（化学工程专业论文）大豆异黄酮萃取的实验研究.pdf

中文摘要 本文主要研究溶剂萃取法对大豆中的活性物质一大豆异黄酮的提取过程，同 时初步讨论了超临界c 0 2 萃取的实验方案。 首先建立了高效液相色谱对大豆异黄酮的分析方法。选用美国w a t e r s 公司 1 5 2 5 系列高效液相色谱，色谱条件为：分离柱：“b o n d a p a h 牌c 1 8 反相柱( 1 0 肛， 4 6 x 3 0 0 m m ) ；进样量：标准品分别为5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 c 叭，试样为1 0 i - t l ；流 动相：甲醇：0 3 h 3 p 0 4 = l ：1 ；流速：0 7 m l m i n ；柱温：室温；分析时间：4 5 分钟； 检测波长：2 5 4 n m 。以脱脂豆粕为原料，乙醇为溶剂，针对溶剂浓度、提取温度、 提取时间和液固比四个因素展开了单因素实验，分析了各因素的改变对异黄酮溶 出量的影响；进行了上述因素的正交实验，结果表明以脱脂豆粕为原料的溶剂萃 取大豆异黄酮的最佳工艺条件为：提取温度7 0 ，料液比为1 ：2 0 ，浸提时间为6 小时，乙醇浓度为8 0 ，提取率可达0 2 。验证了有关溶剂萃取法提取大豆异黄 酮的动力学方程的可靠性，依据本文溶剂萃取实验数据对该方程进行了重新关联， 并对随萃取时间增长大豆异黄酮分解这一现象的预测进行了探讨。 超临界流体c 0 2 萃取大豆异黄酮的操作压力为3 0 - - 6 0 m p a ，结果表明，随着 压力的升高，溶出量增加，但超临界提取的萃取率要低于溶剂萃取。 关键词：大豆异黄酮溶剂萃取超临界萃取动力学方程 i i i a b s t r a c t t h ee x t r a c t i o np r o c e d u r eo fa l la c t i v es u b s t a n c ei ns o y b e a n i s o f l a v o n cb ys o l v e n t e x t r a c t i o nw a ss t u d i e di nt h ep r e s e n tt h e w s t h ee x 仃a c t i o ne x p e r i m e n tv i as u p e r c r i t i c a l c a r b o nd i o x i d ew a se l e m e n t a r i l yd i s c u s s e da sw e l l ， t h em e t h o do fa 1 1 a l y z i n gt h ec o n t e n to fs o y b e a ni s o f l a v o n eb yh i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) h a db e e ne s t a b l i s h e dw i t ha m e r i c a nw a t e r s 1 5 2 5 s e r i e sh p l c c h r o m a t o g r a p h yc o n d i t i o n sw e r ea sl ib o n d a p a hc i sr e v e r s e d - p h a s e c h r o m a t o g r a p h i cc o l o u m n ( 1 0 1 1m p a r t i c l es i z e ，3 0 0 m i n x 4 6 r a m ) i n j e c t i o na m o u n t so f s t a n d a r ds a m p l ew e r e5 ，1 0 ，1 5 ，2 0 ，2 5 ，3 0 1 1l ，w h i l ee x p e r i m e n t a ls a m p l ew a s1 0pl m o b i l ep h a s ew a sm e t h a n o l ：0 3 p h o s p h o r i ca c i d = l ：1 f l o w r a t e w a s 0 7 m l m i n c o l u m nt e m p e r a t u r ew a sr o o mt e m p e r a t u r e a n a l y z e dt i m ew a s4 5 r a i na n d d e t e c t i o nw a v e l e n g t hw a s2 5 41 1 1 1 1 w i t hs e l e c t i n gd e f a t t e ds o y b e a nc a k ea sr a wm a t e r i a l a n de t h a n o la ss o l v e n t , s i n g l ee l e m e n te f f e c tt e s tw a sc o n d u c t e du n d e rf o u rf a c t o r s ， n a m e l