（应用化学专业论文）南瓜多糖的提取纯化及其性能研究.pdf

摘要 多糖是动、植物体内重要的生物活性物质。由于多糖具有各种生物活性功能 以及在保健食品与医药上的广泛使用，多糖的开发利用和研究越来越受到人们的 关注。南瓜多糖是活性多糖之一，但对南瓜多糖的研究还比较少，为此，我们深 入研究南瓜多糖的提取纯化工艺及其性质，为南瓜多糖的推广应用提供理论指导。 实验内容主要如下： l 热水浸提法从南瓜中提取南瓜多糖。影响南瓜多糖提取率的因素有：料液 比、浸提时间、温度、提取次数。在单因素实验的基础之上，采用正交实验对南 瓜多糖的提取工艺进行优化设计。多元线性拟合方程确定南瓜多糖的最佳提取工 艺条件为：温度8 0 、浸提时间3 2 h 、料液比l ：4 0 、提取次数3 次。实验还表 明：四个因素中温度对多糖提取率影响最大，其次为浸提时间、料液比，提取次 数的影响最小。 2 进行了纯化南瓜多糖的实验。在选择多糖的沉淀剂方面，用乙醇沉淀多糖 的效果比用丙酮好。用乙醇沉淀多糖时，浓缩液与乙醇体积比为1 ：4 时沉淀多糖 效果最好。选用活性炭作为脱色剂。活性炭对脱色的影响因素大小为：活性炭用 量 温度 时间，均匀实验确定最佳脱色条件为温度2 0 ，加入o 8 3 的活性炭， 水浴加热5 分钟。脱蛋白处理是在加入木瓜蛋白酶情况下，用氯仿一正丁醇溶液体 积比为4 ：1 的混合液进行充分振荡，振荡3 次可达去除蛋白质的目的。薄层层析 法实验表明南瓜多糖中含有葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖四种成分。南瓜 多糖含量为5 8 2 。 3 进行了南瓜多糖清除羟基自由基和抗氧化性的实验。清除羟基自由基实验 表明：当南瓜多糖浓度为o 5 时，清除率为l o 9 4 ：而当南瓜多糖溶液的浓度达 到4 时，羟基自由基清除率可达6 l - 3 7 ，表现出良好的清除羟基自由基效果。以 猪油作底物，用烘箱贮藏法测定了南瓜多糖的抗氧化活性，实验表明：南瓜多糖 具有较强的抗氧化性，其抗氧化作用随南瓜多糖用量增加而逐渐增强，柠檬酸和 抗坏血酸作为增效剂对南瓜多糖具有协同抗氧化作用。 4 以南瓜为主要原料，进行了南瓜脯这一功能性食品的试制。实验表明：以 0 3 n a h s o 。溶液进行护色，o 5 氯化钙溶液进行硬化，糖液浓度由3 0 9 6 调整至5 0 ， 广东工业大学工学硕十学位论文 烘烤温度为6 ( ) 时制作的南瓜脯最好。南瓜脯中含有丰富的南瓜多糖，有清除人 体内自由基和抗氧化作用，可作为糖尿病患者食用的功能性保健食品。用本法制 得的南瓜脯色泽好，质地均匀，口感柔韧，甜度适宜，是深受欢迎的健康食品。 关键词：南瓜多糖；提取；纯化；清除自由基；抗氧化活性；南瓜脯 v i n a bs t r a c t p o l y s a c c h 耐d ei sav e r yi m p o 舳ts u b s t a 玎c eo fb i o a c t i v i 锣i nl i v i n gc r e a t u r eo r p l a m s b e c a u s eo fo w i n gav a r i e t yo fb i o a c t i v i t i e sa n de x t e n s i v eu s a g e so nf u n c t i o m l f o o da n dm e d i c i n e ，t 1 1 e s t u d yo np o l y s a c c h a r i d e 砒r a c t sm o r ea n dm o r ea t t e n t i o n p u i i l p k i np o l y s a c c h a r i d ci sak i n do fp o l y s a c c h a r i d eo f b i o a c t i v i 坝h o 、e v c r ，t h es t u d y o np u m p k i np o l y s a c c h a r i d ea r ef b 、矾s ow es t i i d yt h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no f p u m p k i p 0 1 y s a c c h 撕d e a 1 1 di t sc h a r a c t e r sa 1 1 dh o p et of i n dt h et h e o r i e st oi m p r o v ei t s a p p l i c a t i o n s t h em a i ne x p e r i m e m s w e r ea sf o l l o w s ： 1 p 啪p k i np 0 1 y s a c c h a r i d ew a se x t r a c t e d 丘o mp u m p k i nb ym e a n so fh o tw a t e r e x 廿a c t i o n t h ef a c t o r st h a ta n b c t e d 曲ee x t m c t i o no f p u m p k i np o l ”a c c h a r i d ei n c l u d e