（应用化学专业论文）中药地榆中抗氧化活性物质的提取及其分析.pdf

摘要摘要本课题丰要对地榆提取物的抗氧化活性进行了研究，包括对三种自由基的清除作用，优化抗氧化活性物质的提取工艺，探讨了抗氧化活性物质的稳定性并进一步对抗氧化活性物质进行分离纯化和成分粗测。最后对地榆提取物作了一些应用研究。采用单因素实验确定每个因素的最佳提取条件分别为：乙醇浓度6 0 ( ) 、料液比1 ：1 2 、提取温度7 0 。c ，提取时间2 h 。采用正交实验，得出最佳提取工艺条件为乙醇浓度6 0 ，料液比l ：1 2 ，提取温度7 3 1 ，提取时间2 0 9 h 。在此条件下，地榆提取物中总黄酮含量为0 210 4 m g m g ，总酚含量为o 19 3 8 m g m g 。对地榆提取物抗氧化活性做了稳定性测试，结果表明地榆提取物的抗氧化活性具有较好的热稳定性，对紫外光照射稳定。采用三种分光光度法，测定了地榆提取物对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用，结果表明：在三种体系中，提取物的自由基清除作用趋势相同。对活性物质进一步分析，首先用四种不同极性的溶剂对地榆提取物水悬液进行萃取，得到五个部分：石油醚部、氯仿部、乙酸乙酯部、正丁醇部和水部，经抗氧化活性比较，确定乙酸乙酯部的抗氧化活性最强，正丁醇部次之。乙酸乙酯部经薄层层析，展开后，有多个斑点，用1 的a 1 c 1 3 显色，多个点显示黄色，紫外灯光下显黄绿色。推断抗氧化活性组分属于黄酮类化合物。乙酸乙酯部分上聚酰胺柱分离，得到抗氧化效果最好的部分，通过l c m s 分析，推断山柰素一3 ，7 二鼠李糖甙是地榆抗氧化有效成分之一。把地榆提取物加入到化妆品中作测试，结果表明地榆提取物具有很好的自由基清除、防腐、美白效果，可以在化妆品中广泛应用。关键词：地榆；抗氧化剂；提取；自由基清除；分离纯化；化妆品；美白；防腐a b s t r a c ta b s t r a c ti nt h i sp a p e r ，e x t r a c to fs a n g u i s o r b ao f f i c i n a l i sw a st e s t e df o ri t sa n t i o x i d a n ta c t i v i t y , i n c l u d i n gi n v e s t i g a t i o no fi t ss c a v e n g i n ge f f e c t so nt h r e ek i n d sf l e er a d i c a l s t h ep r o c e s s i n gc o n d i t i o n so fl e a c h i n ga c t i v es u b s t a n c e sf r o ms a n g u i s o r b ao f f i c i n a l i sw e r eo p t i m i z e dw i t ht h eo r t h o g o n a ld e s i g nt e s t t h es e n s i t i v i t yt ou n i v e r s a lf a c t o r so ft h ee x t r a c tw a ss t u d i e d a tt h es a m et i m e ，t h ei s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no ft h ea n t i o x i d a t i v ec o m p o n e n t so fs a n g u i s o r b ao f f i c i n a l i sw e r ea l s os t u d i e d t h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n so fe v e r yf a c t o rf o rl e a c h i n ga c t i v es u b s t a n c e sd e t e r m i n e db yt h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n tm e t h o dw e r ea sf o l l o w s ：t h ec o n c e n t r a t i o no fe t h a n o lw a s6 0 ：t h er a t i oo fm a t e r i a la n ds o l v e n tw a sl ：12 t e m p e r a t u r ef o re x t r a c t i n gw a s7 0 0 cw i t h2 h w i t ht h eo r t h o g o n a ld e s i g nt e s t ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u me x t r a c t i n gc o n d i t i o nw a s ：t h ec o n c