（化学工艺专业论文）3tbdmso戊二酸甲酯的合成工艺研究.pdf

中文摘要 脂肪酶催化是生产单一对映体产品的有效方法，可以在非水相中通过酯交换 反应分别对醇、酸、内酯进行转换。本文利用固定化的脂肪酶在有机溶剂中的催 化特性，对一种他汀类药物的重要合成原料3 t b d m s o 戊二酸酐进行不对称的醇 解反应，考察了反应时间、反应温度、酶用量、体系水活度、溶剂等方面对反应 的影响。利用高效液相色谱对反应结果进行分析，确定了适宜的反应条件。通过 红外光谱、紫外一可见光谱以及核磁氢谱对制备的产品进行了表征，通过圆二色 光谱对产品的光学纯度进行了分析。主要结论如下： 实验研究了四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醚、甲基叔丁基醚和甲苯五种溶剂对酶 催化反应的影响，结果表明，在甲基叔丁基醚溶剂中，固定化脂肪酶n o v o z y m4 3 5 的催化效果最好，得到了适宜反应条件为：最适温度2 5 ，最佳反应时间6 0h ， 最适加酶量3 0m g m l ，甲醇与酸酐的摩尔比1 0 ，最适底物浓度1 0 0m m o l m l ， 最适p h 值6 0 7 0 ，体系水活度0 6 6 0 7 5 。在优化的反应条件下进行放大实验， 反应转化率达到2 9 1 。 通过考察溶剂( 甲基叔丁基醚) 、甲醇、底物对酶的抑制作用发现，甲基叔 丁基醚对酶的活性几乎没有抑制，底物酸酐对酶的活性抑制作用不大，而甲醇对 酶有相对较大的抑制作用。实验选择甲醇分加的方法对反应进行优化，转化率由 2 9 1 提高到3 2 9 。 实验采用萃取的方法分离出3 - t b d m s o 戊二酸甲酯，并结晶提纯制备了 3 - t b d m s o 戊二酸甲酯的无色晶体，分别通过i r 、u v v i s 、1 h - n m r 对产物进行 了表征，结果表明，合成的产物为3 - t b d m s o 戊二酸甲酯，是单一对映异构体 过量，其对映体过量值为9 4 4 。 关键词：他汀类药脂肪酶非水相手性拆分 a b s t r a c t l i p a s e s c a t a l y s e dr e a c t i o n sa r ec o n s i d e r e da sa l le f f e c t i v em e t h o d t op r e p a r ep u r e e n a n t i o m e r s 。b a s e do ne s t e r i f i c a t i o no fa l c o h o l ，a c i d ，o rl a c t o n ei nn o n a q u e o u sp h a s e u n d e rm i l dr e a c t i o n c o n d i t i o n s t h i st h e s i s s y n t h e s i z e do p t i c a l l y a c t i v e 3 - ( t e r t b u t y i d i m e t h y l s i l y l ) o x y p e n t a n e d i o a t e - 1 m e t h y lm o n o e s t e rb ye n a n t i o s e l e c t i v e a l c o h o l y s i so f3 - ( t e r t - b u t y l d i m e t h y l s i l y l o x y ) g l u t a r i ca n h y d r i d eu s i n g t h ei m m o b i l i z e d l i p a s en o v o z y m4 3 5a sab i o c a t a l y l s t e f f e c t so fr e a c t i o nt i m ea n dt e m p e r a t u r e ， e n z y m ea m o u n t , w a t e ra c t i v i t y , a n ds o l v e n tw e r es t u d i e do nt h es u b s t r a t ec o n v e r s i o n ， a n dt h es e l e c t i v i t y , u s i n gt h ea n a l y s i so fh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y w i t hc 1 8c o l u m n p