毕业设计（论文）-魔芋硒多糖对酒精肝大鼠肝脏SOD的影响分析.doc

本科生毕业论文（设计）本科生毕业论文（设计） 题目：魔芋硒多糖对酒精肝大鼠肝脏魔芋硒多糖对酒精肝大鼠肝脏 SOD 的影响分析的影响分析 院 （系） 农学与生命科学院 专 业 班 级 08 级生物科学 学 生 姓 名 指导教师（职称） 提 交 时 间 二二一二年五月 学 号 0827054023 分类号Q5-33 2 目目 录录 摘 要.4 ABSTRACT.5 第一部分 前 言.7 1.1 魔芋.7 1.2 魔芋葡甘聚糖.7 1.3 魔芋硒多糖抗氧化活性.8 1.4 超氧化物歧化酶.9 1.5 酒精性脂肪肝产生机制.9 第二部分 实验部分.9 2.1 魔芋精粉中葡甘聚糖含量测定.9 2.1.1 仪器和材料.9 2.1.2 方法.10 2.1.3 结果.11 2.1.4 讨论.12 2.2 魔芋精粉中硒含量的测定.12 2.2.1 仪器和材料.12 2.2.2 方法.12 2.2. 3 结果.13 2.2.4 讨论.13 2.3 大鼠饲料自制装置设计及制作方法研究.13 2.3.1 仪器和材料.14 2.3.2 方法.14 2.3.3 结果.14 2.3.4 讨论.14 2.4 魔芋多糖对大鼠酒精肝模型的干预.15 2.4.1 实验动物.15 2.4.1 仪器与材料.15 2.4.3 方法.15 2.4.4 结果.18 图 5 多重比较.20 2.4.5 讨论.21 第三部分 结论.21 参考文献.23 致 谢.25 魔芋硒多糖对酒精肝大鼠肝脏魔芋硒多糖对酒精肝大鼠肝脏 SOD 影响分析影响分析 赵亚宁 （安康学院农学与生命科学院，陕西安康，725000） 摘摘 要要：随着饮酒人数及人均饮酒量的增加，酒精对人类器官的损伤日益成为 一个全球性的问题，主要分为三类，即酒精性脂肪肝，酒精性肝炎和酒精性肝 硬化，这三种形式可单独或混合存在。酒精性脂肪肝是早期酒精性肝病，是完 全可逆的，一般情况下戒酒后脂肪肝逐渐消失，所以开发一种能够预防酒精性 脂肪肝的药物已显得日益迫切。安康地区盛产魔芋，而魔芋硒多糖具有抗氧化 作用、降血糖、降血脂、增强免疫力等多种作用，本文主要讨论魔芋硒多糖对 酒精性脂肪肝 SOD 的影响。实验方法：首先测定魔芋多糖中魔芋葡甘聚糖和硒 的含量；其次进行魔芋硒多糖对大鼠酒精肝的干预效果研究：大鼠编号后随机 分为七组，第一组为空白对照组，第二组为酒精模型组，第三组为 10%GSH 干 预组，第四组为 5%KGM 干预组，第五组为 10%KGM 干预组，第六组为 5%硒 多糖干预组，第七组为 10%硒多糖干预组。再次，测大鼠酒精肝 SOD 方法的建 立。测得结果表明：魔芋多糖中一级精粉、魔芋微粉、纯化精粉葡甘聚糖的 含量分别为 46.97%、54.98%和 75.98%，纯化精粉硒含量的平均值为 0.23860.0136mg/kg，为研究魔芋多糖对酒精肝大鼠影响中魔芋葡甘聚糖和魔芋 硒多糖的给量提供依据；12 周后解剖大鼠取肝组织，测得大鼠肝组织 SOD 酒精建模组与空白对照组差异具有显著性，有统计学意义；干预组大鼠酒精 肝 SOD 含量均高于酒精建模组，具有统计学意义，而干预组与 10%GSH 阳性 对照组大鼠酒精肝 SOD 含量差异不具有统计学意义.由此可见，魔芋多糖对大 鼠酒精性脂肪肝有潜在干预作用。 关键词关键词 魔芋 魔芋葡甘聚糖 酒精性脂肪肝 大鼠 SOD 4 Affect analysis of konjac polysaccharide containing selenium on rats organs SOD with alcoholic liver disease Zhao Yaning (College of Agriculture and life sciences，AnKang university, AnKang Shaanxi，725000) AbstractAbstract: : With the increasing of alcohol consumption and per capita alcohol consumption, human organs damaged by alcohol become a global problem.The three main types is alcoholic fatty liver, alcoholic