e n t r a t i o no fe t h a n o lw a s6 0 ；t h er a t i oo fm a t e r i a la n ds o l v e n tw a s1 ：12 ，t e m p e r a t u r ef o re x t r a c t i n gw a s7 3 1o cw i t h2 0 9 h u n d e rt h i sc o n d i t i o n ，t h ec o n t e n to ft a t a lf l a v i n o i d so ft h ee x t r a c tw a s0 210 4 m g m g ，t h ec o n t e n to f t a t a lp h e n o l so ft h ee x t r a c tw a s0 19 3 8 m g m g t h es t a b i l i t yt ot e m p e r a t u r ea n du l t r a v i o l e to ft h ee x t r a c to fs a n g u i s o r b ao f f i c i n a l i sw e r ea l s os t u d i e d t h er e s u l ts h o w e dt h ee x t r a c tw a sv e r ys t a b l et ot e m p e r a t u r ea n du l t r a v i o l e t a l le x t r a c t so b t a i n e di nd if f e r e n tf r a c t i o n sb yu s i n gd i f f e r e n tp o l a r i t i e so fs o l v e n t ss u c ha sp e t r o l e u me t h e r ，c h l o r o f o r m ，e t h y la c e t a t e ，n o r m a lb u t y la l c o h o la n dw a t e rw e r ec o m p a r e dt h r o u g ht h et e s t i n go ft h e i ra n t i o x i d a t i v ea c t i v i t i e s t h es c a v e n g i n ge f f e c t so ns u p e r o x i d ea n i o nf r e er a d i c a l ( 0 2 ) a n dh y d r o x y lf r e er a d i c a l ( o h )o fe v e r ye x t r a c t i o nw e r es t u d i e db yt h r e ep h o t o m e t r i cm e t h o d s ，b h tw a st h er e f e r e n c e t h er e s u l t ss h o w e dt h a te v e r ye x t r a c t i o ne x c e p tt h ep e t r o l e u me t h e ro ft h ee x t r a c t sf r o mt h ec h i n e s et r a d i t i o n a ld r u gs a n g u i s o r b ao f f i c i n a l i sh a dc a p a c i t yo ns c a v e n g i n g 。o hf r e er a d i c a l ，a n dh a dn oo b v i o u sc a p a c i t yo ns c a v e n g i n g0 2 f r e er a d i c a l t h er e s u l t ss h o w e dt h ee x t r a c t i o no fe t h y la c e t a t eh a das t r o n gc a p a c i t yo ns c a v e n g i n g o hf r e er a d i c a la n dn o r m a lb u t y la l c o h o lt o o ks e c o n dp l a c e t ot r a c ka n t i o x i d a n tc o m p o n e n t si nt h ee x t r a c t so fe t h y la c e t a t ei nw h i c hm a n yd i f f e r e n ta n t i o x i d a n tp o i n t sa p p e a r e da f t e rd i f f u s i o n t h eq u a l i t a t i v ea n a l y s i so fe x t r a c t i n gs a m p l ei sc o n d u c t e db yt h