（卫生毒理学专业论文）细胞色素p4501a1基因多态性与功能变化的初步研究.pdf

i r 山土t 霄士量t 舟文- 鼍邑t 习龋爿研，t 一t 童矗- 妇，研毫文姜 细胞色素p 4 5 0 1 a 1 基因多态性 与功能变化的初步研究 专业：卫生毒理学 博士生：肖勇梅 导师：凌文华教授 中文摘要 细胞色素氧化酶是生物界普遍存在的一种代谢酶类，对其的研究不仅可以帮 助人类了解各种生物问的亲缘关系，而且可以帮助人们进行疾病的预防和治疗， 所以在毒理学和药理学方面对此进行了广泛的研究。细胞色素氧化酶 p 4 5 0 1 a l ( c y p i a i ) 是多环芳烃类化合物( p a h s ) 体内代谢最重要的i 相酶，具有 芳烃羟化酶( a r y l h y d r o c a r b o nh y d r o x y l a s e ，a h h ) 活性，能被苯并( a ) 芘( b a p ) 、二嘿 英( t c d d ) 、3 - 甲基胆葸( 3 m c ) 等所诱导。p a h s 进入人体后，主要经过细胞色素 p 4 5 0 混合功能氧化酶系统( c y p 4 5 0 s ) 中的c y p i a l 代谢活化，生成具有强致癌性 的亲电子环氧化物。因此，c y p i a l 同工酶的活性成为决定p a h s 致癌性的关键 因素。 c y p i a l 主要由定位于人类染色体1 5 q 2 2 - q t e r 上的c y p i a i 编码，流行病学 调查显示，c y p i a l 存在9 个等位基因，其中开放阅读框的第七外显子4 8 8 7 c a ，4 8 8 9 a g 两个碱基突变将导致c y p i a l 血红素结合区域的两个氨基酸一 4 6 1 位的苏氨酸( t h r ) 和4 6 2 位的异亮氨酸( 1 i e ) 改变为天冬酰胺( a s n ) 和缬氨酸 ( v a d ，这两个碱基分别对应c y p l a im r n a 序列中第1 5 0 4 和1 5 0 6 位碱基。目前 国内外的研究中虽有c y p l a l 基因变异的体外实验研究，但主要是对 c y p i a i v a l 4 6 2 单个基因变异的研究，缺乏c y p i a i a s n 4 6 1 及双点变异的研究。 为了深入研究c y p i a l 摹因变异作用机制与代谢活化功能改变的关系，本研 究运用分子生物学技术构建野生型、单点变异和双点变异型重组质粒表达载体， i 中山土t 膏士t t 鲁文t 毛t 毒曩苟一t , 4 ，t 昔t 毫花备，碍竞文t 毒 并转染人胚肺成纤维细胞( h l f ) 。建立起有效的细胞模型，探讨变异型细胞模型 对3 - m c 毒作用的影响，揭示c y p i a i 血红素结合区域氨基酸与其代谢功能关系。 本研究的意义在于：( 1 ) 能够为毒理学研究多环芳烃毒物对机体的作用机制 提供线索：q ) 可以为毒理学开展c y p i a i 功能研究提供体外模型；( 3 ) 构建的细 胞模型也可以用于前致突变物前致癌物筛选试验。 主要研究内容和方法： 一、野生型c y p l a le d n a 全长基因t 载体的构建和鉴定 用t r i z o l 试剂从人乳腺癌细胞株m c f 7 中抽提总r n a ，进行逆转录反应 生成总c d n a ；利用自行设计的两对特异性引物，采用巢式聚合酶链式反应扩增 c y p i a i 基因的c d n a 全长序列，通过t 载体克隆，酶切和测序鉴定确证。 二、c y p i a i 活性结构域附近1 1 1 r 4 6 1 一a s n 6 1 、i l e 4 6 2 一v a l 4 6 2 定点突变及t 载 体克隆 自行设计含突变碱基( 1 5 0 4 c a ，1 5 0 6 a g ) 的两对引物，采用重叠延伸p c r 方法对野生型c y p l a i 基因进行1 5 0 4 c a 单点和1 5 0 4 c 一1 5 0 6 a g 双点的 定点突变，通过t 载体克隆、酶切鉴定和测序确证。 三、c y p l a i w t 和c y p i a i a s n 4 6 1 ，v a l 蜉真核表达载体的构建及细胞模 型建立 将构建的c y p i a l 野生型和a s 1 ，v a l 4 6 2 变异型t 载体双酶切，重组至真 核表达的逆转录病毒p b a b e n e o 载体上，通过p c r 及b a m h l s a l l 双酶切确证。 利用f u g e n e 6 转染试剂盒，将构建的野生型和变异型c y p i a l 表达载体转染至 人胚肺成纤维细胞( h l f ) ，用i 0 0 0 1 l g m lg 4 1 8 筛选转染细胞。用免疫蛋白印迹法 ( w e s t e r nb l o t t i n g ) 检测转染细胞c y p i a i 蛋白的表达，观察比较转染细胞和未转 染细胞的生长形态、超微结构、生长速度、软琼脂培养生长状况等生物学特性， 了解转染细胞对人体正常细胞生物学特性的影响。 四、3 - m c 对c y p i a ia s n 蚓及v a l 4 6 2 变异细胞模型作用的研究 首先观察0 ，0 1 ，0 5 ，2 5 ，1 2 5 ，7 2 5 1 z m o l l3 - m c 对正常h l f 细胞作用 2 4 h 后c y p i a i 蛋白表达和活性的影响，并确定转染细胞的染毒剂量；用 2 5 1 a m o l l3 - m c 对转染和未转染细胞染毒2 4 h ，观察c y p i a i 蛋白表达量和活性， 细胞微核率、核异常率。 