d t h er a t i oo fm a t e r i a lt os o l v e m ，e x 虹a c t i n gt i m e ，t e m p e r a t l l r ea n dt i m e so f e x 订a c t i n g a f o u r - f a c t o rt h r e e l e v e l o m l o g o n a le x p e r i m e n t 、a sd e s i g n c da c c o r d i n gt o 1 es i n g l e f 配t o re x p e r i m e n t s t h em u l t n c a re q u a t i o ns h o w e dt 1 1 a tt h eo p t i i l l a lc o n d i t i o n sw e r e a tt h et e m p e m t u r e o f 8 0 ，e x t 阻c t i l l g t i m e3 2 1 1 t h er a t i oo f m a t c r ! i a lt os o i v c m1 ：4 0a 1 1 d t i m e so f e x t r t i n g3 t h eb i g g e s ti n n u e n c ef h 曲0 rw a st c m p e r a h ，a n dt 1 1 e ne x 打a c t i n g t i m ea n d 吐l er a t i oo fm a t e r i a lt os 0 1 v e n t t l l es m a l l e s ti n n u e n c ef a c t o r ，a s t i n l e so f e x l t a c t i n g 2 t h ee x p e r i m e mo fp u r i 聊n gp 啪p l 【i np o l y s a c c h a r i d ew a s 咖d i e d a st ot h e c h o i c eo f p r e c i p i t a i 】t ，e t h a n o l 、v 船b e 仕e rt l l a i la c e t o n e w h e n u s i n ge t h a n 0 1t op r e c i p i t a t e p u m p k i np o i y s a c c h a r i d e ，t t l e 硎oo f c o n c e n t r a t e d s o i u t i o nt oe t h 趾o lw a s1 ：4 a c t i v a t e d c h a r c o a lw a su s c da sd e c o l o u m n t ；l ei n n u e i l c es e q u e n c ew a st 1 1 ea c t i v a t e dc h a r c o a l s c o n s 啪p t i o n ，t e n l p e m t u r ea n dt i n l e t h eb e s tc o r l d i t i o n so f d e c 0 1 0 i l i z a t i o nw e r eu n d e r t h ct e m p e r a t l l 】陀o f2 0 ，c o n s u n l p t i o no fa 吐i va _ t e dc h a r c o a lo 8 3 ，t i m e5m i n u t e s t h e p r o c e s so fd 印r o t e mw a sc a r r i e do u ta f c e ra d d i n gp a p a i n n 、v a sf o u n dt h a tm eg o a lo f d 印r o t e m w a sa c l l i e v e db y s l l a k i n gm e m o d 研t 1 1s o h l t i o n ，r a t i oo f c h l o r o f 0 肌t ob u t a l l o l 4 ：1 p u m p k i np o l y s a c c h a r i d e w a sc o m p o s e do fg l u c o s e ，i s o d u l c i t o l ，a r a b i n o s e 姐d g a l a c t o s e 5 8 2 p u m p k i np 0 1 y s a c c h 嘶d e c o u l db e g e t 3 t h ee x p e r i m e n t so fs c a v e n g i n g 舶er a d i c a l sa i l d 枷o x i d a n ta c t i v m e sw e r e i x 广东t 业大学工学硕士学位论文 s t l l d i e d t h ee x p e r i m e n to f s c a v e n g i n gf r e er a d i c a l s ( o h ) s h o w e d m a tt h ea r n o u n to f s c a v e n g i n go f + o h w a s1 0 9 4 w t l e n 吐【ec o n c e n t r a t i o n o f p u m p k i n s o l u t i o nw a s0 5 ， a n d6 1 3 7 w h e nt h ec o n c e 曲_ a t i o no f p u i 】叩k i ns o l u t i o nw a s4 ，w h i c hr e p r e s e n t e da g o o ds c a v e n g i l l ge 圩e c to n o h t h ea n t i o x i d a j l ta c t i v i t i e s 、v e r em e a s u r e d b y m eo v e n s t o r a g em e t h o du s i n gl a r da ss u b s 扭a t e nw a sf o u n dm a tp u m p k 证p o l y s a c c h a r i d eh a d a 1 1 t i o x i d a n ta c t i v i t i e s 孤di t se f f b c ti r l c r e a s e dw i t h 锄o u n to fp u m p k i np o l y s a c c h 撕d e 证c r e a s 崦， n es y e 西s t i c盟t i o x i d a n ta c t i v i t i e so f骶血x t l l r eo f p 础p 虹n p o l y s a c c h a r i d ea i l dv c o rc i 订i ca c i dw e r es h o w e d 4 t a k i n gp u m p l 【i na sm a i nm a t e r i a l ，m et e c h n o l o g yo fp r e s e r v e dp u m p k i n a sa f u n c t i o n a lf o o dw a ss m d i e d 1 、h er e s u n ss h o w e dt h a tw h e nu s i n go 3 s o d i u mb i s u l f i t c t op r o t e c tc o l o r o 5 c a l c i u i nc h l o r i d et oh a r d i n g ，c h a n g i r 培t h es u g a rc o n c e n 拄a t i o n 仔o m3 0 t o5 0 a n d f i x i n gt h et o a s t i n gt e m p e r a t u r e a t6 0 ，p r e s e c d p u m p k 访c o u l d b eb e s tm a d e c o n t a i n e da b u n d a n tp u m p k i np 0 1 y s a c c h a r i d em a tc a ns c a v e n g ef k e r a d i c a l sa 工l dh a da 1 1 t i o i d a n ta c t i v i t i e s ，t l l ep r e s e r v e dp 啪p k i nw a sam n c t i o n a lf o o dt o d i a b e t i c s w i t hi l i c ec o l o r 趾d1 u s t e r ，l l i l i f o r i nt e x m r e ，s o f tt a s t c ，s u i t a b l es w e e t ，t h e p r e s e r v e dp u m p k i n w o u l db ea 、v e l c o m ef d 1 ( q 唧o r d s ：p u i n p k i np o l y s a c c h a r i d e ；e x t r a c t i n g ；p u r i 聊n g ；s c a v e n g 血gh y d r o x y l r a d i c a l ；a n t i o x i d a ma c t i v i t i e s ；p r e s e r v e dp u m p h n x 第一章绪论 1 1 多糖的来源 第一章绪论 多糖是自然界含量最丰富的物质之一，也是与人类生活紧密相关的一类生物 高分子。在生命过程中，糖作为能量物质( 如葡萄糖、淀粉等) 和结构物质( 如纤维 素、几丁质等) 是生物体的主要能量来源。同时，多糖也是工业上重要多聚体的原 料来源，如应用于食品工业的卡拉胶、应用于石油工业的田菁胶等。多糖作为广 谱免疫调节剂在医药上也有广泛应用“。 多糖以多种形式存在于植物体内，根据它的存在部位，可将之分为以下几类 类：细胞内多糖、细胞壁多糖和细胞外多糖。 多糖属高分子聚合物，具有复杂的结构，具有装载丰富生物信息的能力。