（化学工艺专业论文）葛根素结晶工艺及溶解度测定.pdf

葛根素结晶工艺及溶解度测定 摘要 天然产物有效成分是制药的重要原料。黄酮类活性成分一直是天然药 物研究的热点。作为葛根的主要黄酮类活性成分，葛根素以其具有改善心 脑血管循环、降低心肌耗氧量，降低血糖，防止高血压及动脉硬化等多种 药理作用，日益受到广泛关注，其高纯度产品在国际市场上倍受青睐。 目前，葛根素纯化的工艺方法较多，而且各具优缺点，但均不能得到 收率高的晶体。因此，研究开发葛根素新的纯化工艺路线是一个重要的研 究方向。本文首先采用双注一底物结晶法对葛根素粗品进行初结晶，然后 采用酸水解法除去葛根素衍生物。着重研究了结晶条件与酸解条件，筛选 出了较优的工艺参数，并对葛根素在结晶溶剂中的溶解度进行了测定，为 葛根素的工业化生产奠定了良好的基础。研究结果表明：无论是结晶工艺 还是酸水解工艺与其它葛根素的纯化方法相比均有自己的独特之处，而且 保证了较高的产品收率与纯度。为了提高葛根素的收率，本文还提出了一 种回收结晶母液与酸水解母液中葛根素的工艺路线。 ( 1 ) 采用双注一底物结晶法对纯度为4 5 9 4 的葛根素粗品进行结晶。 通过研究结晶温度、搅拌速率、结晶时间、衬底液用量、溶析液与溶解液 的用量比等因素对葛根素收率与纯度的影响规律，找出双注一底物结晶的 最佳工艺条件。研究结果表明，结晶温度为5 0 。c ，搅拌速度为6 0 r m i n ，衬 底液用量为l o m l ，结晶时间为4 h ，溶析液与溶解液的用量比为o 5 时，葛 根素的收率为8 7 5 2 ，纯度可达8 7 7 6 。 ( 2 ) 采用酸水解法对纯度为7 2 5 2 的葛根素初结晶物进行酸解。通过 研究不同强度的碱中和、中和至不同的p h 值、不同的洗涤方法等因素对葛 根素收率与纯度的影响规律，找出酸水解的最佳工艺条件。研究结果表明， 采用n a o h 中和至p h 为4 ，过滤、滤饼干燥后采用方法一洗涤，葛根素的 收率为6 2 1 8 ，纯度可达9 8 1 9 。 ( 3 ) 本文中提出一种溶剂法回收结晶母液与酸水解母液中葛根素的工 艺路线，其回收率分别为4 3 1 7 与3 2 6 9 。 关键词：葛根素双注一底物法酸水解溶解度 i i p u r i f i c a t i o no fp u e r a r i nb yt h e d o u b l e i n je c t i o nc r y s t a l l i z a t i o n a n di t ss o l u b i l i t yd e t e r m i n a t i o n a b s t r a c t t h ee f f e c t i v ei n g r e d i e n t so fn a t u r a lp r o d u c t sa r et h ei m p o r t a n tr a wm a t e r i a lo f p h a r m a c y a c t i v ec o m p o u n d s ，e s p e c i a l l yf l a v o n o i d s ，h a v eb e e nt h ef o c u so fr a wm a t e r i a ld r u g a st h e m a i na c t i v ec o m p o n e n to fp u e r a r i af i a v o n o i d s ，p u e r a r i ni sp a i dm o r ea t t e n t i o ni n c r e a s i n g l yf o r i tc a ni m p r o v et h eb l o o dv e s s e lc i r c u l a t i o no fh e a r ta n db r a i n ，r e d u c et h eo x y g e n c o n s u m p t i o n c a p a c i t yo fc a r d i a cm u s c l e ，r e d u c et h eb l o o ds u g a r , p r e v e n tt h eh y p e r t e n s i o na n da r t e r y t e r i o s c l e r o s i sa n ds oo nm a n yk i n d so fp h a r m a c o l o g i c a la c t i o n ，t h ep u r ep r o d u c ti s v e r y p o p u l a ri ni n t e r n a t i o n a lm a r k e t a tp r e s e n t ，t h e r ea r em a n yo fp u r i f i c a t i o nt e c h n i q u e so fp u e r a r i nw h i c hh a v ed i f f e r e n t a d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e s ，b u th i g hy