（应用化学专业论文）微通道无膜扩散法测定有机分子扩散系数.pdf

毒 t a t h e s i si na p d e t e r m i o r g a n n o r t h e a s t e r nu n i v e r s i t y j a n u a r y2 0 0 8 t i ， 独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下完成的。论文中取得 的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人己经发表或撰写过 的研究成果，也不包括本人为获得其他学位而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 ：也 思0 学位论文作者签名：欢吨景 日期：劫嵋f 、w 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者和指导教师完全了解东北大学有关保留、使用学位论 文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人同意东北大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索、交流。 ( 如作者和导师不同意网上交流，请在下方签名；否则视为同意。) 学位论文作者签名： 签字日期： 导师签名： 签字日期： ， _ 1 宣 ， 东北大学硕士学位论文摘要 微通道无膜扩散法测定有机分子扩散系数 摘要 论文描述了一个新的微流控装置，它是利用重力驱动的芯片多相层流测定装置，它 使两种液体间产生无膜扩散，分析物从一种流体通过相界面自由扩散迁移到另一种液体 成为可能，含有分析物的液体和不含分析物的液流由于浓度梯度而产生横向扩散，用数 码影像技术和数学方法处理，可最小限度探明含有分析物的液体分子扩散到不含分析物 的液流的物质的含量，并计算相应的扩散系数。根据扩散定律和流体力学原理，当流体 流经本实验装置一实验微通道宽为5 6 0 t m ，深为7 6 p m 的玻璃芯片上，只有流速控制在 0 0 5 0 m s 以下，雷诺数小于2 0 0 0 时才可进行有效测定。 本实验目的是探索实验条件、测定可以发生化学显色反应的有机分子常温下的扩散 系数d ，并且计算流速和扩散系数来证明实验和装置的实用性。 通过对氢氧化钠和酚酞反应体系、牛血清白蛋白和溴甲酚绿反应体系、人血清白蛋 白和b c g 溶液反应体系，牛血清白蛋白和考马斯亮蓝反应体系测定了不同流速下的 b c g 和考马斯亮蓝分子扩散系数。 关键词：扩散；扩散系数；分子扩散系数；无膜扩散：蛋白质；微通道 j i 一 1 五 知 a n a l y t ef r o mas a m p l es t r e a md i f f u s ei n t oa n o t h e rs t r e a m t h ec o n c e n t r a t i o ng r a d i e n tc a u s e t h et r a n s v e r s ed i f f u s i o nb e t w e e nt h et w ok i n d so ff l o w s t od e t e r m i n em o l e c u l ed i f f u s i o n c o n c e n t r a t i o na n dc o r r e s p o n d i n gc o e f f i c i e n t ，t h em a t h e m a t i c a lm e t h o da n dd i g i t a li m a g e t e c h n o l o g ya l ep r o b e da tap o s i t i o ni nw h i c hm o l e c u l a rd i f f u s i o na c r o s st h eb o u n d a r yo ft h e t w of l o w sh a sb e e nm i n i m a l ，j u s ta f t e rt h ef l o wi n i t i a l l yw i t h o u ta n a l y t em e r g e sw i t ht h ef l o w i n i t i a l l yc o n t a i n i n gt h ea n a l y t ea ta # y e nc o n c e n t r a t i o n a c c o r d i n gt ot h ed i f f u s i o nl a wa n d h y d r o d y n a m i c sp r i n c i p l e ，o n l yi fr ei sl e s st h a n2 0 0 0 ，w h e nl i