es p e c i f i cr e a c t i o no ft o t a lf l a v o n o i d sw i t ha 1 c 1 3a n ds oo n ，i ti sc o n f i r m e dt h a tt h ee x t r a c t i o nm a t e r i a li sf l a v o n o i d s t h ee x t r a c t so fe t h y la c e t a t eo fs a n g u 凼o r b ao f f i c i n a l i sw a ss e p e r a t e db yp o l y a m i d ec o l u m n c h r o m a t o g r a p h y 。t h ea n t i o x i d a n tc o m p o n e n tw a sd e t e r m i n e db yl c - m s t h er e s u l t ss h o w e dt h a to n eo fa n t i o x i d a n tc o m p o n e n t sw a sk a e m p f e r p l 一3 ，7 一d i r h a m n o s i d e t h ee x t r a c to fs a n g u i s o r b ao f f i c i n a l i sw a sa p p l i e di nc o s m e t i c s a l lt h er e s u l t sc o n f i r m e dt h a te x t r a c to fs a n g u & o r b ao f f i c i n a l & h a st h ea n t i o x i d a t i v ee f f e c t ，t h es k i n l i g h t e n i n ge f f e c ta n dt h ea n t i m i c r o b i a le f f e c t s oi tc a nb ew i d e l yu s e di nc o s m e t i c s k e y w o r d s ：s a n g u i s o r b ao f f i c i n a l i s ；a n t i o x i d a n t ；e x t r a c t ；s c a v e n g i n ge f f e c t so nf r e er a d i c a l s ；i s o l a t i o n ；p u r i f i c a t i o n ；l i g h t e n i n g ；a n t i m i c r o b i a li i独创性声明本人声明所呈交的学位论文是芬人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意签名：絮而i 裔日期一兰型芷4关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致保密的学位论文在解密后也遵守此规定签名：强而丽导师签名：日期：立豸，分7i7。、，。k 第章综述前言第一章综述抗氧化剂是指用以提供电子、抑制氧化，通过吸收自由基，而使目标物质不受攻击，但自身却相对稳定的一些化学的或具有生物活性的有机物质【l 】。抗氧化剂被广泛应用于食品、医药、化妆品等领域【2 。3 】：作为食品添加剂，主要的功能是防止或减少食品发生氧化作用，提高食品的稳定性，延长货架期；用于化妆品，有防止皮肤衰老，美容养颜的作用；用于保健食品，主要功能是消除自由基或阻抑自由基的活动，从而起到防老抗衰、抑制肿瘤的发生、防止心血管疾病、增强免疫功能的作用；用于新药品，治疗心脑血管病、抗癌等。对于化妆品学来说，抗氧化剂分为两大类【4 】：物理抗氧化剂和活性抗氧化剂。物理抗氧化剂，是指用于稳定产品基质，抑制基质中一些活性成分氧化的抗氧化剂。这些抗氧化剂包括：b h t 、b h a 、没食子酸等。活性抗氧化剂，是指通过产品基质作为载体，渗透到皮肤或头发中，抵抗氧化、自由基攻击、生物氧化酶反应及u v 光对细胞和细胞间质的生命大分子的破坏的一类活性抗氧化剂。1 1 引言氧化是食品变质的一个重要因素，一些油脂和含油的食品在储藏和加工及运输时会氧化酸败变质，产牛气味，使其质量下降。另外，氧化也是化妆品基质变质【5 】的一个重要因素，许多化妆品含有油脂成分，尤其含有不饱和油脂的化妆品在贮存或使用日久之后，会因为受到空气、水分、日光等多种因素的影响而使油脂发生变味( 即氧化酸败) 使化妆品变质。而氧化反应牛成的过氧化物、酸、醛等会对皮肤产生刺激，可引起皮肤炎症。人类皮肤的衰老1 6 嗡j 、特别是经常裸露的面部皮肤的衰老是整体衰老最容易观察到的外部显示，是整体衰老的局部表现。促使皮肤衰老的因素很多，除先天与遗传因素之外，还受着外界环境中诸多因素的直接影响。阳光、环境污染、烟尘、牛活压力等导致细胞氧化产生自由基，对肌肤造成下燥、斑点、皱纹、粗糙等老化伤害。1 2 抗氧化剂的研究现状1 2 1 抗氧化剂的抗氧化机理抗氧化剂是指在低浓度下能有效延缓或阻止底物氧化的物质【9 - 1 1 】。