（化学工艺专业论文）胭脂虫天然红色素提取纯化工艺研究.pdf

摘要 本论文较系统研究了以胭脂虫为原料制备胭脂虫红色素的工艺过程主要内 容包括： ( 1 ) 在工艺路线筛选的基础上，首次将响应面法( r s m ) 应用于胭脂虫红色 素的提取工艺中，通过响应面方法对试验结果进行分析得到最佳提取条件通过 提取方法和溶剂筛选试验确定以含水乙醇为提取溶剂、回流法提取为提取胭脂红 色素的制备工艺路线通过单因素实验得知温度、提取时间乙醇浓度对提取效 果有较大影响，液料比和提取次数影响较少，在后续研究中取值为：液料比确定 为2 0 ：1 ，提取次数确定为3 次通过响应面实验及回归分析，确定了用含水乙醇 为溶剂提取胭脂虫红色素的最佳工艺参数为：温度7 7 、乙醇浓度5 0 ，每次 提取时间1 5 0 h ，每次提取液料比为2 0 ：1 ，提取3 次该工艺的提取率可达到1 7 6 2 ( 胭脂红色素g g 胭脂虫) ( 2 ) 以酶法水解致敏杂蛋白为理论基础，探索了酶水解胭脂红色素粗提液 中蛋白的工艺路线和工艺过程工艺条件的优化通过四种酶对色素粗提液中的杂 蛋白的水解效果比较，选择木瓜蛋白酶为本次实验的水解用酶通过单因素及正 交实验确定了木瓜蛋白酶水解的最优条件：加酶量3 ，酶解时间为5 h ，水解温 度为5 0 ，水解时溶液p h 值为6 ，水解率为8 2 1 ( 3 ) 研究了大孔树脂法富集、纯化胭脂虫红色素工艺过程，通过对影响吸 附洗脱过程中备因素的研究，确定了大孔树脂分离纯化胭脂虫红色素酶解液的优 化工艺条件，得到了纯度较高的胭脂虫红色素产品通过静态吸附实验表明， a m b e r l i t ex a d7 对胭脂虫色素酶解液分离纯化工艺过程是一种理想的的吸附树 脂，具有吸附容量大、解吸性能好等特点。通过对影响吸附洗脱过程中各因素的 研究，得到了吸附过程优化工艺条件：a a m b e r l i t ex a d7 的吸附容量为2 4 9 0 u g ； b 吸附条件：色素酶解液的上柱液浓度为3 0 u g ，吸附流速为1 5 m l m i n ；c 洗脱 条件：用3 柱体积4 0 , 的乙醇。通过对最终产品的s o s - p a g e 凝胶电泳和紫外扫谱分 析，产品中已基本检测不到有致敏蛋白存在，且与标准品的质量接近 本论文研究结果对胭脂虫红色素的工业化放大实验以及该技术l 的推广利用 打下了一定的理论基础，起到一定的推动作用，可为同类研究提供一定的借鉴和 参考。 关键词：胭脂虫红色素提取纯化工艺 a b s t r a c t t h i ss u b j e c tu s ec o c h i n e a la sr a wm a t e r i a l ，r e dp i g m e n tc o m p o s i t i o no f t h es t u d y , o nt h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o ns y s t e m s - d e p t hs t u d ym a i nc o n t e n t si n c l u d e ： ( 1 ) t h i ss t u d yi st h ef i r s tr c 落 p o n s es n r f a o gm e t h o d ( r s m ) u s e di nt h ec o c h i n e a l p i g m e n te x t r a c t i o np r o c e s s t h r o u g hr s m ，t h eb e s tm e t h o do f e x t r a c f i o ni sf o u n d t h r o u g hr c s p o n s i n gs u r f a c em e t h o d o l o g ya n dr e g r e s s i o na n a l y s i s ，t h ed e s i r e d c o n d i t i o n sa r ec o n c l u d e d ：7 7 o ft h et e m p e r a t u r e , 5 0 o ft h ea l c o h o l c o n c e n t r a t i o n ，1 5h o u r so ft h et o t a le x t r a c i n gt i m e ，t h r i c e ，1 ：2 0o ft h er a t i oo f m a t e r i a lt oa l c o h 0 1 t h ep r e s e n tr e s u l t ss h o w i n gt h a tt h ee x t r a c t i o nr a t ew a g 1 7 6 2 , r e c o v e r yr a t ew a s9 8 8 0 ( 2 ) s e te n z y m a t i ch y d r o l y s i so f p r o t e i n sa st h e o r e t i c a lf