残基的淬灭剂种类很多，最常见的是0 2 和i ，另外还有丙烯酰 胺( a c r ) 、琥珀酰亚胺( n b s ) 、h 2 0 2 、二氯乙酰胺、吡啶绘( c s h s n h ) 、半胱氨酸、氯化烃、 n 0 3 。、1 0 3 、c s + 及c u 2 + 等重金属离子。a c r 由于不影响蛋白质的天然结构和活性，而常 被用以研究蛋白质荧光发色团的暴露情况。 1 3 3 荧光敏化 若体系存在一种荧光体和一种以上的其它物质时，由一个发荧光的给体将能量传给 一个受体，这个受体可以发射它自己特征的荧光( 敏化荧光) ，也可以不发荧光( 荧光淬 灭) 1 2 引。如果用s 表示给体或敏化分子，用彳表示受体分子，受激用水表示，那么 f - a + h v ( 敏化荧光) s 母十彳一s 叫母 0 可能是疏水和静电 作用力；a s 0 ，a s 0 为典型的疏水作用力；a h 二氯 甲烷 d m f 四氢呋喃，其中用二氯甲烷作溶剂，树脂增重率比用1 ，4 二氧六环要小， 可能是因为二氯甲烷与聚乙二醇钠发生取代反应，生成了醚，使得树脂增重率降低。实 验采用1 ，4 二氧六环作溶剂。 2 3 3 2 溶剂分散时间的选择 表2 - 6 不同分散时间对树脂增重的影响 t a b 2 - 6e f f e c to fd i s p e r s i n gt i m eo nw e i g h ti n c r e m e n tp e r c e n t 由表2 6 可知，随分散时间的延长，树脂的增重率逐渐增大，分散4h 后，树脂增重 趋于平衡。这是由于氯乙酰化聚苯乙烯树脂是有一定交联度的微球，在一段时间内，随 着分散时间的延长，树脂微球在分散溶剂的作用下逐渐发生体积溶胀，从而有利于醇类 反应物从表面进入树脂内部发生反应。但当随着分散时间的延长树脂微球溶胀到其限度 时，反应不再进行，在4h 后产物增重达到平衡。 江南大学硕士学位论文 2 3 3 3 反应时间对增重率及氧元素含量的影响 琴 j 。晶 2 儡 萎 鼍 器 g 三 图2 - 5 反应时间对增重率和氧元素含量的影响 f i g 2 - 5e f f e c t so ft i m eo nt h ei n c r e a s e dw e i g h ta n do x y g e nc o n t e n t ：增重率；o ：氧元素含量 从图2 5 可以看出，随着合成时间的延长，增重率和氧元素含量都是先增大后减小。 原因可能是随着合成时问的延长，反应逐渐达到平衡，增重率和氧元素含量都不再增加， 而且反应时间过长，会使反应向反方向进行，因此反应时间过长使得产率降低。 2 3 3 4 温度对增重率及氧元素含量的影响 零 = 罱 2 羔 塑 萎 它 器 2 譬 零 董 磐 c 8 暑 套 。 图2 6 温度对增重率和氧元素含蕈的影响 f i g 2 - 6e f f e c t so ft e m p e r a t u r eo nt h ei n c r e a s e dw e i g h ta n do x y g e nc o n t e n t ：增重率；o ：氧元素含量 从图2 - 6 中可以看出，随着温度的升高，树脂的增重率和氧元素含量都是先增大后 减小。树脂的最适合成温度为3 5 。可能是因为聚乙二醇的亲水性使得反应的温度较低， 反应较快就达到了平衡。且成醚反应为放热反应，所以反应温度不需太高。 1 4 摹、董3口8口膏o 第二章p s - t e p a 和p s - g - p e g 6 0 0 树脂的合成 2 3 3 5 聚乙二醇钠用量对增重率及氧元素含量的影响 蓬 兰 罟 8 磊 奢 。 