r o d u c t sw e r ec h a r a c t e r i z e db yf t i ru v - v i sa n dn m r o p t i c a l p u r i t yo fp r o d u c t sw a sa n a l y z e db yc ds p e c t r a m a j o rc o n c l u s i o n sw e r el i s t e d a s b e l o w d i f f e r e n ts o l v e n t si n c l u d i n gt e t r a h y d r o f u r a n ，e t h y la c e t a t e ，d i e t h y le t h e r , m e t h y l t e r t b u t y le t h e ra n dt o l u e n ew e r ei n v e s t i g a t e di n t h er e a c t i o n i ti si n d i c a t e dt h a t m e t h y lt e r t b u t y le t h e rw a s t h em o s te f f e c t i v es o l v e n t t h eo p t i m a lr e a c t i o nc o n d i t i o n s f o rm o n o e s t e rs y n t h e s i sa l e ：t e m p e r a t u r e2 5 ，r e a c t i o nt i m e6 0h ，t h ea m o u n to f e n z y m e3 0m g m l ，t h em o l a rr a t i oo fm e t h a n o la n da n h y d r i d e1 0 ，t h e s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n1 0 0m m o l m l ，p h6 0 - 7 0 ，w a t e ra c t i v i t yo 6 6 - 0 7 5 b a s e do nt h e o p t i m a lc o n d i t i o n s 。t h es c a l e u pc o n v e r s i o ni s2 9 1 i n h i b i t i n ge f f e c t so f t h es o l v e n t ，m e t h a n o l ，s u b s t r a t et ot h ee n z y m ea c t i v i t yw e r e s t u d i e d i ti si n d i c a t e dt h a tm e t h a n o lh a st h el a r g e s ti n h i b i t i o no nt h ee n z y m ea c t i v i t y c o n v e r s i o n o fs u b s t r a t e sw a si m p r o v e df r o m2 9 1 t o3 2 9 t h r o u g hd i v i d e d a d d i t i o no fm e t h a n 0 1 n em o n o e s t e r p r o d u c t w a s p u r i f i e dt h r o u g h e x t r a c t i o nf o l l o w e d b y c r y s t a l l i z a t i o n a n dt h e nw a sc h a r a c t e r i z e db yi r , u v - v i s ，h - n m ra n dc ds p e c t r a i t i si n d i c a t e dt h a tt h es y n t h e s i z e d3 - ( t e r t b u t y l d i m e t h y l s i l y l ) o x y p e n t a n e d i o a t e - 1 一 m e t h y lm o n o e s t e rw a sas i n g l ee n a n t i o m e re x c e s s w i t ht h ee e v a l u eo f 9 4 4 k e yw o r d s ：s t a t i n ，l i p a