核 酸中的核苷酸和蛋白质中的氨基酸都只有一种链接方式，而多糖中的糖单体则有 多种链接点，可以形成不同构型的直链和支链的结构。多糖也能依据分子量、分 子间氢键的不同而形成不同的高级结构。 自然界中的多糖可分为离子型多糖和非离子型( 中性) 多糖。非离子型多糖依 据其组成单糖种类又分为均聚多糖和杂多糖两大类。均聚多糖主要有d 一葡聚糖、 d 一半乳聚糖、d 一甘露聚糖、d 一木聚糖和d 岩藻聚糖等几种，其中以d 一葡聚糖在自 然界中最为常见。d 一葡聚糖又分为n 一( 1 ，2 ) 一、b 一( 1 ，2 ) 一、n f l ，3 ) 、b 一( 1 ，3 ) 一、 a 一( 1 ，4 ) 一、b 一( 1 ，4 ) 、a 一( 1 ，6 ) 一、b ( 1 ，6 ) 一等几种形式。淀粉和纤维素这两 种对人类生活极为重要的物质就分别是a 一( 1 ，4 ) 一d 一和p 一( 1 ，4 ) 一d 一葡聚糖。 植物来源多糖。3 大多为植物的渗出液，如卡拉胶、阿拉伯胶，可作食品工业 原料。动物来源多糖中最重要及用途最广的是壳多糖，广泛存在于虾蟹的外壳、 乌贼骨、昆虫翅膀中。海藻来源多糖中提取得到的多糖，大多含有硫酸根“1 。微生 物来源的多糖是至今研究得比较详细的一类多糖4 3 。 广东工业大学工学硕士学位论文 表卜1 一些活性多糖的来源及组成 t a b 1 1s o u r c ea n dc o m d o s l t i o no fs o m eb i 0 1 0 9 i c a la c t i v a t ep o l y s a c c h a r l d e s 多糖名称来源 组成 黄芪多糖a s t r a g a l u sq 一1 ，4 葡聚糖 m o n g h o l i c u s 刺五加多糖a c a n t h o p a n a x主链b 一1 ，4 木聚糖，侧链阿拉伯 s e n t i c o s u s糖，4 一甲基葡萄糖 蘑芋多糖a m o r p h o p h a l l u sk o n j a c 葡萄甘露糖 人参多糖 p a n a xg i n s e n g葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、 鼠李糖、半乳糖醛酸 当归多糖a n g e l i c as i n e n s i v 具6 位分枝的d 一1 ，4 葡聚糖 红花多糖 c a r t h 锄u st i n c t o r i n s葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖 竹黄多糖 s h u i r a i ab a j n b u s i c o l a鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡聚糖、 半乳糖、甘露糖 茶叶多糖 t e as i n e n s i s半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖 不同多糖的提取方法有很大不同， 其缀合物对多种危害人类健康的疾病， 炎、血栓等，都具有显著的疗效。 在多糖的研究方面，美国、日本、 多耱研究是从八十年代后才兴起的“。 1 2 多糖的提取及纯化方法 1 2 1 多糖的提取 但均有较高的药用价值。人们发现多糖及 如免疫紊乱、癌症、糖尿病、高血压、肝 德国和加拿大处于世界领先地位，我国对 从不同材料中提取多糖，首先应根据具体情况以小量样品模索，观察哪种方 法提取分离效果好。按多糖的个性，提取采用水提取法、中性盐溶液提取法、碱 提取法、水解酶消化提取法、蛋白酶水解提取法等。同一原料可以先后用水、稀 碱、稀酸或稀盐提取，也可分别用上述溶液提取，但所得产物会有区别。 多糖难溶于冷水，但在热水中可溶，故一般用热水提取。对于香菇、灵芝等 菌类，含有较多的细胞内多糖，采用热水提取可获取较高得率。但以根茎为主的 植物体，细胞壁多糖含量高，用热水直接提取的效果不好。采用酶解或弱碱溶解， 则可以破坏细胞壁，增加多糖的溶出。水提取或中性盐溶液提取较温和，适用于 透明质酸等不含硫酸基多糖的提取。 提取中要防止多糖的降解，用稀酸提取时，常通以氮气或加入硼氢化钠或硼 氢化钾以防降解。含有糖醛酸或硫酸基团等的多糖，可在盐类或稀酸溶液中直接 醇析，使多糖以盐的形式或游离的形式析出。 1 2 1 1 动物多糖的提取 尽管动物多糖的种类繁多，但其提取分离的方法基本相同。动物中所含多糖 多是酸性多糖，主要存在于动物的结缔组织中，常与蛋白质牢固地结合在一起， 因此目前常用如下三种方法提取分离，即碱溶液提取法、中性盐溶液提取法和蛋 白酶水解法。其中以酶解法较好，因其具有产物降解少且产量高等优点，如鹿茸 中酸性多糖的提取，采用木瓜酶消化方法。1 。 1 2 1 2 植物多糖的提取 多糖可存在于植物的根、茎、叶、花、果及种子中。“。大部分植物多糖不溶 于冷水，在热水中呈粘液状，遇乙醇能沉淀。这样从植物中分离、提取较为单一 的植物多糖并鉴定其纯度则极为困难。故提取时需注意对一些含脂较高的根、茎、 叶、花、果及种子类，在用水提取前，应先脱脂，而对含色素较高的根、茎、叶、 果实类，需进行脱色处理。 