o u n d a t i o n , s t u d i e dt h ep r o c e s s o p t i m i z a t i o nc o n d i t i o n so ft h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i so fp r o t e i ni nt h ec o c h i n e a l p i g m e n t se x t r a c t i o n ( 3 ) s t u d i e sn 址l c r o p o r o n s r e s i n c o n c e n t r a t i o n , p u r i f i c a t i o n c o c h i n e a l p i g m e n t c o n d i t i o n s s t u d ye l u t i o np r o c e s so ft h ef a c t o r sw h i c ha f f e c t i n gt h ea d s o r p t i o n , d e t e r m i n et h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fm a c r o p o r o n sr e s i np u r i f i c a t i o nc o c h i n e a l p i g m e n t u s i n g t h i sm e t h o d , g a i nh i g hp u r i t yc o c h i n e a lp i g m e n tp r o d u c t k e y w o r d s ：c o c h i n e a lp i g m e n t e x t r a c t i o n p u r i f i c a t i o nt e c h n o l o g y 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻 读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被 查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文 章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。， 学位论文作者签名：蕉盈指导教师签名：耋壁墨 2 0 0 7 年舂月1 0 日2 0 0 7 年务月1 0 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名：崔匆 ， 2 0 0 7 年6 月l o 目 第一章绪论 1 1 课题研究的意义和背景 色泽是食品感官( 色、香、味) 质量的第一标志。赋予食品美好的颜色可以 增进人的食欲，促使消化腺分泌大量消化液，帮助食物在胃肠道内消化和吸收的 更好，调节了人们的生活质量。由此可见，食用色素( f o o dc o l o r ) 嘲已经和 我们的生活紧密的联系在了一起。 食用色素按其来源可分为天然色素和合成色素两大类。1 9 世纪以前，由于人 类科学水平的限制，不存在合成色素，人们都是用天然色素着色，如我国古代就 利用茜草科植物和黄栀子等色素着色，公元1 0 世纪美洲的托儿铁克人与阿芝特克 人提制胭脂红也用于食品着色等嘲。1 8 5 6 年英国的w h 珀金斯( p e r k i n s ) 发明 了第一个有机合成色素一一苯胺紫( m a u v i n e ) ，揭开了人类合成色素应用的新 纪元“1 。由于合成色素具有色泽鲜艳、着色力强、稳定性好、无臭无味、易于溶 解和调色，成本低廉、使用方便等优点，几乎取代了天然色素在食品中的应用网。 但是，进入2 0 世纪后，随着医学毒理学和生物学试验研究的深入和提高，合成色 素作为食品添加剂的安全性问题已陆续受到了人们的广泛关注。已经证实，曾允 许使用的食用合成色素中不少品种对人体有毒害作用，长期和过量使用会危害人 类健康，甚至有致癌和致畸作用嘲，为此近些年以来各国都在限制合成色素的使 用，西方的一些发达国家在食品中使用天然色素的比例已达8 5 ，并有完全取代 合成色素的趋势，有的国家如挪威已完全禁止使用任何合成色素啪。我国目前允 许使用的合成色素有1 0 种，即：诱惑红、苋菜红、胭脂红、新红、柠檬黄、日落 黄、靛蓝、亮蓝、赤藓红、酸性红。其中前6 种都属于偶氮型化合物。据有关研 究认为，这类化合物在人体内代谢生成的b 一萘胺和a 一氨基萘酚，都是具有致癌 作用的物质，所以我国对这些食用合成色素的使用都有严格的范围和用量的限 制。从消费角度来看，人们对食用天然色素的信任度日渐提高，对食用合成色素 的疑虑日趋加大，这也为食用天然色素的研究与开发创造了较好的外部环境。 天然食用色素安全性高，色调柔和、自然，且不少具有较高的营养价值和 药理作用，有利于人类的健康。随着人们卫生保健意识的提高，崇尚自然的风气 日益增强，天然食用色素将更加受到人们的欢迎。