s e ，n o n a q u e o u sp h a s e ，c h i r a lr e s o l u t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤鲞盘鲎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：凿溯 签字日期： 硼年6 月弓日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权苤望盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：童溯 签字日期：压川年6 月弓日 导师弛孝静 签字日期：一2 棚罗年歹月3 日 前言 前言 手性，是指含碳化合物分子由于四价碳原子的三维空间排列所引起的结构不 对称的特征，是自然界的本质之一。自1 8 4 8 年l o u i sp a s t e u r 首次成功分离出酒石 酸盐的外消旋体以来，随着有机立体化学和生命科学的不断进步，人们发现当手 性化合物在手性环境中发生作用时，同一种物质的不同对映异构体尽管结构相 似，但往往表现出不同的性质和旋光特征，甚至有着截然相反的理化作用。2 0 世纪中叶，著名的“反应停”( t h a l i d o m i d e ) 药物致畸案例在全世界造成了惨痛 的悲剧。不仅医药如此，农药，除草剂，植物生长调节剂，甜味剂和香料都表现 出不同的手性识别，如甜冬素的右旋体具有甜味，其左旋体具有苦味。除草剂 m e t o l a c h i o r 四种异构体中只有两种异构体有活性。从此，为了提高手性化合物中 有效成分的含量及其生物活性效果，减少或排除无效成分的副作用甚至反作用， 降低环境污染，人们不断致力于高纯度、高产量的有效光活性对映体的特征研究 和产品开发，从而推动了手性技术的发展以及手性产品经济市场的快速增长。目 前，手性化合物己经在医药蚴、农药【3 ，4 1 、香料【5 1 、功能材料【6 ，7 1 以及其它精细化 工行业中发挥着十分重要的作用。 当药物的分子结构中存在手性因素时，这类药物称为手性药物。手性药物的 药理作用是在与体内的大分子之间通过严格的手性识别和匹配而实现的。由于手 性药物的对映异构体在立体构型上存在差异，使得它们在人体内的药理，代谢过 程，毒性和疗效存在着显著差异1 8 - 1 0 1 。据统计，l8 0 0 个药物，具有手性中心的就 有1 0 2 6 种，占5 7 。现在市场上只有6 1 种药物是以单对映体形式存在，其余均为 外消旋体( 左、右旋各半) 混合形式。鉴于不同光学活性的手性分子具有如此大 的差异，欧洲，日本和美国的药政部门相继做出了相应的管理规定，如美国f d a 1 9 9 2 年5 月规定：所有在美国申请上市的外消旋新药，生产者均需提供报告说明 所含对映体各自的药理作用【1 1 1 。自此之后，手性药物的市场一直保持快速增长的 态势，近几年单一对映体的年增长率已经超过2 0 ，至u 2 0 0 5 年全球约有6 0 的上 市新药为单一对映体药物。由此看来，手性药物的研发已成为当今世界新药研发 的发展方向和热点领域，从而也带动了手性中间体的发展。 随着对单一对映体功能的药物需求量的增长，生物催化已经用于不对称合成 中。与化学催化( 特别是一些重金属催化剂) 相比，该法反应条件温和。由于酶 无毒、易降解、不会造成环境污染，可以弥补化学拆分法拆分消旋体的许多不足， 适用于大规模生产。有机溶剂中脂肪酶不对称催化反应是一种获取光学纯手性物 前言 质的有效方法。传统上认为，酶在有机溶剂中会发生构象变化而失去活性。非水 相酶反应技术的发展突破了生物催化剂只能在水溶液中进行的局限，为酶工程在 有机合成领域的广泛应用清除了障碍。1 9 8 4 年z a k s 和k l i b a n o v i 叼报道了脂肪酶在 有机溶剂中具有极高热稳定性和较高的催化活性，在低极性有机溶剂中水含量为 0 0 2 时，脂肪酶仍然具有活性。使用有机溶剂作为酶促反应的介质，不仅可以 解决许多疏水性底物或产物的溶解问题，而且由于大幅度降低了系统中水的活 度，使得利用脂肪酶、蛋白酶等水解酶逆向合成光学活性的酯和肽成为可能。从 理论上讲，几乎所有的有机化学反应都可以由酶来催化完成，这种由酶催化的有 机化学反应能以极高的立体专一性在相对温和的条件下完成，并且几乎不产生副 产物，这是常规化学方法无法比拟的。迄今为止，脂肪酶在有机化学领域最重要 的应用就是在旋光异构体的拆分方面。本文基于酶催化手性拆分的优点，研究了 固定化酶催化的非水相中手性药物中间体的拆分。 