i e l dc a nn o tb eg e t t h e r e f o r ei ti so fg r e a ti n t e r e s t a n ds i g n i f i c a n c et oe x p l o r en o v e lt e c h n i q u e st op u r i f yp u e r a r i n i nt h i sp a p e r , t h ep u r i f i c a t i o n t e c h n i q u e so fp u e r a r i na r ea sf o l l o w s ：c o a r s ep u e r a r i nw a sc r y s t a l l i z e db yd o u b l e - i n j e c t i o n t h e na c i dh y d r o l ) o r t e dt h er a m i f i cmeranalhen,acid h y d r o l y z i n gp r o c e s sw a si m p o r t e dt or e m o v et h er a m ic a t i o no fp u e r a r i a e m p h a t i c a l l y , t h ec o n d i t i o no ft h ec r y s t a la n da c i dh y d r o l y z i n gp r o c e s sw e r es t u d i e da n dt h e s o l u b i l i t yo fp u e r a r i ni nc r y s t a ls o l v e n tw a sd e t e r m i n e d t h eo p t i m a lo p e r a t i o np a r a m e t e r s w e r ec h o s e na n dc o n s e q u e n t l ye s t a b l i s ht h ef a v o r a b l eb a s ef o rt h ei n d u s t r i a l i z e dp r o d u c t i o no f p u e r a r i n t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t si n d i c a t et h a t ，c o m p a r e dw i t hs o m eo t h e rm e t h o d s p u r i f i c a t i o n ，b o t ht h ed o u b l e i n j e c t i o nc r y s t a l l i z a t i o nt e c h n i q u e sa n dt h ea c i dh y d r o l y z i n g t e c h n i q u e sh a v et h e i ri n i m i t a b l et r a i t s f u r t h e r m o r e ，t h et e c h n i q u e sc a ne n s u r er e l a t i v eh i g h e r y i e l da n dp u r i t yo fp r o d u c t i no r d e rt og e th i g hy i e l d ，t h i sp a p e rb r i n gf o r w a r dar e c l a i m m e t h o do fp u e r a r i ni nc r y s t a ls o l u t i o na n da c i dh y d r o l y z i n gs o l u t i o n ( 1 ) t h ec o a r s ep u e r a r i ni np u r i t yo f4 5 9 4 w a sc r y s t a l l i z e db yd o u b l e i n j e c t i o n t h e i i i i n f l u e n c e so fc r y s t a lt e m p e r a t u r e ，s t i r r i n gv e l o c i t y ，c r y s t a lt i m e ，v o l u m eo fs u b s t r a t e ，r a t i oo f t h es o l v e n t i n g o u ts o l v e n ta n dt h es o l u b l es o l u t i o nw e r ei n v e s t i g a t e di nd e t a i lt of i n dt h e o p t i m a lc r y s t a lt e c h n i q u e s i tw a sf o u n dt h a tt h ey i e l da n dp u r i t yo fp u e r