n 9 r 山土士t 文- 屯色习a 甯靖，- 一t 童矗白，j 叶tt 文善 研究结果： 一、野生型c y p l a ie d n a 全长基因t 载体的构建和鉴定 根据g e n e b a n k 中c y p l a im r n a 序列设计两对引物( p 1 1 ) 2 ，p 3 p 4 ) ，其中 上游内引物( p 3 ) 的5 端引入b a m h i 内切酶位点，下游内引物( p 4 ) 5 端引入s a i l 内 切酶位点，确定扩增e l 的序列中没有此两个酶切位点。抽提培养的m c f - 7 细胞 总r n a ，电泳观察完整性，进行逆转录反应获得e d n a ：首先用p i p 2 引物扩增 出含目的片断在内的1 7 0 3 b p 片断，以此为模板，用p 3 p 4 扩增出c y p i a le d n a 全长1 5 4 i b p 的目的片断。 将扩增产物与t 载体连接，转化感受态大肠杆菌d h 5 。，筛选阳性克隆，提 取重组质粒后，p c r 扩增，得到预期的1 5 k b 片断。用b a m h i 和s a i l 对重组质 粒进行酶切分析，得到1 5 k b 和3 0 k b 片断；测序结果与g e n e b a n k 中c y p i a i 基 因e d n a 序列比较，符合率达9 9 9 ，证实插入的片断为1 ：1 的片断。将此质粒命 名为。p g e m t - c y p i a i ”。 二、c y p i a i 活性结构域附近t h r 4 6 1 一a s n 拍1 、i l e 4 6 2 一v a l 舶2 定点突变及t 载 体克隆 根据人群研究的资料，确定c y p l a lm r n a 的1 5 0 4 、1 5 0 6 碱基为突变的目 标碱基，设计两对含1 5 0 4 、1 5 0 6 突变碱基的引物( p t l p t 2 ，p t 3 p t 4 ) 与扩增目的片 断的引物( p 3 p 4 ) 共组成了五对引物，应用p c r 技术先分别得到含单点a s n 4 6 1 ， 双点a s n 4 6 1 v a l 4 6 2 变异的1 3 9 7 b p 上游片断和1 7 7 b p 的下游片断，以此上下游片 断为模板，采用p 3 p 4 引物扩增得到含突变位点的全长c y p l a ie d n a 。扩增产 物与t 载体连接，转化感受态大肠杆菌d h 5 。，筛选阳性克隆，提取重组质粒后， p c r 扩增得到1 5 k b 片断；用b a m h l 和s a i l 对重组质粒进行酶切分析得到1 5 k b 和2 6 k b 两个片断，将酶切鉴定正确的质粒用t 载体通用引物测序，结果与 g e n e b a n k 中c y p l a l 基因e d n a 序列比较，确证成功将目标位点进行了单点 1 5 0 4 c a 和双点i 5 0 4 c a 1 5 0 6 a g 突变。将此两个质粒分别命名为 “p m d t - a s “蚓”和。p m d t - a s h 4 6 1 ，v a l 4 6 2 ”。 三、c y p i a i w t 和c y p i a l - a s n 4 6 1 ，v a l 4 6 2 真核表达载体的构建及细胞模型 建立 1 野生型和变异型c y p l a l 细胞模型的建立和鉴定 将野生型p g e m t - c y p i a i 质粒和变异型p m d t - a s h 蚓， i 9 t 山土士t 鲁文- t 色1 | a 曩恕一，- 鼻琦t 蔓矗由，舛竞一r 文姜 p m d - t - a s n 4 6 1 ，v a 产2 质粒重组至真核表达的逆转录病毒p b a b e n e o 载体中，p c r 和酶切鉴定确证后，命名为“p b a b e w t ”，。p b a b e a s n 4 6 l ”， “p b a b e a s h 4 6 1 ，v a l 舶2 ”。利用f u g e n e 6 转染试剂将三种质粒及p b a b e r i c o 载 体转染至h l f 中，g 4 1 8 筛选。 转染至第十天左右镜下观察到转染细胞克隆，将转染细胞分别命名为 “h l f p b a b e ”，“h l f w t ”，“h l f a s n 4 6 h ，“h l f a s i l 4 6 1 ，v a l 4 6 2 ”。以a c t i n 蛋 白为内对照，用蛋白免疫印迹法测得h l f w t ，h l f a s n 4 6 1 ，h l f a s n 4 6 1 v a l 4 6 2 三种转染细胞的c y p i a i 蛋白均有表达，而正常h l f 细胞和空载体h l f p b a b e 细胞则未见到明显的条带。说明成功建立了c y p i a l 野生型和变异型h l f 细胞 模型，且空载体的转染不会影响正常h l f 细胞c y p i a i 表达。 2 变异型h l f 细胞生物学特性研究： ( 1 ) 细胞形态：在显微镜下观察，未转染组和转染组细胞形态一致，均呈梭 形，贴壁生长，苏木素染色观察可见细胞胞膜完整，胞核呈椭圆形，核膜完整清 晰，提示c y p i a i 蛋白不会影响到细胞本身的形态。 ( 2 ) 转染细胞的超微结构：在投射电镜下观察未转染组细胞和转染组细胞超 微结构，五种细胞超微结构基本相同，均表现为细胞边界清楚，核膜清晰，核仁 明显，内织网和溶酶体等细胞器未见明显异常。 ( 3 ) 细胞生长速度：未转染的正常h l f 细胞和四种转染的h l f 细胞生长曲线 相似，均呈“s ”型，h l f 、h l f p b a b e 、h l f w t 、h l f a s h 4 6 1 、h l f a s n 4 6 1 m i 拍2 细胞的倍增时间分别为0 9 7 9 d ，0 9 6 1 d ，1 0 4 0 d ，0 8 4 9 d ，1 1 0 6 d ，五者接近，提 示c y p l a i 转染的细胞增殖能力相当，即c y p i a i 蛋白血红素结构域附近氨基 酸的变化和p b a b e - n e o 空载体对h l f 细胞生长速度没有显著的影响。 ( 4 ) 细胞恶性程度鉴定：h l f 、h l f - p b a b e ，h l f w t 、h l f - a s h 6 1 、 h l f a s n 4 6 1 v a l 4 6 ：细胞于软琼脂中培养1 4 天后观察细胞集落的形成情况，可见培 养h e l a 细胞的3 个平皿均长出细胞集落，而h l f 、h l f p b a b e 、h l f w t 、 h l f - a s n 4 6 1 、h l f a s n 4 6 1 m i 4 6 2 细胞则未见细胞集落形成，说明h l f w t 、 h l f a s r i 拍1 、h l f a s h 4 6 1 ，v a l 4 6 2 细胞还不属于恶性转化细胞，p b a b e 1 1 c o 载体转 染对细胞恶性程度无影响。 四、3 - m c 对c y p i a ia s n 4 6 1 及v a 严2 变异细胞模型作用的研究 1 3 - m c 对正常h l f 细胞c y p i a i 表达及e r o d 的影响 9 i r 山太膏士t t 鲁文- t 毛t 芦颤a 坩_ ，t 一t 宴矗鲁，tr 文善 3 - m c 可以诱导正常细胞表达c y p i a i 蛋白，且有一定的剂量效应关系； 3 - m c 可以增高h l f 细胞e r o d 活性，各组方差检验f = 3 6 0 9 2 ，p 0 0 1 ；l s d 检验，2 5 9 m o l l 以上染毒组与对照组比，均p o 0 5 ) ，但h l f - a s n 矧v a l 4 6 2 细胞e r o d 显著 高于h l f w t ( e o 0 5 ) 。提示单点和双点变异型基因转染对h l f 细胞代谢功能产 生了不同影响。 3 3 m c 对h l f - a s n 4 6 1 和h l f a s n 4 6 ，v a l “细胞蛋白表达及e r o d 活性的影 响 3 - m c 对转染细胞染毒2 4 h 后，野生型h l f w t 与变异型h l f a s n 4 6 1 、 h l f a s n 4 6 1 n a l 4 6 2 细胞的c y p i a i 蛋白表达没有显著性差异。转染细胞染毒后 h l f a s h 4 6 1 细胞e r o d 活性比h l f w t 低，两者有显著性差异( p 0 0 5 ) ； h l f - a s n “，v a l “细胞e r o d 活性高于野生型h l f w t 细胞( 尸 0 0 5 ) 。提示t h 1 一a s i l 4 6 1 单点变异和1 1 l r 4 6 1 一a s 1 i l e 4 6 2 一v a l 4 5 2 双点变异改变了h l f 对3 - m c 的代谢。 4 3 m c 对细胞微核率和核异常率的比较 用2 5 1 _ i m o l l3 - m c 对野生型和变异型细胞染毒2 4 h 后，变异型细胞组微核 率、核异常率与野生型细胞组比无显著性差异( 胗0 0 5 ) ，而与各自阴性未染毒组 比则有显著增高( 尸 0 0 1 ) 。各转染组与正常h l f 细胞相比，微核率和核异常率明 显增加( 尸 o 0 1 ) ，提示3 - m c 的作用将会对细胞的遗传物质d n a 产生明显损伤， 且无需外加s 9 活化系统，在2 5 1 _ l m o l f l 剂量就能诱发h l f 细胞微核显著增加， 证明了转染c y p i a i 的h l f 细胞对3 - m c 的损伤更加敏感。 结论： v 山土量膏士t 鲁文- 奠毛t 习昏曾，琦t 童花由，一tl r 文鼻 1 运用p c r 和基因克隆技术成功构建了含有人细胞色素氧化酶p 4 5 0 1 a i e d n a 全长的t 载体。 2 利用自行设计的突变引物成功进行了c y p i a in i 1 一a s n 4 6 1 和n l 1 一 a s n 4 6 1 i i e 4 6 2 一v a i 撕2 的突变，建立了真核表达载体和细胞模型。 3 3 m c 可以有效诱导正常h l f 细胞和转染细胞c y p i a i 的表达；变异型 h l f 细胞和野生型h l f 细胞对3 - m c 的代谢不尽相同，提示突变可能改变了 c y p i a l 的功能。 关键词 细胞色素氧化酶p 4 5 0 ，定点突变，e r o d ，微核试验，3 一甲基胆蒽 9 r 山点膏士t t 鲁文- t 毛t 霄西口b 一，矗蕾砷t 毫花- 由，碍竟善文乓 c y t o c h r o m ep 4 5 0 1 a 1g e n ep l o y m o r p h i s m s a n di t sf u n c t i o ni n v e s t i g a t i o n m a j o r ：h e a l t ht o x i c o l o g y p h dc a n d i d a t e ：x i a oy o n g m e i s u p e r v i s o r ：p r o f l i n gw e n h u a a b s t r a c t c y t o c h r o m eo x i d a s e ，o n eo f t h em e t a b o l i ce n z y m e s ，i su b i q u i t o u si nt h el i v i n g n a t u r e t h es t u d yo nt h i se n z y m ec o u l dn o to n l yh e l pt ou n d e r s t a n dt h eg e n e t i c r e l a t i o n s h i pa m o n g v a r i o u sk i n d so f o r g a n