2 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 高血脂及降血脂药物简介 1 1 1 高血脂症症状及现状 在我国，心血管的并发症，如心肌梗塞、中风和外周血管疾病占所有疾病的 一半。高血脂症是一种常见的心血管疾病，主要是由于血脂代谢紊乱引起的，常 表现为高胆固醇血症( t c 升高) ，高甘油三脂血症( t g 升高) 或二者兼有，是 导致动脉粥样硬化和冠心病的重要危险因素，成为严重威胁人类健康的危险因 素。因此，开发新型有效的降血脂药物越来越受到人们关注。 1 1 2 降血脂药物简介 降血脂药是通过抑制机体产生脂蛋白或从血浆中除去脂蛋白，以降低血浆中 的脂蛋白浓度的药物。脂蛋白可分为五种基本的类型：乳糜微粒、极低密度脂蛋 白、中密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白。研究显示，血流中高水平低 密度脂蛋白( l d l ) 是阻塞血流和促进血栓的冠状动脉病变的主要因素，降低血 浆l d l 水平可以降低患有心血管疾病患者以及高胆固醇血症患者发生临床危 险。 极低密度脂蛋白是在肝脏中生成的，主要包括外源的甘油三酯与不饱和脂肪 酸结合的胆固醇酯。它们在有机体内进行脂解，形成短暂寿命的中密度脂蛋白， 其中含有近等量的甘油三酯和胆固醇酯，然后它们再次进行脂解，转化成低密度 脂蛋白，这时胆固醇酯为主要成分。低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白，在代谢中 从酯中水解释放出有利的胆固醇，胆固醇沉积在血管组织上，导致动脉粥样硬化； 而乳糜微粒和高密度脂蛋白不导致动脉粥样硬化。 降低机体的胆固醇水平主要包括：或从血浆中除去过量的胆固醇，或抑制低 密度和极低密度脂蛋白的内源性合成。可根据作用机制把降脂药物分为：增加代 谢的和从机体中除去动脉粥样硬化产生的脂蛋白和脂的药物( 考来替泊和考来烯 胺) ，和抑制导致动脉粥样硬化产生的降脂药贝特类( 氯贝丁酯和吉非贝齐) ， 及天然化合物他汀类( 洛伐他汀、美伐他汀及其类似物) ，同样也包括普罗 布考和烟酸。此外，药物还包括有时用于降低机体胆固醇水平的右甲状腺素和新 霉素。目前他汀药物对于患有心血管疾病的患者用于降低血流中l d l 的水平式 3 第一章文献综述 治疗效果最好的药物。 他汀药物通过竞争的抑制3 羟基3 甲基戊二酰辅酶a 还原酶( h m g c o a 还原酶) 而破坏了在肝中胆固醇和其它固醇的合成。h m g c o a 还原酶催化 h m g c o a 转变成甲羟戊酸，甲羟戊酸是在胆固醇生物合成中决定速率的步骤， 从而使在肝中胆固醇形成速率的下降。胆固醇的减少引起在血流中大量的l d l 受体的增加和相应的l d l 粒子浓度的下降。在血流中l d l 水平的下降减少了冠 状动脉疾病的风险。 1 2 他汀类药物的合成研究进展 世界上第一个上市的他汀类药物是美国默克公司研制开发的洛伐他汀，于 1 9 8 7 年在美国上市。目前全世界已上市的他汀类药物还有氟伐他汀、阿伐他汀、 西立伐他汀、柏伐他汀、民伐他汀等等。如果我们把微生物产生的洛伐他汀称为 第一代他汀类药物，经结构修饰而成的辛伐他汀和普伐他汀称为第二代，则化学 全合成的其它他汀可称为第三代他汀类药物。目前，还有更多的第三代他汀类药 物正在研究中，他汀类药物已在心血管疾病领域占领重要的一席之地。 s i m v a s t a t i n 4 脚a s t a t i n f l u v a s t a t i n 第一章文献综述 r o s u v a s t a t i n 图1 - 1 他汀类药物 f i g u r e1 - 1s t a t i n s 目前，对于第三代化学全合成的他汀类药物，其合成方法主要有消旋体拆分 法和手性试剂法【1 3 】。 1 2 1 消旋体拆分法 消旋体拆分法是指制备两种外消旋体的混合物，然后用化学、酶、色谱的方 法进行分离。如匹伐他汀钙的合成：2 氨基4 氟二苯酮与3 环丙基3 氧代丙酸 乙酯环化、二异丁基氢化铝( d i b a h ) 还原及氯铬酸吡啶( p c c ) 氧化后，经缩 合、对甲苯磺酸( p t s ) 水解得q ，1 3 不饱和醛；再与乙酰乙酸乙酯低温下缩合、 n a b i - 1 4 选择性还原、水解后得以( 3 5 s ) 与( 3 s ，5 r ) 两种顺式构型存在的消旋体【1 4 | 。 与( + ) 苯基乙胺形成非对映异构体拆分后得单一构型，在酸性条件下游离、碱化、 在无水条件下与氯化钙反应得匹伐他汀钙1 1 引。消旋体拆分法反应原料易得，操作 简单，但对消旋体进行手性拆分一步较为繁琐，产品质量不易控制，且拆分以后 不需要的( 3 s ，5 r ) 。构型造成较大的浪费，使总产率较低。 