a r i nc a l lr e a c h 8 7 5 2 a n d8 7 7 6 r e s p e c t i v e l y , w h e nt h et e m p e r a t u r ei s4 5 c ，t h es t i r r i n gv e l o c i t yi s 6 0 r m i n ，t h e v o l u m eo fs u b s t r a t ei s10 m l ，t h ec r y s t a lt i m ei s 4 h ，t h e r a t i oo ft h e s o l v e n t i n g o u ts o l v e n ta n d t h es o l u b l es o l u t i o ni s0 5 ( 2 ) t h ep u e r a r i ni np u r i t yo f7 5 5 2 a f t e rf i r s ts t e pc r y s t a l i z a t i o nw a sh y d r o ! y z e db ya c i d t h ei n f l u e n c e so fn e u t r a l i z a t i o nb yd i f f e r e n ta l k a l in e u t r a l i z a t i o n , n e u t r a l i z i n gt od i f f e r e n tp h ， d i f f e r e n tw a s h i n gm o d ew e r ei n v e s t i g a t e di nd e t a i lt of i n dt h eo p t i m a lh y d r o l y z i n gt e c h n i q u e s t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t si n d i c a t e dt h a tb yt a k i n gn a o ht o p h = 4 ，f i l t r a t i n g ，d e s i c c a t i n g ， w a s h i n gb ym o d e1 ，t h ey i e l da n dp u r i t yo fp u e r a r i nc a i lr e a c h9 8 19 a n d6 2 18 r e s p e c t i v e l y ( 3 ) t h i sp a p e re s t a b l i s h e sar e c l a i m i n gt e c h n i q u e so fp u e r a r i ni nc r y s t a ls o l u t i o na n da c i d h y d r o l y z i n gs o l u t i o nb ys o l v e n t t h er e c l a i m i n gy i e l do fp u e r a r i nc a l lr e a c h4 3 17 f o rt h e c r y s t a ls o l u t i o na n d3 2 6 9 f o rt h ea c i dh y d r o l y z i n gs o l u t i o n ，r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：p u e r a r i n ；d o u b l e - i n je c t i o n ；a c i dh y d r o l y z i n g ；s o l u b i l i t y i v 符号说明 意义 相对误差 每毫升溶剂中溶解葛根素的质量 结晶或酸解后葛根素的质量 结晶或酸解前葛根素的质量 从葛根素结晶或酸水解后的母液中回收葛根素的量 葛根素结晶或酸水解后损失的量 溶剂的摩尔质量( 混合溶剂为平均摩尔量) 葛根素的摩尔质量 醋酸的摩尔质量分数 甲醇的摩尔质量分数 溶解度 甲醇的体积 醋酸的体积 实验测得的葛根素摩尔分数 根据拟合方程计算得到的葛根素摩尔分数 结晶或酸解后葛根素的纯度 结晶或酸解前葛根素的纯度 葛根素回收率 葛根素得率 甲醇与醋酸混合溶剂的密度 甲醇的密度 醋酸的密度 i 单位或量纲 g g g g g g m o l g m o l g m o l g m o l g l o o g m l m 1 咖 咖 咖 捐 j m 屹 鸭 豫 m 施 坂 虬 s k 吃 x n 舱y 玎 p n 见 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得 的成果和相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名 单位发表或使用本论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人 已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对 本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致 谢。 