i s m s ，b u ta l s ob e n e f i tf o rd i s e a s ep r e v e n t i o n a n dt r e a t m e n t t h u si ti sw i d e l yi n v e s t i g a t e di nt h et o x i c o l o g ya n dp h a r m a c o l o g y d o m a i n i nt h ec o u r s eo fm e t a b o l i s mo fp o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ( p a h s ) ， c y t o c h m m eo x i d a s ep 4 5 0 1 a i ( c y p i a i ) i s t h em o s ti m p o r t a n tp h a s eie n z y m e ，a n di t h a st h ea r y l h y d r o c a r b o nh y d r o x y l a s e ( a h h ) a c t i v i t yw h i c hc a nb ei n d u c e db ym a n y s u b s t a n c e s ，s u c ha sh e n z o - a - p y r e n e ( b a p ) ，t c d d ，3 - m e t h y l c h o l a n t h r e n e ( 3 一m c ) ，e t c i n d u c t i o no fc y p l a ie n h a n c e st h em e t a b o l i s mo fp a h sa n dc o n v e r t si ti n t o c a r c i n o g e n i ce l e c t r o n p h i l i ce p o x i d e t h e r e f o r et h ea c t i v i t so f c y p 4 5 0 l a li s o z y m ei s t h ek e yd e t e r m i n a n to f p a h sc a r c i n o g e n i c i t y c y p i a ii se n c o d e db yc y p i a ig e n el o c a t e do nc h r o m o s o m e1 5 q 2 2 - q t e r t h e e p i d e m i o l o g i c a ls t u d i e s s h o w e dt h a tc y p i a ih a s9 a l l e l e s ，c o n t a i n i n gt w o p l o y m o r p h i s mi nt h eo p e nr e a d i n gf r a m eo f t h ec y p i a lg e n e ，t w op o i n tm u t a t i o n si n e x o n7 ( 4 8 8 7 c a 。4 8 8 9 a g ) c r e a t i n gt w o1 1 1 r 4 6 1 一a s n 4 6 1a n di l e 4 6 2 一v a l 4 6 2a m i n o a c i ds u b s t i t u t i o n sr e s p e c t i v e l y t h e s et w os u b s t i t u t i o n s ，c o r r e s p o n dt ot h e1 5 0 4 ma n d 1 5 0 6 “b a s eo ft h es e q u e n c eo fc y p l a lm r n a ，a r cm o s tl i k e l yw i t h i nt h eb e r n e b i n d i n gr e , o no ft h ep r o t e i n a l t h o u g hm a n ys t u d i e sf o c u s e do nc y p i a l 一i i e 4 6 2 m u t a t i o no f i n d i v i d u a lg e n e ，l i t t l ei sk n o w no no f e o n s q u e n c eo f c y p l a l - t h r 4 6 1a n d d o u b l ep o i n tm u t a t i o n t of u r t h e rd e m o n s t r a t et h ep o s s i b l em e c h a n i s mo fc y p l a lg e n ef u n c t i o na n di t s r e l a t i o n s h i pb e t w e e nm u t a t i o na n dm e t a b o l i s m ，t h ew i l dt y p e ，o n e - p o i n tm u t a n ta n d v h 0 4 山土t 尊士t 蕾文- t 毛芦叠坼一，- 靖t 蔓七由夕j 叶tl 文善 d o u b l e - p o i n tm u t a n tr e c o m b i n a n tp l a s m i de x p r e s s i o nv e c t o r sw c r ec o n s t r u c t e da n d t r a n s f e c t e di n t oh u m a ne m b r y o n