被氧化的底物包括蛋白质、脂质、糖和d n a 。根据作用机理的不同，抗氧化剂丰要分为两类：初始型抗氧化剂和次级型抗氧化剂。1 2 1 1 初始型抗氧化剂初始型抗氧化剂( a h ) 也称作链断裂型抗氧化剂，可通过与脂质自由基l 、过氧自由1江南大学硕：i ：学位论文基l o o 或烷氧自由基l o 反应抑制脂质氧化链反应。l + a h l h + a l o o 十a h l o o h + a l o + a h l o h + a 抗氧化自由基a 也能与过氧自由基、烷氧自由基反应从而终止脂质氧化反应。l o o + a l o o al o + a l o a1 2 1 2 次级型抗氧化剂次级型抗氧化剂也称阻止型抗氧化剂，可通过各种机理延缓脂质氧化，如鳌合过渡金属、给初始型抗氧化剂补充氢、消除氧以及使活性物质失活等。1 2 2 表征抗氧化活性的方法与参数1 2 2 1 方法表征抗氧化活性的方法有许多种，这些方法都是为了说明在特定条件下被测物抑制底物氧化的效力或清除自由基的能力。方法有：( 1 ) 在指定的时间测量氧化产物或官能团的浓度或吸光度值；( 2 ) 测量反应的速率；( 3 ) 测量诱导期或氧化达到一定程度所需的时问；( 4 ) 测量速度的积分( 即动力学曲线下的面积) ；( 5 ) 测量被测物产生与标准抗氧化剂相当作用的浓度。1 2 2 2 参数( 1 ) 诱导期( i n d u c t i o np e r i o d )诱导期t l n d 诱( 也叫延滞期，l a gp e r i o d ) 常定义为化学反应的速度。例如：脂质氧化突然加速的时候。诱导期是一个相当不确定的值，受检测方法、使用仪器的灵敏性以及一些其他因素的影响。对于脂质氧化，诱导期通常是指链增长阶段动力学曲线切线和时间轴的交点。( 2 ) 抑制率( p e r c e n t a g eo fi n h i b i t i o n ) 和i c 5 0抑带0 率和i c 5 0 ( 抗氧化剂提供5 0 抑制作用时的浓度) 常用来表征抗氧化能力。它们不仪与被测抗氧化剂的反应性能和氧化的底物有关，而且受其他因素的影响，如脂质氧化链反应的长度和抑制速率等。1 2 3 对抗氧化活性测定方法的要求测定抗氧化剂抗氧化活性的方法应满足如下要求：( 1 ) 能说明测试体系中发牛的反应，并能用明确的动力学图解描述；( 2 ) 测试要有再现性；( 3 ) 测试效率要足够高；2第一章综述( 4 ) 方法要相对简单；( 5 ) 能连续检测；( 6 ) 应使用与体内或食品有关的活性自由基；( 7 ) 分析中被测物的浓度在食品中或在牛物体内能够得到；( 8 ) 除了适合纯溶液外，还适合复杂生物组织和天然产物的测定；( 9 ) 水溶性的和脂溶性的化合物都适用。实际上，没有一种方法能够满足以上所有要求。实际应用要在各种要求间折衷考虑，满足前2 条的要求是必须的。体外测定抗氧化活性的方法有许多种，对于具体某一物质抗氧化活性的测定，还要注意：应至少适用两种不同的方法，因为某一物质在一种测定方法中是抗氧化剂，在另一种方法中可能没有抗氧化活性，或充当了促氧化剂。1 2 4 测定抗氧化活性的方法抗氧化剂的抗氧化活性丰要表现在抑制脂质( 也可以是蛋白质或d n a ) 的氧化降解、清除自由基、抑制促氧化剂( 如鳌合过渡金属) 和还原能力等几方面。大多数方法涉及到直接或间接测量：( 1 ) 底物或标记底物或氧消耗的衰减；( 2 ) 氧化产物的牛成；( 3 ) 特征自由基的形成或衰减的速度或程度。( 1 ) 和( 2 ) 中，抗氧化活性是以对反应物的消耗或牛成物的形成程度或速率来表征抗氧活性的；( 3 ) 是假设通过捕获脂质自动氧化中的自由基抑制氧化的，因此集中在检测被测抗氧剂对自由基的捕获或抑制自由基的形成的能力上，而不是检测实际发生的氧化反应。1 2 4 1 以抗氧化剂抑制脂质氧化为基础的方法脂质中的不饱和脂肪酸自动氧化，生成不稳定的氢过氧化物，氢过氧化物继续分解形成短碳链的醛、酮、酸等小分子化合物 1 2 - 1 4 】。抗氧化剂的加入可以延缓氢过氧化物及其分解产物的形成，由此可测得抗氧化活性。脂质氧化的检测方法：在化学方法中，过氧化值、碘值、游离脂肪酸的含量酸值、t b a r s法、羰基化合物、克雷斯试验和茴香胺值已被广泛采用。至于物理方法，如粘度、颜色、共轭二烯含量、红外光谱、折光指数、介电常数和气相色谱法、液相色谱法、气相色谱和质谱联用等已用于油脂氧化的测定。1 2 4 2 清除自由基的方法( 1 ) f e n t o n 法 1 5 - 2 3 】f e 2 + + 32 +江南大学硕：j ：学位论文h 2 0 2 + f e 2 + o h + o h _ + f e 3 +f e 2 + 与邻二氮菲生成红色络合物，该络合物在5 1 0 n m 处有特征吸收峰，f e n t o n 反应产生羟自由基对f e 2 + 邻二氮菲络合物产牛氧化作用，使溶液红色变淡，引起吸光度变化。加入抗氧化剂后，可减弱o h 对f d + 邻二氮菲的氧化作用，根据吸光度的变化可测得抗氧化剂的活性。( 2 ) 亚硝基r 盐一c 0 3 + 褪色法c 0 2 + + h 2 0 2 一c 0 3 + + o h - + o h利用h 2 0 2 c 0 2 + 体系产牛的o h 氧化亚硝基r 盐c 0 3 + 配合物，可使其4 1 0 n m 处最大吸收峰消失或减弱。