（化学工艺专业论文）高纯度叶黄素的制备及其衍生物的合成.pdf

硕i j 学位论文 摘要 叶黄素是一种优良天然色素，其所具有的良好抗氧化性能，日益受到人们青 睐，但在国内高纯度叶黄素制备仍然是一个空缺。本课题主要研究了高纯度叶黄 素制备、油酸叶黄素酯的合成和叶黄素、油酸叶黄素酯的抗氧化研究。 万寿菊是富含叶黄素类物质的天然原料，非常适合作为提取叶黄素的原料， 作者对万寿菊颗粒耐高温、光照、酸、碱性能做研究，旨在为万寿菊颗粒储存提 供依据。 利用超声波的空化作用、热效应、机械作用加速细胞壁的破碎，促使细胞内 叶黄素的溶出，以提高含量，缩短提取时间。并采用s t a t i s t i c a 6 0 软件，根据 中心复合旋转设计( c e n t r a lc o m p o s i t er o t a t a b l ed e s i g n ，c c r d ) ，考察提取时 间、提取温度、料液比对提取率的影响，从响应曲面上得出超声波提取叶黄素的 最优工艺条件：提取温度：3 0 ，提取时间：5 0 m i n ，料液比：1 ：4 。 叶黄素在植物体中主要是以酯衍生物的形式存在，所以要经过皂化处理，将 叶黄素还原为单体形式。本研究利用超声波产生的空化效应和机械作用， 加快皂化时间，降低皂化温度。采用薄层层析，考察皂化时间、皂化温度、加 碱量及加碱次序对皂化率的影响，得出超声皂化最佳工艺条件：用碱量( 1 0 k o h 一 甲醇溶液) 2 4m l ，加碱次序：0 6 0 分钟每5 分钟加入0 6 7 m l ，6 0 1 5 0 分钟每5 分钟加0 8 m l ，1 5 0 1 9 0 分钟每1 0 分钟加0 9 m l ，1 9 0 2 l o 分钟无碱加入，超声温 度：4 0 ，超声时间：1 2 0 分钟。 利用重结晶法对叶黄素的分离纯化工艺进行了研究，采用浸膏( g ) ：四氢呋 喃( m 1 ) ：无水乙醇( m 1 ) ：石油醚( m 1 ) ：水( m 1 ) = 1 ：2 0 ：1 5 ：5 ：2 0 混合溶剂 对叶黄素进行第一次重结晶，并用丙酮+ 水十石油醚混合溶剂进行第二次重结晶， 依次进行四次重结晶可以从纯度低的叶黄素( 4 0 ) 得到高纯度叶黄素( 8 8 ) 。 采用直接酯化法，合成油酸叶黄素酯，体外提高叶黄素稳定性，体内分解为 叶黄素和油酸，同时满足人们对叶黄素和油酸需求，通过n m r l h 、n m r 培c 、m s 、i r 检测表明合成成功。作者也对甘氨酸叶黄素的合成进行研究，但在脱氨基保护剂 过程中，由于在高温环境下叶黄素发生异构化导致实验失败。 从清除羟自由基、d p p h 自由基能力方面研究了油酸叶黄素双酯、叶黄素、油 酸叶黄素单酯的体外抗氧化活性，并与抗氧化剂b h t 进行比较。结果表明，叶黄素、 油酸叶黄素单酯、油酸叶黄素双酯对d p p h 自由基、羟自由基都有一定的清除作用， 其清除能力大小为：b h t 叶黄素 油酸叶黄素单酯 油酸叶黄素双酯。该结论论 证了类胡萝卜素抗氧化性与共扼双键有关，并随羟基数增多，其抗氧化性能增强。 高纯度叶黄素的制备及1 e 衍生物的合成 关键词： 叶黄素；制备； 合成；油酸； 响应曲面；抗氧化 a b s t r a c t l u t e i ni san a t u r a lp i g m e n t ，w h i t hh a v eg o o da n t i - o x i d a t i o np e r f o r m a n c e ，i n c r e a s i n g p e o p l e sf a v o r ，b u ti nt h ed o m e s t i cp r e p a r a t i o no fh i g hp u r i t yl u t e i ni ss t i l lav a c a n c y ， t h em a j o rr e s e a r c ht o p i c sw a s h i g h p u r i t yl u t e i np r e p a r a t i o n ，t h es y n t h e s i so fo l e i ca c i d i u t e i na n dl u t e i n ，o l e i ca c i dl u t e i n da n t i o x i d a n tr e s e a r c h m a r i g o l di n c l u d el u t e i nn a t u r a li sr a wm a t e r i a l s ，i sw e l ls u i t e da sar a wm a t e r i a lf o r e x t r a c t i o no fl u t e i n ，t h ea u t h o rd i dr e s e a r c ho f m a r i g o l dp a r t i c l ea g a i n s t i n gt e m p e r a t u r e ， l i g h t ，a