hepatitis and alcoholic cirrhosis, the three forms can be used alone or mixed exist. But alcoholic fatty liver disease is early alcoholic liver disease and completely reversible, under normal circumstances and alcohol,the fatty liver can gradually disappear, so the development of a drug preventing alcoholic fatty liver has become increasingly urgent.Ankang region is rich in konjac, whose konjac selenium polysaccharide has antioxidant effects, lowering blood sugar, lowering blood pressure, strengthening the immune system and many other effects. This article focuses on the impact of konjac selenium polysaccharide on alcoholic fatty liver of SOD. Method: first of all,determining the contents of konjac glucomannan and selenium of konjac polysaccharide;Secondly, researching the intervention effects of konjac polysaccharide containing selenium on rats with alcoholic liver: after numbered the rats were randomly divided into seven groups, the first group was the control group, the second group for the alcohol model group, the third group is the intervention group with 10% of GSH , the fourth group is the intervention group with 5% of KGM, the fifth group is the intervention group with 10% of KGM, the sixth group is the intervention group with 5% of selenium polysaccharide, the seventh group is the intervention group with 10% of selenium polysaccharide.Finally, establishing the method to measure rat alcoholic liver SOD. Result: the first class powder,the contents of KGM of konjac powder ,and the purified konjac glucomannan powder were 46.97%, 54.98% and 75.98 %., the average selenium content of the purified powder is 0.2386 0.0136mg/kg, which built a foundation to the intervention of Konjac selenium polysaccharide for the model of alcoholic fatty liver method in rat;12 weeks later, take liver tissue after anatomy rats and measure the lever of the