根据此原理建立了以l o 变化反映羟自由基氧化作用的光度测定方法。( 3 ) 连苯三酚自氧化法连苯三酚易自氧化，以其在3 2 0 n m 处特征吸收峰的变化率可以反应连苯三酚的自氧化程度。加入抗氧化剂后，可减弱连苯三酚的自氧化趋势。( 4 ) d p p h 法d p p h ( 2 ，2 - - d i p h e n y l - 1 p i c r y l h y d r a z y l ，2 , 2 一二苯代苦味酰基苯肼) 是一种稳定的自由基，其乙醇溶液显紫色，在5 1 5n m 处有最大吸收。当有供氢能力的抗氧化剂存在时( o h 酚类) ，d p p h 溶液的颜色变浅，吸光度值变小。根据吸光度的变化可测得抗氧化剂的活性。( 5 ) d m p d 法在酸性条件下，d m p d ( n ，n - d i m e t h y l p p h e n y l e n e d i a m i n e ) 可被a b a p 、f e c l 3 、c u c l 2 、h 2 0 2 氧化，牛成稳定的d m p d ，它在5 0 5 n m 处有最大吸收峰，根据加入抗氧化剂后吸光度的变化可测得样品清除自由基的能力。1 2 4 3 以抑制自由基对底物的氧化降解为基础的方法此方法的测试体系中既有底物又有自由基，由基反应，形成有荧光或带有颜色的特征物质，由此可测得抗氧化活性【2 4 。2 9 】。但底物自身不能生成自由基，它与外源自抗氧化剂的加入使牛成的特征产物减少，常用方法有：o r a c 法：o r a c ( o x y g e nr a d i c a la b s o r b a n c ec a p a c i t y , 氧自由基吸收能力) ；化学发光法；b 一胡萝卜素漂白法；藏花素漂白法等。1 2 4 4 抗氧化剂的还原能力方法有胁3 1 】：f r a p ( f e r r i cr e d u c i n ga n t i o x i d a n tp o w 铁离子还原抗氧化能力) 法；循环伏安法等。1 2 5 抗氧化剂的种类抗氧化剂按其溶解性能可分为油溶性和水溶性抗氧化剂两类，常用的油溶性抗氧化剂有：二丁基羟基甲苯( b h t ) 、丁基羟基茴香醚( b h a ) 、叔丁基对苯二酚( t h b q ) ，2 , 4 ，5 一三羟基苯丁酮( t h b p ) 和乙氧喹( e m q ) ，混合牛育酚浓缩物、迷迭香属提取物及愈创树脂等；水溶性抗氧化剂有：抗坏血酸及其钠盐、异抗坏血酸及其钠盐、植酸等。对于化妆品学来说，抗氧化剂分为两大类：物理抗氧化剂和活性抗氧化剂。4第苹综述1 2 5 1 活性抗氧化剂化妆品对皮肤的抗氧化作用是指对抗离子和低能辐射产生的活性氧自由基( r o s ) 对皮肤脂质、蛋白质、牛物膜的损害作用【3 2 。4 1 1 。目前，对抗和清除自由基，防止自由基的损伤作用，往往通过活性抗氧化剂得以实现。活性抗氧化剂大致可以分为以下几类：一类是非酶类抗氧化剂：包括维生素类、肽类、矿物质类以及三类比较有特点的植物提取物：多酚类、类黄酮类和类胡萝卜素类。另一类是酶类抗氧化剂，使用最广泛的是超氧化物歧化酶( s o d ) 。这两类抗氧化剂已经加入化妆品，但对酶类抗氧化剂在化妆品中的稳定性以及由于分子量较大，渗入皮肤受限制等方面的因素，它的使用仍有局限性。因此，使用非酶类抗氧化剂更为看好。化妆品中的抗氧化活性原料：超氧歧化酶( s o d ) 、维牛素e 、金属硫蛋白( m t ) 、木瓜巯基酶、辅酶q 黄酮类化合物，原花青素等。1 3 天然抗氧化剂的研究与利用1 3 1 天然抗氧化剂的种类与性质近年来，从自然界寻求天然抗氧化剂的研究已引起各国科学家的高度重视【4 2 1 。世界各国开发了大量天然抗氧化剂产品，受到人们的普遍欢迎。其天然抗氧化成分的来源包括：某些草木植物、香辛料、茶叶、油料种子、果蔬、酶及蛋白质水解物等。目前，已开发利用或正在研究的天然抗氧化剂丰要有以下几类物质。( 1 ) 香辛料提取物香辛料是指一类具有芳香和辛香等典型风味的天然植物性制品，或从植物所提取的某些香精油。香辛料除了赋予食品在感官上特殊的风味及生理保健功能外，它还有抑菌、防腐抗氧矫臭的作用。其中抗氧化机能较好的是迷迭香和鼠尾草提取物4 3 硝】。( 2 ) 茶多酚类茶叶中富含一类多羟基的酚类物质，称为茶多酚【4 5 1 ( t p ) ，t p 是一类以儿条素类为主体的多酚类，此外还含有黄烷醇类、黄烷酮、酚酸和花色甙等成分。茶多酚的抗氧化能力高于维生素e 1 0 2 0 倍。( 3 ) 天然黄酮类黄酮类化合物主要指以2 苯基色原酮为基核的化合物【4 2 】，三个环上可连有1 个或多个羟基。这类化合物在自然界中分布极其广泛，以游离的甙原或与糖等结合的甙的形式存在。从大豆中提取的异黄酮也是理想的天然抗氧化剂。( 4 ) 维牛素类维生素a 、c 、e 及其衍生物，既是食品营养素，又可作为抗氧化剂。( 5 ) 蛋白质和酶类超氧化物歧化酶( s o d ) 可通过清除超氧化物自由基而达到抗氧化效果。谷胶蛋白也具有抗氧效果。