论文作者繇受音改 挪年胪日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发 发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：约法导师签 嵋年月d 日 葛根着 莒由结晶工艺及溶解度濠4 定 1 1 简介 第一章前言 目前，与化学制药、生物制药相比，天然药物的开发与利用已经越来越受到人们的 重视。天然药物提取物不但可作为植物药制剂的主要原料，还可应用于营养补充剂、化 妆品等相关领域。作为自然界中的一大类天然化合物，黄酮类物质更是天然药物研究开 发的热点。 葛根始载于我国汉代神农本草经，列为中品，野葛( p u e r a r i al o b a t a ( w i l d ) o hw i ) 和粉葛( e t h o m s o n i ib e n t h ) 是常用的传统中药，并属于我国卫生部公布的药食资源。 我国葛根资源丰富，主产于湖南、河南、陕西、浙江、四) l l t l l 。国内外学者从葛根中分 离鉴定出多种化学成分，主要包括异黄酮类、三帖类及芳香类化合物等，其中葛根素为 葛根异黄酮的主要有效成分，此外还有大豆甙元、大豆甙、4 ，7 二葡萄糖大豆甙、芒 柄花素等【2 3 1 。 葛根总黄酮( 以葛根素为代表) 为葛根的提取物，是一种毒性低，安全有效的药物， 主要用于心、脑血管疾病的治疗。它对于改善心脑血管循环、降低血管阻力、增加脑流 量、降低心肌耗氧量、防止高血压及动脉硬化，增强机体免疫能力等均具有疗效。同时， 葛根异黄酮对骨质疏松、更年期综合症也有一定的疗效。目前，葛根素的成品制剂主要 有：葛根黄酮片、葛根注射液、愈风宁心片等。 葛根素的毒性试验：小鼠灌胃葛根素2 9 k g ，3 次d ，狗静脉注射5 0 m g k g x 3 d ，均未 见毒性反应。小鼠尾静脉注射葛根素的l d s o 为7 8 3 m g k g ，以6 0 k g 成人计算得l d s o 的阈剂 量为2 8 3 8 m g 次静脉注射，说明葛根素基本无毒【4 j 。 1 2 本课题研究的背景、目的和意义 葛根素( p u e r a r i n ) ，化学名为4 ，7 - - - 羟基一8 p d 一葡萄糖基异黄酮，是用于治疗心脑 血管疾病的药品及保健品的重要原料药，为近年来国际市场上的畅销产品，市场前景广 阔。我国葛资源丰富，而对于葛资源的利用仅限于葛粉的加工，经济效益也较低，随着 我国葛种植数量的增加，葛原料的价格也在下降，部分地区甚至下降到2 元公斤。目前， 葛根素的结晶工艺及- ：g j l 荜度测定 葛根素( 含量9 7 ) 的市场价格在2 0 0 0 元t ；公斤以上。因此，如果将这些原料) ；n - r 提取出 葛根素，必将产生可观的经济效益。 国内西北大学【5 1 、陕西镇坪制药厂【6 】、山东省医学科学院药物研究所7 ，引、安徽农业 大学生物研究中心【9 】、陕西中医学院、陕西师范大学化学系等单位在葛根素提取方面分 别做了不同的研究，并分别提出一些专利生产技术或适合于工业化大生产的工艺路线。 早在1 9 世纪5 0 年代末6 0 年代初，日本的柴田承二等人就对葛根进行了系统的研究。随着 葛根的保健和药理功能研究的深入，国外对葛根的兴趣越来越浓厚，除日本，东南亚一 些国家外，欧美也对葛根展现出了青睐。 目前，用于葛根素纯化的方法较多。传统的纯化方法有：冷却结晶法、铅盐沉淀法、 溶剂法、盐析法和柱层析法等；新的纯化方法有：微波结晶法、超声波结晶法、磁处理 结晶法以及1 3 环糊精键合固定相技术等。葛根素具体的纯化方法应视提取条件及纯化目 的而定。冷却结晶法虽然工艺简单，但是它们的存在过程不稳定，晶体形貌差，而且收 率与纯度都比较低；铅盐沉淀法得到的成品中总异黄酮含量虽然最高，但其有效成分损 失大，得率极低；溶剂法、盐析法、络合萃取技术等则适用于实验室少量纯品的提取； 大孔径树脂法难以同时获得高收率和高纯度；而聚酰胺柱层析吸附法处理量小，机械强 度低，通用性差，需要结合其他的分离方法( 如萃取等) ，且分离中使用的聚酰胺介质 毒性大，不宜用来制备药物。微波结晶法、超声波结晶法、磁处理结晶均属于刺激结晶， 其晶体纯度较低，且成本高。b 环糊精键合固定相技术虽然具有产品纯度、收率高和方 法简单的优点，但是要进行工业化生产，还需进一步研究。综合考虑收率、纯度与经济 成本等因素，这些方法都不适宜工业化生产。 葛根素的理化性质国内外虽有相关报道，但物性数据却出现较大差异，如不同的溶 解度、旋光度和熔点【1 0 d 2 1 等。而溶解度和溶出速率等物性的不同，不但会影响到生物利 用度，影响人体对药物的吸收与利用，而且不能为葛根素结晶纯化工艺的研究提供有效 的数据参考。 本课题着重要解决的问题就是从得到工艺简单、低能耗、高纯度葛根素的角度出发， 研究一种新的便于工业化纯化葛根素的方法。同时，本课题还对葛根素的溶解度进行了 测定，为生产高纯度的葛根素提供具有指导和参考意义的物性数据。 