rats liver tissue SOD ;there was significance of alcohol modeling group and control group; alcoholic liver SOD levels of intervention group were higher than the alcohol modeling group, with 5 statistical significance, while the difference of rats alcoholic liver SOD between intervention group and 10% of GSH positive control group was not statistically significant. It shows that the polysaccharide konjac has potential intervention effects to SOD of rats alcoholic fatty liver . KeyKey wordswords Konjac Konjac glucomannan Alcoholic fatty liver Rat SOD 6 第一部分第一部分 前前 言言 1.1 魔芋魔芋 魔芋（Amorphophallus konjac C.Koch） ，学名蒟蒻，别名蛇头草、花杆莲、 魔芋子等，是一类天南星科魔芋属（AmorpHopHallus Blume）多年生草本植物 的总称。原产于印度和斯里兰卡，一般生长在年平均气温 16、海拔 8002500m 的亚热带山地或丘陵地区，主要分布在印度半岛及东亚各国，南起 赤道线雨林气候的印度尼西亚，北至北纬 36的我国宁夏、陕西和甘肃南部季 风区，西到非洲，东达日本岛。全世界魔芋品种有 163 种，亚洲为魔芋属的多 样化中心。据资料报道，澳大利亚有 2 个特有种，非洲有 27 个种，日本有 2 个 种，中国记载的有 21 个种，其中中国台湾的大魔芋、魔芋、硬毛魔芋，云南的 西盟魔芋、攸乐魔芋等 14 个种为中国特有种 1,2 。 1.2 魔芋葡甘聚糖魔芋葡甘聚糖 1.2.1 结构 魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan ，KGM）是继淀粉和纤维素之后，一 种较为丰富的可再生天然高分子有可生物降解性，它是主链由 D-甘露糖和 D- 葡萄糖以 -1.4 吡喃糖甘链连结的杂多糖3，在主链甘糖的 C3位上存在通过 - 1，3 键结合的支链结构，每 32 个糖残基上有 3 个左右的支链，支链只有几个 残基的长度，并且每 19 个糖残基上有一个乙酰基团。KGM 具有与肝素相近似 的骨架架构，其单体分子中 C2、C3、C6位上的-OH，均具有较强的反应活性， 其分子结构4为图 1： 图 1 分子结构 1.2.2 性质 魔芋葡甘聚糖具有亲水性、凝胶性、成膜性、抗菌性、可食用性、低热值 性等多种特性和一些特殊的生理功能，其作为一种可再生天然资源，来源充足， 可生物降解，具有化学可修饰的官能团，成膜性良好，具有一定金属离子络合 能力，因此可广泛应用于食品、医药、化工以及生物等领域。 7 1.2.3 多糖的药用价值 多糖是一类天然大分子物质，是存在于自然界的醛糖或酮糖通过糖苷键连 接在一起的多聚物，是构成生命的三大基本物质之一，近20年来，随着细胞生 物学和分子生物学的发展，人们认识到多糖不仅是参与构成生命的基本物质， 还具有作为细胞骨架、传递细胞间信号等功能，更重要的是发现多糖在机体免 疫调节、增强细胞抗肿瘤活性等方面具有重要的生物活性，此外还有抗衰老、 降血糖、抗凝血等作用。近些年，糖生物学成为继基因组学、蛋白质组学之后 的另一研究热点。 药用研究主要集中在 KGM 调节代谢方面，在糖代谢方面：茅彩萍等5用魔芋 精粉对四氧嘧啶糖尿病大鼠模型进行了试验，结果在给药两周末显著降低模型 大鼠的空腹血糖值，糖耐量能力明显增加。魔芋精粉可使四氧嘧啶糖尿病大鼠 的胰岛结构逐步恢复和改善，降血糖作用在一定给药浓度范围内呈一定的量效 关系。在脂代谢方面：陈黎等6对魔芋的降血脂作用进行了研究。高血脂组小 鼠每天喂高脂溶液，低聚糖组在高血脂溶液中加 30 %魔芋低聚糖，结果低聚糖 组小鼠血清中甘油三酯较高脂组降低 29%，总胆固醇降低 32 %，高密度脂蛋白 胆固醇升高 35 %，与高脂组比较 P0.001，降脂作用较为明显。