因此，天然食用色素的开发和 应用已成为当代食品工业重要的研究课题。 近年，我国在天然食用色素的研究方面做了大量的工作，并取得了可喜的成 果。我国批准允许使用的天然食用色素共4 7 种( g b 2 7 6 0 1 9 9 6 ) ，具体品种有红曲 红、甜菜红、辣椒红、玉米黄、可可色素、高粱红、菊花黄、天然苋菜红等。现 在我国已经成为天然食用色素的品种和产量大国，并形成了一个初具规模的产业 化行业。2 0 0 3 年我国天然食用色素总产销量约为2 l 万吨，绝大部分产品用于国内， 其中约有1 7 个天然食用色素品种出口，出口金额约2 8 亿元叫。由于天然食用色 素的市场巨大，所以，研究其提取技术的意义重大。 胭脂虫红色素( c o c h i n e a lc o l o r ) ( 也称洋红酸、胭脂红) 是从生长在不同 地区、不同类型的仙人掌上的胭脂虫体内提取的一种天然色素，色调呈粉红至紫 红。在许多国家( 欧洲、美国、日本及中国) 都允许作食品添加剂使用，且许多 食品生产厂家和客户都认为它是品质优良的天然红色素。它是一种蒽醌类天然色 素，与其他天然色素不同，其理化性质非常稳定，是食品、化妆品、医药及纺织 品的优良着色剂，被视作最安全的天然色素而用于食品、化妆品、药品及纺织品 等生产。它是目前美国唯一允许用于眼部的有机色素，也是惟一一种f d a 允许 既可用于食品又可用于药品和化妆品的天然色素，是保持经久不衰的颜料之一， 在美国永久性列入食品、药品和化妆品目录，并在联邦法规编号部分免除证书洲 近一段时间来，因发现人工合成色素“苏丹红”等对人体健康的极大危害，世界 各国纷纷将含有苏丹红等人工合成色素的食品、化妆品等回收并加以销毁，对食 品加工业和化妆品生产业造成巨大损失。取代苏丹红等人工合成色素的最佳天然 色素是从胭脂虫中分离出的胭脂虫色素，其市场迅速增长。 胭脂虫红色素因来源非常有限，国际市场上一直供不应求，且价格高昂，资 料报道目前进口胭脂虫洋红的价格已高达1 0 0 元人民币克“”。最近的研究表明 胭脂虫红色素除了着色功能外，对防止因致癌物导致的d n a 损伤有明显的作用 “，并可用于病毒性疾病( 如水疱性口炎、疱疹性口炎等) 、癌症和爱滋病的防 治1 3 1 。 胭脂红广泛地用于食品、化妆品、药品等多种行业，因此早期饲养胭脂虫是 一种有利可图的行业。1 8 3 1 1 8 7 4 年间，加那利群岛的谷类田地、葡萄园几乎被 2 仙人掌种植园取代，以饲养胭脂虫。但是，后来由于人工化学合成的煤焦油类染 料( 色素) 的风行，其成本低廉，很快地占领了染料色素市场，胭脂虫业因而一 落千丈，迅速衰退。然而，近代因发现煤焦油染料对人类健康有害，有的甚至有 致癌作用，许多国家已明令禁止使用。事实上，化学合成的胭脂红色素与天然的 胭脂红只是颜色极近似，二者的化学成分则不同。例如，在我国食品业现仍允许 使用的合成胭脂红色素 又称丽春红4 r ，染料索引c i ( 1 9 7 1 ) 1 6 2 5 5 ，它在世界上 亦是应用最广泛、用量最大的一种化学合成色素，虽尚未发现有致癌作用，但高 剂量喂雌鼠已呈现明显不良效果，在美国已禁止在各行业使用“”。因而，目前世 界上天然胭脂红色素需求急增，价格日高，促使胭脂虫业再度兴起。 我国目前无胭脂虫及胭脂红色素的生产，每年需花大量外汇进口胭脂红以用 于制药及食品工业，而在我国西南部亚热带及温带地区，分布着大面积的干热河 谷，如金沙江、元江、澜沧江、怒江等流域的许多地区，生态环境十分脆弱，不 适于发展农业，但却适于栽培仙人掌。在这些地方推广种植仙人掌并饲养胭脂虫， 一方面可以绿化荒山、改善生态环境，另一方面能增加农民收入，一旦形成产业， 还将解决农村大量闲散劳动力问题。而大量种植仙人掌还可提供农村牲畜饲料来 源，一定程度上解决了因缺乏饲料而引起的过度放牧问题，从而维护现有生态环 境。因此，仙人掌和胭脂虫的推广和繁育具有重要的经济、生态和社会效益，对 促进干旱半干旱地区经济发展及生态环境建设具有重要意义及广阔发展前景“ 在色素领域这种大的发展趋势背景下，成都广润科技有限公司主要决策人看 到了开发从胭脂虫中提取胭天然脂红色素的意义和潜力，委托西北大学化工学院 对此课题进行前期研究和探索，经过近一年的努力，目前对此课题已完成了小试 工艺研究，取得了阶段性的成果。 1 2 天然色素的提取技术和工艺综述 1 2 1 溶剂提取法 用有机溶剂浸提，然后经过滤、减压浓缩、真空干燥精制等工艺过程得到最 终产品。根据色素的性质、所用原料的不同选择不同的溶剂，常用的溶剂有水、 酸碱溶液、有机溶液如乙醇、丙酮、烷烯烃、油脂类及二氧化碳等。文献报道“”， 乙醇是天然食用色素较优提取剂。此法工艺简单，设备投资少，提取操作方便， 对环境无污染，成本低，便于生产。但存在着浸提时间长、色泽变化较大等不足， 尽管如此，此法仍是提取过程经常采用的一种方法，例如用9 5 乙醇提取含水量 较少的红辣椒和郁金香，用无水乙醇作为提取剂提取于含水量较多的萝卜，用稀 酸水溶液提取紫色菜苔色素“”等。 1 2 2 冻结一融解法 7 冻结一融解法条件温和，操作温度不超过室温，对热敏性高的天然食用色素 破坏较少，是生物化学研究中常用的破碎微生物细胞壁的方法“”。