y , c o n t e n to fe t h a n o l ，s o a k i n gt e m p e r a t u r e ，s o a k i n gt i m ea n dl i q u i d - t o s o l i dr a t i o a tt h es 锄et i m e t h ei n f l u e n c eo ft h e s ef a c t o r st ot h ea m o u n to fs o l u t ew a sa n a l y z e d n e x t , t h eo a h o g o n a l t e s tw a sc o n d u c t e da n dt h eo p t i m a lc o n d i t i o nw a sf o u n da ss o a k i n g t e m p e r a t u r e7 0 c ，l i q u i d - t o - s o l i dr a t i ol ：2 0 ，s o a k i n gt i m e6 h , c o n t e n to fe t h a n o l8 0 a n dt h ee x t r a c t i o nr a t e0 2 a so n ep a r to ft h et h e s i s t h ek i n e t i ce q u a t i o no f i s o f l a v o n es o l v e n te x t r a c t i o nw a sv a l i d a t e db ya n a l y z i n go t h e r s d a t a , a n da c c o r d i n gt o t h et e s tr e s u l t si nt h ep r e s e n tw o r k a n dt h ek i n e t i cm o d e le q u a t i o nw a sc o r r e l a t e d i n t h i sp a r t , t h ep h e n o m e n o no fi s o f l a v o n ed e c o m p o s i t i o na st i m eg o i n go nw a sd i s c u s s e d c o n s e q u e n t l y s u p e r c r i t i c a lc a r b o nd i o x i d ee x t r a c t i o nf o ri s o l a t i n gt h ei s o f l a v o n ew a sc o n d u c t e da t t h ep r e s s u r ev a r i e df r o m3 0 m p at o6 0 m p a i tw a sf o u n dt h a tw i t ht h ep r e s s u r e i n c r c a s i n g ，t h es o l u t ei n c r e a s e d ，b u tt h ee x t r a c t i o nr a t ew a sl o w e rt h a nt h a to fs o l v e n t e x t r a c t i o n k e yw o r d s zs o y b e a ni s o f l a v o n es o l v e n te x t r a c t i o n s u p e r c r i t i c a le x t r a c t i o n k i n e t i ce q u a t i o n i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研 究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外。论文中不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果，也不包含为获得鑫鲞盘茎或其他教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：l 签字目期： 2 以年z 月加日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫鲞盘生有关保留、使用学位论文的规定。 特授权叁鲞盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 艰霖导师签名：乏昂孑j 习 签字日期：2 年z 月知日签字日期：乙。多年乙月己日 前言 刖青 大豆是我国一种传统食品，含有大量的生物活性物质，包括低聚糖类、磷脂、 维生素类、异黄酮、大豆皂甙类等。随着对大豆功能型成分的研究不断深入，大 豆的综合开发利用也越来越受到世界各国的关注1 9 9 4 年，我国“国家食物与营养 咨询委员会”向国务院及有关部委提出了关于我国城乡实施“大豆行动计划”的建 议，得到国务院及有关部委的大力支持。