在改善肠道功 能和增强免疫方面：崔熙等5的试验说明白魔芋可促进排便和缩短排便时间。 由于 KGM 有极强的吸水性，可吸水膨胀 80100 倍 ，可增加粪便的含水量， 软化大便。KGM 还具有凝胶性、黏结性、可形成黏稠的溶胶，有润肠作用，减 少肠道内有害物质的重吸收。另外，魔芋低聚糖可使大肠内双歧杆菌大量增殖。 双歧杆菌是无任何毒性的菌群，具有明显的免疫调节作用。在增强微量元素吸 收方面：以添加魔芋精粉的含铅饲料和含铅无 KGM 饲料，分别喂饲大鼠，对 照结果表明，摄入魔芋精粉可致铅排出量增加，从而使血铅，肝铅，脑铅和股 铅含量降低，即魔芋精粉具有减少消化道铅吸收和体内铅储留的作用7。另外， 魔芋低聚糖可使大肠内双歧杆菌大量增殖8。双歧杆菌是无任何毒性的菌群， 具有明显的免疫调节作用。 1.3 魔芋硒多糖抗氧化活性魔芋硒多糖抗氧化活性 硒是人体必须的微量元素之一，是动物和人体中一些抗氧化酶和硒-P 蛋白 的重要组成部分，其主要功能是抗氧化，以硒蛋白。硒酶形式发挥作用，并以 硒代半胱氨酸的形式存在于蛋白质中，作为硒酶的活性中心发挥作用。此酶可 清除自由基，保护肝细胞免受自由基的损伤。 秦岭大巴山地区有着丰富的魔芋资源。安康富硒地层厚度达 4050 米，富 硒浓度适中，易于被植物吸收，不含毒素元素，被专家一致评价为“优质、环保、 安全”的富硒区域。硒是人体必需的，又不能自制，因此世界卫生组织建议每 8 天补充 200g 硒，可有效预防多种疾病的发生。 1.4 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶 人体在新陈代谢过程中产生过多的超氧阴离子自由基攻击生命大分子造成 组织细胞损伤，引起肌体衰老，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要原因，而 SOD 恰有清除超氧阴离子自由基的功能。SOD 是国际公认氧由基的消除剂，在 SOD 作用下氧阴离子自由基被歧化为过氧氢和氧，由于人体内含有大量的过氧化物 酶能立即与刚刚产生的过氧化氢作用，使之成为水合新生氢，从而消除氧化氢 自由基对人体的负作用。SOD 清除氧自由基使之成为无毒的水，是一种连锁反 应，不仅有 SOD 的参与，同时还有过氧化氢酶（catalase CAT） 、过氧化物酶 （peroxidase POD） 、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase GSH-P X） 共同参与反应，组成一道多酶的防护群带，起到保护细胞、保护皮肤的增效或 共济作用。SOD 复合酶是唯一能清除细胞自由基的酶，自由基本身带有不成对 的电子、离子或原子，其化学性质活泼，有极高的氧化性能，以夺取核酸、氨 基酸更强的羧基自由基，可导致机体的多种疾病。故 SOD 基因工程成为了世界 生物技术领域的一个热门课题，目前，在化妆品、食品、保健品、医药、酒类、 饮料等行业已经开始使用 SOD9。 1.5 酒精性脂肪肝产生机制酒精性脂肪肝产生机制 酒精肝是酒精性肝病的简称，酒精性肝病早期可无任何症状，但此时肝脏 内部组织已经发生病理变化。酒精性肝病主要分为三类，即酒精性脂肪肝，酒 精性肝炎和酒精性肝硬化，这三种形式可单独或混合存在。酒精性脂肪肝是早 期酒精性肝病，是完全可逆的，一般情况下戒酒后脂肪肝尚可逐渐消失。 酒精在肝细胞的乙醇脱氢酶和微粒体乙醇氧化酶系的作用下变成乙醛，乙 醛再转变为乙酸，还原型辅酶（dihydronicotinamide-adenine dinucleotide, disodium salt NADH）和氧化型辅酶（beta-Nicotinamide adenine dinucleotide trihydrate NAD）比值的升高可抑制线粒体三羧酸循环，使肝内 脂肪酸代谢发生障碍，中性脂肪堆积于肝细胞中。另一方面，NADH 的增多又 促进脂肪酸的合成，使脂肪在肝细胞中堆积而发生脂肪变性，从而导致脂肪肝 的形成。 第二部分第二部分 实验部分实验部分 2.12.1 魔芋精粉中葡甘聚糖含量测定魔芋精粉中葡甘聚糖含量测定 2.1.1 仪器和材料 美国热电 Thermo Micro-17R 离心机，微量电子天平（赛多利斯） ，浙江临 9 海市精工真空设备厂 HSG-IB-2 型电热恒温水浴锅，海尔冰箱 BCD-196T XZ，pH 计（上海雷磁） ，加热磁力搅拌器（上海司乐） ，上海科-721 可见分光 光度计。 