( 6 ) 植酸江南大学硕i ：学位论文植酸即肌醇六磷酸酯，是从米糠、麦麸等谷类和油料种子的饼粕中分离出来的含磷有机酸，它是一种安全性高的天然抗氧剂。( 7 ) 中草药提取物目前，已经开发利用及正在研究的天然抗氧化剂中，有一类是中草药提取物。中国传统中草药是很有潜力的天然抗氧化剂资源，在医药、食品和化妆品中有着较为广阔的应用前景。随着人们对中草药化学成分更加深入的研究，以及对中草药提取物中起抗氧化作用的活性物质的鉴定，从中草药中提取的抗氧化剂将发挥越来越大的作用。国内已经有人对一些中草药的抗氧化性进行了研究：我国的一些研究报告指出【4 引，红参、当归、生地、酸枣仁、阿魏等中草药极其成分均有抗脂质过氧化作用；李琳【4 6 】等人研究了三种中草药的乙醇和水的浸提物在卵黄脂蛋白不饱和脂肪酸过氧体系中的抗氧化活性，并比较了对o h 和0 自由基的清除能力；刘玉鹏等人 4 7 - 4 9 采用乙醇一三氯甲烷( 2 ：1 )作溶剂，对选定的3 0 种中草药进行提取，并用烘箱法和o s i 法测定了提取物的抗氧化活性；魏安池【5 0 铆1 等人研究了5 6 种植物原料的抗氧化性能；我国台湾学者s u 等人对1 9 5 种中草药的乙醇、甲醇及乙酸乙脂提取物的抗氧化活性进行了研究。研究表明，许多中草药的提取液具有抗氧化作用，但对一些中草药仪是对其粗提物抗氧化性的初步研究，对其抗氧化成分的分离，纯化，鉴定的研究较少。另外，应用实验大都是关于食品防腐方面的，应用于化妆品中的很少。1 3 2 中草药抗氧化剂活性物质的提取方法1 3 2 1 固液浸提固液浸提【5 2 】是用溶剂从固体原料中提取有效成分，浸提的原料多数是溶质与不溶性固体组成的体系，所用的溶剂必须具备与所提取得溶质互溶的特性。固液浸提所选用的溶剂首先要能有选择的溶解提取物质，这样有利于后续的纯化分离；其次，溶剂对溶质的饱和溶解度要大，这样可以得到高浓度的浸提液，若溶质在所选的溶剂中的溶解度小，就需要消耗较多的溶剂，在进行溶剂回收时，需要消耗较多的能量；第三需要考虑溶剂的物理性质，从溶剂回收的角度来看，沸点应该低一些，因为如果在常压下进行操作，沸点将成为浸取温度的上限，而且粘度和密度对扩散系数、固液分离、搅拌的动力消耗均有影响。另外，还必需考虑溶剂的价格、毒性、燃烧、爆炸、腐蚀性、对环境的污染等问题。若提取物应用于医药，化妆品和食品行业，则溶剂的无毒、无色、无味等是至关重要的方面。1 3 2 2 超临界流体萃取超临界流体萃取 5 3 - 5 7 l ( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ，s f e ) ，又叫气体萃取( g a se x t r a c t i o n ) 、浓气萃取( d e n s eg a se x t r a c t i o n ) 。超临界流体是指当压力和温度超过物质的临界点时，所形成的单一相态。如c 0 2 的临界温度为3 1 ，临界压力为7 3 9 m p a , 当压力和温度超过此临界点时，c 0 2 便成为超临界流体。超临界流体既不同于气体，也不同于液体。它的特殊性质使其在测定组分的萃取中有以下特点。首先，它具有与液体相似的密度，因而具有与液体相似的较强的溶解能力；其次，溶质在其中扩散系数与气体相似，因而具有传质快、提取时间短的优点，提取完全一般仪需数1 0m i n ，超临界流体的表面张力为零，这6第一覃综述使它很容易渗透到样品的里面，带走测定组分；超临界流体的选择性强，通过改变萃取的条件，如温度、压力等，可以选择性地萃取某些组分；超临界流体在通常状态下即成为气体，因此萃取后溶剂立即变为气体而逸出容易达到浓集的目的。1 3 2 3 超声提取超声波是频率高于2 0 0 0 0 h z ，入耳听不到的高声波。超声波辅助萃取是超声能量辅助作用下的提取方法。丰要是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取。该提取方法【5 8 枷1 的优点包括：廉价、快速、操作简便，可以保持提取过程的无人看守状态。v e r o n i c a p 等从一种海洋沉积物中提取多环芳香烃，用超声波提取3 0 m i n 比常规煎煮法提取3 h 的提取率要高9 。1 3 2 4 微波辅助萃取微波萃取【6 1 。6 2 】即微波辅助萃9 2 ( m i e r o v a v ea s s i s t e de x t r a c t i o n ，m a e ) 是用微波能加热与样品相接触的溶剂，将所需化合物从样品基体中分离，进入溶剂中的一个过程。m a e 萃取法是通过萃取剂的选择以及微波发牛条件的选定，使固体或半固体中草药样品中的某些成分与基体物质有效分离，并保证被提取物不发牛分解以适应定性、定量分析的要求。1 3 2 5 半仿生提取法半仿牛提取法【6 3 】即模拟1 2 1 服给药及药物经胃肠逆转运的原理，将药料先用一定p h 的酸水提取，继以一定p h 的碱水提取。提取液分别过滤、浓缩，制成口服途径给药的制剂。这是从牛物药剂学的角度考虑而提出的一种新方法。1 3 2 6 强化溶剂提取法强化溶剂提取畔】是从超临界流体提取法中衍生出来的一种方法。超临界流体高的扩散速度和比液体黏度低的特点。超临界流体可在相对低的温度下溶解分析物，因此它有利于减少样品由于热而引起的分解作用。