2 葛根案的结, f s 工艺及溶解度测定 1 3 本课题研究的内容 为了使葛根素分离纯化的效果更好，使得到的葛根素不仅纯度高、晶体好，而且结 晶工艺又更容易实现工业生产，本文在课题小组前面所做的研究方法基础上进行了改 进，做了以下工作： ( 1 ) 采用双注一底物法结晶纯化葛根素。该法首先应用于制备高分散纳米氢氧化镁 1 3 1 的工艺中，此工艺简单，且结晶过程稳定，可使过饱和度维持在较低水平，如果加料 速率与结晶速率匹配，可以实现连续加料及连续结晶，但是该法会将葛根素衍生物同时 结晶析出，因此只适合于葛根素的初结晶中。实验方法为：先用甲醇溶解葛根素粗品， 使其刚好完全溶解，得到的甲醇溶液作为溶解液。以对葛根素溶解度很小的冰醋酸作为 溶析液；在一定的温度和搅拌速率下，将溶解液与溶析液缓慢同时加入到开始具有一定 溶析液( 衬底液) 的结晶器中，该法不但可以得到较高的产品纯度和得率，而且克服了 传统结晶法中产品得率低、结晶时间长以及超声波结晶中产品纯度低的问题。 ( 2 ) 研究酸水解法除去葛根素衍生物后处理工艺。采用双注一底物法结晶纯化的 葛根素中常含有少量葛根素衍生物，可通过酸水解工艺将葛根素衍生物水解成葛根素， 该法既提高了葛根素的得率，又提高了葛根素的纯度。与其它除去葛根素衍生物的工艺 比较，酸水解工艺简单，易操作。实验方法为：取一定量，一定浓度的盐酸在一定温度 的水浴中搅拌预热，将一定量的葛根素初结晶物缓慢的加入到盐酸溶液中。恒温一段时 间后，用碱中和至一定的p h 值，然后降低搅拌速度，并自然降温至室温，过滤，滤饼 采用不同的洗涤方法洗涤后真空干燥。 ( 3 ) 葛根素纯化溶剂中溶解度的测定。本实验采用静态法对不同温度下不同溶剂 中葛根素的溶解度进行了测定。该法不受溶解平衡速率的影响，对于溶解速度快或慢的 物系均适用。实验方法为：取1 0 0 m l 溶剂置于锥形瓶中，加入过量的葛根素，使其达 到过饱和，在摇床上振荡一段时间后，静置，取上层清液测定其溶解度。 本研究的创新点是： ( 1 ) 采用双注一底物法结晶纯化葛根素。结晶中溶液浓度、粘度及离子强度、过 饱和度维持恒定，结晶过程稳定，若结晶速度与加料速度匹配，可得到颗粒较大的晶体， 且晶体的洗涤及干燥比较容易。与目前采用的纯化葛根素的方法相比，不仅节能、节时、 工艺简单，而且晶体收率高，纯度好。 ( 2 ) 研究酸水解法后处理工艺。采用酸水解法除葛根素的衍生物不仅提高了葛根 广西大掌硕t 仑文 葛根素的结晶工艺及溶解度测定 素的得率，还提高了葛根素的纯度。而且此过程是在初结晶之后进行的，与文献中酸水 解过程是在初结晶之前进行的报道【1 4 】相比，不但酸水解效果不好，而且盐酸用量也少， 成本费用低。 ( 3 ) 葛根素纯化溶剂中溶解度的测定。制药结晶过程中，溶解度参数是一个重要 的指标。本文针对不同温度不同溶剂中葛根素的溶解度进行了测定，对葛根素的纯化结 晶工艺具有实际指导意义。 4 葛根紊的结晶工艺及溶解度测定 2 1 葛根素的提取方法 第二章文献综述 葛根素为近年来国际市场畅销产品，药理作用显著，是生产用于治疗心脑血管疾病 的药品及保健品的重要原料药，市场应用前景广阔。目前葛根素主要是从野生葛根中提 取，其提取方法可概括如下。 2 1 1 葛根素的传统提取方法 溶剂提取法：溶剂提取法的原理是根据中药化学成分与溶剂间的“极性相似相容” 原理，依据各类成分溶解度的差异，选择对所提成分溶解度大、对杂质溶解度小的溶剂， 依据“浓度差”的原理，将所提成分从药材中溶解出来的方法。中药提取的传统方法包括 煎煮法、浸渍法、渗漉法、回流法、索氏提取法等，其中水煎煮法是最常用的方法，浸 渍法一般在同时提取葛根淀粉和异黄酮时才用 1 5 - 1 7 】，目前用于葛根素提取和纯化的溶 剂主要有甲醇、乙醇、丁醇等。 传统方法存在较多的缺点：( 1 ) 煎煮法有效成份损失较多，尤其是水不溶性成份。 ( 2 ) 提取过程中有机溶剂有可能与有效成分作用，使其失去原有效用。( 3 ) 非有效成 分不能被最大限度的除去，浓缩率不够高。( 4 ) 提取液中除有效成分外，往往杂质较多 给精制带来不利。( 5 ) 高温操作会引起热敏性有效成分的大量分解。( 6 ) 提取时间长， 溶剂用量大。 李琰【1 6 】等分别以乙醇为溶媒，采用渗滚法、冷浸法、回流法对葛根素进行提取比较， 结果证明回流法提取葛根素的相对收率最高，与冷浸法相比提取速度快。 x u 博j 等探讨了乙醇用量、浓度、提取时间及次数对葛根素收率的影响。其最佳提 取工艺为：提取剂为体积分数7 0 乙醇，每次7 倍量，加热提取3 次，每次1 h ，本工 艺提出葛根素质量分数为2 6 5 ，浸出转移率达9 8 。 2 1 2 葛根素的现代提取方法 为提高中药质量、改变传统中药剂型“大、黑、粗”的状态，让中药步入国际市场， 一些现代高新工程技术正在不断地被借鉴到中药生产中来，一方面使中药生产加工符合 葛根素的结晶工艺及溶解度测定 传统的中医药理论，确保用药的质量要求，另一方面也提高了现有中草药资源的利用率。 常用的葛根素新型提取法有微波辅助萃取法，超临界流体萃取法，超声波提取法等。 微波辅助萃取是一种颇具发展潜力的新型萃取技术【1 9 ，2 0 1 ，它具有耗能低、操作时间 短、溶剂耗量少、选择性高、目标组分得率高，符合环境保护要求1 2 m 3 】等优点。