另外，流行病学调查发现长期食用大豆 的东南亚人群中，癌症、心血管疾病的发生率明显低于西方。大豆和豆制品具有 广泛的生物特性，如防治癌症、降低血脂、抗动脉粥样硬化症、改善更年期妇女 综合症、防治鼻出血综合症等，研究表明这些功效均与其含有的活性物质异黄酮 o s o f l a v o n e ) 密切有关。自1 9 3 1 年对大豆异黄酮的报道，特别是上世纪八十年代发 现异黄酮的许多生理活性以来，许多国家的科学家对异黄酮进行了广泛和深入的 研究。 近几年，制取富含大豆异黄酮制品或异黄酮纯品的专利技术不断问世。总结 开发之中的大豆异黄酮素材，以大豆胚芽( 胚轴) ，特别是富含异黄酮配基形式的大 豆蛋白制取的专利技术为多，高纯度大豆异黄酮素材开发的专利技术相对较少， 高纯度大豆异黄酮素材以实验室制取为主，国外一般是将大豆片或脱脂大豆片经 水、醇等溶剂浸出溶出液，加热、分离溶出液得异黄酮粗品，再经色谱法或其他 方法精制而成；或者将溶出液经超滤膜等分离，透过液冷却、结晶化，再经离心 分离或过滤得异黄酮结晶物；或者用树脂吸附，再用水洗净树脂，经水、醇溶剂 溶出一定浓度的异黄酮，真空干燥得制品。工业生产高纯度大豆异黄酮的报道很 少，且大多数处于研究状态。据近期外国专利介绍，主要有溶剂萃取法、柱层析 法、碱提取酸沉淀法、活性碳吸附法、离子交换树脂法等方法提取大豆异黄酮， 采用溶剂萃取法与吸附树脂相结合，不仅可获得高纯度大豆异黄酮，还可以获得 大豆皂苷，蛋白质及水溶性多糖，还适用于采用高于蛋白质等电点的弱碱性水溶 液提取工艺。 目前我国对大豆的研究开发主要集中在较小范围内的豆制品方面，如加工成 豆粉、豆奶粉、豆腐及一些发酵豆制品。在生产的过程中，异黄酮的损失量相当 大，有的损失高达5 0 以上，并且这些产品中异黄酮总量太少，难以满足人体需 要。尽管我国学者已经开始注意到大豆异黄酮产品研究开发的重要性。但总的说 来，开始层次低，异黄酮含量低，提取精制技术落后。现在我国大约有十余家进 行大豆异黄酮生产的厂家，但极少有特色产品推向市场，主要向日本、美国、及 欧洲出口低含量的大豆异黄酮粗品。而国外，尤其是日本已开发出一系列浓度的 大豆异黄酮粗品。尤以最近研究出的“富士黄酮”大豆异黄酮系列制品为代表。该产 前言 品具有独特的优点：水溶性高、热稳定性高，无苦涩味，已广泛应用于药品、保 健品、食品及饮料行业美国的a m d 公司于2 0 0 0 年在美国率先推出了含量4 0 的大豆异黄酮制品。在2 0 0 1 年美国植物制剂销售市场上，大豆异黄酮类产品的销 售排名第九。据专家预测，在以后几年，其销售排名将更靠前，对一个新产品来 说，上市刚一年，就进入销售额前十名，这在美国植物制剂销售市场是相当少见 的。经调查，市场对大豆异黄酮的年需求量在1 5 0 0 t ，而目前的年产量为5 0 0 t ，高 纯度大豆异黄酮市场销售价格相当昂贵，据报道，纯度为9 8 的大豆异黄酮在美 国的售价曾一度高达1 3 9 美元，毫克。因此，大豆异黄酮的研究和开发具有很大的 市场潜力。我国是大豆的故乡，有数千年的食用史，并具有丰富、低廉的大豆原 料，随着对大豆异黄酮功能型和营养型的深入研究，随着提取及精制工艺的不断 完善，大豆异黄酮将在医药、保健品、食品、饮料及其他行业得到越来越广泛的 应用。 近年研究发现大豆具有很多特殊的生理活性，而这些功效均与其含有的活性 物质异黄酮密切相关。自然界中异黄酮资源十分有限，大豆是唯一含有异黄酮且 含量在营养学上有意义的食物资源。我国大豆资源非常丰富，但目前主要作为生 产豆制品的原料，如榨油等，直接作为食品或者经简单粗略的加工后作为传统的 食品供人们食用。以大豆异黄酮为食品添加剂的食品制品和本身含有大豆异黄酮 的保健食品在国际市场上越来越普遍。大豆异黄酮在保健食品、功能型食品添加 剂及生物制药等领域有着非常开阔的应用前景。大豆异黄酮所具有的药理作用显 示了它具有很大的开发价值，如能充分利用大豆中的活性成分，提高其附加值， 一定能取得良好的经济效益和社会效益。 本文旨在以脱脂豆粕为原料，对其中的总异黄酮的提取和纯化工艺条件进行 研究，通过单因素实验和正交实验确定最佳提取参数，考察各参数变化对提取结 果的影响；同时对超临界c 0 2 法萃取大豆异黄酮的实验装置进行选型、安装、调 试，并讨论了压力对萃取结果的影响。根据异黄酮的提取数据对中药提取的动力 学方程进行了拟合和修正。 2 第一章文献综述 第一章文献综述 大豆，又名黄豆，是豆科植物大豆的种子，是许多国家和地区的主要食品之 一近年来的研究表明，大豆和豆制品具有许多生理活性，如防癌和降血脂等， 这些功效与其中含有的生物活性成分异黄酮( i s o f l a v o n e ) 有关。自1 9 31 年对大豆异 黄酮的报道，特别是上世纪八十年代发现异黄酮许多生理活性以来，许多国家的 科学家对异黄酮进行了广泛和深入的研究。 1 1 大豆异黄酮的结构、命名与分布 异黄酮是一类类黄酮化合物，呈无色透明结晶状物，是植物生长过程中的一 类次生代谢产物【i - 2 。目前发现的大豆中异黄酮共有1 2 种，分为游离型的甙元 ( a g l y c o n ) 和结合型的糖甙( g l u c o s i d e s ) 两类，甙元占总量的2 一3 ，包括染料木 素( o e ) 、大豆黄素( d e ) 和黄豆黄素( g 1 y ) 。