魔芋精粉(购自安康魔芋加工生物科技有限公司)，苯酚显色剂，甲酸钠缓 冲液，葡萄糖。 2.1.2 方法 2.1.2.1 显色剂及缓冲液的配制方法 苯酚显色剂（DNS）10:A 液：溶解 6.9g 结晶的重蒸馏的苯酚于 15.2mL10%氢 氧化钠溶液中，稀释至 69mL，在此溶液中加入 6.9g 亚硫酸氢钠。B 液：称取 225g 酒石酸钾钠，加入到 300mL 10%氢氧化钠溶液中，再加入 880mL1%3，5- 二硝基水杨酸溶液。将 A 液与 B 液混合，贮于棕色试剂瓶中。在 4放置 710d 以后使用。 甲酸钠缓冲液的配制：取 2mol/L 甲酸 75mL 加酚酞指示剂 3 滴，摇匀，加 2mol/L 氢氧化钠中和至颜色退去，再加入甲酸 225mL，用水稀释至 600mL，调 节 pH 至 3.25-3.30 之间。 2.1.2.2 魔芋葡甘聚糖测定液的制备方法 准确称取样品 0.1950g，加入盛有 50mL 甲酸氢氧化钠缓冲液并处于电磁搅 拌状态的 100mL 容量瓶中，30搅拌溶胀 4h，溶胀过夜，第二天用甲酸-氢氧 化钠缓冲液定容至 100mL，搅拌均匀后在离心机上以 4000r/min 离心 20 min， 取上清液，此上清液即为魔芋葡甘聚糖提取液，该步骤去除了魔芋精粉中游离 的还原糖，避免了其对测定结果的影响。准确移取 25.0mL 魔芋葡甘聚糖提取 液于 100mL 容量瓶中，准确加入 3mol/L 硫酸 20mL，摇匀，在沸水浴中具塞密 封水解 1.5 h，冷却。加入 6mol/ L 氢氧化钠 20mL，摇匀，加蒸馏水定容至 100mL，即得待测液。 2.1.2.3 建立标准曲线 葡萄糖工作液配制(1.0mg/mL) ：称取大于 2g 的葡萄糖置于热风干燥箱 105干燥至恒重，准确称取 1.802g 葡萄糖，用 12mmol/L 苯甲酸溶解并定容至 100ml，放置 2 小时，即为葡萄糖标准液。量取葡萄糖标准液 5ml，用苯甲酸稀 释并定容至 100ml，即为 5mmol/L 葡萄糖工作液。 制作标准曲线方法见表 2： 表表 2 标准曲线的制作方法标准曲线的制作方法 123456 葡萄糖工作液（ml） 水(ml) 显色剂 DNS(ml) 0.4 1.6 2.0 0.8 1.2 2.0 1.2 0.8 2.0 1.6 0.4 2.0 2.0 0 2.0 0 2.0 2.0 10 沸水浴加热 5min，冷却，蒸馏水定容至 25ml，摇匀。以蒸馏水显色反应 液做空白调零，用 1cm 比色皿在 556nm 处测吸光值。记录不同浓度葡萄糖工作 液的吸光值 A，以吸光度为纵坐标(M)，葡萄糖毫克数为横坐标(A)，绘制标准 工作曲线。 2.1.2.4 样品中葡甘聚糖含量测定 2.0ml 葡甘聚糖待测液2.0ml 显色剂 DNS沸水浴 5min冷却定容至 5ml分光光度计 556nm 处比色。在标准曲线上查出(或通过回归方程计算) 吸 光度所对应的葡萄糖毫克数。结果按下式计算：魔芋葡甘聚糖含量= （式中，：葡甘聚糖中葡萄糖和甘露糖残基分子量与其水 200 1000 100 % 解后生成的葡萄糖和甘露糖分子量之比，= 0.911，为多糖的校正系数；M：在 标准曲线上查出的葡甘聚糖水解液葡萄糖毫克数，单位为 mg；m：魔芋精粉样 品质量，单位为 g。 2.1.3 结果 2.1.3.1 标准曲线：从图 2 可以看出，标准曲线为 y = 0.509x + 0.004（R = 0.999） 表表 3 葡萄糖标准液光密度值葡萄糖标准液光密度值 123456 葡萄糖标准液 （ml） OD556nm值 0 0 0.4 0.181 0.8 0.383 1.2 0.571 1.6 0.727 2.0 0.919 图 2 葡萄糖标准曲线 2.1.3.2 样品测定结果见表 4： 表表 4 待测样品光密度值待测样品光密度值 01234567含量 11 一级精粉 魔芋微粉 纯化精粉 0 0 0 0.145 0.320 0.383 0.187 0.325 0.422 0.220 0.328 0.422 0.212 0.295 0.433 0.200 0.295 0.440 0.184 0.306 0.423 0.202 0.281 0.438 46.97% 54.98% 75.98% 从表 4 中可以看出，纯化精粉中葡甘聚糖含量最高，为 75.98%，其次是魔 芋微粉，含量为 54.98%，最后为一级精粉，含量为 46.97%，可见，纯化精粉 的纯度最高。