i cl u n gf i b r o b l a s t ( h l f ) 髂a ne f f e c t i v ec e l lm o d e l t h ec y t o t o x i c i t yo f3 - m ci nt h et r a n s f e c t e dc e l lw a si n v e s t i g a t e dt or e v e a lt h e b i o l o g i c a lf u n c t i o no fa m i n oa c i d ss u b s t i t u t i o no fc y p l a ih e i n eb i n d i n gr e g i o no n t h et o x i e a lc o m p o u n d s t h es t u d yp o s s e s s e st h r e ep o i n t so f s i g n i f i c a n c e ，( 1 ) p r o v i d i n g aa c t i o nm e c h a n i s mc l u eo fp o l y c y c l i c a r o m a t i ch y d r o c a r b o nc o m p o u n df o r t o x i c o l o g y ；( 2 ) s u p p l y i n gac e l lm o d e lf o rt o x i c o l o g yt os t u d yt h ef u n c t i o n so f c y p i a i加v i t r o ；( 3 ) o f f e r i n gac e l l m o d e lo fs e l e c t i o n t e s t f o r p r o m u t a g e n p r o e a r c i n o g e n r e s e a r c h e sa n dm e t h o d s ： ic o n s t r u c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f t - v e c t o ro f w i l d t y p ec y p l a ie d n a t h et o t a lr n aw a se x t r a c t e df r o mc u l t u r e dm c f 一7c e l l s ，u s i n gt r i z o lr e a g e n t t h ef u l l l e n g me d n aw a ss y n t h e s i z e db yr e v e r s et r a n s c r i p t i o na n da m p l i f i e db y n e s t - p c r t h ea m p l i f i e dd n af r a g m e n t sw a sl i g a t e di n t op g e m - tv e c t o r , a n dt h e n t r a n s f o r m e di n t oe c o i ls t r a i nd h 5d t h ep o s i t i v ec l o n e sw e r es c r e e n e do u ta n d r e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r ei d e n t i f i e db yp c i 乙r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e sa n a l y s i sa n d s e q u e n c i n g i is i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i so ft h 1 一a s n 矧、i l e 拍2 一v a 严2n e a r h e m e b i n d i n gr e g i o no f c y p l a la n dc o n s t r u c t i o no f t - v e c t o r t h i sp r o t o c o li sb a s e do nt h ed e s i g no ft w od i f f e r e n tp r i m e r s ，w h i c hc r e a t ea 1 5 0 4 c aa n dt w o1 5 0 4 c - - a 1 5 0 6 a gc h a n g er e s p e c t i v e l y t h ef r a g m e n t sw i t h s i n g l ea s n 4 6 1a n dt w om u t a n t sa s n 4 6 l - v a 4 6 2w e r eo b t a i n e db yo v e r l a p p c ra c c o r d i n g t ow i l d - t y p ec y p i a it e m p l a t e t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r ev e r i f i e db yp c r r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e sa n a l y s i sa n ds e q u e n c i n g i l ic o n s t r u c t i o no fe u k a r y o t i c e x p r e s s i o