糖苷占总量的9 7 - - 9 8 ，主要以染料 木苷( g ) 和大豆黄苷( d ) 及丙二酰染料黄苷( 6 ”- - o - - m a l o n y l g e n i s t i n ) 和丙二酰大豆黄 苷( 6 ”- - o - - m a l o n y l d a i d z i n ) 形式存在，约占总量的9 5 3 1 。它们的分子结构骨架是 3 一苯基色元酮。具体结构式如下图： 图1 1 大豆异黄酮的骨架结构式 f i g1 - lm o l e c u l a rs r u c t u r eo f i s o f l a v o n e s 根据骨架上r l 、r 2 、r 3 、的不同。可以分为d 、g 、g l y 三个家族，各家族 又分别包括四种物质1 4 】。具体结构及名称见表1 1 ： 第一章文献综述 表1 1 大豆异黄酮的分类及命名 t a b i e1 - 2c l a s s i f l c a t i a n dn o m i n a t i o no f i s o f l a v o n e s 表1 - 2 大豆各部位异黄酮含量( 腭g ) 【6 】 t a b l e1 - 2i s o f l a v o n e sc o n t e n t si ns o y b e a n 异黄酮主要分布在豆类植物中，尤以大豆中含量较高，广泛分布在种皮、胚 轴、子叶内，胚轴中含量较高，约为整个大豆含量的5 倍，而在种皮中的含量则 较少嘲表1 2 即为大豆各部位所含异黄酮的量。 4 第一章文献综述 表1 - 3 大豆种子中异黄酮的分布川 t a b l e1 - 3c o n t e n t so f d i f f e r e n tk i n d so f i s o f l a v o n e si ns o y b e a n 由表1 - 3 可见，相同重量的胚轴同子叶相比，前者异黄酮的含量约为后者的 5 - 6 倍，但由于子叶占大豆子粒重量的9 5 以上，所以子叶中异黄酮的绝对量远远 高于胚轴。 表1 - 4 中国大豆品种与日本大豆品种的异黄酮含量的比较单位：p g g i s t a b l e1 - 4c o m p a r i s o no f i s o f l a v o n ec o n t e n t sa b o u tc h i n e s es o y b e a na n dj a p a n e s es o y b e a n + 美国品种 不同的大豆中异黄酮含量以及存在形式各不相同，这种差异不仅与大豆品种 基因型有关，而且也受到生长环境、生长期、分离提取方法的影响。通常，光照 和水分对大豆中异黄酮的积累有促进作用；而高温可以显著降低异黄酮的含量。 因此光照时间越长、水分越充足的地区生长的大豆中异黄酮含量越高。大豆种子 发育过程中异黄酮含量也有变化，随着种子的发育异黄酮的含量稳步增加。 第一章文献综述 1 2 大豆异黄酮性质 1 2 1 物理性质 1 2 1 1 颜色与味道 异黄酮类化合物与其他黄酮类化合物相比由于a 、b 、c 环共轭程度与黄酮类 相比较小，故颜色较浅，一般为淡黄色或灰白色粉末，具有苦味、收敛性及干涩 感觉1 9 l 。 1 2 1 2 旋光性及荧光 异黄酮的甙元不具有旋光性，但由于糖苷中引入了葡萄糖基，因而具有旋光 性。大豆异黄酮在紫外荧光下不明显，但与某些金属离子形成络合物后荧光有所 加耐1 0 1 。 1 2 1 3 溶解性 大豆异黄酮的甙元一般难溶于水或不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、 乙醚等有机溶剂及稀碱中，大豆异黄酮的结合式糖苷易溶于甲醇、乙醇、毗啶、 乙酸乙酯及稀碱液中，难溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚等有机溶剂，对水溶解度 增强，可溶于热水【1 1 】。 1 2 1 4 酸碱性 由于异黄酮分子中有酚羟基，故其显弱酸性，可溶于碱性水溶液及吡啶中由 于染料木黄酮比大豆苷元多一个酚羟基，因此酸性更强。 1 2 1 5 紫外吸收特性 黄酮类化合物典型的光谱图上一般有两个吸收带，2 4 0 - - 2 8 5 n m ( 带i i ) 和3 0 0 - - 5 0 0 r i m ( 带i ) 。带i 与b 环肉桂酰系统的吸收有关，带i i 与a 环苯甲酰系统的 吸收有关由于大豆异黄酮的a 环与b 环几乎不共轭，因此其紫外光谱的共同特 征为强的带i i 吸收，而带i 则以带i i 的肩峰或低强度吸收峰出现【1 2 1 。 6 第一章文献综述 1 2 2 化学性质 1 2 2 1 显色反应 大豆异黄酮的颜色反应多与分子中的酚羟基及t 一毗喃酮环有关【1 3 1 。 ( 1 ) 钠汞齐还原反应向含有大豆异黄酮乙醇溶液中加入钠汞齐试剂，放置4 小时后过滤，滤液用1 m o l l 的盐酸酸化，溶液显红色。 ( 2 ) 锆盐一枸橼酸显色反应，加入2 二氯氧锆( z r o c h ) 的甲醇溶液到样品的甲 醇溶液中，染料木黄酮及染料木苷( 因有5 0 h ) 出现黄色，再加入2 枸橼酸的甲 醇溶液，黄色减退，加水稀释后转为无色。 ( 3 ) 硫酸一茴香醛显色将大豆异黄酮溶液加入到硫酸一茴香醛溶液中，染料 木苷显深褐色，大豆苷显深蓝色，染料木黄酮显桔黄色，大豆苷元不显色。 ( 4 ) 醋酸镁显色反应大豆或其制品的乙醇溶液加1 醋酸镁甲醇溶液，通过纸 斑反应后，异黄酮类化合物呈褐色，且紫外下产生荧光。 1 2 2 2 降解反应 丙二酰基大豆异黄酮在光照或加热条件下易脱羧转变为乙酰基大豆异黄酮， 因其不稳定，容易继续脱乙酰基转变为大豆异黄酮糖苷。大豆异黄酮糖苷在酸、 碱或酶的作用下，可脱糖基转变为大豆异黄酮的苷元。 1 2 2 3 还原性 还原性是酚类化合物的共性之一。大豆异黄酮分子中的多个酚羟基可以作为 氢供体，使其具有还原性。如染料木黄酮5 ，7 ，4 一三羟基异黄酮，其7 一位羟基 上的氧原子同时受到a 环大冗键的p 一兀共轭效应和其对位吸电子基团的诱导效 应，使得氧原子上的电子云向大丌键方向移动，对氢原子的吸引力相对较弱，因 此该酚羟基上的氢原子易与氧原子脱离而形成氢离子，发挥其还原作用。 1 3 大豆异黄酮的加工特性 不同的加工工艺对大豆产品中异黄酮的含量以及存在形式影响显著。在大豆 加工中，由于异黄酮的流失程度不同，大豆产品中各种异黄酮所占比例与未加工 的大豆有所不同。例如：在浸泡中大豆异黄酮损失为1 2 ，热加工为4 9 ，豆腐 制作为4 4 ，大豆蛋白分离提取为5 3 。浸泡和加热使丙二酰异黄酮苷减少而相 应的乙酰异黄酮苷增加，游离苷元增加【1 4 1 。发酵和碱提取也可以使游离苷元增加。 用0 2 5 n a h c 0 3 溶液煮沸豆粉3 0 分钟可以显著减少游离苷元的产生。 7 第一章文献综述 在大豆加工中，加工工艺对大豆异黄酮的含量和组成有很大的影响。大豆浓 缩蛋白、分离蛋白、豆乳、豆粉、豆腐以及豆腐皮中的大豆异黄酮与天然大豆中 的异黄酮结构类似，主要以糖苷的形式存在，苷元的含量均在2 0 以下；由于异 黄酮糖苷具有较高的极性，在非极性的豆油以及豆油浸出剂中溶解度低，豆油中 基本上没有异黄酮存在；浓缩大豆蛋白中异黄酮的含量与生产时使用的溶剂有关， 醇法生产的浓缩蛋白异黄酮含量低；在发酵的豆制品如多种豆酱、腐乳、豆豉、 天培( 印尼发酵豆制品) 中，总异黄酮含量虽然不高，平均含量为o 6 一1 4 m g g ， 酱油中含量极低，但是在这些发酵制品中苷元是异黄酮的主要存在形式，苷元均 占异黄酮总量的4 0 以上，有的甚至达到1 0 0 ，这种现象是由于微生物的发酵 使得大部分异黄酮糖苷分解并转化为苷元的缘故【”6 1 。因此，发酵豆制品中大豆 异黄酮比未发酵豆制品有更高的生物利用率。 1 4 大豆异黄酮的生理功能特性 由于大豆异黄酮与大豆制品( 如豆浆) 的苦涩味有关，因此长期以来被视为大豆 中的不良成分而试图将其去除。近年，西方膳食结构引起的肿瘤、心脑血管等疾 病越来越受到关注。流行病学的研究表明，由于亚洲人膳食中更多食用大豆制品， 心血管疾病、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌的发病几率比美国和西欧人低【1 7 】。美国 科学家研究揭示了大豆抑制癌症的奥秘，他们发现了一种特有的防癌物质一三羟 基异黄酮( g e n i s t e i n ) 结晶体，在恶性肿瘤孕育中可有效的阻止血管增生的生理过程， 断绝养料来源，从而延缓或阻止肿瘤恶化成癌症【l 引。除具有抗肿瘤作用外，大豆 异黄酮还具有许多其他重要的生理活性，如抗氧化、抗溶血【1 9 1 。对心血管疾病 2 0 l ， 骨质疏松症1 2 l 】以及更年期综合症具有预防甚至治愈作用。此外，大豆异黄酮作为 植物雌激素对动物也有一定的影响【2 2 】。它可明显提高动物的免疫功能，改善动植 物体内的生理过程或繁殖能力，提高家畜的生产力。染料木素和黄豆黄素作为大 豆异黄酮苷元的主要成分，具有多种生理作用，应用价值较高。 1 5 大豆异黄酮的鉴定和检测 1 5 1 鉴定 1 5 i 1 纸层析例 取少量总黄酮用乙醇溶解，以2 0 k o h 为移动相进行纸层析，展开后用铅笔 画下前沿将滤纸在烘箱中烤干后，与紫外灯下观察，划出荧光位置，求出r f 值。 8 第一章文献综述 1 5 1 2 薄层层析刚 吸附剂：硅胶g 展开剂：氯仿甲醇( 8 3 ：1 7 ) 显色剂：三氯化铁一铁氰化钾试剂 1 5 2 检测 1 5 2 1 大豆中总异黄酮的紫外分光光度计法测定瞄一蚓 ( 1 ) 标准曲线的制备精密称取染料木素纯品1 0 m g 于5 0 m l 容量瓶中，加9 5 甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，吸取o 2 、0 4 、0 6 、o 8 、1 0 m 1 分别置于1 0 m l 容 量瓶中 ( 2 ) 样品的测定称取大豆2 0 0 m g ( 6 0 目) 于5 0 m l 容量瓶中，加入9 5 乙醇3 0 m l 在沸水浴加热1 0 r a i n ，冷却后加9 5 乙醇至刻度，摇匀，放置过夜，准确吸取澄 清液1 0 m l 置于2 5 0 m l 容量瓶中，再加蒸馏水稀释至刻度，同时吸收1 0 m l 乙醇同 法处理做空白对照，在2 5 0 r i m 测吸收度，从标准曲线计算出大豆中异黄酮的含量。 