科学家们曾采用经水或甲醇等有机溶剂的水溶液浸泡、低温减压浓缩、流水 透析、凝胶柱层析、冷冻干燥等途径得到较单一的多糖成分，再经高效液相色谱 或凝胶层析测定其纯度、分子量，酸水解气一液相层析或纸层析测定其单糖组成。 如人参多糖( p a n a x a n s ) 、大枣多糖( a t r a c t a n s ) 、茶叶多糖( a c o n i t a n s ) 、仙人掌 多糖( t r i c h o s a n s ) 、紫草多糖( 1 i t h o s p e r m a n s ) 等的提取“。 1 2 1 3 菌类多糖的提取 各类真菌中所含多糖类化合物，提取分离方法利用水提醇沉，除去小分子杂 质和蛋白质( s e v a g e 法、三氟三氯乙烷法等) ，即得多糖。如灵芝多糖、槐耳多糖、 香菇多糖等。 至三些叁耋：差堡圭耋堡笙塞 1 2 2 多糖的纯化 1 2 2 1 脱蛋白方法 用水或稀碱提取的多糖常含有蛋白质，必须予以除去。一般选择那些使多糖 不沉淀而使蛋白质沉淀的试剂来处理，如酚、三氯乙酸、鞣酸等。但处理时必须 时间短、温度低，避免多糖降解。 s e v a g e 法“：根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用氯仿：戊醇( 或 正丁醇) 5 ：l 或4 ：1 ，混合物剧烈振摇2 0 到3 0 分钟，蛋白质与氯仿一戊醇( 或正 丁醇) 生成凝胶物而分离，离心，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。此种方 法在避免降解上有较好效果，但效率不高，如能配合加入一些蛋白质水解酶，再 用s e v a g e 法效果更佳。 三氟三氯乙烷法“：多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合，在低温下搅拌1 0 分钟左右，离心得上层水层，水层继续用上述方法处理几次，即得无蛋白质的多 糖溶液，此法效率高，但溶剂沸点较低，易挥发，不宣大量应用。 三氯醋酸法：在多糖水溶液中滴加5 一3 0 三氯醋酸，直至溶液不再继续混浊 为止，在5 1 0 放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖溶液。此法会引起 某些多糖的降解。 以上的方法均不适合于糖肽，因糖肽也会象蛋白质那样沉淀出来。对于对碱 稳定的糖蛋白，在硼氢化钾存在下，用稀碱温和处理，可以把这种结合蛋白质分 开。 1 2 2 2 脱色工艺” 多糖中常含有些色素( 游离色素或结合色素) ，根据其不同性质采取不同的 方法。常用的脱色方法有：离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法( 纤维 素、硅藻土、高龄土、活性炭等) 。 d e a e 一纤维素是目前最常用的脱色方法，通过离子交换柱不仅达到脱色的目 的，而且可以分离。 双氧水脱色法：利用双氧水的氧化作用在5 0 一6 0 对多糖中的色素物质进行降 解，使色素产生的颜色得以脱去，但反应条件较剧烈，温度、时间须控制良好， 以防止高温长时间下多糖的降解。 活性炭脱色法：利用活性炭对色素的吸附作用进行脱色。活性炭为黑色细微 4 第一章绪论 粉末，无臭，无味，具有无毒、脱色脱臭效果良好的特点，可以反复使用，成本 低。但其用量、温度、时间等反应条件须经试验才能得到最好效果。 对于同时含有游离蛋白质和色素的多糖，可通过生成金属络合物的方法，同 时除去蛋白和色素。方法是加入费林试剂生成不溶性络合物，经分离后用阴离子 交换树脂分解络合物。吸附脱色法也常用，如通过活性炭、高岭土、硅藻土达到 纯化的目的。 1 2 23 除酯工艺 将乙醇沉淀所得的粗多糖装入滤纸筒后置于索氏提取器，4 5 恒温水浴提取 至粗脂肪脱尽，挥干残醚得浅黄色粗多糖。 1 2 24 杂质的去除 通过逆向流水透析除去低聚糖等小分子杂质。 对于无机盐及低分子量的有机物质，可用透析法、离子交换树脂或凝胶过滤 法除去。 纯化是将多糖混合物分离为单一的多糖组分，主要是除去多糖提取液中所含 的小分子物质，实质上分离与纯化很难明显区分开来，因为有的在分离过程已纯 化了，反过来有的在纯化过程中进一步得以分离。根据多糖的性质常采用的方法 有：分步沉淀法、d e a e 一纤维素层析法、s e p h a d e x 凝胶过滤法、季铵盐沉淀法、盐 析法、金属络合法、亲和层析、超滤和电泳等方法。 1 3 多糖的结构 1 3 1 多糖的结构层次 讴蛄。h 、h 图卜1 寡糖的结构 f i g 1 一l s t r u c t u r eo f0 1 i g o s a c c h a r i d e s “ ：奎占些奎兰三耋耍圭耋堡垒圣 糖类是生物大分子，具有十分复杂的结构。图卜1 例举了寡糖0 一d 纤维二糖 ( a ) 和0 一d 龙胆二糖多糖( b ) 的结构。多糖的结构分类沿用了蛋白质和核酸的 分析方法，分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构“。 多糖的一级结构是指糖基的组成、糖基排列顺序、相邻糖基的连接方式、异 头碳构型以及糖链有无分支、分支的位置与长短等”。糖的一级结构非常复杂， 糖残基上还可以连接硫酸基团、甲基化基团、磷酸基团和乙酯基团，这就使得多 糖一级结构更加复杂。 多糖的二级结构指多糖骨架链间以氢键结合所形成的各种聚合体，只关系到 多糖分子中主链的构象，不涉及侧链的空间排布。