c i d ，a l k a l i n ei no r d e rt op r o v i d i n gb a s i sf o rt h es t o c k p i l eo fp a r t i c l e sm a r i g o l d w eu s e dc a v i t a t i o n ，t h e r m a le f f e c t s ，m e c h a n i c a la c t i o no fu l t r a s o n i ct os p e e d u pt h e b r o k e no fc e l lw a l lt ot h ed i s s o l u t i o no fl u t e i ni no r d e r t oi m p r o v ec o n t e n t s h o r t e nt h e e x t r a c t i o nt i m e u s e ds t a t i s t i c a 6 0 s o f t w a r e ，b a s e do nc e n t r a lc o m p o s i t er o t a t a b l e d e s i g n ( c c r d ) ，w ev i s i t e di m p a c t i o no fe x t r a c t i o nt i m e ，e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e , r a t i oo f m a t e r i a lt oe x t r a c t i o nr a t e f r o mt h er e s p o n s es u r f a c ew eo b t a i n e dt h em o s te x c e l l e n t c o n d i t i o n so fu l t r a s o n i ce x t r a c t i o no fl u t e i n ：e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e ：3 0 e x t r a c t i o n t i m e ：5 0 m i n ，l i q u i dr a t i o ：1 ：4 l u t e i ni st h em a i nf o r mo fe s t e rd e r i v a t i v e si n t h ep l a n t ，i th a st og ot h r o u g h s a p o n i f i c a t i o nt r e a t m e n t ，a n dw i l lb er e v e r t e dt ot h em o n o m e rf o r mo fl u t e i n i nt h i s s t u d y ，w es p e e d e du pt h es a p o n i f i c a t i o nt i m e ，l o w e r e dt e m p e r a t u r es a p o n i f i c a t i o nb v u l t r a s o n i c c a v i t a t i o n a n dm e c h a n i c a la c t i o nt o u s i n gt h i n 1 a y e rc h r o m a t o g r a p h y ，w e i n s p e c t e dt h ee f f e c t so fs a p o n i f i c a t i o nt i m e ，s a p o n i f i c a t i o nt e m p e r a t u r e ，i n c r e a s i n gt h e v o l u m eo fa l k a l ia n dt h eo r d e ro fi n c r e a s i n ga l k a l is a p o n i f i c a t i o nt od e r i v eo p t i m u m s a p o n i f i c a t i o nc o n d i t i o n s ：t h ev o l u m eo fa l k a l i ( 1 0 k o h m e t h a n o ls o l u t i o n 、w a s2 4 m l ，0 6 0m i n u t e sa d d i n g0 6 7 m lp e rm i n u t e ，6 0 1 5 0m i n u t e sa d d i n g0 8 m l p e r5 m i n u t e s ，1 5 0 - 1 9 0m i n u t e sa d d i n g0 9m lp e r1 0 m i n u t e ，1 9 0 2 1 0m i n u t e sa d d i n g0m