当植物细胞壁 破裂后，胞内可溶物迅速溶出，很容易得到高浓度的色素溶液，与常规浸提相比， 由于避免了通过细胞壁传质的过程，浸提时间大为缩短。植物细胞壁破碎后，胞 内可溶物都会溶出，为了得到较纯的产品，乙醇提取仍是不可缺少的。如对栀子、 红蓝草、枫叶为原料3 种色素提取的结果表明，此工艺对提取水、醇兼溶的植物 色素具有较普遍的适用性“”，可推广于其它同类色素的工业化生产，甚至提取其 他非色素类的胞内物质也有作用。 1 2 3 超临界流体提取法 超临界流体提取是食品工业新兴的一项提取和分离技术，是利用液体在超临 界区域兼有气液两性( 即与气体相当的高渗透能力和低黏度及与液体相当的密度 和对物质优良的溶解力) 的特点和它对溶质溶解能力随压力和温度改变而在相当 宽的范围内变化这一特性而实现溶质溶解与分离的一项技术。利用这种超临界 流体可从多种液态或固态混合物中萃取出待分离的组分，一般采用c 如作为提取 剂。超临界c o ：提取技术是以液态c 晚为溶剂进行提取的，是一种不同于传统天然 食用色素提取的新工艺，其提取率与提取温度、提取压力、c 0 2 消耗量等因素有 关。此技术的主要特点是兼具传统溶剂提取法和蒸馏法的双重功能，尤其对热敏 性物质和不挥发性物质的分离更具特色。因此，超临界c 0 ：提取技术符合人们回 归自然的潮流，可以带动相关产业发展，带动我国化学溶剂法的技术改造，促进 行业发展，是一种从天然物质中提取、制备及分析样品的优良方法，例如人们成 功的将超临界c o , 技术用于对天然番茄红素的提取哪! 。但此法由于设备投资较大 等制约因素，尚处于推广起步阶段。 4 1 2 4 大孔树脂吸附法 吸附树脂是近1 0 年发展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂，它具有物理化 学稳定性高，吸附选择性强，不受无机物存在的影响，再生简便，解吸条件温和， 使用周期长，宜于构成闭路循环，节省费用等诸多优点，避免了用有机溶剂提取 分离造成的有机溶剂回收难、损耗大、成本高、易燃易爆、对环境污染严重等缺 点，现已广泛用于有机物浓缩、分离、制备与提纯等方面嘲。吸附树脂对物质的 吸附作用不仅同树脂的物理和化学性质有关，而且同吸附物质的性质、介质的性 质及操作方法等因素有关。此项技术多用于提取花青素类色素，它是将植物用酸 性溶液浸提后过滤，滤液用大孔吸附树脂吸附后再用合适的溶剂洗脱，将洗脱液 浓缩或喷雾干燥即得最终产品，如用a d 5 0 大网络吸附树脂提取精制紫叶小檗叶 红色素嘲等。 1 2 5 微波提取法 微波指频率在3 0 0 3 0 0 ，0 0 0 m h z 之间的电磁波，亦称超高频波。微波提取的 机制，一方面是微波辐照过程是微波射线自由透过透明的提取介质，到达生物材 料的内部维管束和腺胞系统。由于吸收微波能，物料内部温度突然升高，天然物 料的维管束和腺胞系统升温更快，保持此温度直至其内部压力超过细胞壁膨胀的 能力使细胞破裂。位于细胞内的有效成分从细胞壁周围自由流出，传递转移至提 取介质周围，在较低的温度下被提取介质捕获并溶解其中，过滤分离残渣，即得 提取物。另一方面，微波产生的电磁场加速被提取组分由物料内部向提取溶剂 界面的扩散速率。如物料中的水分子，由于微波能量发生器以每秒百万次变化的 正负极电荷中心发出高频幅射能，产生交变电场，在其作用下，水分子吸收电场 能，有转动的趋势，当交变电场频率足够高时，水分子高速转动成为激发态，而 激发态是一种高能量不稳定状态，或者水分子汽化，加强提取组分的驱动力，或 者水分子本身释放能量回到基态，所释放的能量传递给其它物质分子，加速其热 运动，缩短提取组分的分子由食品物料内部扩散到提取溶剂界面的时间，从而提 高提取速率。微波提取方法的优点是提取率高、准确、快速、操作成本低，减少 原料预处理费并对环境无害。微波射线穿透性极好，可施加于任何天然生物材料， 在接近环境温度下抽提所需的有效成分，对于热敏性成分的提取极为有效，而且 还可将其与超临界流体提取结合运用，解决微波提取中溶剂残留问题，这是现有 的各种提取法难以达到的。随着微波技术在工业中的普及，微波提取作为一种新 的顺应潮流的高新技术必将得到迅速发展。例如人们将微波提取法提取栀子黄色 素嘲，其提取率可达到9 8 2 。 1 2 6 酶法提取 对于一些被细胞壁包围不易提取的原料可用酶法提取嘲，如红花黄色素。 红花黄色素存在于红花管状花花瓣中，此部位植物材料的化学成分主要为纤维素 类物质，它们构成了红花黄色素由植物材料向提取介质扩散的屏障。应用纤维素 酶作用于红花管状花，使其细胞壁及细胞问质中的纤维素、半纤维素等物质降解， 使细胞壁及细胞问质结构发生局部疏松、膨胀、崩溃等变化，从而增大胞内有效 成分( 即红花黄色素) 向提取介质扩散的传质面积，减小传质阻力，从传质角度促 进红花黄色素提取率提高。此过程的实质是利用与非有效成分纤维素作用的酶解 反应强化有效成分的传质，从而提高了红花黄色素的提取率。 在纤维素酶制剂中，除了主要成分纤维素酶之外，还含有少量半纤维素酶、 果胶酶、蛋白酶等。由于植物材料中不仅含有纤维素，而且含有半纤维素、果胶、 蛋白质、木质素等物质，在提取过程中，纤维素酶制剂中的半纤维素酶、果胶酶、 蛋白酶等由于底物的存在也同时显示催化活性。