在多糖链中，糖环的几何形状 几乎是硬性的，各个单糖残基绕糖苷键旋转而相对定位，由此决定多糖的整体构 象。 三级结构指由多糖中糖残基中的羟基、羧基、氨基以及其他官能团之间通过 非共价作用而导致的有序、规则而粗大的空间构象。 多糖的四级结构是指多聚链间非共价键结合形成的聚集体”。多糖链的聚集 作用可在相同的分子间进行，也可在不同的多糖链间进行。 1 。3 2 多糖的结构分析 多糖的结构分析主要以一级结构为主，因为多糖二级及以上结构是以一级结 构为基础的。分析多糖结构有许多方法，包括化学方法、物理方法和生物方法“。 化学方法中有下列几种方法：( 1 ) 水解法：通过水解多糖链分解为各个单糖， 然后进而分析，这是分析多糖链组成成分的主要手段。水解法包括完全酸水解、 部分酸水解、乙酰解和甲醇解；( 2 ) 高碘酸氧化法：高碘酸可以选择性的氧化断裂 糖分子中的连二羟基或连三羟基处，生成相应的多糖醛、甲酸，反应定量地进行。 ( 3 ) s m i t h 降解：s m it h 降解是将高碘酸氧化产物还原后进行酸水解或部分水解。 由于糖基之间以不同的位置缩合，用高碘酸氧化后则生成不同的产物，由降解产 物可以推断苷键的位置。( 4 ) 甲基化反应：将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全 部甲基化，然后将甲基化多糖水解得到部分甲基化的单糖，分析这些单糖，就有 可能推测组成多糖分子中单糖间连接的位置。 物理方法主要有：红外光谱、气相色谱、液相色谱“、核磁共振波谱”“、质 第一章绪论 谱“、气质联用、电子衍射、毛细管电泳、x 射线衍射“2 1 等。与化学方法相比，物 理方法对多糖结构的分析具有快速、准确性高等特点，是糖链结构分析不可缺少 的手段。多糖高级结构的分析主要采用物理方法。 生物学方法主要是利用特异性糖苷酶进行的酶法分析。“。酶促反应具有高度 专一的特性，且副产物少，在糖链的结构分析中是一种很好的方法。多糖链中糖 苷键类型可以利用n 一糖苷酶和b 一糖苷酶对多糖底物的催化反应来确认，利用酶 法分析糖肽连接方式。 表卜2 测定多糖一级结构的常用方法 t a b 1 2c o m m o nm e t h o d so fd e t e r m i n i n gt h ef i r s tc l a s ss t r u c t u r eo f p 0 1 y s a c c h a r i d e 项目方法 分子量测定 单糖组成和分子比例 吡喃环或呋喃环形成 连接次序 异头异构体 羟基被取代情况 糖链一肽链连接方式 凝胶过滤法、质谱法、蒸汽压法 酸解法、纸色谱、气相色谱 红外光谱 选择性光谱法、糖苷酶顺序水解、核磁共振 糖苷酶水解、核磁共振 甲基化反应一气相色谱、过碘酸氧化、核磁共振、质谱法 单糖与氨基酸组成、稀碱水解法、肼解反应 1 4 多糖的物化性质 1 4 1 多糖的物性 ( 1 ) 分子量” 多糖分子量的分布一般比较分散，平常所说的分子量是指大小分子的平均数， 即平均分子量。一个分子量较分散的样品，若用不同性质的分子量测定法测定它 的分子量结果，往往存在一定的差异。 因为多糖的理化性质与生物活性都与分子量有关，所以研究多糖首先要测定 多糖的分子量，多糖分子量的测定方法有蒸气渗透压法、溶液渗透压法、超离心 广东工业大学工学硕十学位论文 法、粘度法、光散射法、还原末端法、聚合度法等。应用高效凝胶层析法测定多 糖的分子量具有快速、高分辨和重现性好的优点，它根据在凝胶柱上不同分子量 的多糖与洗脱体积成一定关系的特性，先用各种已知分子量的多糖制成标准曲线， 然后由样品的洗脱从曲线中求得分子量。 ( 2 ) 纯度 由于多糖的分子大小差异性，其纯度不同于一般化合物，其纯度只代表某一 多糖的相似链长的平均配布，即一定分子量范围的均一组分。常用比旋度法、超 离心法、高压电泳及凝胶过滤法判定多糖的均一性。 ( 3 ) 溶解性 难溶于冷水，在热水或碱液中可溶。不溶于丙酮、乙醇、正丁醇、乙醚、醋 酸乙酯等有机溶剂。 ( 4 ) 热稳定性热 不稳定，当温度大于4 0 时，分解加快。 ( 5 ) 酸碱稳定性 p h 小于5 时开始降解，小于3 时有2 0 降解，大于7 时氧化加快。 1 4 2 多糖的化性 与硫酸蒽酮、硫酸苯酚反应阳性，常用于定量分析；可与部分有机、无机离 子络合，如与十六烷基三甲基溴化铵( c t a b ) 、氢氧化钡等结合沉淀。 1 5 多糖的活性功能 多糖具有多种生理活性，表卜3 列出了针对不同作用部位，多糖所起到的生 理活性。 表卜3 多糖类药物的生理活性 t a b 1 3p h y s i o l o g i c a la c t i v a t i o no fp 0 1 y s a c c h a r i d em e d i c i n e s 作用部位生理活性 免疫系统 凝血系统 消化系统 其它 补体活化活性、抗肿瘤活性、致有丝分裂活性、刺激巨噬细胞的吞 噬作用、巨噬细胞的肿瘤细胞毒的刺激作用、细胞因子的诱导和超 氧离子的诱导、增加自然杀伤细胞毒的活性、抗病毒活性、抗炎活 性、抗辐射活性 抗凝血活性 抗呕吐活性、抗溃疡活性 降血糖活性、抗青光眼活性、刺激性功能的活性 1 5 1 多糖的促进免疫功能 多糖对免疫系统有重要的调节作用，不仅能激活巨噬细胞( m 由) 、细胞毒t 细 胞( c t l ) 、t 淋巴细胞、b 淋巴细胞、自然杀伤细胞( n k ) 、淋巴因子激活的杀伤细 胞( l a i ( ) 等免疫细胞，还能促进细胞因子生成，活化补体，从而在抗肿瘤、抗病毒 ( 抗感染) 等的防治上具有独特的功效。”