l ， u l t r a s o u n dt e m p e r a t u r e ：4 0 ，u l t r a s o n i ct i m e ：1 2 0m i n u t e s w es t u d i e dt h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fl u t e i nb yr e c r y s t a l l i z a t i o nt h eu s e o f e x t r a c t ( g ) ：t e t r a h y d r o f u r a n ( m 1 ) ：e t h a n o l ( m 1 ) ：p e t r o l e u me t h e r ( m 1 ) ：w a t e r ( m 1 ) = 1 ：2 0 ：1 5 ：5 ：2 0m i x e ds o l v e n t sm a d et h ef i r s t r e c r y s t a l l i z a t i o n a c e t o n e ，p e t r o l e u m e t h e ra n dw a t e rm i x e ds o l v e n tm a k et h e s e c o n dr e c r y s t a l l i z a t i o n f o l l o w e db va f o u r 。c r y s t a l h i g hp u r i t yl u t e i n ( 8 8 ) w e r em a d ef r o mt h el o w p u r i t yo fl u t e i n ( 4 0 ) t h i s s t u d yp r o v i d e da ne f f e c t i v em e a n sf o rh i g h g r a d eo fl u t e i n b yd i r e c te s t e r i f i c a t i o nm e t h o d ，w es y n t h e s i s e do l e i ca c i dl u t e i ne s t e r s ，w h i t h e n h a n c e dt h es t a b i l i t yo fl u t e i no u to ft h eb o d y ，d i v i d e di n t ol u t e i na n d o l e i ca c i di n 高纯度叶黄素的制备及其衍生物的合成 t h eb o d y ，m e tp e o p l e sd e m a n df o rl u t e i na n do l e i ca c i d n m r l h ，n m r l 3 c ，m s ，i r a n a l y s i ss h o w e d t h a tt h es y n t h e s i si ss u c c e s s ，t h ea u t h o ra l s os t u d i e do fs y n t h e s i so f g l y c i n el u t e i n ，b u ti nt h ep r o c e s so fd e a m i n a t i o na g e n t ，l u t e i no c c u r r e di s o m e r i z a t i o n b e c a u s eo fh i g h t e m p e r a t u r ee n v i r o n m e n ta n dt h ee x p e r i m e n tf a i l e d t h ea n t i o x i d a n tp r o p e r t i e so ft w o - o l e i ca c i de s t e rl u t e i n ，l u t e i n ，l u t e i no l e i ca c i d e s t e rw e r ee v a l u a t e db ys e v e r a lm e t h o d s ：s c a v e n g i n ge f f e c to nh y d r o x y l ，d p p hr a d i c a l a n dc o m p a r i e dw i t ha n t i o x i d a n tb h t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt w o o l e i ca c i de s t e r l u t e i n ，l u t e i n ，l u t e i no l e i ca c i de s t e rh a dt h ea b i l i t yo fc l e a r i n gd p p hf r e er a d i c a l s ， h y d r o x y