此结果为后续实验中给大鼠添加魔芋精粉辅料的准确用量奠定基 础。 2.1.4 讨论 在用3,5-二硝基水杨酸比色法12测定多糖纯度的实验中，葡萄糖标准工作 液的配制是决定该实验成败的关键，而对葡萄糖的干燥是该实验的重中之重； 甲酸-氢氧化钠缓冲液的配制是一个关键的决定因素，而pH计的使用又是该步的 重点。故在实验中把握好这几个重点，仅需注意一些具体的实验步骤，该实验 可以理想的结果。 目前，安康魔芋葡甘聚糖的生产基本上均采用乙醇沉淀法。利用 KGM 溶 于水而不溶于乙醇的特性，方法流程如下：魔芋精粉（KF）去离子水溶胀 静置 5h稀释抽滤旋转蒸发95%乙醇沉淀无水乙醇洗涤风干纯品 KGM。乙醇沉淀法得到的产品，水溶性好，凝胶性能无太大变化，得率和纯度 都较理想，且生产工艺简单，过程中只用了乙醇一种试剂，安全性得到保证， 成本低廉。 多糖是一类天然大分子物质，是存在于自然界的醛糖或酮糖通过糖苷键连 接在一起的多聚物，是构成生命的三大基本物质之一，近20年来，随着细胞生 物学和分子生物学的发展，人们认识到多糖不仅是参与构成生命的基本物质， 还具有作为细胞骨架、传递细胞间信号等功能，更重要的是发现多糖在机体免 疫调节、增强细胞抗肿瘤活性等方面具有重要的生物活性，此外还有抗衰老、 降血糖、抗凝血等作用。近些年，糖生物学成为继基因组学、蛋白质组学之后 的另一研究热点。2001年， Science用Carbohydrates and Glycobiology专版介 绍了糖生物学各研究方向的进展，预示了糖生物学的时代已经到来13-14。 近期研究表明，许多植物性多糖，中药多糖能提高SOD、GSH-PX等抗氧 化物酶的活性，降低脂质过氧化物含量15。魔芋为天南星科魔芋属的多年生草 本植物，含有丰富的葡甘聚糖(KGM)。KGM是做为魔芋抗氧化的重要成分，魔 芋葡甘聚糖具有多种药理作用和生物活性功能，其清除自由基，调节脂质代谢， 抗脂质过氧化等活性越来越受到人们的关注16。 2.2 魔芋精粉中硒含量的测定魔芋精粉中硒含量的测定 2.2.1 仪器和材料 SY2200-T 型超声波清洗机，PF6-2 型非色散原子荧光分光光度计，微量电 12 子天平（赛多利斯） ，浙江临海市精工真空设备厂 HSG-IB-2 型电热恒温水浴锅， 自动控温消化炉。 魔芋精粉(购自安康魔芋加工生物科技有限公司)。 2.2.2 方法 2.2.2.1 样品处理 称取风干的待测样品1. 0000 g于100 mL锥形瓶中，加入硝酸高氯酸( 3 + 2) 混酸15 mL， 放入超声波清洗机中超声20 min。超声后，在160自动控温消化 炉上， 消化。向锥形瓶中加入盐酸( 1+ 1) 溶液5. 0 mL，置于沸水浴中加热10 min，取下锥形瓶，冷却至室温，用去离去水将消化液转入50mL容量瓶中，定 容至刻度，摇匀。 2.2.2.2 标准溶液配制 分别移取硒标准工作溶液0. 00，2. 00，4. 00，8. 00，12. 00，16. 00，20. 00 mL 置于50 mL 容量瓶中，用盐酸( 1+ 1) 溶液稀释至刻度，摇匀，按照仪器工 作条件测定系列标准溶液。 2.2.2.3 样品分析 开机，设定好仪器工作条件，输入样品质量、定容体积等有关参数，原子 化器点火，仪器预热20 min。启动自动进样系统，依次测定空白溶液、系列标 准溶液、样品溶液的荧光强度。由仪器自动计算结果。 2.2. 3 结果 按试验方法对硒系列标准溶液进行测定，硒的质量浓度与其对应的荧光强 度在20gL以内呈线性关系，线性回归方程y=62.91x-0.1529，相关系数为 0.9996。 各样品中硒含量结果：纯化魔芋精粉多糖中硒含量的平均值为 0.23860.0136mg/kg。本次实验表明魔芋中多糖富集硒能力很强，魔芋中的硒 主要是以硒多糖的形式存在。本实验结果为实验中给大鼠添加魔芋精粉辅料的 准确用量奠定基础。 2.2.4 讨论 硒是人体必须的微量元素之一，以硒代半胱氨酸的形式构成谷胱甘肽过氧 化物酶的活性中心，此酶可清除自由基，保护肝细胞免受自由基的损伤。硒有 增强机体免疫，提高机体抗氧化能力等生物功能。