1 。 多糖促进免疫功能的途径有以下几种：1 提高巨噬细胞的吞噬能力，诱导白 细胞介素1 ( i l 。) 和肿瘤坏死因子( t n f ) 的生成。如海藻多糖、牛膝多糖、商陆多糖。 2 促进t 细胞增殖，诱导其分泌白细胞介素2 ( i l 。) 。如商陆多糖、黄芪多糖、人 参多糖、枸杞子多糖。3 促进淋巴因子激活的杀伤细胞( l a k ) 活性，如枸杞子多糖、 黄芪多糖。4 提高b 细胞活性，增加多种抗体的分泌，加强机体的体液免疫功能， 如褐藻多糖、银耳多糖、香菇多糖。5 激活补体系统。如当归多糖、茯苓多糖。 多糖通过增强宿主免疫机制可以抵抗细菌、病毒、寄生虫的侵袭，因而具有 广泛免疫调节作用。如香菇多糖对泡状口炎病毒感染引起的小鼠脑炎有显著疗效 和预防作用，对阿伯耳氏病毒和十二型腺病毒感染也有效。灵芝多糖对抗慢性肝 炎有显著疗效。 1 5 2 多糖的抗肿瘤功能 多糖是生物反应调节剂的重要组成部分，能激活免疫细胞，诱导多种细胞因 广东工业大学1 _ ：= 学硕士学位论文 子和细胞因子受体基因的表达，增强机体抗肿瘤免疫功能，从而间接抑制或杀死 肿瘤细胞。7 “。一些具有细胞毒性的中药植物多糖可以直接杀死肿瘤细胞，如猕 猴桃多糖。 肿瘤是一类严重威胁人类健康的疾病。从细菌、真菌、酵母、地衣等植物、 海洋植物中提取的多糖均具有抗肿瘤活性。某些多糖还能对抗化学试剂的致癌 作用。多糖作为抗癌剂最大的优点是毒副作用少，与化疗联合作用，还可以对抗 化疗药的骨髓抑制等不良反应。 抗肿瘤多糖分为二种：一种是直接杀死了肿瘤细胞的多糖，这种多糖具有细 胞毒性。如茯苓多糖、香菇多糖、灵芝多糖等；另一种多糖是作为生物免疫反应 调节剂，通过增强机体的免疫功能而间接抑制或杀死肿瘤细胞的，大多数多糖通 过这一途径起到抗肿瘤作用。 茯苓多糖的抗肿瘤研究表明其对小鼠s 1 8 0 的抑瘤率达8 8 一9 6 。云芝多糖的 抗肿瘤研究表明：云芝多糖对s 1 8 0 肉瘤、艾氏腹水癌、吉田氏瘤、腹水型肝癌等 实验性肿瘤有良好的抑瘤作用，有的肿瘤可以完全消退，可以增强宿主的免疫功 能。对于消化道癌、肺癌、宫颈癌也有较好的效果，并且可以增加放化疗的疗效。 香菇多糖可以降解癌毒素对免疫系统的影响，减轻或预防化疗药物对免疫淋巴细 胞的抑制。从香菇中提取的多糖体中有一种组分l c 一1 1 抑瘤作用最强，其对小鼠 s 1 8 0 的抑瘤率达1 0 0 。猪苓多糖临床实验表明，猪苓多糖能增强癌症和肝炎病人 的机体免疫力，减轻化疗副反应，增进食欲，减少出血和感染，使肺癌与肝癌病 人平均生存时间延长2 3 个月。 具有抗肿瘤活性的多糖大多是由6 一( 1 ，3 ) 一键连接的d 一葡聚糖。长期的研究表 明，在多糖骨架链上占优势的交替( 1 ，3 ) 键连接的b d 一葡聚糖往往具有较明显的 抗肿瘤活性，若骨架结构主要由( 1 ，6 ) 键或其他键连接，则抗肿瘤活性就很低。香 菇多糖、猪苓多糖、裂褶多糖和核盘菌多糖等都属于含有b 一( 1 ，3 ) 一键连接的d 一 葡萄糖残基为骨架的葡聚糖。 1 5 3 降血糖作用 多糖并不增加胰岛素的分泌，雨是作用于糖代谢的酶。植物多糖可通过调节 糖代谢酶的活性，抑制糖异生，促进葡萄糖的利用，达到改善糖代谢紊乱和胰岛 1 0 第一章绪论 素抵抗的目的。 正常情况下，人体内脂质的合成与分解保持一个动态平衡，一旦平衡遭到破 坏，血脂含量的增高将使动脉内膜受到损伤而导致动脉粥样硬化，从而诱发心脑 血管疾病。降低血脂含量对于防治心血管疾病具有重要意义。南瓜多糖具有降衄 糖和降血脂的作用，对糖尿病的防治效果己获确证1 。另外，具有降血糖作用的 还有番石榴多糖、甘蔗多糖。人参多糖对正常及四氧嘧啶糖尿病小鼠均有显著的 降血糖作用。“。 1 5 4 降血脂作用 肝素( h e p a r i n o i d ) 能促进脂蛋白脂肪酶的释放，使血液中大分子的脂质分解 成小分子，故对因血脂过多引起的血清混浊有澄清作用，也能明显降低血胆固醇。 茶叶多糖增强了卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性，故有利于胆固醇的清除。 高血脂症是指血液中一种或多种物质成分异常增高的病症，它能直接导致动 脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化等心脏病，而后者的死亡率较高，因此积极防治 高脂血症具有十分重要的意义。孔庆胜等用正常及糖尿病模型小鼠做试验，发现 注射南瓜多糖水溶液的两种小鼠均总胆固醇、低密度脂蛋白下降，高密度脂蛋白 增加，此实验表明南瓜多糖是较理想的能改善脂类代谢的食疗剂”。现已发现的 具有降血脂活性的多糖有海带多糖、甘蔗多糖、灵芝多糖、茶叶多糖、紫菜多糖、 魔芋多糖等。 1 5 5 其它 抗衰老嘲、抗凝血作用。”、抗溃疡作用、阻抗放射性元素和毒素的吸收、镇 静剂功用。、辐射保护剂、早期引产作用。 1 6 南瓜的研究现状 南瓜属葫芦科植物，果肉内含有丰富的营养成分：多种氨基酸、多糖、维生 素、蛋白质、淀粉、纤维素及一些微量元素。