lr a d i c a l s t h es e q u e n c eo ft h e i ra b i l i t yw a sb h t l u t e i n l u t e i no l e i ca c i d m o n o e s t e r l u t e i nt w o o l e i ca c i de s t e r t h ec o n c l u s i o n sd e m o n s t r a t e dt h a t t h e f e a s i b i l i t yo ft h ec a r o t e n o i da n t i o x i d a n tc o n n e c t e dw i t ht h en u m b e ro fc o n ju g a t e d d o u b l eb o n d s t h em o r eo fn u m b e ro fh y d r o x y l ，t h es t r o n g e ro fi t sa n t i o x i d a n t p r o p e r t i e s k e y w o r d s ：l u t e i n ；p r e p a r a t i o n ；s y n t h e s i s ；o l e i ca c i d ；r e s p o n s es u r f a c e ；a n t i - o x i d a t i o n 兰州理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者签名： 日期：钞孵多月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权兰州理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：幸石，7 关 导师签名环碟 日期： 日期： f ) r | 6 月 绦脊 训 劢 硕一 ：学位论史 1 1 叶黄素的结构及性质 第1 章绪论 叶黄素，英文名l u t e i n ，是一种无维生素a 活性的类胡萝卜素，叶黄素为3 ， 3 一二羟基一a 一胡萝卜素，分子式c 。h 。0 。，分子量为5 6 8 8 5 ，纯的叶黄素为 棱格状黄色晶体，有金属光泽，溶点为1 8 3 1 9 0 ，不溶于水和丙二醇，易溶于 油脂和乙醇、丙酮、氯仿等脂肪性溶剂。人们仅在植物( 水果和蔬菜) 中发现单一 结构的叶黄素乜。5 1 ，结构式即为图1 1 ， h 、o h 图1 1 叶黄素结构式 叶黄素具有3 个手性中心，故有8 种立体异构体，有一个共同的基本结构：两 个六元碳环由一个含十八碳原子的共扼双键的长链相连接1 。 叶黄素在4 4 6n m ，4 4 2n m 和4 7 0n m 处有吸收峰：应避免8 0 c 以上高温使用或 保存；对直射日光不稳定，但对散射光和一定强度的紫外光很稳定：耐氧化、耐还 原性好：对e d t a 及大多数金属离子稳定，但对f e 2 十，a l3 + ，c u ”敏感h 。 1 2 叶黄素的分布和来源 据报道n 2 叫3 1 广泛存在于各类蔬菜、水果和花卉中，如椰菜、卷心菜、胡罗卜、 谷子、绿豆、柏子、羽衣甘蓝、散叶葛芭、柑橘、番木瓜果、豌豆、菠菜、笋瓜、 马铃薯、金盏菊等。不同来源果蔬，其叶黄素含量不同，且各地不同来源、不同 单位分析结果也千差万别n4 。1 引。若直接从果蔬中提取叶黄素，成本将十分高昂。 所以目前国内外用于商品化大量提取叶黄素产品的是万寿菊，万寿菊中叶黄素含 量约为1 6 ，是其他植物所不能比的，可作为工业生产的理想来源。 1 3 叶黄素的功能 1 3 1 预防年龄相关性视黄斑退化及白内障 美国社会调查表明，与年龄相关的视网膜黄斑变性( a g e r e l a t e dm a c u l a r 高纯度叶黄素的制备及】e 衍生物的含成 d e g e n e a r t i o n ，a m do ra r m d ) 是导致老年人视力下降和失明的重要原因引。 s c h a l h c ，h n e d e l m n a n 耵等人先后对视黄斑色素及视网膜进行的研究表明：在眼睛的 晶状体中存在叶黄素和玉米黄素，该研究发现纠正了以往认为1 3 一胡萝卜素保护 视网膜的错误观点，认识到了叶黄素和玉米黄素在防止老年视黄斑退化和视网膜 的氧化性损伤方面的重要作用。 1 3 2 抗氧化作用 类胡萝卜素，尤其是叶黄素，是一种性能优良的抗氧化剂，具有很好的抗氧化 功能，能通过提供电子抑制活性氧的生产，达到清除自由基的目的，故可以防止 自由基所造成的组织损伤，细胞衰老等病变：另外，叶黄素也是单线态氧的淬灭剂， 能清除单线态氧，减少光过敏作用，在防止自由基对生物膜的损害、淬灭单线态 氧及捕获氧自由基等方面有独特功效n 引。 1 3 3 抗癌作用 叶黄素是人体血液中主要类胡萝卜素之一，它在抑制肿瘤生长方面有着特殊 生物学功能，体外研究表明，叶黄素在抑制细胞膜脂质自氧化和氧化诱导细胞损 伤方面比1 3 一胡萝卜素更有效。