图2 7 聚乙二醇钠川量对增重率和氧元素含量的影响 f i g 2 7e f f e c t so fa m o u n to fp o l y e t h y l e n eg l y c o ln a t d u mo nt h ei n c r e a s e dw e i g h ta n do x y g e nc o n t e n t ：增重率；o ：氧元素含昔 由图2 7 可知，树脂增重率和氧元素含量曲线的变化趋势是一致的。当聚乙二醇钠 的加入量为5m l ( 且l j5 7 5g ) 时，增重率和氧元素含量分别达到最大。此时聚乙二醇钠与 氯乙酰化聚苯乙烯的投料比为2 8 7 5g g 树脂。 2 4 小结 1 p s t e p a 树脂的最佳合成条件：用二氯甲烷作溶剂，分散8h ，合成温度为8 5 ， 反应时间为1 2h ，四乙烯五胺与氯乙酰化聚苯乙烯的投料比为3 2 g 树脂时，合成的 p s t e p a 型树脂的增重率和氮元素含量最大，分别为7 5 和8 。 2 p s - g - p e g 6 0 0 树脂的最佳合成条件：用l ，4 二氧六环作溶剂，分散4h ，合成温度 为3 5 * ( 2 ，合成时间为6h ，聚乙二醇钠与氯乙酰化聚苯乙烯的投料比为2 8 7 5g g 树脂时， 合成的p s - g - p e g 6 0 0 型树脂的增重率和氧元素含量最大，分别为3 7 和1 3 。 1 5 江南大学硕士学位论文 第三章p s t e p a 和p s - g - p e g 6 0 0 树脂固载洳淀粉酶 3 1 实验材料及仪器 表3 1 实验试剂 t a b 3 1e x p e r i m e n t a lr e a g e n t 表3 - 2 实验仪器 t a b 3 2e x p e r i m e n t a li n s t r u m e n t 仪器名称产地 w d p 微生物多用培养箱 d m 3 恒温水浴锅 t u 1 9 0 1 型双光束紫外一可见分光光度计 t g 3 2 8 a 分析天平 上海医用仪表厂 北京金坛仪器厂 北京普析通用仪器有限责任公司 上海天平仪器厂 3 2 实验方法与步骤 3 2 1i x - 淀粉酶酶活的测定 采用t u 1 9 0 1 型双光束紫外可见分光光度计测剧4 。取2 0 0m l 2 0g l 可溶性淀 粉溶液于试管中，加入5 0 0m lp h6 0 磷酸盐缓冲溶液，在6 0 下预热5m i n ，加入1 0 0 m l 待测液体样品或0 5g 固定化样品振荡反应5m i n 后。取反应液1 0 0m l 于5 0 0 m l 稀碘液中，摇匀后测定其在6 6 0n l n 波长下吸光度似) 。查表求得样品酶液的活性。 相对活力：一定条件下，将酶的最高活力定为1 0 0 ，其余与之相对应的百分含量 即为其相对活力p 6 。 酶活吸附率= 固定化酶活力加入游离酶总活力1 0 0 【4 2 。 3 2 2 蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝比色法测定4 3 1 。t u 1 9 0 1 型双光束紫外一可见分光光度计。 ( 一) 标准曲线的测定：取7 支干净试管，如下表编号并加入试剂。混匀，室温静置 3m i n ，以第l 管为空白，于波长5 9 5n n l 处比色，读取吸光度值。 表3 - 3 标准曲线的测定 t a b 3 3d e t e r m i n a t i o no fs t a n d a r dc u r v e 1 6 第三章p s t e p a 和p s - g - p e g 6 0 0 树脂对o r , 淀粉酶的同嫩化 以吸光度为纵坐标，各标准液浓度作为横坐标作图得标准曲线，图3 1 。 图3 - 1 蛋国质标准嚏线 f i g 3 1s m n d a r dc t l f v eo fp r o t e i n 得到，2 5 时标准曲线方程为；y = 0 。