但是它 对某些化合物有一定的降解作用，应严格控制提取时间，且微波提取法设备费用高，产 品的成本费用也高，同时微波对人体，尤其眼睛有一定的伤害作用，因此，应用时需注 意微波的泄漏和防护【2 4 1 。 超声波提取是利用超声空化产生的强大剪切力使植物细胞壁破裂，细胞内含物溶解 释放的过程。有效的质量传递和细胞破裂是强化提取的主要推动力，超声波提取不仅省 时，节能，而且总黄酮的提取率较传统法高，但设备费用高，成本高。 超临界流体萃取是利用超临界流体作为萃取剂在高于临界温度和压力下，从目标物 中萃取有效成分，当恢复到常压常温后，溶解在流体中的成分以溶于吸收液的液体状态 与气态流体分开的过程。该法具有收率高、纯度高、速度快等优点，但是常用的超临界 流体极性小，在提取时需加调节剂来改变极性，从而会影响后续的分离工艺。 张尊听1 2 5 】等采用超声萃取提取葛根异黄酮的实验结果表明：甲醇为溶剂超声萃取 3 0 m i n 提取野葛根异黄酮成分效果最佳，提取率为2 0 6 ，总黄酮质量分数为5 0 0 3 。 其结果还表明超声萃取不仅不会影响活性成分的化学结构，而且具有省时、节能、总黄 酮提取率和产品纯度高的优点。 2 1 3 内部沸腾法和减压内部沸腾法提取葛根素 2 1 3 1 减压内部沸腾法 减压内部沸腾法【2 6 】是在植物组织被少量低沸点解吸剂润湿后，在减压操作条件下， 加入温度高于解吸剂沸点的提取溶剂，使渗透到植物组织内部的解吸剂来不及扩散就被 加热沸腾汽化，从而使有效成份溶出的过程。 郝瑞然【2 7 】曾用该方法提取过葛根素，经过反复的实验得出结论：在最佳的提取工艺 条件下，减压内部沸腾法比传统方法提取温度低了3 5 ；提取时间比传统方法减少1 4 倍；提取得率高于传统方法；所得的粗浸膏中葛根素含量也比传统方法高；杂质提取率 比传统乙醇提取减少1 1 1 ；乙醇用量也明显少于传统方法，该法具有提取时间较短， 葛根中的淀粉不易糊化，提取得率高，产品杂质含量低的特点。但由于该法是在减压条 件下进行的，因此操作压力较难控制。 6 葛根素的结晶工艺及溶解度测定 2 1 3 2 内部沸腾法 内部沸腾法1 2 8 1 具体过程为先用一定浓度的乙醇在室温下解吸一段时间，然后迅速加 入一定温度的正丁醇进行回流提取。该方法不但具有一般两步内部沸腾提取法的快速、 收率高等特点，而且省去了乙醇回收工序，简化了生产工艺流程。 徐华东【2 9 1 曾用内部沸腾法提取葛根素，该法不仅解决了淀粉糊化问题，而且克服了 乙醇提取后提取液中杂质含量高，需用正丁醇对乙醇提取粗浸膏的水溶解物进行反复萃 取，造成有机溶剂浪费，增加实验步骤的缺点，同时，内部沸腾法是一种半连续提取法， 可以减少了正丁醇的用量，经过反复的实验得出最佳的提取工艺条件为：乙醇解吸剂浓 度为6 0 、原料与解吸剂的用量质量比为1 1 6 、解吸时间为2 0 m i n 、提取溶剂为含水 2 0 的丁醇、原料与提取溶剂用量比为1 1 2 、丁醇溶液的温度为9 0 ，在该条件下，总 黄酮的收率为1 1 3 。 2 2 葛根素的结晶纯化方法 葛根的提取液经过浓缩，除杂，旋转蒸干后得到的是葛根素的粗浸膏，它是含有诸 多成分的混合物，需经过迸一步的分离、纯化才能得到高纯度的葛根素。 结晶是利用混合物中各种成分在溶剂中溶解度的差别，使非结晶状物质通过处理转 为结晶状物质的过程。此时形成的晶体一般还含有较多的杂质，为粗结晶，需选用适当 的溶剂处理纯化为较纯的结晶状物质，此过程称为重结晶。近年来，结晶分离技术发展 很快，传统结晶法进一步得到发展与完善，新型结晶技术也正在工业上得到应用或推广。 2 2 1 冷却结晶法 冷却结晶法是在高温条件下将溶质溶于溶剂中，再降温使溶质析出的方法。此法适 用于随温度升高，溶解度也显著增加的物质。它具有节能、无需设置换热面、不会引起 结疤、不会导致晶体破碎等特点，但是它存在过程不稳定，控制困难，且结晶速率慢， 晶体形貌差，收率与纯度都比较低。在实验室里为获得较大的完整晶体，常采用缓慢降 低温度的方法来减慢结晶速率。 左春耀【6 】等对葛根素的冷却结晶进行了研究，结果表明：取粗品5 0 9 ，加入9 5 的冰 醋酸1 7 5 m l 力l ：l 热至1 1 6 溶解，并结晶得到精品1 8 7 5 9 ，精品经干燥，测得葛根素含量 为9 7 6 。 7 j i 根焉 的结晶工艺及溶解度测定 2 2 2 蒸发结晶法 蒸发结晶法是一种通过加热蒸发溶剂使溶液达到过饱和的结晶方法，同时为了避免 产物在高温下易破坏，一般多采用减压蒸发。该法适用于温度对溶解度影响不大的物质， 它具有设备简单，无需换热界面的优点，但其耗能较大，结晶过程中温度和浓度是不断 变化的，控制操作比较困难，很难得到质量比较好的晶体。 目前，还没有关于蒸发结晶葛根素的报道，这是因为如果采用加热的方法蒸发结晶 葛根素，可能会对其产生破坏作用，而且结晶过程不稳定，不利于得到形貌好，纯度高 的晶体；如果采用自然挥发溶剂法结晶纯化葛根素则耗时太长，因此蒸发结晶还未应用 于纯化葛根素。 2 2 3 盐析结晶法 盐析结晶法是在中草药的提取液中、加入无机盐至一定浓度或达到饱和状态，使某 些成分在水中的溶解度降低，沉淀析出，从而达到与杂质分离的过程。常用作盐析的无 机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。