1 5 2 2 高效液相色谱法【2 7 2 9 】 ( 1 ) 方法原理高效液相色谱( h p l c ) 柱用粒径为5 1 0 9 m 的颗粒作载体，将洗 脱剂( 流动相) 以高压泵注入柱内，形成显著的压力降，样品组分迅速连续不断地在 两相问进行反复多次平均分配，以达到分离的目的。各组分流出顺序依其组分对 两相间相对样合性，分离后的组分通过鉴定器产生讯号，经放大后在记录仪上描 出色谱峰。 ( 2 ) 仪器设备 ( 3 ) 试剂异黄酮标样品，纯度量9 9 ；样品制备用乙醇为分析纯；高效液相用 甲醇色谱为色谱纯；重蒸水；标准溶液；准确称取标准样品各1 0 m g ，加入到1 0 0 m l 容量瓶中，以甲醇溶解，定容至刻度备用。 “) 测定步骤 试样溶液的制备：取1 0 m l 经抽滤的乙醇粗提液，放入定量试管中，储存在 冰箱里以备检测。 标准曲线的制备：准确称量出标准品的质量，溶于甲醇配制成一定浓度的 标准溶液，利用自动进样器进样分析，测定出各组分色谱峰面积，以标准品的进 样质量和对应的峰面积作标准曲线，回归出线性方程。 ( 5 ) 色谱条件 9 第一章文献综述 分离柱：pb o n d a p a h 牌c j 8 反相柱( 1 0 肛，4 6 3 0 0 m m ) 进样量：标准品分别为 5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 t d ；试样为1 0 m ：流动相：甲醇：o 3 h 3 p 0 4 = 1 ：l ：流速： 0 7 m l m i n ；柱温：室温；分析时间：4 5 分钟；检测波长：2 5 4 n m 。 1 6 大豆异黄酮的提取工艺 原料应是事先经过脱脂的，如大豆粉、大豆粕、脱脂豆粕等，原料粒径最好 在o 5 一o 8 m m ，最大不超过l m m 。粒径过大，给提取造成困难；过小，则粉末度 过高，给后续分离操作带来困难。 文献报道的初步提取方法主要有碱提酸沉淀法、有机溶剂萃取法和c 0 2 超临 界萃取，而较常用的为溶剂提取法。溶剂提取法所采用的溶剂有乙醇、甲醇、丙 酮和弱碱性水溶液。提取物中除异黄酮外还有油脂、蛋白质、纤维素、单糖、多 糖等杂质。 1 6 1 甲醇提取 在5 0 - - 6 0 ( 2 条件下甲醇提取两次，每次提取时间为3 0 分钟，料液比( 质量： 体积) 为l ：l ，可得含量为1 5 的g e n i s t i n 和含量为1 3 d a i d z i n 粗提物。也有文献 【3 0 1 报道甲醇提取之后用醋酸铅沉淀杂质，再用硫化氢除铅。甲醇提取步骤繁琐， 甲醇、硫化氢以及重金属盐、醋酸铅均为有毒物质，不符合环保安全要求，不适 合大规模工业生产。 1 6 2 丙酮提取3 ” 丙酮对异黄酮溶解有良好的选择性，可使乙醇提取物中大部分杂质不被溶解 而除去，异黄酮则部分或全部溶解于丙酮中，而且可以在室温下进行。文献f 3 2 1 报 道丙酮加酸的提取方法能使异黄酮含量提高到2 5 6 ，可以用于精制过程。虽然 丙酮对异黄酮溶解具有极强的选择性，但是初步提取大剂量使用丙酮显然是不经 济的，因此考虑精制阶段使用丙酮。 1 6 3 乙醇提取【3 3 。3 4 】 考虑后续操作的难易程度、操作成本以及溶剂毒性等因素。最常用的是乙醇 水溶液，其次为弱碱性水溶液。从经济型和工艺优化考虑，主要确定乙醇提取的 浓度、用量( 料液比) 、提取温度及时间等因素。总结得，乙醇浓度为4 0 8 0 ， 溶剂与原料比为( 8 一1 6 ) ：l ( 体积m l ，重量g ) ，提取温度4 0 1 2 9 0 ，提取次数为1 l o 第一章文献综述 一3 次，提取时间为1 h 一1 0 1 1 。也有文献报道，大豆异黄酮最佳提取条件为：8 0 乙醇。料液比大于l ：1 8 ，时间1 h ，温度不超过5 0 c ，提取一次，洗涤一次； 乙醇7 0 ，料液比l ：5 ，提取时间l h ，温度5 0 c ，浸提两次，提取回收率可 达9 5 以上。 1 6 4 碱提取酸沉淀法嘲 该法比较简单，将大豆粉末浸泡在弱碱性水溶液中，提取一段时间后加酸调 节p h 值到蛋白质等电点，使之沉淀成凝乳状物，分离后得到液相提取物。所用弱 碱性溶液水溶液与大豆粉末的比为8 ：1 1 6 ：1 ( v ：w ) 溶液p h 值在6 7 9 7 比较好，等 电点p h 值为4 4 - - 4 6 。提取时间为2 4 小时，温度为3 2 - - 5 5 ( 2 。蛋白质沉淀可 通过过滤或离心分离去除。采用弱碱性水溶液提取得杂质比较多，般用于综合 利用回收蛋白质等工艺。 1 6 5 超临界c 0 2 萃取3 6 】 超临界c 0 2 萃取是采用c 0 2 做溶剂，超临晃状态下的c 0 2 流体的密度和介电 常数较大，对物质溶解度很大，并随压力和温度的变化而急剧变化，因此，不仅 对某些物质的溶解度有选择性且溶剂和萃取物非常容易分离。利用大豆中异黄 酮与其它组分溶解性的差异，采用超临界c 0 2 萃取是一个可行的办法。提取条件 如下：压力2 0 0 - - 3 0 0 b a r ，温度4 0 一7 0 ，c 0 2 用量5 5 2 9 ，流速1 0 m i m i n ，夹带 剂体积0 ，2 4 ，或4 8 ( 摩尔百分数分别为0 ，5 或1 0 ；n = 2 ) 。