这些超临界流体的特点在亚临界流体中也存在。当流体通过亚临界超临界界线时，超临界流体的性能并没有明显的变化。强化溶剂提取就利用了这些性质，在加压和高于超临界的流体所采用的温度下进行溶剂抽提。优点在于快速、不破坏成分的形态以及比索氏提取用溶剂量少几倍甚至几十倍，并且可以自动化提取。1 4 地榆的资源及其生物活性作用1 4 1 地榆的资源地榆【6 5 舶l s a n g u i s o r b ao f f i c i n a l i s ，味苦、酸、涩，性微寒，别名黄瓜香、猪人参、血箭草、马软枣，是蔷薇科地榆属多年生草本植物，因其具有清新雅致的黄瓜香味，一些地区俗称黄瓜香。地榆分布于北温带，我国东北、西北、华北、华中、华南均有分布。喜牛于山坡、谷地、草丛以及林缘和林内。适应性很强，抗寒、耐早、喜光。除寒冷的冬季外，其余季节均可长出新叶。7江南大学硕j j 学位论文地榆根是一种中草药材，在本草纲目中已有记载。可于春秋季挖其根、洗净、干燥；或趁鲜切片，干燥，待用。因其根中含地榆皂甙，能凉血止血、收敛止泻、解毒敛疮。常用于便血、痔血、血痢、崩漏、水火烫伤、痈肿疮毒。1 4 2 地榆的化学成分地榆中具有生理活性的鞣质、黄酮类以及原花青素的含量较高6 7 1 。地榆根中含有鞣质、黄酮类化合物、原花青素、三| ；占皂甙等物质【6 8 】；地榆中含有丰富的营养物质，其中根含有淀粉1 6 1 ，茎含有缩戊糖1 3 8 3 ；茎叶中含有山奈酚的甙，熊果酸等物质，叶含维牛素c 、维牛素b 2 ，花含矢车菊甙，双矢车菊甙，粗纤维、胡萝卜素、钾、镁、磷、钠、铁、锰、铜、锌。1 4 3 地榆的研究现状及应用1 4 3 1 医药方面( 1 ) 对血液系统影响高小平【6 9 】等采用体外培养小鼠骨髓细胞并结合a t p 生物发光检测的方法，从地榆中筛选促骨髓细胞增殖的活性部位，结果显示，皂甙类成分能明显促进细胞因子刺激的骨髓细胞体外增殖，而鞣质和黄酮类成分没有作用，且在高浓度时表现为抑制骨髓细胞增殖，这可能与对造血祖细胞的抑制作用有关。党春兰【7 0 】等采用正常短毛家兔连续2 d 灌服地榆水煎液( 2 0 9 牛药k g ) 后测定血液生物力学指标的方法，结果与对照组相比，全血黏度、血细胞压积均显著增大，而血浆黏度无差异，提示地榆使血液中红细胞百分比含量增多，造成集轴现象中外周血浆层厚度减少，导致全血黏度的升高，血流速度趋缓，有利于凝血功能的发挥。( 2 ) 抗氧化作用地榆提取物( 含鞣质约4 6 3 ) 大鼠灌胃给药3 0 d 后造模 7 1 。7 2 】，低剂量组( 1 0 0 m g k g ) 、高剂量组 提取时间 提取温度 乙醇浓度，最佳配比为a 3 8 2 c 3 d i ；用s a s 处理正交试验数据，考虑对提取影响较大的三个主要因素料液比、提取时间、提取温度，由s a s 处理得到黄酮最佳提取工艺条件如下：料液比0 0 8 3 4 ( h p1 ：1 2 ) 、提取时间1 8 2 h 、提取温度6 9 7 。在确定提取所用乙醇浓度的最佳条件时，考虑经济因素及单因素确定的最佳提取条件，选定乙醇浓度为6 0 。因此总黄酮的最佳提取条件为：乙醇浓度6 0 、料液比0 0 8 3 4 ( 旺1 1 ：1 2 ) 、1 9江南大学硕f ：学位论文提取时间1 8 2 h 、提取温度6 9 7 。2 2 2 2 2 总酚最佳提取工艺的确定对四因素进行极差分析，以总酚含量为应力，见表2 3 。由极差分析可知，各因素对总酚提取率影响的程度由高到低依次为：料液比 提取时间 提取温度 乙醇浓度。最佳配比为a l b 2 c l d l ；用s a s 处理正交试验数据，考虑对提取影响较大的三个主要因素料液比、提取时间、提取温度，由s a s 处理得到总酚最佳提取工艺条件为：料液比0 0 8 3 6 ( 臣1 1 ：1 2 1 、提取时间2 0 9 h 、提取温度7 3 1 。在确定提取时乙醇浓度的最佳条件时，考虑经济因素和文献报道的单因素最佳提取条件，选定乙醇浓度为6 0 。因此总酚的最佳提取条件为：乙醇浓度6 0 、料液比0 0 8 3 6 ( 臣p1 ：1 2 ) 、提取时间2 0 9 h 、提取温度7 3 1 。在确定提取时乙醇浓度的最佳条件时，考虑经济因素及单因素确定的最佳提取条件，选定乙醇浓度为6 0 。因此总酚的最佳提取条件为：乙醇浓度6 0 、料液比o 0 8 3 6 ( h 1 1 ：1 2 ) 、提取时间2 0 9 h 、提取温度7 3 1 。表2 - 2 总黄酮含量的极差分析t a b 2 - 2d i f f e r e n c ea n a l y s i so ft h ec o n t e n to ft o t a lf l a v o n e2 0第二章地榆抗氧化成分的提取i ：艺研究表2 - 3 总酚含量的极差分析t a b 2 - 3d i f f e r e n c ea n a l y s i so ft h ec o n t e n to ft o t a lh y d r o x y b e n z e n e2 2 2 3 最佳提取工艺的验证本试验在正交试验及s a s 分析所得的最佳条件下做验汪试验，结果见表2 4 。