1 2 2 手性试剂法 手性试剂法即用手性中间体的方法合成，包括直链手性试剂 1 6 - 1 9 和环状手性 试剂【2 0 川。 1 直链手性试剂 所有合成制备的h m g c o a r 抑制剂具有芳族碱结构和所谓的他汀侧链1 ( 或 其闭链化合物2 ) ，在制备化合物时存在的一个重要问题就是3 ，5 一二羟基侧链的 形成，从1 9 8 0 年开始就有相关的研究报道。研究发现，这个他汀侧链可以通过 h o m e r - w a d s w o r t h e m m o n s ( h w e ) 试剂3 和手性w i a i g 试剂4 ，生成侧链酮酯5 ， 得到重要的他汀侧链1 1 2 2 。 5 ”令 第一章文献综述 卧跫足兄嘛 1 - 。墨宜父! 淼 2 h o ! r 3 2 o j r # 图1 - 2 他汀侧链的合成 f i g u r e1 - 2s y n t h e s i so fs i d e - c h a i no fs t a t i n s 目前，工业上主要是以3 t b d m s o 戊二酸酐为原料，选择合适的手性亲核试 剂，将酸酐开环及一系列反应，最后得到h w e 试剂。t e r r yr o s e n 等【l7 ，2 3 j 选择( ) 苯乙胺作为手性亲和试剂，将酸酐5 与( ) 苯乙胺反应制得手性试剂6 ，6 经碘甲烷 酯化得7 ；通过笑气在7 中引入n o ，再催化还原得9 ；9 与甲基磷酸二甲酯在正丁 基锂作用下延长碳链得h w e 试剂2 ，如图1 3 所示。通过2 与芳基侧链缩合，酸性 条件下脱去硅烷保护基，经n a b i - h 选择性还原水解得最终产品。 5 h 2 e t 3 n , t o l u e n e 莘i m e 2 b u l u 眦 6 串i m e 2 b u $ i m e 2 b u 骂m 幻l u 一儿人j l m e 0 7 vvn h 7 h 2 ，p d ( o h ) 2 再面五五赢磊丽 串i m e 2 b u 臂?曰 m e o w o h 睾i m e 2 b u 铲父叟显乒呲吼m 悯人令人儡 图1 3h w e 试剂的合成 f i g u r e1 - 3s y n t h e s i so f t h eh w er e a g e n t s 9 h u上。哉。 第一章文献综述 类似的手性亲核试剂还有( 1 r ) 1 苯乙醇【1 6 】，( 1 r ) 1 ( 1 萘基) 乙醇和( 1 s ) 1 ( 1 萘基) 乙醇【2 4 1 ，苯甲基偎) ( ) 扁桃酸锂盐和苯甲基( s ) ( + ) 扁桃酸锂盐【2 2 1 。 直链手性试剂法采用先合成直链手性试剂再引入取代喹啉的方法，得到3 位 为r 型化合物后再进行选择性还原。该法不会造成外消旋体拆分过程中另外一种 构型的浪费，但3 t b d m s o 戊二酸酐及手性拆分剂价格昂贵，在加氢反应中也需 要用昂贵的钯催化剂，而重金属会残留在最终产物中影响产品质量，且选择性还 原5 位羰基一步的转化率不能保证，将会导致成本较高。 2 环状手性试剂 6 氰基3 ，5 二羟基己酸1 0 和6 羟基3 ，5 二羟基己酸1 1 都是环状手性试剂，如 6 羟基3 ，5 二羟基己酸是合成罗苏伐他汀的关键中间体，它的合成主要是以表氯 醇作为起始原料，在用n h 4 c i 处理过的环氧化合物存在下，与1 2 甲基苄基醇反应 得到l 一氯3 ( 4 甲基苄氧基) 2 丙醇；在正己烷与乙腈的混合溶剂中通过酶催化不 对称酯化反应得到( r ) 1 氯3 ( 4 甲基苄氧基) 2 丙醇；然后引入羟基保护基，与 叔丁基2 溴醋酸盐反应后加入氰化钠可得到1 3 羟基酮；1 3 羟基酮在异丙醇溶液 中，于0 下与硼氢化钠反应后，用2 ，2 二甲氧基丙烷酸催化保护，然后经酸溶 液处理、硅胶色谱分离，最后将苯基保护基进行氢解即可得到该中间体【2 1 1 】。 研究发现，这些关键中间体都可以从氯取代的前体1 3 衍生得到【2 0 】，w o l b e r g m 等【2 5 - 2 8 报道了用酶法合成羟基酮酯1 2 ，通过对映选择性拆分得到二羟基己酸， 再引入异亚丙基保护得到氯取代前体1 3 ，如图l - 4 所示。 y c ，忒姒呻u 叁c 。处b u 1 2 1 3 n c 、工工兄b u 掣。饿 1 3 忒 n 伽 u 啪u = a t o r v a s t a t i n 0 4c m 一；扫描范围： 4 0 0 0c m 。1 - 4 0 0c m 。绘出样品的红外光谱图。 2 6 2 紫外可见光谱分析 分子吸收紫外可见光区2 0 0 8 0 0n m 的电磁波而产生的吸收光谱称为紫外可 见吸收光谱( u v ) 。