Llaneza P等研究17表明，在 超重、过度肥胖的绝经后的女性中，其血清中低硒与血液中高胆固醇、高低密 度脂蛋白、高甘油三酯存在一定的相关关系。 研究发现硒多糖的生物学活性普遍高于多糖和硒，使硒和多糖的生理和药 理功能得到优化18。本次实验表明魔芋中多糖富集硒能力很强，魔芋中的硒主 13 要是以硒多糖的形式存在。本次实验结果将为后期分析其生物学功能以及魔芋 硒多糖的开发提供一定的实验依据，为综合利用陕西硒资源和魔芋资源奠定基 础。 2.3 大鼠饲料自制装置设计及制作方法研究大鼠饲料自制装置设计及制作方法研究 在实验周期长的实验中，通过胃肠道干预方式是对动物施加影响的最常用 的途径。最简单可行的方法就是将药物或某种物质添加到大鼠饲料中，但现行 饲料加工成本高，用料过多，有的也会影响药物效果，没有达到实验所需效果。 本实验介绍的方法简便，经济，实用，适合制作少量大鼠特配饲料的制作装置。 2.3.1 仪器和材料 10 ml 的一次性注射器，大鼠粉状饲料 2.3.2 方法 2.3.2.1 自制装置设计 将 10 ml 的一次性注射器前端用手术刀片切除，然后将注射器活塞插入套 管即可。 2.3.2.2 特配饲料制作 将大鼠粉状饲料、添加成分、适量的水按照一定比例混合后，成团，将成 团的饲料填充到 10 ml 一次性注射器套管内，压实，然后有注射器活塞将饲料 推出。然后按照实验要求，可将特配饲料冷冻或者高温烘干。 2.3.3 结果 自制装置制作的特配饲料形状、大小、质地均一，含水量适中。且制作方 法简单，经济，实用。 2.3.4 讨论 2.3.4.1 自制装置制作饲料和手工捏制饲料相关性状的比较见表 5： 表表 5 5 饲料相关性状比较饲料相关性状比较 饲料性状手工捏制-烘干自制装置制作-冻干自制装置制作-烘干 色状色泽均匀度较差色泽均匀度好色泽均匀度好 性状均一性较差好好 含水量%101510 硬度均一性较差较好较好 适口性一般好，大鼠喜食好，大鼠喜食 手工捏制得饲料团块大小、质地不均一，在干燥过程中，饲料干燥时间不 同步，导致有的饲料哄的过于干燥、太硬，大鼠对这种饲料偏嗜性较差。用简 易大鼠饲料自制装置制作的饲料大小、质地均一，在干燥过程中，饲料干燥时 14 间同步。 2.3.4.2 自制装置制作饲料和手工捏制饲料制作时间比较 1干大鼠粉状饲料和适量水混合后，手工捏成小的团块，3 人同时制作需 要 1h；用简易大鼠饲料自制装置制作大鼠饲料，3 人同时制作需要 20min 节省 了实验时间。 2.3.4.3 自制装置制作饲料和手工捏制饲料费用比较 目前由各实验动物中心或生物科技有限公司提供的大鼠维持饲料价格约 6 元-1 ，而配合饲料价格在 20 元-1 左右（自行提供特定添加成分） 。实 验设计中一般会有阳性对照，待分析成分的浓度也不止一种，这样需要配合饲 料的规格需要好几种，按各实验动物中心或生物科技有限公司提供的饲料价格 和机器制作加工每种规格最少量计算，配合饲料加工所需的实验经费就不少。 因此，自制大鼠特配资料节省的实验费用还是比较可观的。 2.3.4.4 自制装置制作饲料干燥方式 自制的大鼠饲料可以根据实际情况选择冷冻干燥或高温干燥。 2.42.4 魔芋多糖对大鼠酒精肝模型的干预魔芋多糖对大鼠酒精肝模型的干预 2.4.1 实验动物 SPF 级雄性 SD 大鼠 28 只，购自西安交通大学医学院实验动物中心。 2.4.1 仪器与材料 超纯水仪（购自重庆华创生物科技有限公司） ，海尔超低温冰箱，超氧化物 歧化酶（SOD）试剂盒（购自南京建成生物科技有限公司） 。 无水乙醇（国产分析纯） ，谷胱甘肽(Glutathione，GSH)，魔芋精粉(购自安 康魔芋加工生物科技有限公司)。 2.4.3 方法 2.4.3.1 大鼠分组处理 28 只大鼠简单随机分为七组，分别为为空白对照组（4 只） ，酒精肝模型组 （4 只） ，10%GSH 干预组（4 只） ，5%魔芋硒多糖干预组（4 只） ，10%魔芋硒 多糖干预组（4 只） ，5%KGM 干预组（只） ，10%KGM 干预组（只） 。 采用颜色与位置相结合编号的原则：品红涂屠成的红色表示个位，美蓝涂 成的蓝色代表十位，左前腿、左腹、左后腿、头、背、尾、右前腿、右腹、右 后腿分别表示 1、2、3、4、5、6、7、8、9。