q u i dt h r o u g ht h em i c r o c h a n n e l o fw i d t hf o r5 6 0 z ma n dd e p t hf o r7 鲰m ，o n l yc o n t r o ll i q u i df l o wr a t el e s st h a n0 0 5 m s ， d i f f u s i o nc o e f f i c i e n tc a nb ed e t e r m i n a t i o n t h i se x p e r i m e n ta i m e da to p t i m i z i n ge x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ，a tt h es a m et i m e d e t e r m i n i n gt h ed i f f u s i o nc o e f f i c i e n to fo r g a n i cm o l e c u l ew h e nt h et e m p e r a t u r ew a s2 9 3 k t h ep r a c t i c a b i l i t yo ft h ee x p e r i m e n ta n dd e v i c ew a sp r o v e db yt h e c a l c u l a t e do ff l o wr a t ea n d d i f f u s i o nc o e f f i c i e n t t h eb r o m o c r e s o lg r e e na n dc o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u ed i f f u s i o nc o e f f i c i e n ta td i f f e r e n t f l o wr a t ew a sd e t e r m i n i n gt h r o u g ht h ee x p e r i m e n t a li n v e s t i g a t i o n so ft h er e a c t i o ns y s t e m so f s o d i u mh y d r o x i d ea n dp h e n o l p h t h a l e i n ，b l o o ds e r u mp r o t e i na n db r o m o c r e s o lg r e e n ，b l o o d s e r u mp r o t e i na n dc o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u e k e yw o r d s ：m i c r o f l u i d i cd e v i c e ；d i f f u s i o n ；d i f f u s i o nc o e f f i c i e n t ；m o l e c u l e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t ；m i c r o f l u i d i cc h a n n e l ；p r o t e i n ；n om e m b r a n ed i f f u s i o n 1 1 1 i 翟 l 1 - 4 1 微流控分析技术概述一8 1 4 2 微全分析系统( u 1 = a s ) 的发展一9 1 4 3 微流控分析系统的主要应用领域1 0 1 5 微流控芯片的多相层流无膜扩散理论模型1 1 1 5 1 层流扩散分离的理论基础1 1 1 5 2 多相层流扩散芯片构型1 2 1 5 3 多相层流扩散分离的应用1 4 1 5 4 多相层流扩散分离芯片的应用特点1 6 1 5 5 微流控多相层流技术发展的方向1 6 i v 东北大学硕士学位论丈目录 1 6 论文的目的和意义。1 7 第2 章实验1 9 2 1 仪器和试剂1 9 2 1 1 仪器1 9 2 1 2 式剂2 0 2 2 实验步骤。2 0 2 3 数据处理方法2 1 2 3 1 数据的采集2 1 2 3 2 扩散系数的计算步骤2 2 第3 章结果与讨论。2 5 3 1 酚酞试液与氢氧化钠溶液反应体系。2 5 3 2 牛血清白蛋白与b c g 溶液反应体系。2 6 3 3 人血清白蛋白与b c g 溶液反应体系。2 9 3 4 牛血清白蛋白与考马斯亮蓝g 2 5 0 溶液反应体系3 1 3 5 讨论及注意事项3 4 3 5 1 讨论3 4 3 5 2 在微通道中层流的条件3 5 3 5 3 注意事项3 5 第4 章结论。3 7 参考文献3 8 致谢。