紫外光谱与电子跃迁有关，分子通常是处于基态发热，但 当分子受紫外光照射时，且紫外光的能量( = y ) 恰等于基态与高态能量的差 值( 三，) ，则就可能发生能量转移，使电子从e l 跃迁至e 2 。这就是紫外可见 光谱的基本原理。 在紫外光谱里，峰的强度遵守朗伯比尔定律：当一束波长为九的单色光通过 均匀溶液时，其吸光度与溶液浓度和光线通过的液层厚度的乘积成正比，即 a = l g d i = fc 其中4 为吸光度，厶分别为透射光强度和入射光强度，- 为光程长，即比色皿厚 度，c 为摩尔浓度，为摩尔吸光系数( l r n 0 1 - 1 c m 。) ，其大小表示这个分子在 吸收峰的波长处可以发生能量转移( 电子从能位低的分子轨道跃迁到能位高的分 子轨道) 的可能性。 实验采用v a r i a n 公司生产的c a r y 3 0 0 型紫外可见光谱仪( u v v i s ) 。 u v 的操作参数：控温2 5 ，扫描波长2 0 0 3 5 0a m ，温度由c a r yt e m p e r a t u r e c o n t r o l l e r 进行控制。 检测步骤为：称取一定量制备的3 - t b d m s o 戊二酸甲酯溶于无水甲醇中， 配制成1 0g l 的3 - t b d m s o 戊二酸甲酯溶液，在甲醇透明范围内( 2 0 5 8 0 0a m ， 甲醇的透明界限为2 0 5n m ) ，进行紫外光谱分析。实验中使用1m m 光程的石英 比色皿，实验前先用两个空白溶剂进行对比进行u v - v i s 在2 0 0 3 5 0n m 波长范围 内的吸光度值调零，然后在样品比色皿中加入样品，样品的扫描曲线是由溶液的 扫描曲线减去相应的溶剂的基线而得到的。 2 6 3 n m r 分析 核磁共振现象来源于原子核的自旋角动量在外加磁场作用下的进动。由于原 子核携带电荷，当原子核自旋时产生一个磁矩，磁矩的方向与原子核的自旋方向 相同，大小与原子核的自旋角动量成正比。将原子核置于外加磁场中，若原子核 磁矩与外加磁场方向不同，则原子核磁矩会绕外磁场方向旋转，这一现象类似陀 第二章实验部分 螺在旋转过程中转动轴的摆动，称为进动。进动具有能量也具有一定的频率，由 外加磁场的强度和原子核本身的性质决定。原子核磁矩的方向在这些磁量子数之 间跳跃，形成了一系列的能级。处于低能态的自旋核吸收电磁辐射能跃迁到高能 态的现象称为核磁共振，简称n m r 。 当氢核处在外加磁场中时，将产生一个与外加磁场相对抗的附加磁场，这种 核外电子削弱j t - d 口磁场对核的影响的作用叫做屏蔽，由于有机分子中各种质子所 处的化学环境不同，受到不同程度的屏蔽效应，因此各种核在不同磁场强度下共 振产生化学位移，在核磁共振谱的不同位置上出现吸收峰。氢的核磁共振谱提供 了三类极其有用的信息：化学位移、偶合常数、积分曲线。应用这些信息，可以 推测质子在碳胳上的位置。 实验在v a r i a ni n o v a 型超导傅里叶变换液体核磁共振仪上进行。1 h 谱频 率为5 0 0m i - i z ，测试所用核磁管内径为5m m ，样品体积为1 0m l ，1 h - n m r 实验 是以氘代二甲亚砜为溶剂，州s ( 四甲基硅) 为标准物，在室温下进行测定。 2 6 4 圆二色光谱分析 平面偏振光( 即线偏振光) 是以相同的传播速度前进的左、右两个圆偏振光 的矢量和。当平面偏振光通过旋光性物质时，组成平面偏振光的左旋圆偏振光和 右旋偏振光在介质中的传播速度不同( 即折光率不同) ，使平面偏振光的偏振面 旋转了一定的角度，这就是旋光现象。 当直线偏振光通过手性化合物时，透过的偏振光不再是直线偏振光而成椭圆 偏振光，这是因为左旋和右旋的圆偏振光的吸收强度产生了差异，两者的吸收差 异被称为圆二色性( c d ) ，即c d ( a a ) 信号，其吸收大小由式( 2 3 ) 确定， a = a l a r - l c l 一r c l = a e c l ( 2 3 ) 式中，c 为物质浓度，l 为检测池长度，l 为物质对左旋光摩尔吸光系数，r 为物 质对右旋光摩尔吸光系数。 造成这种现象的本质是：手性分子中与手性异位生色团有关的电子( 或振动) 跃迁造成了左、右圆偏振光被有差别的吸收，即康顿效应。只要样品中含有过量 的某一个对映异构体，两圆偏振光束的强度在被激发的样品中就不再相等。一般 有三种情况会导致康顿效应的产生【6 。玎( 1 ) 由固有的手性发色团产生，如不共 面的取代联苯化合物，螺烯等。( 2 ) 原有发色团是对称的，但处在手性环境当 中而被歪曲。如手性环已酮中羰基是对称的，但邻位有个手性中心，导致了其 康顿效应的产生。手性烯烃中的双键也同样可以被歪曲而产生康顿效应，如环己 酮。