古代名医李时珍在本草纲目中 对南瓜的作用有如下记载“补中，补肝气，益心气，益肺气，益精气”，凡久病气 虚、脾胃虚弱、症见气短倦怠、食少腹胀、水肿尿少者宣用。南瓜对环境适应力 广东工业大学工学硕士学位论文 极强，极易生长，在我国各地普遍栽培。又因为运输和保存都很方便，所以价格 便宜。 近年来的研究结果亦表明，南瓜的营养成分丰富，其营养成分为水分9 0 2 4 、 蛋白质o 6 5 、脂肪0 1 3 、碳水化合物6 0 8 、纤维2 1 5 、灰分o 7 3 ，同时还 含有丰富的胡萝h 素、维生素b 、维生素c 、维生素e 、精氨酸、天门冬氨酸、腺 嘌呤、果胶、甘露醇、叶红素、叶黄素及钙、钾、锌、铬等矿物质，特别是稀有 氨基酸瓜氨酸含量达2 0 9 m g 1 0 0 9 ，果胶含量占南瓜干物质的7 一1 7 。南瓜具有 多种食疗保健作用和药用价值“”“。南瓜的抗糖尿病作用是比较显著的，据文献报 道：对空腹血糖在8 ，2 5 m m 0 1 l 的轻度患者，每天服用5 0 0 9 鲜南瓜即有可靠的疗 效；血糖在8 2 5 m o l l 以上的患者，需配合饮食和运动疗法：血糖超过1 m m 0 1 几 的患者，可酌情配合药物或胰岛素治疗。 随着人们对南瓜认识的不断加深，国内外逐渐开始对南瓜进行综合开发利用， 目前市场上出现的系列南瓜产品有南瓜粉、南瓜酱、南瓜罐头、南瓜果脯、三合 味南瓜片、南瓜蜜钱瓜干、南瓜晶、南瓜糊、南瓜糕点、南瓜饮料、南瓜冰淇淋、 什锦瓜果、南瓜果冻、南瓜酱油、南瓜火腿、南瓜营养汁等多种品种”1 。 1 7 选题的目的意义和研究内容 国内许多研究学者对多糖的活性功能做了大量的研究。1 ，但是南瓜多糖的提 取纯化工艺的研究却很少，本文针对这一现状，改进提取纯化的工艺条件，获得 制备南瓜多糖的最佳线路。 当前常用的食品抗氧化剂( 如b h t 、b h a 、t b h q ) 大多是合成品，由于合成抗 氧化剂存在毒性和致癌等可能性，已经被一些国家禁用或限制使用，天然抗氧化 剂由于安全、无毒等优点引起人们的关注。寻找高效天然的抗氧化剂是适应形势 发展的极有价值的课题，南瓜多糖的抗氧化性的研究就是基于此而提出来的。羟 自由基与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬有关，因此研究南瓜多糖对羟自由基 的消除作用，对开发保健品市场有很大帮助。南瓜多糖可作为长效、无毒、降血 糖、调血脂药物或食疗荆，具有可进一步开发利用的价值，有广阔的前景。 本研究课题利用我国资源丰富、价格便宜的南瓜作为原料进行研究，寻找最 佳的制备工艺，为南瓜多褚产品的规模化生产与应用奠定理论和实验基础，也为 第一章绪论 开发高档次、附加值高的各种食品和营养保健品提供参考。 具体研究内容如下： ( 1 ) 改进南瓜多糖的提取方法和分离纯化工艺，找到一条工艺简单、成本低、 提取率和纯度高、经济有效的制备南瓜多糖的方法，并对南瓜多糖进行定性分析， 如南瓜多糖的组成、溶解性等。 ( 2 ) 研究南瓜多糖对清除羟基自由基的作用。 ( 3 ) 研究南瓜多糖对猪油的抗氧化作用。 ( 4 ) 功能性食品南瓜脯的试制。 广东丁业大学t 学硕士学位论文 第二章南瓜多糖的提取 多糖具热水溶性，故一般用热水提取，可减少脂溶性物质溶出。对于香菇、 灵芝，南瓜等植物多糖类，含有较高的细胞内多糖，采用热水提取可获取较高得 率。南瓜粉末经热水浸提后，去除其中蛋白质、色素、小分子杂质等其他干扰物 质，沉淀烘干得到南瓜多糖。 具体工艺流程如下： 南瓜一烘干一粉碎一准确称重一热水浸提一纱布过滤，浓缩一第一次沉淀多 糖一离心一脱色一去除蛋白质一透析一第二次沉淀多糖一离心一乙醚、丙酮洗涤 一烘干一南瓜多糖 2 1 南瓜多糖提取的单因素实验 2 1 1 实验试剂和仪器 2 1 1 1 实验试剂 葡萄糖：分析纯，广州化学试剂厂 浓硫酸：分析纯，广州化学试剂厂 苯酚；化学纯，广州化学试剂厂 2 1 1 2 实验仪器 j a 5 0 0 3 型电子天平：上海良平仪器仪表有限公司 电热恒温水浴锅：北京泰克仪器有限公司 7 2 1 分光光度计：上海第三分析仪器厂 小型电动粉碎机：北京机械技术有限公司 2 1 2 实验方法 2 1 2 1 南瓜粉的制备 南瓜一去皮、去耔一切丝一晾晒一烘干一粉碎一过筛一南瓜粉 2 1 2 2 南瓜多糖提取工艺参数的确定 南瓜多糖属酸性多糖，易溶于热水，影响热水浸提的因素主要有料液比、浸 1 4 第三章南瓜多糖的纯化 提时间、温度以及提取次数。对于南瓜多糖提取工艺，主要从以下四个因素来考 虑对提取率的影响，为正交试验设计的水平提供有意义的取值范围。 1 料液比对提取率的影响 称取1 0 克南瓜粉6 份，分别加入水1 0 0 m l 、2 0 0 i i l l 、3 0 0 m l 、4 0 0 m l 、5 0 0 m l ， 6 0 0 i i l l 置于7 0 的水浴中，浸提2 小时，过滤，滤液离心，苯酚一硫酸法测定南瓜 多糖浓度，计算提取率。 2 浸提时间对提取率的影响 称取1 0 克南瓜粉6 份，加入3 0 0 m l 水，控制水温7 0 ，分别浸提0 5 、1 、2 、 3 、4 、5 个小时，抽滤，滤液经离心后用苯酚一硫酸法测定南瓜多糖浓度，计算提 取率。 3 温度对提取率的影响 称取l o 克南瓜粉6 份，加入3 0 0 m l 水，置于温度不同的水浴锅中，控制水温