在饲料中添加叶黄素能抑制小鼠可转移乳腺肿瘤 生长并促进淋巴细胞增长比训。 1 3 4 调节人体免疫能力 类胡萝卜素是具有免疫调节活性的一类重要的天然物质，叶黄素是类胡萝卜 素中的一种。动物实验证实，叶黄素在体内能被迅速吸收，主要分布于视网膜、 肝脏和脾脏，而脾脏对于叶黄素的摄取可能是其免疫调节作用的基础心。 一些研究表明，叶黄素对细胞免疫和体液免疫均有作用乜2 吨钉。补充叶黄素能 促进抗原刺激的淋巴细胞增殖反应和迟发型变态反应( d t h ) 能力，并可影响细胞 表面分子的功能性表达，并能增加细胞亚群数量、血浆免疫球蛋白水平以及增加 抗体反应。 1 3 5 保护皮肤 最近，美国几家研究机构发现，人的皮肤中存在较高浓度的类胡萝卜，包括 叶黄素，由于叶黄素是优良的抗氧化剂，能有效清除体内自由基，因此有利于防 止皮肤损伤。e s k l i n g 的研究也证明这一点，威尔医学院和哈佛医学院正在进一步 探索叶黄素在保护皮肤方面的作用 2 6 o 2 硕f ：学位论文 1 3 6 预防心血管疾病 s t e i n b e r g 的研究表明，玉米黄素与叶黄素水平低时，患动脉粥样硬化的重要 原因之一，叶黄素可能通过阻止l d l 的氧化而降低动脉粥样硬化和冠心病的发病 率陆0 1 。j a m e s 等进行的流行病学研究、体外实验和动物模型研究结果都表明，增加 叶黄素的摄入能防止动脉粥样硬化的发生砼7 1 。 在对动脉粥样硬化病的研究中发现，动脉粥样硬化病灶中有氧化修饰低密度 脂蛋白( o x l d l ) 的沉积，o x l d l 可快速地被吞噬细胞吞噬，导致脂质在血管壁的沉 积，o x l d l 还可通过其它细胞生物学反应促进冠心病的发生发展。经饮食摄入的叶 黄素在l d l 颗粒中可保护l d l 免受单线态氧中介的氧化作用，从而预防心血管疾 病的发生口8 。3 们。 1 4 叶黄素的提取方法 1 4 1 溶剂法 盛爱武等研究采用不同种有机溶剂或几种的混合物提取万寿菊中叶黄素，发 现以已烷：丙酮：甲醇复合试剂提取万寿菊花粉中叶黄素，叶黄素提取率最高， 产率可达6 2 1 m g l 口。赵文恩等也用乙醇和正己烷提取万寿菊发酵干花粒中叶黄 素。但是这些加工过程都引起类胡萝卜素大量损失n 扪。 1 4 2 酶处理法 ： b a r z a n a 等人提出一种酶反应和有机溶剂萃取同时进行的方法，用一系列水 解酶在主要是有机溶剂、低水分含量的介质中降解细胞壁组分。以万寿菊鲜花为 原料，酶处理鲜花后无需去除水分直接用正己烷萃取，类胡萝卜素产率达8 5 以 上，而对照组类胡萝卜素产量只有4 4 聆引。另外，在水解酶的选择上 n a v a r r e t e b o l a n o s 等人研究一种非商业性酶制剂对万寿菊花中叶黄素萃取的影响， 此酶由青贮过程产生的内生微生物合成制得，纤维素酶活性较高，萃取效果较好 【3 4 1 1 4 3 微波提取法 与传统提取方法相比，微波提取可以缩短生产时间，降低能源溶剂的消耗，同 时可以提高收率和提取物纯度。它的优越性不仅在于降低设备投资和运行费用，而 且也符合环境保护的要求。因此微波提取在天然色素的提取工艺中具有广阔的应 3 高纯度叶黄素的制备及其衍生物的合成 用前景。 1 4 4 干燥法 国外研究出一种新型转筒式干燥机，用来干燥和捶击万寿菊花瓣，可以从中提 取叶黄素。捶击比率不同时，捶击效率就在7 0 一9 0 之间波动。叶黄素的多少取决 于干燥时间长短，但在相同的干燥时间里，7 0 ( 2 下干燥提取的叶黄素含量比6 0 下 提取的叶黄素含量要少b 引。 1 4 5 膜分离技术 从降低成本还是从提高产品质量的角度来讲，将膜分离技术应用于天然色素 的提取是极有价值的。首先用陶瓷膜微滤( m l ) 对浸提液进行精滤提纯，再用反渗透 膜( r o ) 浓缩过滤液。这种工艺以膜分离技术为主体，替代了传统的酒精提纯和蒸发 浓缩，工艺过程简单，色素溶液基本处于常温操作状态，既节约能源，又保证了色素 产品的质量3 6 1 。 1 4 6 超临界c 0 ：萃取法 超临界流体萃取具有以下特点：( 1 ) 工艺流程简单，操作方便，节省能量，萃取 完全。( 2 ) 提取温度低。( 3 ) 采用无毒无害的流体( 工艺采c o 。) ，安全性好。( 4 ) 萃取 和分离合二为一，这样不仅萃取效率高而且能耗较少，节约成本。( 5 ) 压力和温度都 可调，萃取速度快、时间短7 4 。 1 5 叶黄素的分析方法 目前测定叶黄素的方法主要有以下几种： 1 5 1h p l c 方法 高效液相色谱法h 2 1 ( h p l c ) 是在高压、快速条件下进行的液相层析，由于层析 柱固定相基质粒度很小，表面积大，可以偶连各种基因，选择性好，流动相可根 据不同要求而改变，因此分辨率高，灵敏度高。可以有效地分离和准确定量许多 种类的物质。 一般使用的h p l c 有两种：正常相高效液相色谱( n o r m a l p h a s eh p l c ) 和反相 高效液相色谱( r e v e r s e p h a s eh p l c ) 。