大鼠对应编号见表 6： 表表 6 大鼠编号大鼠编号 左前 腿红 左腹 红 左后 红 头红背红尾红 右前 腿红 右腹 红 右后 腿红 123456789 15 左前 腿红 101213141516171819 左腹 蓝 2021232425262728 左后 红 1122 喂酒精时酒精浓度从 5%，10%，15%，20%，25%，30%，35%到 40%， 在 40%时，持续 5 周时间。每天早晚记录饮用酒精量及食用饲料的量。实验于 14 周末处死大鼠，取肝组织及血清，超低温冰箱保存。 2.4.3.2 大鼠肝脏组织 SOD 活力测定方法 试剂及器材 上海精科-721 型分光光度计，37恒温水浴锅，台式离心机，微量式移液 器，纯水仪（重庆华创生物科技有限公司） ，冰醋酸，超氧化物歧化酶（SOD） 试剂盒（购于南京建成生物科技有限公司） 。 相关溶液配制： 100 管试剂盒的组成与配制：（0.25%肝匀浆，取样量 30L） 试剂一：贮备液：10ml1 瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热 水浴溶解后再用） ； 试剂一应用液的配制：用时每瓶加蒸馏水稀释至 100ml，4保存 6 个月。 试剂二：液体 10ml1 瓶，4-10保存 6 个月。 试剂三：液体 10ml1 瓶，4-10保存 6 个月。 试剂四：液体 350l2 支，4保存不可冷冻；4 号稀释液 10ml1 瓶， 4保存 6 个月。用时二者按 1:14 稀释，需多少配多少。配好的试剂四 4保存， 不可冷冻。注：所用吸嘴为一次性吸嘴。 试剂五：粉剂1 支，用时加 70-80热双蒸水 75mL 溶解后备用，若加 热过程中水分蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至 75mL 溶解后备用. 试剂六：粉剂1 支，用时加蒸馏水 75ml 溶解后备用，配好后试剂避光 4冷藏保存 6 个月。 显色剂的配制：按试剂五：试剂六：冰乙酸=3:3:2 的体积比配显色剂，4 冷藏保存 3 个月。 实验方法 标准曲线的制备（制作标准曲线的操作过程见表 7） 1g/ml 标准品的配制：取德国 BOEHRINGER MANNHEIM 公司生产的 SOD 标准品（其活力为 5000U/mg）1mg，容量瓶定容至 10ml 配成 100g/ml 16 标准品贮备液，取标准品储备液 1ml，容量瓶定容至 100ml 配成 1g /ml 标准 品应用液（5U/ml） 。 表表 7 7 标准曲线的制作的操作过程标准曲线的制作的操作过程 管号012345678910 SOD 试 剂一 （ml） 1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0 1ug/ml 标准品 (ml) 00.00250.0050.010.020.030.040.050.060.070.08 双蒸水 (ml) 0.080.07750.0750.070.060.050.040.030.020.010 SOD 试 二(ml) 0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1 SOD 试 剂三 (ml) 0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1 SOD 试 剂四 (ml) 0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1 漩涡混匀器充分混匀，37水浴 40 分钟 显色剂 (ml) 2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0 混匀，10 分钟后，550nm，1cm 光径，双蒸水调零，比色，以标准取样量为横 坐标，以百分抑制率为纵坐标，做坐标图。 大鼠肝脏组织中 SOD 活力测定： 大鼠处死前 12 小时禁食禁饮，称重。处死时用乙醚吸入麻醉，肝脏组织 研磨，低速离心，取上清。 取干燥清洁的试管两支，标明测定管和对照管，按表 8 进行操作： 表表 8 8 大鼠肝脏组织中大鼠肝脏组织中 SOD 测定的操作过程测定的操作过程 17 试 剂测定管对照管 试剂一(ml)1.01.0 样 品(ml)a* 蒸馏水(ml)a* 试剂二(ml)0.10.1 试剂三(ml)0.10.1 试剂四(ml)0.10.1 用漩涡混匀器充分混匀，置 37恒温水浴 40 分钟 显色剂(