n v e c t o ro fc y p i a i w ta n d c y p i a i a s n 4 6 1 v a l 4 6 2a n dc e l lm o d e l t h ef r a g m e n t sc o n t a i n i n gc y p i a l w ta n d a s n 4 6 1 v a l 4 6 2w a sc l o n e di n t o e x p r e s s i o nv e c t o rp b a b e - n c o t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r ev e r i f i e db yp c 心 r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ee n z y m ea n a l y s i s h u m a ne m b r y o n i cl u n gf i b r o b l a s t s ( h l f ) w a st r a n s f e e t e dw i t hp b a b e - n e oo fc y p i a ig e n e b yf u g e n e 6r e a g e n t t h e t r a n s f e c t e dh l fc e l l sw e r es c r e e n e db y1 0 0 0 1 t g m lg 4 1 8 t h ec y p i a ip r o t e i n e x p r e s s i o no f t r a n s f e c t e dc e l l sw a sd e t e c t e db yw e s t e r nb l o t t i n gt oe s t i m a t ee f f i c i e n c y v 1 1 t 9 r 山土t 膏士t 静文- t 毛t 习蕾身靖，t 琦t 毫克，碍tl 文垂 o ft r a n s f e c t i o n c e l lm o r p h o l o g y , u l t r a s t r u c t u r e ，g r o w t hs p e e d , g r o w t hs t a t u s i ns o f t a g a rw e r eo b s e r v e di nb o t ht r a n s f e c t e dc e l l sa n dn o r m a lc e l l st os t u d yt h ee f f e c t so f c y p i a ip r o t e i no nc e l l a rb i o l o g yc h a r a c t e r s i ve f f e c t so f 3 m c0 f ic e l lm o d e l sw i t hc y p i a i a s n 4 6 1a n d v a l 4 6 2 t h ep r o t e i na n d7 - e t h o x y r e s o m f i no - d e e t h y l a s e ( e r o da c t i v i t y ) w e r eo b s e r v e d a r e re x p o s u r et o0 ，0 1 ，0 , 5 ，2 5 ，1 2 5 ，7 2 5 p m o l l3 - m cf o r2 4 hi no r d e rt o d e t e r m i n et h e e x p o s u r e d o s eo ft r a n s f e c t e dc e l l s c y p i a ip r o t e i n ，e r o d ， m i c r o n u c l e u st e s tw e r ep e r f o r m e da f t e rt h et r a n s f e c t e dc e l l sa n dn o r m a lc e l l sw e r e t r e a t e dw i t i i2 5 t l m o l f l3 - m cf o r2 4 hr e s p e c t i v e l y r e s u l t s 1c o n s t r u c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f t - v e c t o ro f w i l d - t y p ec y p i a ie d n a t w op a i r so fs p e c i f i cp r i m e r s ( p l p 2 ，p 3 p 4 ) w e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt o c y p l a lm r n ai ng e n e b a n k ab a m h ia n das a i lr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s es i t e sw a s i n s e r t e di n t o5 - e n do f p 3 p 4r e s p e c t i v e l y a f t e rt o t a lr n ae x t r a c t e df r o mm c f 7c e l l l i n e ，a1 7 0 3 b pd n af r a g m e n tw a sg o tu s i n gp 1 p 2p r i m e tb yr ta n dp c i l t h e nt h e f i r s tp c rp r o d u c t i o nw a sa st e m p l a t ed u r i n gt h es e c o n dp c rb yu s i n gp 3 p 4p r i m e r a 1 5 4 1 b pd n af r a g m e n tw a s o b t a i n e di np 3 p 4p r i m e r 1 1 1 er e c o m b i n a n t sw e r ef o r m e da f t e rt h ep c r p r o d u c t i o nl i n k e dt otv e c t o r , a n d t r a n s f o r m e di n t od h 5 。