r p - h p l c 的固定相上并入非极性结合相( 八 烷基( c 。) 或十八烷基( c 。) ) 或者多聚物相( 聚苯乙烯、丁二烯基苯、聚甲基丙 4 硕卜学位论文 烯酸酯) ，其流动相是极性的。层析时类胡萝i - 素在非极性固定相和极性流动相 之间分配，含氧的叶黄素首先洗出，而胡萝卜素洗出在后。而n p h p l c 的固定相含 有吸附相( 硅、铝) 和极性结合相( 烷基胺、烷基睛、烷基醇) ，流动相为非极 性。类胡萝卜素分子上的极性部分与溶剂修饰剂争夺固定相上的吸附部位。因此， 极性低的胡萝i - 素首先洗出，而极性高的叶黄素保留时间长，从而达到分离的目 的。 1 5 2 分光光度法 1 5 2 1 原理 分光光度法的基本原理是朗伯一比尔定律，当波长和强度一定的入射光通过 光程长度固定的有色溶液时，吸光度和有色溶液浓度成正比，此关系用下式表示： h = a b c 其中a 一吸光系数( l g c m 。1 ) b 一为光通过样品的光径长度或液池厚，一般为l c m c 一为有色化合物的浓度( g l 1 ) 吸光系数a 是吸光物质在特定波长和溶剂的情况下的一个特征常数，它可作 为定性鉴定的常数，也可用以估量定量方法的灵敏度，可由a 对c 的标准曲线斜 率计算得到。 1 5 2 2 叶黄素的含量测定( a o a c 法) ( 1 ) 试剂配制 h e a t 混合物：正己烷一丙酮一无水乙醇一甲苯( 1 0 ：7 ：6 ：7 ) ； 4 0 氢氧化钾甲醇溶液：称取4 0 9 氢氧化钾溶于甲醇中，冷却后用甲醇定容1 0 0 m l ； 1 0 硫酸钠溶液：将1 0 0 0 9 无水硫酸钠溶解定容至1 0 0 m l 。 ( 2 ) 样品的测定h 3 1 称取1 0 m g 样品于1 0 0 m l 容量瓶，加入h e a t 混合物2 0 m l ，加入2 m l 4 0 氢氧化 钾甲醇溶液，旋转1 分钟后置于5 6 c 热水中2 5 分钟。再加3 0 m l 正己烷于瓶内， 然后用1 0 硫酸钠溶液定容至1 0 0 m l ，摇动3 分钟后置于黑暗中，直至清澈为止， 用移液管吸取上层清液，在分光光度计上选择4 7 4 n m 波长进行比色测定，用正己 烷作为空白比较。 ( 3 ) 结果计算 叶黄素( g k g ) = 瓦= i a 西鬲1 0 0 0 a = 在4 7 4 n m 处的吸光值 s 高纯度n 1 黄素的制备及j e 衍生物的合成 c = 稀释系数 e 4 ，。= 叶黄素在4 7 4 n m 处的吸光系数，e 4 1 4 = 2 3 6 0 w = 样品的重量，单位为m g 稀释系数c = 1 5 0 = 0 0 2 叶黄素( g k g ) = 2 1 1 8 6 4 a 1 5 3 薄层层析法 1 5 3 1 原理 薄层色谱是一种物理化学的分离技术，所涂的薄层即为固定相，样品溶液滴 于薄层的起始线上，待溶剂挥发后，置入盛有流动相( 展开剂) 的密闭容器内， 由于吸附剂对不同物质的吸附力的大小不同j 它对极性大的物质吸附力强，对极 性小的物质吸附力相应的较弱，因此当溶剂流过时，不同物质在吸附剂和溶剂之 间会发生不断地吸附、解吸附、再吸附、再解吸附。在这个过程中，易被吸附的 物质( 吸附力强的物质) ，相对移动的慢一些，出现较低的r ，值，而较难被吸附的 物质，也就是吸附力较弱的物质，则相对移动快一些，出现较高的r ，值。因不同组 分之间移动速度的差异，经过一段时间以后，便达到了分离的目的。 1 5 3 2 方法 用毛细管微吸入一定量的叶黄素样品溶液，在薄层层析板上点样，试样原点 直径一般不应超过5 m m 。将薄板放入展缸中上行展开，待各组分分离后，取出层析 板，自然风干，记录各点的颜色，根据各点的展开距离计算r ，值。薄层层析所用展 开剂为v ( 石油醚) ：v ( 丙酮) = 3 ：1 的混合溶液。 1 6 国内外研究现状 1 6 1 国外研究现状 意大利f a b i o 等人采用浓缩富集、离心分离、冷冻干燥等工艺，从苜蓿中分离 得到富含胡萝卜素和叶黄素的浓缩物，而后联用c o ：萃取工艺，在不同的萃取工艺下， 分别得到胡萝卜素和叶黄素钔。美国凯明食品公司( k e m i n f o o d c o ) 率先发明了生产 叶黄素的新工艺使叶黄素成为一种新型保健食品添加剂r 。 2 0 0 0 年德国法兰克福欧洲健康食品展会上，德国m a r c u s 公司展出了叶黄素。 说明书中指出，叶黄素从金盏花中提取，因为金盏花的叶黄素含量比菠菜要高出 2 0 倍。金盏花花瓣中所含的叶黄素，主要是一种叶黄素酯的形式。这种叶黄素酯 在人体内能被代谢，转化成叶黄素而被吸收。科学家对叶黄素化学结构的研究表 6 硕卜学位论文 明，它具有3 个手性中心，故有8 种立体异构体。实际上自然界只存在一种异构体 h 叼。植物中提取的叶黄素才含真正具有抗氧化作用的活性物质。美国采用的技术 主要是利用萃取的方法n 。用正己烷做萃取溶剂，在合适的温度下经萃取、皂化、 精制、重结晶得到叶黄素油及叶黄素的结晶。据资料报导，此项技术工艺简单、 投资小、萃取液在食品中残留在2 5 p p m 以下，对环境无污染，目前此方法已实现工 业化。