因此，不同的纤维素酶制剂作用 于同一种植物材料时，有效成分提取率的高低不仅与制剂中纤维素酶的含量、活 性有关，也与酶制剂中半纤维素酶、果胶酶等的含量、活性有关。因此，应对不 同来源的纤维素酶进行筛选，以获得与植物材料匹配的、具有最大提取率的纤维 素酶。 1 2 7 超声波法 超声波作为一种新的应用技术，近年来广泛应用于天然植物的提取。其原理 是超声波可在液体中产生“空穴作用”，而“空穴作用”产生的冲击波和射流可 以破坏植物细胞和细胞膜结构，从而增加细胞内容物通过细胞膜的穿透能力，有 助于天然色素的释放与溶出。超声波使提取液不断震荡，有助于溶质扩散，同时 超声波的热效应使水温达n 5 7 ，对原料有水浴作用。因此，超声波法大大缩短 了提取时间，提高了有效成分的提出率和原料的利用率。如以水为介质，应用超 声波技术提取密蒙花黄色素嘲，黄色素提取率可达1 4 1 6 1 3 胭脂虫简介和胭脂虫红色素标准 1 3 1 胭脂虫简介 制备胭脂虫红色素的主要原料是胭脂虫，胭脂虫是泛指雌虫能生产胭脂红色 素的蚧虫，主要种类有明胭粉蚧( d a c t y l o p i u sc a c t ic o s t a ) 及苔粉蚧( d c o c c u sc o s t a ) 原产于墨西哥和中美洲，寄主为仙人掌类植物。胭脂虫为卵胎 生，世代重叠，生活史不整齐，根据气温不同，生长期从4 0 天到9 0 天不等。胭 蚧科种类很多，1 9 7 7 年，m a r i n 和c i s n o r o 对其雌雄两性的各发育阶段的形态特 征进行了描述( m a r i n c i s n o r o ，1 9 7 7 ) 嘲，1 9 9 2 年，p e r e z 和k o s z t a r a b 又对 其作了补充( p e r e z ，1 9 9 2 ) 瞄嘲。 饲养胭脂虫的寄主植物主要为茎节扁平的仙人掌，如印榕仙人掌( o p u n t i a f i c u s i n d i c a ) 和甜仙人掌( o p u n t i a c o c c i n e l l i f e r a ) ，饲养的虫种主要为苔 粉蚧。传统的胭脂虫饲养是在野外生长的仙人掌植株上露天放养的，每年可收3 4 次，但露天放养只能在雨量稀少、分布较均匀地区进行( 如加那利群岛，年 雨量2 0 0 4 0 0 m m ) 。为避免雨淋，8 0 年代中期人们开始搭棚饲养，并于9 0 年 代投入生产，搭棚饲养是把接种幼虫后的成熟仙人掌节片悬挂在棚内繁育，雌虫 约经3 个月( 夏季) 至5 个月( 冬季) 成熟，待雌虫成熟后收集并净化虫体。留下 一些雌虫繁殖后代，繁殖的幼虫则再次接种于新鲜的成熟仙人掌节片上饲养。此 法每9 0 舒棚可年产干雌虫约7 5 k g ，每公顷仙人掌的节片可供3 、4 个饲养棚饲 养m 1 。我国李志国等对从南美引进的胭脂虫开展了繁养试验嘲。 墨西哥人很早就利用野生胭脂虫提取胭脂虫红，并已饲养了数百年，十五世 纪西班牙人开始在本土及加那利群岛栽种仙人掌饲养胭脂虫，以提取胭脂虫红色 素嘲天然的胭脂虫红也称洋红酸( c 。她0 0 ，) ，属蒽醌类色素，色泽亮红鲜艳， 可进一步制备成洋红，广泛地用于食品、化妆品、药品等多种行业。1 9 8 7 年， 英国生物工业研究院对从胭脂虫体内提取得胭脂红色素进行了毒性检测，证明这 种天然的胭脂红色素无致癌性、致畸性等慢性毒性，对其以后三代亦无影响 ( d g r a n t ， i f g a u n t ， 1 9 8 7 ) 。 目前，原产地传统的胭脂虫饲养大多是在野外生长的仙人掌植株上露天放 养。露天放养有严格的地理区域与气候环境要求，尤其是降雨量，要求雨量稀少、 分布均匀。因此，至今胭脂虫及胭脂虫红酸9 0 以上出自秘鲁，据秘鲁农业研 7 究机构统计显示，1 9 9 9 年秘鲁向国际市场出口了8 0 0 吨胭脂虫( 包括胭脂虫 红) ，占世界胭脂虫及其加工产品总出口量的9 0 以上，其中，美国、法国、 西班牙和德国是秘鲁胭脂虫的主要进口国，其进口量占秘鲁胭脂虫出口量的6 0 以上 1 3 2 胭脂虫生化成分 ( 1 ) 各种营养成分 胭脂虫雌成虫的营养成分分析表明其主要组分是： 水分含量为：6 9 9 4 干物质含量：3 0 0 6 在干物质中粗蛋白占：4 3 9 8 粗脂肪占：6 4 粗灰分占：5 3 8 总糖占：7 0 4 5 人体所需要的微量元素也很丰富，含有：k 、n a 、c a 、f e 、z n 、m n 、c u 、p 、 m g 、c o 等十几种元素。 ( 2 ) 蛋白质和氨基酸 胭脂虫雌成虫蛋白质含量占总千物质的4 3 9 8 。含有1 9 种氨基酸( 详见 表1 1 ) 。其中含有成人所需8 种必需氨基酸( t h r 、v a l 、m e t 、i l e 、l e u 、p h e 、 l y s 、t y r 和儿童所必需的另外两种必需氨基酸( h i s 、a r g ) 。人体必需氨基酸总 量占总氨基酸量的5 1 3 4 。 