先静态提取l o m i n ， 再动态提取2 0 m i n ，总共提取3 0 m i n ，提取三次。结果发现温度对g e n i s t i n 和g e n i s t e i n 的影响显著，压力对d a i d z e i n 的影响显著。对总异黄酮而言，最佳提取条件为：温 度5 0 。压力为3 6 0b a r 但是所得总异黄酮浓度低于其他提取方法如超声提取。 1 7 异黄酮精制 大豆胚芽粗提物中除含有大豆异黄酮外，还含有较多的杂志如蛋白质、单糖、 多糖等，为获得较高纯度的大豆异黄酮苷产品，需进一步精制去杂。总结文献1 3 3 】口7 1 精制方法有超滤膜法、吸附法、柱层析法、高效液相色谱法、重结晶和溶剂萃取 法等。现简单介绍： 1 7 1 吸附法工艺 浸提液啼吸附树脂吸附+ 解吸 干燥 第一章文献综述 此工艺是采用吸附树脂吸附浸提液中的大部分异黄酮，洗脱去除浸提液中的 蛋白质、单糖、多糖及其他杂质，从而达到提纯大豆异黄酮的目的。解吸液解吸 后进行干燥，可得4 0 - - 9 0 的大豆异黄酮。 有人【3 8 】用合成树脂d i a i 伪q h p 一2 0 和o d s 结合使用，分离得到m a l o n y l d a i d z i n 和m a l o n y l g e n i s t i n 。3 k s 大豆粉末用碱提取酸沉淀法提取得粗提物溶液，以1 l h 速度过柱( d i a i o n h p 一2 0 ，5 x 2 1 5 c m ) ，吸附丙二酰基异黄酮葡萄糖苷 ( m a l o n y l i s o f l a v o n cg l y c o s i d e ) ，然后用2 l 蒸馏水洗涤。洗脱液为：5 乙醇溶液2 l ， 1 0 、2 0 、3 0 、4 0 乙醇溶液各3 l ，5 0 乙醇溶液2 l 。洗脱液为l l 为单位 分瓶收集。通过高效液相色谱检测洗脱液得异黄酮分别得到m a l o n y l d a i d z i n 和 m a l o n y l g e n i s t i n 的洗脱液，含量分别为1 6 1 9 3 k g 大豆和1 7 6 9 3 k g 大豆。两种洗脱 液p h 均调至8 ，以3 0 m l m i n 的流速过柱( o d s ，4 x 1 6 c m ) ，0 5 l 蒸馏水洗涤。分别 用5 和1 0 的乙醇溶液2 l 洗脱，收集洗脱液，浓缩冷冻得到m a l o n y l d a i d z i n 和 m a l o n y l g e n i s t i n 的钠盐均为1 1 5 9 。 装有聚甲基丙烯酸酯( p o l y m e t h a c r y l a t e ) 的反相柱分离效果比较好1 3 3 】。1 8 l 甲醇 粗提物溶于水，甲醇浓度约为2 0 。以适当条件过柱( 4 x 7 0 c m ) ，洗脱液为5 0 、 6 0 、7 0 的甲醇溶液各5 倍于柱体积。2 8 4 1 倍柱体积的洗脱液( 5 0 甲醇) 可 洗脱得到d a i d z i n ，6 3 8 0 倍柱体积洗脱液( 6 0 甲醇) 可洗脱得到g e n i s t i n ，i i 9 一1 3 1 3 倍柱体积洗脱液( 7 0 甲醇) 可洗脱得到g l y c i t e i n 。d a i d z i n 回收率可达8 2 ， g e n i s t i n 的回收率达8 1 。 1 7 2 超滤膜与吸附树脂相结合工艺 浸提液_超滤膜_ 吸附_解吸 一干燥 该法用超滤膜去除部分杂质，饵是单独使用超滤膜来精制，则得到的大豆异 黄酮纯度在1 2 ，因此要与吸附衍脂相结合，同时也可以减轻树脂的负担。超 滤膜切割分子量在1 0 0 0 0 左右。g e n i s t i n 在水中的溶解度与温度有关，因此通过超 滤膜的溶液温度最好在8 0 c 以上，以减少异黄酮的损失。 1 7 3 吸附与溶剂萃取相结合工艺 这一工艺是对原料综合利用，不仅得到大豆异黄酮，还可得到大豆皂苷、蛋 白质以及水溶液多糖。利用丙酮对异黄酮良好得选择性溶解使浸提液中大部分杂 质除去，从而得到高纯度的大豆异黄酮。具体流程如下： 1 2 第一章文献综述 萃取遗留物干燥卜皂苷 f 浸提液+ 吸附树脂吸附物溶剂解吸丙酮萃取 萃取物 未吸附物酸化+ 离心分离+ 沉淀得蛋白费+ 干燥 li 清液 回收多糖大豆异黄酮 1 7 4 柱层析法 按常规方法将聚酰胺装柱后 3 9 1 ，用水淋洗至无杂质并除去气泡。缓缓倒入含 异黄酮糖苷的溶液，以每分钟5 一l o m l 的速度通过吸附剂，等液体全部流出后加 水淋洗柱子直至流出液无颜色为止，最后用约两倍柱体积的7 0 洗脱柱子上的吸 附的异黄酮糖苷。所得洗脱液浓缩即得异黄酮粗品，一般含量在1 8 一3 0 ，回 收率为9 5 以上；在使用乙酸乙酯和8 一5 0 乙酸乙酯一甲醇梯度洗脱聚酰胺 柱下，皂苷峰和异黄酮苷峰不能完全分离。 葡萄糖凝胶柱s e p h a d e x - - 2 5 过柱 4 0 1 。5 0 7 , 酵洗脱可分离得到一个总皂甙峰和 一个总异黄酮峰。