其他公司也在探索新的叶黄素生产途径。如南美洲h e n k l e 公司己从资源丰 富的南瓜和榨汁后的橘渣中提取出“叶黄素酯”的商品名为x a n g o l d 医学专家早已 证实叶黄素酯在人体内可自动转化成为“叶黄素”“引，故叶黄素酯与叶黄素一样 均能作为新型食品添加剂使用。瑞士罗氏公司推出5 含量的叶黄素，并和多种维 生素和叶黄素配成护眼口嚼片。 1 6 2 国内研究现状 我国有丰富的万寿菊资源，已广泛开展了叶黄素的提取加工，但以粗制品为 主，大量组织以出口和饲料着色剂使用。作制取高含量、高纯度的叶黄素，用于 食品和医药，技术上有一定难度。鉴于叶黄素的生理活性和护眼功能，有关高纯 度叶黄素的研究，据查全世界有1 7 0 多项专利。在国内，对高纯度叶黄素的制备已 经取得一定成就国内中国农大、北京大学、上海交大等，均开展了高纯度叶黄素 的研制工作，叶黄素纯度可达9 5 以上钔。2 0 0 3 年1 月，广卅i 范乐医药科技公司， 采用罗氏公司的叶黄素( 1 u t e in ) 加工的“维视保 软胶囊，己向卫生部提出申报 为保健品。保健功能为改善视力。华北制药神草有限公司大批量生产的叶黄素纯 度已达至u 8 9 ，符合国家卫生局对叶黄素作为食品添加剂的要求( 纯度 8 0 ) 。 在国内，以饲料为主导产业的民营企业新希望集团在四川凉山彝族地区大力 开展扶贫工作，走共同发展、共同富裕的道路。该公司从1 9 9 6 年引进种子、种植 技术，用当地农民大面积种植万寿菊花，鲜花经粗加工以后出口，在国外提取出 叶黄素油。近几年由于农民种植万寿菊的积极性逐年的提高，因此国内研究此项 技术也有所增加，目前用超临界二氧化碳从万寿菊花中提取叶黄素油的方法由中 科院山西煤炭研究所研究，此种方法设备投资较大、工艺复杂。青岛大学科技教 育开发公司食品科学研究所，采用石油醚提取，提取液加热蒸发提到叶黄素油的 半成品，蒸汽经冷却得到再生石油醚的方法。此研究采用石油醚作原料，目前对 食品业的应用方面还存在争议，因此尚无工业化的报导。 1 7 本课题研究的主要内容 近年来，随着人们对合成色素毒性问题的认识及各国对使用合成色素种类的 7 高纯度叶黄素的制备及j e 衍乍物的合成 限制增多，消费者对天然色素的需求急剧增加。人们的关注点己从以前的合成色 素转移到如何提取天然色素的开发和应用上。而叶黄素就是一种优良天然色素， 其所具有的良好抗氧化性能，日益受到人们青睐，国内外市场对叶黄素的需求也 在不断增长，我国西北部地区已经开始大面积种植叶黄素源植物金盏菊。但由于 我国对叶黄素研究起步较晚，而国外高纯叶黄素的化学法制备技术较为成熟，并 在该方面申请了大量专利，使得我国在金盏菊的深加工工艺上难以突破。我国叶 黄素相关产品的出口以金盏菊干花和金盏菊粗提物( 主要成份为叶黄素酯) 低附加 值原料为主。所以对高纯度叶黄素的制备已经是迫在眉睫一项任务。 本课题主要利用超声波从万寿菊干花瓣中萃取万寿菊黄色素，并经过超声皂 化，重结晶得到高纯度叶黄素，为高纯度万寿菊黄色素的主产提供新工艺、新方 法和为万寿菊花的有效利用提供新途。研究的主要内容如下所示： ( 1 ) 万寿菊颗粒的存储是一项重要任务，作者对万寿菊颗粒耐高温、光照、酸、 碱性能做研究，旨在为万寿菊颗粒储存提供依据。 ( 2 ) 利用s t a t i s t i c a 6 0 软件，根据中心复合旋转设计( c e n t r a lc o m p o s i t e r o t a t a b l ed e s i n ，c c r d ) ，考察提取时间、提取温度、料液比对提取率的影响， 从响应曲面上得出超声波提取叶黄素的最优工艺条件。 ( 3 ) 利用薄层层析，考察皂化时间、皂化温度、加碱量及加碱次序对皂化率的影 响，得出最佳皂化条件。 、 ( 4 ) 设计四套重结晶方案，从中选出最优方案，考察重结晶溶剂、溶剂的比例、 第二次重结晶溶剂选择、重结晶次数及分步结晶对产率及纯度的影响。 ( 5 ) 对叶黄素衍生物的合成，主要合成油酸叶黄素酯、甘氨酸叶黄素酯，旨在提 高叶黄素的稳定性，同时也满足人们对油酸，甘氨酸的需求。 ( 6 ) 从清除羟自由基、d p p h 自由基能力方面研究了油酸叶黄素双酯、叶黄素、油 酸叶黄素单酯的体外抗氧化活性，并与抗氧化剂b h t 进行比较。 8 硕 ：学位论文 !im，一 i i 第2 章万寿菊颗粒稳定性研究 万寿菊晒们( m a r i g o l d ，学名t a g e t e se r e c t al ) ，又名臭芙蓉、万盏灯，属菊科一 年生草本植物，原产墨西哥。由于其适应性较强，现已广泛种植于世界各地，我 国南北均有栽培。万寿菊干花瓣中类胡萝卜素含量高达1 6 嫡卜5 2 1 ，其中8 9 6 为与月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸等饱和脂肪酸结合成为叶黄素酯，其他类胡萝卜 色素含量非常低，万寿菊花中叶黄素资源的评定见表2 1 嫡钉。 