( 3 ) 由分子中轨道不互相交叠的发色团耦合相互作用而产生康顿效应。如 ( + ) b i p h e n a n t h r y l - 2 ，2 ，d 1 0 1 1 6 8 。 第二章实验部分 基于上述三种康顿效应产生的原因，可知只有分子中具备了发色团时，才可 能具有圆二色性，即在出现紫外可见光吸收峰的情况下才可能出现圆二色谱的 吸收峰，即康顿效应。 圆二色性以摩尔椭圆率【e 】或摩尔圆二色性表示。对有机化合物一般采用 摩尔圆二色性，a e 是指左旋体和右旋体的圆偏振光的摩尔吸收系数之差，即 a e = e l f r ，由于s 的绝对值很小，常用摩尔椭圆率【e 】来代替，在摩尔椭圆率【o 】 和摩尔圆二色性之间，存在下列关系： 0 = 3 3 0 0 a = 3 3 0 0 ( e l 一r ) 由c d 数据处理软件计算出的【e 】经过换算就可以得到值。 检测步骤为：称取一定量制备的3 - t b d m s o 戊二酸甲酯分别溶于无水甲醇 和无水乙醇溶剂中，配制成一定浓度的3 t b d m s o 戊二酸甲酯溶液，进行圆二 色光谱扫描。圆二色光谱以5 0n m m i n 的速度对3 - t b d m s o 戊二酸甲酯溶液在 2 0 0 3 5 0n n l 的波长范围内进行扫描，使用的是1l n m 光程的石英比色皿，每个样 品的扫描曲线是由被测溶液的c d 扫描曲线减去相应的空白溶剂的基线而得到 的。 2 6 5 对映体组成的测定 实验采用核磁共振谱法( n m r ) 确定3 t b d m s o 戊二酸甲酯的e e 值。在通 常条件下，除了旋光和x 光衍射谱外，对映体的其它光谱是完全相同的，正如在 非手性条件下，它们具有相同的熔、沸点、相同的色谱保留值等一样。测定手性 化合物e e 值的核磁共振方法分为两种：一种是间接法，即通过衍生化反应，使 互为对映体的两种化合物与对映体纯的手性衍生剂( c h i r a ld e r i v a t i z i n ga g e n t s ， 简称c d a ) 定量反应，生成非对映异构体衍生物，原则上非对映体的核磁共振信 号是不等价的。另一种是直接法，即给对映体提供一个手性的外部环境。从理论 上讲，对映体在手性环境中的核磁共振信号是不等价的。这种手性的环境有：( 1 ) 将对映体溶解在手性溶剂( c h i m ls o l v a t i n ga g e s ，简称c s a ) 中；( 2 ) 加入手性 位移试剂( c h i r a ls h i f tr e a g e n t s ，简称c s r ) 1 6 引。 实验采用手性衍生化法，这是一种间接的n m r 方法，它首先将被测物( 互 为对映体) 与手性衍生剂定量反应，生成一对非对映异构体衍生物，如果非对映 异构体n m r 信号能够分开，则对其分别积分，求出底物的e e 值。手性衍生化剂 选择( r ) 1 苯乙胺。 实验在v a r i a ni n o v a 型超导傅里叶变换液体核磁共振仪上进行。1 h 谱频 率为5 0 0m h z ，测试所用核磁管内径为5r n m ，样品体积为1 0m l ，溶剂为氘代 氯仿，标准物为t m s ，在室温下进行测定。 第二章实验部分 对映体纯度的分析属于相对含量的测定，是混合物中两个或两个以上组分相 对含量的比较，不需要对照的标准化合物，只需考虑两个对映体的相对比例。 n m r 的定量比较有两种：峰面积比较和峰高比较。峰面积法准确，也最常用。 对于结构相似的混合物，由于其被积分的信号过于接近而无法准确测定各自共振 峰面积时，可采用峰高法进行定量分析，通过实验求出峰高与含量之间的关系常 数，以校正一些非线性误差，然后再进行样品的测定。笔者在实际m r 测定实 验中发现，即使对于同一样品，在两次谱图采集或在同一谱图采样累加过程中， 同样的两个谱峰的半高宽和相对高度都会发生变化，因此，用峰高法定量是不完 全可靠的，在本文的定量分析中，采用峰面积积分比较。由于对映体纯度的测定 是同一样品中两个组分相对含量的测定，消除了样品称量误差。 对映体纯度常用对映体过量( e e ) 值表示，如式2 4 所示： 4 一j e e = = 墨- 二x 1 0 0 ( 2 - 4 ) a r j ra s ( a r ，彳s 分别为r 体，s 体吸收峰面积的积分值) 衍生物的制备：取制备的3 - t b d m s o 戊二酸甲酯0 0 9 5 7g ( 0 3 4 6m m 0 1 ) ， 溶于甲苯甲醇= 5 ：l 的混合溶剂5m l 中，在0 ，n 2 保护下加入氯化亚砜3 7u l ( 0 5 lm m o i ) ，搅拌1 0m i n 后加入( r ) 1 一苯乙胺4 5ul ( 0 3 4 6m m 0 1 ) 和三乙 胺1 5 01 jl ( 1 0 3 8m m 0 1 ) ，2 2 搅拌反应3h 【蚓。 