表1 1 胭脂虫的各种氨基酸含量( m g g ) t a b l e1 1a m i a c i dc o n t e n to fd a c t y l o p i u sc o c c u sc o s t a ( m g g ) ( 3 ) 微量元素 微量元素仅占胭脂虫体重的0 0 1 ，但其重要性在于它参与了人体中3 3 7 0 酶组分，对人的健康起着重要作用。 经分析胭脂虫雌成虫体内含有l o 种微量元素。结果见表1 2 。其中以k 、p 、 m g 含量较为丰富，分别为8 1 3 0 0 1 l ig g 、6 3 3 3 3 3 | lg g 、2 5 8 9 0 0 | ig g 。 表1 2 胭脂虫雌成虫体内微量元素测定结果( pg g ) t a b l e l 2a n a i y s i so fm ir i o te l e m e n t so fd a c t y l o p i u sc o c c u sc o s t a ( p g g ) 1 3 3 胭脂虫红色素的性质与产品质量标准 ( 1 ) 胭脂虫红酸( c a r m i n i ca c i d ，c o c h i n e a le x t r a c t ) 法定编号：i n s1 2 0 ，e e c e1 2 0 ，c i 7 5 4 7 0 天然红4 号，c a s 1 3 9 0 6 5 4 、 1 2 6 0 1 7 9 c f r 7 3 1 0 0 ， 日本天然1 8 2 ：分子式：c 2 2 h 加。，分子量：4 9 2 3 9 。结构式见图1 1 。 图1 1胭脂虫红酸结构式 f i g1 1m o l e c u i a rs t r u c t u r eo fc a r m i n i ca c i d 胭脂虫红酸是由水、稀醇萃取胭脂虫后浓缩而得的红色粉末、块状、糊状或 液体，略有特殊臭味，p h 小于4 时为橙色，p h 为5 6 时为红色或紫红色，p h 大 于7 时为紫色，遇铁离子变成黑紫色，遇蛋白质变成红紫色或紫色。分解温度为 2 5 0 ，溶于水、醇，不溶于油脂。 9 f a o w h 0 ( 1 9 9 5 ) 质量标准：胭脂虫红酸 2 0 、残留溶剂1 5 0 r a g k g 、砷 ( 以a s 计) 3 o m g k g 、蛋白质2 0 、铅 o m g k g 、沙门氏杆菌试验阴 性。商品胭脂虫红酸中还可添加柠檬酸盐、磷酸盐等作稳定剂，添加乳糖等作稀 释剂。 ( 2 ) 胭脂虫红铝( c a r m i n e ) 法定编号：i n s1 2 0 ，e e c e1 2 0 ，c i 7 5 4 7 0 天然红4 号，c a s 1 3 9 0 6 5 4 】、 1 2 6 0 1 7 9 ，结构式见图1 2 ： 图1 2 胭脂虫红铝结构式 f i g1 2 _ o i e c u i a rs t r u o t u r oo fc a r m i l i e 胭脂虫红铝是由胭脂虫红酸与铝的含水鳌合物，可联接铵、钙、钾、钠中的 一种或多种阳离子，为有光泽的红色碎片或深红色粉末，溶于碱液，微溶于热水， 几乎不溶于冷水和稀酸。 f a 0 1 i o ( 1 9 9 5 ) 质量标准：胭脂虫红酸5 0 、干燥失重2 0 、砷( 以a s 计) 1 0 m g k g 、灰分1 2 、蛋白质2 5 、铅l o m g k g 、稀氨水不溶物1 0 、沙门氏杆菌试验阴性。可用于番茄调味酱、洋酒、草莓酱、饮料、香肠、 糕点、糖果、酸奶、布丁、冰激凌、风味奶粉等。 胭脂虫红色素中的非色素成分不仅影响色素品质( 如使终产品产生沉淀、出 现异味) ，而且还有可能影响人体健康，近年相继发现残留在色素产品的虫体蛋 白可能成为人体致敏原，使人体过敏，导致过敏性哮喘等疾病慨卅，文献报道致敏 虫体蛋白的分子量为1 7 5 0 k d a e m 。为此必须寻找到一种提取一分离一纯化的工艺 路线，以除去产品中的致敏杂蛋白及异味，达到提高胭脂虫红色素的质量，增加 其市场份额。 1 0 5 0 d 1 4 课题研究的主要内容 根据文献综述、委托企业要求以及本课题组长期的相关经验，确定本研究的 主要内容和实验思路如下： ( 1 ) 进行提取工艺路线的的筛选，在单因素试验基础上，通过响应面分析确 定小试提取过程优化的工艺条件。 ( 2 ) 通过酶解实验完善水解虫体蛋白工艺，确定小试酶水解过程优化的工艺 条件。 ( 3 ) 通过上柱纯化实验确定色素酶水解液上柱过程优化的工艺条件。 第二章胭脂红色素的提取工艺过程研究 本章首先进行了提取工艺路线的筛选研究，然后在单因素实验基础上，通过 响应面法优化胭脂红色素的提取工艺过程。 2 1 实验试剂和仪器 表2 ，试验试剂 t a b1 1 p r i m a r yr e a g e n t sf o rt h ee x p e r i m e n t 表2 2主要试验仪器及设备 t a b 4 2p ri m a r ya p p a r a t u sf o rt h ee x p e ri m e n t 2 2 色素含量的测定 紫外分光光度法呻既能进行定性又能进行定量测定。它是根据物质对紫外区 域的光或可见光的选择吸收性，利用最大吸收波长及吸收峰的形状进行物质定 性、定量分析的一种方法1 。