表2 1 万寿菊中叶黄素成分评定 化合物含量( 毫克克重) 叶黄素 叶黄素酯 玉米黄素 其它类胡罗i - 素 合计 2 1 3 11 2 1 0 5 6 2 5 1 1 6 4 万寿菊是富含叶黄素类物质的天然原料引。每千克不低于1 2 克，其他类胡萝 卜素含量非常低，非常适合作为提取叶黄素的原料，目前叶黄素的相关研究工作 也是围绕金盏菊展开阳2 删。叶黄素酯必须经过皂化反应才能转化为叶黄素。叶黄 素具有抗氧化、预防年龄相关性视黄斑及白内障晦引、抗癌、预防心血管疾病乜6 1 等 生理功能，在保健品及药品领域中有广阔的应用前景。 近几年国家大力开展扶贫工作，走共同发展、共同富裕的道路。以饲料为主 导产业的民营企业新希望集团从1 9 9 6 年引进种子、万寿菊种植技术，在四川凉山 彝族地区当地农民大面积种植万寿菊花，鲜花经粗加工成万寿菊颗粒以后出口， 在国外提取出叶黄素油。由于万寿菊中叶黄素酯易发生氧化分解异构化，因此， 万寿菊颗粒的存储是一项重要任务，作者对万寿菊颗粒耐高温、光照、酸、碱性 能做研究，旨在为万寿菊颗粒储存提供依据。 2 1 试验材料与仪器 2 1 1 试验材料 万寿菊颗粒：甘肃省丰蕾天然色素有限公司提供。 9 高纯度n i 黄素的制备及其衍生物的合成 2 1 2 万寿菊颗粒的制备工艺 万寿菊花一发酵一干燥 2 1 3 主要仪器与设备 所用主要仪器设备：j a 2 0 0 3 电子天平( 上海精科厂) ，v i s - 7 2 2 0 g 可见分光光度计 ( 北京瑞利分析仪器有限公司) 。 2 1 4 主要试剂 所用主要试剂：所用试剂均为分析纯 2 1 5 叶黄素含量的测定方法( a o a c 法) 见1 5 2 2 所示 2 1 6 叶黄素酯损失量采用下式计算 z ；w , - w 2( 2 1 ) ；一 1 ， 式( 2 1 ) 中w ，一暗处常温放置的万寿菊颗粒中叶黄素酯质量 w 。一条件改变后万寿菊颗粒中叶黄素酯质量 2 2 稳定性实验 2 2 1 光照对万寿菊稳定性的影响 将万寿菊颗粒置于光照良好的条件下照晒，每隔l h 测定4 7 4 n m 下的吸光值， 并与暗处常温放置的万寿菊颗粒的吸光值作比较，计算其叶黄素酯损失率。 2 2 2 高温对万寿菊稳定性的影响 将万寿菊颗粒置于6 0 c 条件下放置，每隔l h 测定4 7 4 n m 下的吸光值，并与暗 处常温放置的万寿菊颗粒的吸光值作比较，计算其叶黄素酯损失率。 2 2 3 碱性条件对万寿菊稳定性的影响 将万寿菊颗粒置于i o n a o h 条件下放置，每隔l h 测定4 7 4 n m 下的吸光值，并 硕十学位论文 与暗处常温放置的万寿菊颗粒的吸光值作比较，计算其叶黄素酯损失率。 把万寿菊颗粒置于不同碱性强度条件下2 4 h ，测定4 7 4 n m 下的吸光值，并与暗 处常温放置的万寿菊颗粒的吸光值作比较，计算其叶黄素酯损失率。 2 2 4 酸性条件对万寿菊稳定性的影响 将万寿菊颗粒置于i o h c l 条件下放置，每隔1 h 测定4 7 4 n m 下的吸光值，并 与暗处常温放置的万寿菊颗粒的吸光值作比较，计算其叶黄素酯损失率。 把万寿菊颗粒置于不同酸性强度条件下2 4 h ，测定4 7 4 n m 下的吸光值，并与暗 处常温放置的万寿菊颗粒的吸光值作比较，计算其叶黄素酯损失率。 2 3 结果与讨论 2 3 1 光照的影响 表2 2 光照对万寿菊稳定性的影响 由表2 2 可以看出光照对万寿菊颗粒稳定性的影响很大，1 h 后叶黄素的损失 量达到3 2 7 ，4 h 后达到5 0 8 3 ，强烈光照会加速万寿菊颗粒中叶黄素酯的分解， 导致叶黄素酯经皂化反应成叶黄素后含量也随着降低，所以万寿菊颗粒应避光保 存。 2 2 2 高温的影响 表2 3 高温对万寿菊稳定性的影响 由表2 3 可以看出6 0 ( 2 高温对万寿菊颗粒影响显著，随着时间增长损失量逐 步提高，并且随着时间增长损失的速率也变化比较快，3 4 h 之间叶黄素酯的损失 量增加1 0 2 1 ，所以万寿菊颗粒应低温储藏，避免其处于高温条件。 2 2 3 碱性的影响 高纯度叶黄素的制备及其衍牛物的合成 表2 4i o n a o h 对万寿菊稳定性的影响 表2 5 不同碱性强度对万寿菊稳定性的影响 由表2 4 ，表2 5 可以看出万寿菊颗粒在1 0 n a o h 碱性条件下短时间( 3 h ) 内 变化不大，3 h 其叶黄素酯损失量为3 3 3 ，但到4 h 损失量就显著增加到7 0 4 ， 特别是到2 4 h 损失量达到3 3 5 9 ，但是随着碱性增强( 由5 到2 0 ) ，叶黄素酯 损失量没有显著变化，这将为叶黄素酯的皂化反应提供依据。 2 2 4 酸性的影晌 表2 6i o h c l 对万寿菊稳定性的影响 表2 7 不同酸性强度对万寿菊稳定性的影响 由表2 6 ，表2 7 可以看出万寿菊颗粒在i o h c i 酸性条件下随着时间增加， 叶黄素酯损失量也随着增加，2 4 h 损失量达到2 5 3 6 ，并且随着酸性增强，损失 量也在增大，2 0 h c l 酸性条件下2 4 h 损失量达到5 5 1 0 。 2 2 5 不同程度的酸碱， 生对万寿菊稳定性影响的比较 1 2 硕十学位论文 51 01 5 z o 浓度 图2 1