p o s i t i v ec l o n e sw e r es c r e e n e do u ta n d1 5 k bf r a g m e n tw a sg o t b yp c r ；1 5 k ba n d3 0 k bw e r eg a i n e db yr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ed i g e s t i o n ；t h er e s u l t o f s e q u e n c i n gw a si na c c o r d a n c eg e n e b a n ka tt h er a t eo f 9 9 9 t h e s er e s u l t ss h o w e d t h a tc y p i a le d n ah a db e e nc l o n e di n t ot - v e c t o rs u c c e s s f u l l y t h ep l a s m i dw a s n a m e da s “p g e m - t - c y p i a l ” i is i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i so ft h 1 一a s 1 、i l e 4 6 2 一v a l 4 6 2n e a r h e m e b i n d i n gr e g i o no f c y p i a ia n dc o n s t r u c t i o no f t - v e c t o r 1 5 0 4 “a n d1 5 0 6 “b a s e o f c y p 埘m r n a w a s d e t e r m i n e d a s t a r g e t m u t a n t b a s e d o nc o h o r ts t u d i e s t h ef r a g m e n t sw i t hm u t a n t sw e r ea m p l i f i e db yp c rt h r o u g hu s i n g t h ep r i m e r s w h i c hc o n t a i n1 5 0 4 m 蚰d1 5 0 6 t hm u t a n tb a s e d i f f e r e n tp r i m e r sp r o d u c e d t h ef r a g m e n to f1 3 9 7 b pa n d1 7 7 b pr e s p e c t i v e l y t h e nt h ef u l ld n aw a ss y n t h e s i z e d b yo v e r l a p p c r 1 1 1 er e c o m b i n a n t sw c f ef o r m e da f t e rt h ep c rp r o d u c t i o nl i n k e dt ot v e c t o r , a n dt r a n s f o r m e di n t od h 5 。p o s i t i v ec l o n e sw e r es c r e e n e do u ta n d1 5 k b f r a g m e n tw a sg o tb yp c r ；1 5 k ba n d2 6 k bw e r cg a i n e db yr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e i x 9 山土毒 | 士t 静文- t 毛a 岛- 一，t 斗t 毫矗备，一蠢羹文- 善 d i g e s t i o n t h er e s u l t so f s e q u e n c i n gv e r i f i e dt h es i n g l eb a s e1 5 0 4c a a n dt w ob a s e s 1 5 0 4 c 一1 5 0 6 a gs u c c e s s f u l l y t h i st w o p l a s m i d s w e r en a m e da s “p m d - t - a s n 4 6 1 ”a n d “p m d t a s 1 、，a i 拍2 ”r e s p e c t i v e l y i i ic o n s t r u c t i o no fe u k a r y o t i c e x p r e s s i o n v e c t o ro fc y p i a i w ta n d c y p i a i a s h 6 1 v a 严a n dc e l lm o d e l l - c o n s t r u c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f c y p l a l w ta n dv a