第三章结果与讨论 第三章结果与讨论 3 1 3 - t b d m s o 戊二酸酐和3 - t b d m s o 戊二酸甲酯的色谱分析 在选定的色谱条件下，对原料3 - t b d m s o 戊二酸酐进行定性及定量分析， 确定酸酐的保留时间，绘制标准曲线。通过对反应后溶液的处理分析，确定产物 3 - t b d m s o 戊二酸甲酯和3 - t b d m s o 戊二酸二甲酯的保留时间，进行定性。 3 1 1 3 - t b d m s o 戊二酸酐的色谱分析 r e t e n t i o nt i m e ( r a i n ) 图3 l3 - t b d m s o 戊二酸酐色谱谱图 f i g u r e3 - 1h p l co f 3 - t b d m s og l u t a r i ca n h y d r i d e 将原料3 - t b d m s o 戊二酸酐溶于一定量甲醇溶液中，在检测条件下进行色 谱分析，谱图为图3 1 。从图中可以看出，3 - t b d m s o 戊二酸酐基本实现了基线 分离，在选定的色谱检测条件下3 - t b d m s o 戊二酸酐的保留时间为11 0 8 9m i n ， 溶剂甲基叔丁基醚的保留时间为1 3 1 2 8m i n 。 ooc叮oioq 第三章结果与讨论 3 1 2 产物的色谱分析 称取1 0m m o l ( 0 2 4 4g ) 的3 - t b d m s o 戊二酸酐于5 0m l 带有密封磨口 旋帽的锥形瓶中，用1 0m l 甲基叔丁基醚溶剂溶解，加入等摩尔量的甲醇( 4 0 止) ，最后加入0 3gn o v o z y m4 3 5 固定化脂肪酶，置于恒温摇床中进行醇解反 应，摇床转速1 0 0r r a i n ，反应温度2 5 ，反应6h 后取样进行色谱分析，其 h p l c 谱图如图3 2 所示，与反应前谱图相比，可以发现反应后溶液中除 3 - t b d m s o 戊二酸酐和溶剂甲基叔丁基醚的峰外，在保留时间为3 7 0 7 和7 8 0 8 m i n 处出现了两个明显的峰，这表明酶催化反应后产生了两种产物，推测产物可 能为3 - t b d m s o 戊二酸甲酯和3 - t b d m s o 戊二酸二酯。 r e t e n t i o nt i m e ( r a i n ) 图3 23 - t b d m s o 戊二酸酐醇解反应前后对比 f i g u r e3 - 2h p l co f 3 - t b d m s og l u t a r i ca n h y d r i d ea l c o h o l y s i sp r o d u c t i o n 将反应溶液过滤掉固定化酶后，用一定量n a h c 0 3 水溶液处理至检测p h = 8 0 以上，取有机相分析，其h p l c 谱图如图3 3 所示。将处理前后谱图进行对比可 以发现样品中保留时间在3 7 0 7r a i n 处的峰消失，而保留时间在7 8 0 8m i n 处的峰 没有变化，由此证明样品中确实存在3 - t b d m s o 戊二酸甲酯，且其在选定色谱 检测条件下的保留时间为3 7m i n 左右，保留时间为7 8 0 8r a i n 处的峰则为 3 - t b d m s o 戊二酸二甲酯的峰。 3 l oocmo10田q 第三章结果与讨论 o o c d o 疗 d ；mo叱 第三章结果与讨论 有机溶剂处理后，酶的残余活力都在8 0 以上，l o g p 值在0 6 7 和1 4 2 间时对酶的 活性影响不大，l o g p 值过高或过低时都会使酶的活性明显降低，这是由于亲水 性越强的溶剂( l o g p 值越小亲水性越强) ，越容易争夺水，夺走酶蛋白周围的 水合层，使酶的活性降低甚至失活，疏水性溶剂则容易保持酶分子的必需水，从 而有利于保持酶的催化活性。 反应转化率和选择性随有机溶剂l o g p 值的变化关系也符合这一规律，如图 3 - 6 所示，结果表明，随着l o g p 值的增高，n o v o z y m4 3 5 催化的转化率先增大后 减小，在以甲基叔丁基醚( l o g p 值为1 4 ) 为介质时，显示出高的反应转化率， 当反应6h 时，转化率达到3 0 1 5 ，以乙醚为溶剂时对甲酯的选择性较好，但转 化率仅为1 3 2 2 。因此，综合这两方面的考虑，以固定化脂肪酶n o v o z y m4 3 5 为 催化剂，甲基叔丁基醚是适合本实验条件的溶剂。同时在无酶催