例如：在三七的水提取液中加硫酸镁至饱 和状态，即可沉淀析出三七皂甙乙；在黄藤的提取液或三颗针的提取液中加入氯化钠或 硫酸铵盐，即可分别沉淀析出掌叶防己碱、小檗碱；有些成分如原白头翁素、麻黄碱、 苦参碱等水溶性较大，在提取时，亦往往先在水提取液中加入一定量的食盐，再用有机 溶剂萃取。 张尊斤【3 0 】等采用盐析法将葛根黄酮从水溶液中析出进行纯化，同时利用分光光度法 和hp lc 法分别对葛根素的含量进行了测定，实验表明该方法有利于葛根素的富集纯 化。 2 2 4 超临界流体萃取结晶法 超临界流体萃取( s c f ) 结晶是超临界流体溶液通过快速膨胀过程( r e s s ) 或气体 抗溶剂过程( g a s ) 快速增加过饱和度实现结晶的过程。由于许多药物在超临界流体中 溶解度小，所以快速膨胀实际应用的可能性很小，气体抗溶剂过程具有液体溶剂易于选 择，操作压力低，应用范围广的优点更适于药物结晶。c 0 2 是最重要的超临界流体，其 临界温度和临界压力低、毒性小、成本低、萃取速度快，而且超临界萃取结晶是在3 5 4 0 进行，因此特别适用于提取或精制热敏性和易氧化的中药物质。 8 葛根曩时结晶工艺及溶解度测定 潘见【3 1 1 首次提出这一技术，并应用于结晶纯化天然产物的提取物。张庆勇【3 2 1 将超临 界c 0 2 萃取结晶应用于葛根素的纯化中，葛根素的纯度可从3 9 3 提高至1 j 8 4 o ，结晶率 在4 5 左右。其最优工艺为：投料量5 0 9 ，萃取结晶压力1 7 m p a ，萃取结晶温度5 5 。c ，萃 取结晶时间9 0 m i n ，夹带剂为乙醇一水。与传统法比较，该法具有省时，耗能低的特点， 但是该法机理尚不明确，需对超临界流体萃取结晶分离葛根素中试工艺做进一步研究。 2 2 5 磁处理结晶法 磁化分离是一种利用元素或组分磁敏感性的差异，借助外磁场对物质进行处理，从 而达到强化分离过程的新兴技术。随着强磁场、高梯度磁分离技术的问世，磁分离技术 的应用己经从分离强磁性大颗粒发展到去除弱磁性及反磁性的细小颗粒，从最初的矿物 分选、煤脱硫发展到工业水处理，从磁性与非磁性元素的分离发展到抗磁性流体均相混 合物组分间的分离。作为洁净、节能的新兴技术，磁化分离显示出了诱人的开发前景【3 3 1 。 在某些情况下，磁场促进溶液的结晶，晶体粒径增大；而在另外一些情况下，利用 磁场的作用可以控制粒径的生长，使结晶的粒度减小。比如：磁场防垢，k o b e 【3 4 】等在实 验中发现，经过磁处理的水样中得到易于清除的文石，而未经磁处理时则得到硬垢状的 方解石。据此，他们开发了具有环保优势的自来水磁化处理设备。 谢慧q j 3 5 】等对醋酸一乙醇、乙醇一水、异丙醇溶剂中的葛根素进行了电磁诱导结晶， 用扫描电镜观察结晶颗粒的微观形貌，并利用高效液相色谱进行纯度检测，结果表明： 在0 2 4 t 磁场诱导下，葛根素结晶速度加快，晶体纯度均有提高；在异丙醇中电磁诱导 结晶可得纯度达9 9 5 的超纯品，而且在同一溶剂系统中，电磁诱导下能获得均匀且排 列规则、有序的晶体。 2 2 6 超声波结晶 超声波结晶是利用超声波的能量控制结晶的过程。超声波不仅可以加快成核速率， 缩短诱导期，加快结晶进程，而且超声功率越高，结晶时间越短，但是晶体平均粒径减 小，晶体纯度也会下降，超声波结晶是一个复杂的过程，对它的控制十分困难。 l e e 3 6 j 等将超声波与传统法，高压溶剂法提取纯化葛根素进行了对比，结果表明： 超声波不但提取率高，节省时间，而且比较经济。徐华东【2 9 j 将加热法、超声波法对葛根 素结晶进行了比较，结果显示：超声波结晶葛根素的纯度为7 7 2 1 ，得率为3 7 6 ，加 9 j 譬根素的结, 1 1 1 , 工艺及溶解度测定 热结晶葛根素的纯度为8 1 7 8 ，得率为1 0 0 。超声波法较加热法结晶速率快，但是由 于葛根素的骤然加速聚集，也加速了部分杂质的析出，使葛根素的纯度降低。 2 2 7 双注底物法结晶 双注一底物法结晶是将两股流体同时加入到结晶容器中进行结晶的一种方法。在反 应结晶中，两股流体可以是两种可以反应的物质，在边反应边结晶的同时得到产物。在 天然产物有效成分纯化过程中，其中一股流体是对有效成分溶解度很高的溶解液，称为 溶解注，另一股流体是对有效成分溶解度很低的溶剂，称为溶析注，把两股流体同时注 入具有底物的结晶容器中，通过突然降低溶解度，使有效成分结晶成核，晶体生长析出， 从而得到纯度高及质量好的晶体。 双注一底物结晶法的优点：首先，在结晶过程中，结晶罐的溶液浓度、粘度及离子 强度维持恒定，晶体条件稳定、易于控制；其次，结晶过程过饱和度维持恒定，若结晶 速度与加料速度匹配，可得到颗粒较大的晶体，防止晶体过小而发生团聚，夹带杂质增 加。最后，晶体的洗涤及干燥比较容易。与目前采用的结晶方法相比，如降温结晶、浓 缩结晶等，控制操作比较容易，且得到晶体质量好。 陈志航【l3 】等以氯化镁、氢氧化钠为原料，氯化钠为衬底溶液，采用双注一水热法对 高分散氢氧化镁纳米片进行了制备，结果表明：采用双注方式或提高衬底溶液氯化钠浓 度均有利于降低反应体系过饱和度，改善常温产物的结晶性和分散性。 目前，该法还未应用于葛根素的纯化过程中，如果将溶有葛根素的甲醇溶液作为溶 解液，对葛根素溶解度小的醋酸作为溶析液和底物，在滴加的过程中葛根素溶解度降低， 结晶析出。