0 0 8 7 3 x ，r 2 = 0 。9 9 7 8 。 ( 二) 样品溶液的测定：另取1 支干净的试管，加入样品液1 0m l 及考马斯亮蓝染液 4 0m l ，混匀，室温静置3m i n ，于波长5 9 5n m 处比色，读取吸光度，由样牖液的吸光 度查标准逮线即可求出含量。 载体蛋白吸附率= f 加入总蛋白含量。上清液中蛋自含量) a n 入总蛋白含量1 0 0 4 2 】。 3 2 3 淀粉醇的固定化 分别取0 5gp s t e p a 和p s - g - p e g 6 0 0 树脂置于装量为5 0m l 酶液的具塞三角烧瓶 中，在转速为9 0r m i n 的振荡器上振荡，考察不同温度、不同p h 值、不同时间、不同 酶量下载体对0 c 淀粉酶的固定化情况，裂口测定不同情况下的酶活吸附率和蛋白吸附率。 p s 和7 1 7 型苯乙烯阴离子交换树脂固定化0 c 淀粉酶的条件：取0 5g 树脂于含1 0 0 0 u 的势淀粉酶的5 0m lp h8 0 磷酸盐缓冲液中，子3 0 * ( 2 下在转速为9 0r m i n 的振荡器上振 荡固定化8h 。 3 2 4 四乙烯五胺与聚乙二醇6 0 0 对甜淀粉酶活力的影响 用2 0m lp h7 5 的磷酸盐缓、挣溶液秀已制1 2 份仪淀粉酶溶液，在1 2 份淀粉酶溶液 中分别加入质量分数为0 、0 。1 、0 3 、0 。7 、0 。9 、1 o 的四乙烯五胺溶液和0 2 、 0 5 、o 8 、1 o 、4 o 、5 0 的聚乙二醇6 0 0 溶液。静置lh ，测酶活，得到不同浓 度的四乙烯五胺和聚乙二醇6 0 0 对僻淀粉酶酶活的抑制情况。 3 。2 5 戊二醛的影响 分别取0 5gp s t e p a 、0 5gp s - g - p e g 6 0 0 固定化酶与1 0 0 0u 的自由酶一起，考察 不同浓度戊二醛对自由酶活性的影响，以及对固定化酶吸附酶活的影响。 3 。2 6 固定化酶与自由酶的着嗷动力学 在3 0 、p h8 0 条件下，测量不同淀粉浓度下的酶催化降解淀粉的初速度v 。用 m i c h a e l i s 。m e m e n 方程拟合脚】，l a n g m u i r 法作图，即以淀粉浓度与反应速度的比为纵坐 标( 阎柳，淀粉浓度( 阎) 为横坐标作 s l w i s 图。方程为： 1 7 江南人学硕+ 学位论文 翻1 w k m l v m 瓢+ 【跚舣 ( 3 1 ) 式中：阎淀粉质量浓度( m g l ) ； ，旷一反应速度【m 耿l s ) 】； 。x _ 一最大反应速度 m g ( l s ) 】： 米氏常数( m g l ) ，其数值等于酶促反应达到其最大速度觚一半时的底 物浓度嘲。它可表示酶和底物之间的亲和能力，值越大，亲和能力越弱，反之亦然。 3 2 7 固定化酶的性能 最适温度和p h 值范围的测定：分别在不同温度和不同的p h 值下，测定固定化酶 和自由酶的相对酶活。 固定化酶的抗沈脱能力比较：首先制备各树脂固定化酶，取0 5gp s t e p a 、 p s - g - p e g 6 0 0 、p s 和7 1 7 型苯乙烯阴离子交换树脂于含1 0 0 0u 的0 c 淀粉酶的的5 0m l 磷 酸盐缓冲溶液中，于3 0 下在转速为9 0r m i n 的振荡培养箱上固定化8h 。将混合溶液 抽滤，固体置干燥器常温干燥至恒重，测固定化酶酶活。然后在各固定化酶中加入5 0m l 去离子水，置培养箱室温下振荡洗脱。测量不同的洗脱时间，各固定化酶的酶脱落情况。 固定化酶的批式操作稳定性：在固定化酶最适p h 值和最适温度条件下，以1 淀 粉为底物进行批式操作，比较每批的残余相对酶活。 3 2 8 固定化酶与自由酶的失活半衰期比较 酶的半衰期：当酶浓度为酶初始浓度的一半时的时间称为半衰期t l 2 。 将1 0 0