物质分子对可见光或紫外光的选择性吸收在一定的 实验条件下符合l a m b e r t - - b e e r 定律，即溶液中的吸光分子吸收一定波长光的吸 光度与溶液中该吸光分子的浓度c 的关系为 ， a = l g 挚= 妇 j 式中彳为吸光度，彤为摩尔吸收系数( 与入射光的波长、吸光物质的性质、 温度等有关) ，b 为样品溶液的厚度，c 为溶液中待测物质的浓度。根据彳与c 的线性关系，通过测定标准溶液和试样溶液的吸光度，用图解法或计算法，可求 得试样中待测物质的浓度。以下为具体的操作步骤： 2 2 1 标准曲线的制作 ( 1 ) 标准溶液的配制用t g - - 3 2 8 a 分析天平精确称取标准品1 0 0 0 m g ， 置于5 0 m l 容量瓶中，加入适量蒸馏水，在水浴上加热溶解，自然冷却，稀释至 刻度，摇匀。 ( 2 ) 标准曲线的制作取l o m l 容量瓶6 只，分别用移液管准确吸取标准溶 液l m l 、2 m l 、3 m l 、4 m l 、5 m l 置于1 0 m l 容量瓶中，另一容量瓶中不加标准溶液( 配 制空白溶液，作参比) ，用水稀释到l o m l ，放置2 0 r a i n 。在紫外可见分光光度仪 上，先取两个2 e m 比色皿加空白溶液，调零。取出一个比色皿，分别加入不同浓 度的溶液，在波长5 9 4 n m 处测定吸光度，结果见表2 3 。 以色素浓度( c ) 为横坐标，吸光度( a b s ) 为纵坐标，绘制标准曲线，得到回 归方程：c = o 1 1 9 8 a - 0 0 0 0 5 3 9 ，相关系数r = o 9 9 9 7 ，表明该方程可以作为吸光 度与浓度间换算的公式来使用。结果见图2 1 。 表2 3 色素浓度( 西与吸光度的对应关系 t a b l e2 3t h ec o r r e s p o n d i n gr e l a t i o nb e t w e e n t h ec o n c e n c r a t i 0 1 1a n da b s o r b a n c eo fc o c h i n e a ic o i o r ( 3 ) 未知液中胭脂红色素含量的测定由标准曲线可知，当浓度在 o o 1 0 0 | n l 咖l o o s o o m g m l 的范围内时，红色素浓度c 与吸光度a b s 呈线性关 系。因此，可以通过测量未知液的吸光度，然后参照标准曲线求出未知液的色素 含量。 由于样品中的红色素含量未知，故需要经过多步稀释才能进入已知的线性浓 度范围，待稀释完成后，吸取2 m l 未知液代替标准溶液，其它步骤均同上 图2 胭脂虫红色素标准工作曲线 f i g2 i t h ea t a n d a r dw o r m n gc u r v eo fc o c h i n e a ic o l o r 2 2 2 色素含量的测定 本实验经查阅文献资料嘲及紫外最大吸收峰扫描，确定标样及试样的最大 吸收波长都在4 9 4 n m 处。准确称量一定量的色素标准品，按照标准曲线制作方法 得到其在最大吸收峰处的标准曲线，建立回归方程，在最大吸收波长处测定色素 提取液的吸光值，再根据回归方程计算出其中胭脂红色素的含量。 胭脂红色素提取率= ( 提取液中红色素总量所用胭脂虫质量) x1 0 0 。 2 3 胭脂红色素提取工艺流程 胭脂虫红色素提取工艺原则流程图如图2 2 所示： r 。1r o _ _ _ _ - _ o _ _ ，_ _ _ _ _ - ， 麟虫干俸一i 蒜鬟卜叫i 旋蒸i 叫i 牧嘉b 攫取液o_o 图2 2 溶剂提取法原则工艺流程图 f i g2 2t h et e c h n o i o g yp r o c e s so fs o i v e n te x t r a c t i o n 1 4 研究思路和操作步骤： ( 1 ) 胭脂红色素提取准确称量0 5 0 0 0 9 的胭脂虫干体，置于带有温度 计、回流冷凝管的三口烧瓶中，进行提取方法和溶剂筛选试验，步骤如下： 分别采用室温冷浸和加热搅拌回流两种提取方法，以甲醇、乙醇水溶液为溶 剂进行分别提取，以提取液中的胭脂红色素含量为评价指标，综合评定不同的提 取方法、不同的溶剂组合提取效果，确定理想的提取方法和性能良好的溶剂。 ( 2 ) 单因素试验优化的工艺路线确定后，首先进行单因素实验。试验 中选取温度、溶剂浓度、提取时间、液料比、提取次数5 个可能影响提取效果的 因素进行实验，以确定相关因素及各因素的合适范围。 ( 3 ) 响应面实验根据单因素试验结果，选择对胭脂红色素提取效果有 显著影响的因素，采用响应面设计实验，运用根据b o x - b e n h n k e n 的中心组合实验 设计原理，做响应面分析实验。 2 4 试验结果与分析 2 4 1 提取方法和溶剂筛选试验 在选定条件下，以甲醇、乙醇水溶液为提取剂，分别采用室温冷浸和搅拌回 流法对胭脂红色素进行提取，数据如表2 4 。由表可以看出，无论是选用冷浸法 或回流法，甲醇的提取效果均稍优于乙醇，但甲醇成本高、毒性大，故选用含水 乙醇作为提取剂。