4 3 i v 东北大学硕士学位论文第1 章概述 第1 章概述 1 1 液相扩散系数研究的必要性 液相扩散系数在化工过程及传质过程中起着非常重要的作用，如在精馏、混合、萃 取、结晶和化学反应等过程中，扩散系数往往是这些单元操作及反应器设计的关键。近 年来随着生物化工、环境污染控制以及同位素分离的兴起与发展，液相扩散系数的研究 与应用领域也在不断扩展。正因如此，对液相扩散系数进行测定的必要性愈发突出。 综合所阅文献，常见的测定方法有膜池法、光干涉法及t a y l o r 分散法。其中，光 干涉法精度最高，但对设备及操作要求极为严格。膜池法和t a y l o r 分散法的共同优点 是操作简单，在普通实验室易于实现。膜池法数据准确，操作时间较长；t a y l o r 分散 法精度虽不及膜池法，但也有较高精度，而且测定周期短，适于大批量数据的测定。选 择何种方法，应依各自具体情况而定。 一， 1 2 液相扩散系数测定方法的近期研究进展 随着生物化工、环境污染控制等分离的兴起与发展，液相扩散系数的研究与应用领： 域在不断发展。 液相扩散系数是研究传质过程、计算传质速率及化工设计与开发的重要基础数据， 胤： 已广泛应用天生化及环保等新兴行业中。研究和积累各类体系的扩散系数一直被视为是 重要的应用基础研究。然而由于液体结构十分的复杂，分子堆积密度较大，分子问平均 距离远比气体分子小，又不及固体那样有规则排列，分子总处在较强相互作用的范围内， 所以液相扩散系数的测量和理论描述远比气体及固体困难，试验数据相当缺乏，有待于 进一步的测定和研究。 本部分详细阐述了全息干涉法和膜池法测量液相扩散系数的基本原理和方法，测定 了文献中少见的有机指示剂分子的液相扩散系数，以期为实际应用提供基础实验数据。 1 2 1 液相扩散系数的定义 根据f i c k 第一扩散定律，对一维扩散 j a 。一珥v 巳 ( 1 1 ) 1 东北大学硕士学位论文第1 章概述 其中，d f 表示f i c k 扩散系数。 对二元物系( 二元组分分别以a 或b 表示) ，采用固定体积参考系，在x 方向进行 一维扩散，则应表示为 r - 一百o c a ( 1 - 2 ) 或 其中相互扩散系数 j 。v 一一鲁 d a b = d 队 ( 1 3 ) ( 1 - 4 ) 对于固定质量、固定重心或固定摩尔量的参考系，等式( 1 4 ) 依然成立【1 1 。关于几 种参考系的详细研究请参阅文献【2 捌。本论文采用( 1 2 ) 式，即固定体积参考系，为方 便起见，扩散通量的上标v 以后省略。 除相互扩散系数外，还有内扩散系数d i ( i = a b ) ，以及自扩散系数d i i 。内扩散系 数与自扩散系数均表示组分对自己的扩散，只是内扩散系数指在混合物中，与组成有关； 而自扩散系数在纯物质中，与组成无关。 随着对液相扩散系数测定的研究和发展，学者们丌发出了很多种测量方法，它们大 多以f i c k 第一定律或第二定律为基础。总体说来，可以分为三大类： 一、扩散初始状态为似稳态，可以测量浓度梯度。 二、扩散初始浓度分布已知，实验终了时的浓度分布可以测量。 三、扩散初始浓度分布已知，在整个实验中不断或问歇地测量浓度分布。 + ：- 1 2 2 似稳态测量法 似稳态法计算较简单，一般对设备要求比较低，按f i c k 第一定律 将积分扩散系数表示为d ，则 d = ( a c o x ) 2 ( 1 5 ) 时，膜孔内壁与电解质溶液之间的双电层内电子发生迁移，使测得的扩散系数偏高【9 1 。 s t o k e s 9 l 在实验中采用1 耻m 的玻璃烧结膜，通过将密度大的液体置于扩散池上 室，密度小的液体置于下室，探讨了重力引起的主体流动对扩散的影响，提出应将密度 大的溶液置于下室。h i l d e r b r a n d l l 0 】采用一种相互平行并垂直地镶嵌在聚乙烯板中的一组 不锈钢毛细管构成的膜，由毛细管的规格可直接计算池常数。但毛细管再细，其孔径也 比玻璃烧结膜的孔径大得多，很难避免主体流动。 h a r t l e y 和r u n n i c l e s 曾提出一种绕斜轴转动的装置，让玻璃球随池的转动而在膜上 滚动以消除滞流层。由于球与膜的接触面很小，滞流层不能完全打破。 s t o k e s l 9 】提出的磁力搅拌装置，池外为一旋转磁场，膜的两侧装有两个带铁芯的搅 拌棒，重者上轻者下，外磁场一转，两搅拌棒便贴着膜转，打破膜表面的滞流层，使膜 池法迄今仍被认为是较准确且广泛使用的方法。 3 东北大学硕士学位论文第1 章概述 w e n d t 设计了一种自搅拌旋转膜池装置，电机使扩散池时转时停，池内液体由于惯 性作用而搅拌。这种方法比不上s t o k e s 的方法。p i e r r e l l l 】针对粘度较大的溶液，在上室 装有一个搅拌棒，下室于同一轴上装有两个搅拌棒，使液体充分搅拌，取得了较好的效 果。m i l l s 曾提出用泵进行外循环代替电磁搅拌。这种方法对泵要求很高，一般难以实 现。 从以上可以看出，s t o k e s 装置是最成功的一种，但它仍存在许多不足，表现在： 不适于测量挥发性液体； 未考虑混合时的体积改变【1 2 j ； 扩散时间太长。 