但是该法得到的晶体颗粒较小，因此，可以考虑在葛根素的初结晶中采用双 注一底物法进行纯化。 近年来，研究者们除进一步完善传统结晶方法外，仍在不断探索新的结晶方法，如 将冲击喷射结晶法应用到药粒制备工艺中【3 7 1 ，物理场辅助结晶法的研究【3 8 】等。 2 3 葛根素的其它纯化方法 目前，除了上述纯化葛根素的结晶方法外，还有许多可以从葛根异黄酮中分离纯化 葛根素的方法。例如：溶剂法、酸水解法、盐析法、络合萃取技术、大孔吸附树脂法、 聚酰胺柱层析吸附法和环糊精键合固定相技术等，现将这些方法介绍如下。 l o 葛根瞄结晶工艺及溶解度测定 2 3 1 溶剂分离法 溶剂分离法是利用中药有效成分在不同极性溶剂中溶解度不同而进行分离纯化的 方法。一般是将上述总提取物，选用三、四种不同极性的溶剂，由低极性到高极性分步 进行分离的方法。 广而言之，自提取溶液中加入另一种溶剂，析出其中某种或某些成分，或析出杂质， 也是一种溶剂分离的方法。例如：天花粉素的括楼根汁提取液，可滴入丙酮析出；多糖 及多肽类化合物的水提液、可加乙醇或丙酮析出；葛根素的水提液中常含有树胶、粘液 质、蛋白质、糊化淀粉等，可以加入一定量的乙醇，使这些不溶于乙醇的成分自溶液中 沉淀析出，从而达到与其它成分分离的目的。 赵爱平【3 9 】在葛根浸膏的提取中采用的水提醇沉法，经聚酰胺柱层析，以水洗脱、浓 缩、放置析出葛根素粗品，粗品再次经聚酰胺柱层析、水洗脱、浓缩析出结晶，再经冷 冻干燥或喷雾干燥或用体积分数7 0 8 0 醇重复结晶制得精品，其葛根素含量9 0 以上。 张永煜【4 0 】根据葛根黄酮结构中酚羟基易溶于碱性溶剂的性质，采用8 倍量饱和氢氧 化钙水溶液以2 h 提取3 次，合并提取液，调p h 值为5 ，减压浓缩后，在搅拌下浓缩液 以9 5 乙醇调醇浓度达6 5 ，静置0 5 h 后过滤，回收乙醇得总黄酮。与传统法比较： 新工艺耗醇量仅为老工艺的2 5 ，老工艺的生产周期是新工艺的1 1 5 倍，新工艺的收率 比老工艺收率提高了2 ，新工艺总黄酮纯度比老工艺提高了6 。 2 3 2 层析法 层析法是基于样品组分在互不相溶的两“相”溶剂之间分配系数之差( 分配层析) ， 组分对吸附剂吸附能力不同( 吸附层析) ，和离子交换，分子的大小( 排阻层析) 而分 离的方法。 2 3 2 1 吸附层析法 吸附层析的分离效果取决于吸附剂、溶剂和被分离化合物的性质这三个因素。液一 固吸附层析是运用较多的一种方法，特别适用于很多中等分子量的样品( 分子量小于 1 0 0 0 的低挥发性样品) 的分离，尤其是脂溶性成分，一般不适用于高分子量样品的分离， 如蛋白质、多糖或离子型亲水性化合物等。吸附剂：常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活 性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。 ( 1 ) 柱层析法 葛根素的结晶工艺及溶解度测定 聚酰胺柱层析是利用分子中的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基，酰胺键上 的游离胺基或醌类、脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附，至于吸附强弱则取决 于各种化合物与之形成氢键的能力。 大孔吸附树脂是依靠它和吸附的分子( 吸附质) 之间的范德华引力，通过它巨大的 比表面进行物理吸附而进行有效成分分离的。在实际应用中对一些与其骨架结构相近的 分子具很强的吸附能力，如芳香族环状化合物。 赵玉山以聚酰胺柱层析分离葛根提取液，将点样后收集的洗脱液浓缩，再净化处 理得葛根素产品。欧来良【4 2 1 等选用非极性、弱极性、中极性( 氢键受体型) 、强极性吸 附树脂柱( 经预处理) 对葛根素进行分离，结果表明中极性吸附树脂对葛根素的分离效 果较好。因为中极性吸附树脂比表面积虽低，但带有孤对电子的羰基能与葛根素的酚羟 基形成氢键，大大提高了吸附选择性。 在我国，还有许多专禾l j 4 3 郴1 是采用大孔吸附树脂法对葛根素进行分离纯化的。李剑 君1 4 6 1 等对中性氧化铝、硅胶及大孔吸附树脂进行筛选的基础上，认为大孔吸附树脂是分 离葛根素较为理想的吸附剂，通过等温及动力学实验，得出大孔吸附树脂中a b 8 型树 脂是分离葛根素的较优吸附剂。通过正交实验，确定了以a b 8 型树脂作为吸附剂的最 佳工艺条件为高径比为1 0 ：1 的层析柱在3 0 时以2 0 m l m i n 的流速洗脱，葛根素的收 率9 3 7 5 。 ( 2 ) 薄层层析法 薄层层析是将柱层析用的吸附剂撒布到平面，如：玻璃片上，形成一薄层进行层析 的方法。该法是一种简便、快速、微量的层析方法，其原理与吸附柱层析基本相似。常 用薄层层析法探索柱层析分离条件，即在进行柱层分离前，对选用何种吸附剂与洗脱剂， 洗脱过程中各个成分将按何种顺序被洗脱以及每次洗脱液是否为单一成分或混合体等 均可由薄层层析法得到判断与检验。该法是实验室中常用的一种方法，不能工业化生产。 李云霞【4 7 】对薄层扫描法测定葛根药材中葛根素含量进行了研究。实验中采用了不同 比例的氯仿一甲醇一水系统作为展开剂，并对展距进行了摸索，结果显示采用2