由表2 4 还可以看出，室温冷浸的效果远不如搅拌回流法，因 此以下实验均采用搅拌回流法提取。 表2 4 提取溶剂和提取方法的比较 t a b i e2 4t h ec o l l l p a r i s o l lo fe x a t r a c t i o ne f f e c t o fs oiv e n t sa n dm e t h o d s 提取方法提取液吸光度 6 5 甲醇室温冷浸 6 5 甲醇搅拌回流提取 6 5 乙醇室温冷浸 6 5 乙醇搅拌回流提取 0 1 8 2 0 5 8 6 0 1 5 7 0 5 6 9 2 4 2 单因素试验 ( 1 ) 温度对提取效果的影响 图2 3 是0 5 0 0 0 9 干胭脂虫力, 1 0 m l 6 5 乙醇， 液料比2 0 ：l ，提取次数3 次，分别在5 5 、6 5 、7 5 、8 5 下回流提取1 h 的结果。由图2 3 - 以看出，随着温度的升高，胭脂红色素的提取率显著增加， 但在7 5 后反有下降趋势，其原因为胭脂红酸置于8 0 环境下l h 以上，其结构将 遭到破坏“”。因此提取温度以不高于8 5 为宜。 图2 3 提取温度对提取效果的影响 f i 9 2 3t h ee f f e c to ft e m p e r a t u r eo nt h ee x t r a c t i o n ( 2 ) 乙醇浓度对提取效果的影响其它条件不变，采用不同浓度的乙醇于 6 5 下回流提取1 h ，结果见图2 4 。由图2 4 可见，乙醇浓度在5 5 6 5 时提取效 率较高，乙醇浓度继续提高时，提取效率有所下降，这是因为胭脂虫红酸在稀醇 中有较高的溶解度所致，考虑到高醇浓度可促使致敏源虫体蛋白变性，为后面的 除蛋白工序作准备，应尽可能采用高浓度乙醇，以提高产品品质。 图2 4 乙醇浓度对提取效果的影响 f ；9 2 4t h ee f f e c to fe t h a n o lc o n c e n t r e t i o no r t h ee x t r a c t i o n 1 6 ( 3 ) 提取时间对提取效果的影响其它条件不变，提取时间从0 5 2 o h ， 其对提取效果的影响见图2 5 ，由图2 5 结果可知，在一定的时间范围内，胭脂红 色素的提取率随提取时间的延长，而不断增加，提取率在1 5 h 前增加较明显， 以后趋于平缓，为缩短工时减少能耗，选择提取时间范围为0 5 1 5 h 。 图2 5提取时间对提取效果的影响 f i 9 2 5t h ee f f e c to ft i m ao l lt h ee x t r a c t i o n ( 4 ) 液料比对提取效果的影响采用6 5 乙醇，在6 5 下每次提取1 h ，共提 取3 次，采用不同的液料比，结果见如图2 6 。由图2 6 - t 知，在液料比从1 0 ：1 增 加至2 0 ：l 时，提取率增加明显，此后随液料比继续上升，提取效果增加不大，而 且增加溶剂量反而会增加非色素成分的浸出和增加生产成本。由此确定液料比为 2 0 ：1 为宜。 图2 6液料比对提取效果的影响 f i 9 2 6t h ee f f e c to fr a t i oo f ii q u i dv 8 m a t e r i a io nt h ee x t r a c t i o l l ( 5 ) 提取次数对提取效果的影响固定其他条件，改变提取次数，发现提取 3 次即可基本提取完全，继续增加提取次数，提取效率增加不明显，且增大了溶 剂消耗，延长了生产时间，造成生产成本的增加，故提取次数定为3 次。 1 7 图2 7 提取次数对提取效果的影响 f i 9 2 7t h ee f f e c t o fe x t r a c t i o nt i m e so nt h ee x t r a c t i o n 从单因素实验可以得出结论：提取温度应选在6 5 8 5 之间，乙醇浓度应选 在2 5 6 5 之间，选择提取时间范围为0 5 1 5 h ，因液料比和提取次数对提 取结果影响较小，根据单因素实验结果确定液料比为2 0 ：1 为宜，提取次数定为3 次。 2 4 3 响应面实验 数理统计方法( 线性回归分析和正交试验设计) 在工农业生产和科学研究 中有着广泛的应用。但它们都存在着一些缺点：线性回归分析虽然可以利用实验 数据得出因素与指标( 即响应值) 之间的回归方程，但要求数据量较大，耗时耗 资，且只是讨论一种因素的影响，无法综合考虑几种因素的综合作用。正交试验 设计则注重如何科学合理地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因素水平 组合，但它不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表 达式，即回归方程，从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。 因此，人们期望找到一种试验次数少、周期短，求得的回归方程精度高、能研究 几种因素间交互作用的回归分析方法，响应面分析方法在很大程度上满足了这些 要求鲫。 响应面分析方法( r e s p