由表2 4 可知：( 1 ) 在总黄酮的最佳提取工艺下，得到的黄酮含量大于正交试验各组的黄酮含量，因而试验求得的最佳提取工艺条件得到验证，乙醇浓度6 0 、料液比0 0 8 3 4 ( 即l ：1 2 ) 、提取时间1 8 2 h 、提取温度6 9 7 为黄酮的最佳提取工艺条件( 2 ) 在总酚的最佳提取工艺下，得到的总酚含量远远大于正交试验各组的总酚含量，因而试验求得的最佳提取工艺条件得到验证，乙醇浓度6 0 、料液比o 0 8 3 6 ( 臣1 1 ：1 2 ) 、提取时间2 0 9 h 、提取温度7 3 1 为总酚的最佳提取工艺条件。( 3 ) 在验证试验中，总黄酮含量在两个试验条件下相差不多，而总酚含量在黄酮提取最佳工艺下明显低于酚类提取最佳工艺条件；综合考虑，确定地榆中抗氧化成分的最佳提取工艺条件为总酚的最佳提取工艺：乙醇浓度6 0 、料液比0 0 8 3 6 ( 强1 l ：1 2 ) 、提取时间2 0 9 h 、提取温度7 3 1 。表2 _ 4 验证试验的总黄酮和总酚含量t a b 2 - 4t h ec o n t e n to ft o t a lf l a v o n ea n gh y d r o x y b e n z e n eo fv a l i d a t ee x p e r i m e n t a t i o n2 l江南大学硕+ ：学位论文2 2 3 小结( 1 ) 单因素实验确定每个因素的最佳提取条件分别为：乙醇浓度6 0 ( v v ) 、提取温度7 0 0 c 、提取时间l h ( 提取两次) 、液料比( w v ) l ：1 2 。( 2 ) 正交实验，结果经s a s 分析，验证后综合分析得到地榆中抗氧化成分的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度6 0 、料液比o 0 8 3 6 ( 即1 ：1 2 ) 、提取时间2 0 9 h 、提取温度7 3 1 。第三章地榆抗氧化活性物的稳定性及成分初步分析第三章地榆抗氧化活性物的稳定性及成分分析3 1 活性物质的稳定性3 1 1 试剂与仪器数显电子天平热风干燥箱p h 计地榆提取物3 1 2 实验方法上海天平仪器厂上海实验仪器总厂上海理达仪器厂自制3 1 2 1 样品的制备取地榆在最佳提取工艺条件下的提取物粉末，用9 5 乙醇配制成l m g m l 的溶液。3 1 2 2 稳定性实验( 1 ) 温度对地榆提取物抗氧化活性的影响将配制好的地榆提取物l m g m l 溶液分别置于5 。c 、4 0 、6 0 、8 0 。c 水浴和1 2 0 。c 湿热条件下各处理2 0 m i n ，对照样置于3 0 ；采用亚硝基r 盐c 0 2 + 褪色法测定对o h 自由基的清除作用，具体方法见第二章1 2 3 。实验重复3 次。( 2 ) 紫外光对地榆提取物抗氧化活性的影响将配制好的地榆提取物l m g m l 溶液分别置于紫外灯下分别照射5 m i n 、1 0 m i n 、1 5 m i n 、2 0 m i n 、2 5 m i n 后，原液作为对照；采用亚硝基r 盐c 0 2 + 褪色法测定对o h 自由基的清除作用，具体方法见第二章1 2 3 。实验重复3 次。3 1 3 结果与讨论3 1 3 1 热处理对地榆提取物抗氧化活性的影响采用亚硝基r 盐c 0 2 + 褪色法，测定了经过不同温度处理的地榆提取物对o h 自由基的清除作用，结果见图3 1 。由图可以看出，地榆提取物在不同温度处理后其抗氧化活性差别不大，基本保持原有的活性。这表明地榆提取物的抗氧化活性具有较高的热稳定性。江南大学硕一l j 学位论文8 06 0槲篮蜒4 02 002 04 06 08 01 0 01 2 01 4 0温度( )图3 1 温度对地榆提取物抗氧化活性的影响f i g 3 - 1t h ee f f e c to ft e m p e t a t u r eo na n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fe x t r a c t sf r o ms a n g u i s o r b ao f f i c i n a l i s3 1 3 2 紫外光对地榆提取物抗氧化活性的影响将地榆提取物经紫外光处理后，采用亚硝基r 盐c 0 2 + 褪色法，测定对o h 自由基的清除作用，结果见图3 2 。由图可以看出，随紫外光处理时间的变化，提取物的抗氧化活性基本保持不变。由此可见地榆提取物对紫外光具有极高的稳定性。8 0余6 0槲箜蜓4 02 0o1 02 03 0紫外光照射时间( m i n )图3 2 紫外光对地榆提取物抗氧化活性的影响f i g 3 - 2t h ee f f e c to fu l t r a v i o l e tr a d i a t i o no na n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fe x t r a c t sf r o ms a n g u i s o r b ao f f i c i n a l i s3 1 4 小结实验结果表明，经不同温度处理的地榆提取物的抗氧化活性差别不大，说明地榆提取物的抗氧化活性具有较好的热稳定性，添d n 至, l 化妆品中进行热处理加工