分离情况较好。用硅胶柱，9 5 甲醇洗脱，皂苷峰和异黄酮苷 峰相互重叠，分离效果不理想。 1 7 5 离子交换法川 用带有磺酸基的极性阳离子交换柱来层析分离得到7 一糖基一异黄酮( 7 一 g l y c o s y l - - i s o f l a v o n e ) ，而蛋白质和其他形式的异黄酮糖苷( g l y c o s i d e ) 被去除掉。离 子交换树脂有如下通式： m h s 0 3 - n a 。 树脂用量5 9 ，膨胀后装柱，柱体积约2 5 m l 。树脂预处理：4 n a o h ( 1 t 0 0 1 ) 溶 液浸泡4 小时，重复操作直到没有杂质、颜色，用相当于柱体积的水洗。再用3 m h c l 溶液，用量相当于3 4 倍柱体积洗涤，再用相当于柱体积4 5 倍的热水( 4 0 ) 洗。重复上述操作。处理完毕就上柱，每个柱体积的溶液上柱时间约为l 小时， 温度1 5 ( 2 左右。洗脱液为8 6 的乙醇溶液加1 o m 乙酸，每个柱体积用时l o 一 2 0 r a i n ，温度3 5 。该作者认为通过该法回收率可达9 5 。 1 3 第一章文献综述 1 8 异黄酮的水解及纯化 欲制得高纯度游离态异黄酮，需要将过柱或水解得到的产品( 纯度3 0 - 6 0 ) 进一步纯化，主要通过结晶来实现。可以通过结合丙酮萃取来进行纯化。将含有 游离态异黄酮粗品溶于丙酮，5 0 - 6 0 c 水浴搅拌回流1 小时，趁热过滤，去渣， 滤液在4 下结晶2 0 小时以上。也可通过分步结晶得到d a i d z c i n 和g e n i s t e i n 。一 次结晶回收率在7 5 以上，纯度超过9 5 ，一般需要反复多次结晶才能得到高纯 度得游离态异黄酮。 从大豆异黄酮的生物活性来看，如何提高游离型大豆异黄酮( 即苷元形式) 的含 量是关键。现工业上一般采用水解法制备大豆异黄酮苷元【4 2 】。大豆中异黄酮糖苷 有三类：大豆异黄酮d 一葡萄糖苷、6 ”一0 一丙二酰基葡萄糖苷和6 一o 一乙酰基 葡萄糖苷。其中6 - - o - - 丙二酰基葡萄糖苷含量最多，占总量的5 5 一6 5 。大 豆异黄酮配糖体( 糖苷) 的水解可分为3 步：第一步，6 ”一o 一丙二酰基葡萄糖苷 水解为乙酰基葡萄糖苷；第二步是乙酰基葡萄糖苷再水解为b 一葡萄糖苷；第三步 b 一葡萄糖苷水解为大豆异黄酮苷元。前两步水解容易进行，高温、弱碱性和弱酸 性条件都可水解，比较而言，弱碱性和高温条件下水解较快。第三步b 葡萄糖苷 水解为大豆异黄酮苷元需要较高条件，通常采用高温低p h 值和酶水解。酸水解主 要用盐酸获得苷元，多采用较浓的盐酸( 如l 一3 m o l l 1 ) ，较高温度( 9 8 0 1 0 0 ) ， 但强酸条件下不易进行工业化。酶水解主要水解酶为b 一葡萄糖苷酶。 1 8 1 丙二酰基葡萄糖苷的水解m 1 p h 值越高则需水解温度越低，水解时间也就越短。在p h = l l ，t = 3 5 c 件下， 水解时间只要4 5 m i n 左右，丙二酰基葡萄糖苷几乎全部水解成b 一葡萄糖苷。在 p h = 9 条件下，需水解温度t = 7 3 c ，水解时间则需要4 6 h 。在高温条件下 水解的过程，粗提物的水溶液在8 0 水浴中水解1 5 小时，丙二酰基葡萄糖苷由水 解前的8 0 下降到0 4 。 1 8 2 b 一葡萄糖苷水解【3 7 】 专利报道了p 一葡萄糖苷的酶水解。认为酶水解的原理是：能够使l ，4 一 e , l u c o s i d e 键断开，即异黄酮部分( i s o f l a v o n em o i e t y ) 与葡萄糖苷中葡萄糖分子之间 的配糖键( g l u c o s i d el i n k a g e ) 断裂。文献选用四种不同酶( g - - z y m e9 9 0 ，b i o p e c t i n a s c 1 0 0 l ，l a c t a s e 5 0 0 0 0 ，a l p h a - - g a l 6 0 0 l ) 作比较，酶的用量为原料干重的1 0 ，温 度保持在5 0 ，6 小时，p h 调至4 5 。发现a l p h a - - g a l6 0 0 l 型酶几乎可将三种 类型的葡萄糖苷完全水解。 1 4 第一章文献综述 酶水解的报道很多，但是所介绍的酶水解效率不是很高。如选用b i o p e c t i n a s e 1 0 0 l ，用量o 2 9 酶1 0 0 9 粗提液，p h = 7 ，4 5 ，水艇时间2 2 小时，三种异黄酮 得率都接近1 0 0 。也有介绍两种酶作用 4 5 1 ( 1 3 - - g l u e a n a s e l j - x y l a n a s e ) ，常温水解，回 收率在9 5 以上，可水解时间仍需1 8 小时。 也有强酸水解得到游离态异黄酮的专利报道。该专利作者将4 7 0 m l h c l 加到 9 8 7 3 m g d a i d z i n 中，1 0 0 反应5 小时，回收率可达9 2 。同样的物料比和水解条 件对g e n i s t i n 进行水解，回收率可以达到9 6 。用硫酸水解，水解液硫酸浓度不超 过5 ，乙醇浓度大于