为了克服前二种缺点，s a n n i 等设计- f _ 室膜池法。c h r i s t o p h e r l l 3 】对三室膜池法进 行了改进。在高温测量这一点上，膜池法优于光学法。k i r c h e r 还设计了用于测定高压 下液体扩散系数的膜池装置，可测定常压至约4 m p a 范围内的扩散系数。天津大学杨 晓宁和马沛生【1 4 】也对膜池进行改进，测定了高压下的扩散系数，压力高达2 0 m p a 。r a o l l 5 】 于1 9 7 1 年设计了一种似稳态的膜池装置，只要连续检测流进a 室和流出a 室溶液的 组成及流量，就可直接算出微分扩散系数。该法大大缩短了测定时间，但对分析及计量 仪器要求较高。为了缩短测定时间，g a g e 1 6 1 和k e e o v y l l 7 】曾用滤纸作扩散膜，但滤纸 强度差，不耐腐蚀，未能广泛应用。h a s h i t a n i 和t a m a m u s h i 【1 8 1 ，b o a r d 和s p a l d i n g l l 9 l 用 很薄的微孔高分子膜，也因强度差，在有机溶液中发生溶胀而被淘汰。 张建侯【2 0 , 2 1 1 、陈锦文【2 2 j 及杨晓 【1 4 l 均以金属膜代替玻璃烧结膜测定二元有机物系液 相扩散系数取得了成功。金属膜强度高，有效扩散面积大，对一般物系，测定时问可由 1 - - 3 天缩短为约两小时。陈锦文【2 3 】将扩散池上、下室设计为半球面，把具有恒定浓度 的溶液连续流过膜池下室，将测定时间进一步缩短为一小时。 膜池法还可用放射性或非放射性同位素来进行自扩散的研究。 二恒通量法 f i c k 在1 8 5 5 年以稳态实验为基础推导扩散定律时，采用了一种简单的装置：两端 开口的一根直管垂直放置，上端插入一溶剂储罐，下端插入一溶液储罐。c l a c k 在1 9 0 8 - 1 9 2 4 年问用一根方形管同样放置，借助折光率与浓度的关系，以测折光率来测定整个管 长中已达成稳态的浓度梯度，得到高精度的实验结果。尽管如此，其分析比光学方法更 复杂，结果未传用下来。 4 东北大学硕士学位论文 1 2 3 非稳态测量 t 。 。 符合这种要求的方法主要是毛细管法。这类方法中最古老而简便的 管进入装有溶剂或不同浓度溶液的大容器中。毛细管末端封口，直径均 知浓度的溶液，到终止扩散时可认为大容器内浓度不变。通过测量毛细管中的浓度梯度 或进入或流出毛细管中的物质的量，就可测得扩散系数。这种方法费时长，分析困难， 而且按理论要求初始浓度差应相当小，因而逐渐不受青睐。 毛细管法十分适用于测量微量放射性同位素的示踪扩散系数。因其经济而且简便， w a n g l 2 4 - 2 6 l 多次用它测量放射性碘的自扩散系数，以及用放射性或非放射性元素示踪的 化合物的自扩散系数【2 7 , 2 8 】。毛细管在这方面的发展还应归功于光电放大器的改进，高效 液状荧光物的发现以及光谱分析技术的进展。 1 2 4 光干涉法 光干涉法的原理是：在扩散过程中，扩散池中溶液浓度的变化导致池中不同位置溶 液的折射率不同。当入射光线射入时，产生干涉条纹，通过测量干涉条纹的特征尺寸计 算溶液的扩散系数。 对于两组分间折射率有合适差值的体系来讲，测量扩散过程中溶液折光率的变化最 可信赖的方法当属光干涉法。不过它对实验设备要求相当高，在获取和分析折光率数据 噫 时应非常小心。 g o u y 在1 8 8 0 年提出可将折射率的测量用于扩散实验，并对预想到的干涉现象进 行了定性解释，但首先推出光束通过溶液而弯折的方程并进行了实验的却是w e i n e r ( 1 8 9 3 年) 。t h o v e f l 在1 9 0 1 - - 1 9 1 0 问对该方程不断进行改进。l a m m 的改进当时非常 成功，被许多研究者采用。实验时一般将密度大些的均匀浓度为c o 的溶液置于扩散池 的下部，均匀浓度为c o 。的溶液置于上部，两溶液间要有一尽量清晰的界面。没有清晰 的初始条件，产生的结果不会精确。k a h n 和p o i s o n 采用毛细管虹吸技术使初始界面清 晰，l o n g s w o r t h l 2 9 1 采用该方法进行扩散实验，取得了良好的结果。c a l d w e l l 和b a b b i 蚓 在扩散池界面所处高度开设两条水平狭缝，可以从那儿抽取溶液，使界面很快清晰。 尽管g o u y 早在1 8 8 0 年就定性地讨论了不均匀浓度溶液中的干涉现象，但直到 1 9 4 7 年k e g e l e s 和g o s t i n g l 3 1 】才结合l o n g s w o r t h l 3 2 j 的实验数据提出了定量的解释。 l o n g s w o r t h 2 9 】利用主要条纹的位置等特征参数来求取扩散系数的方法最为著名。g o s t i n g 气 东北大学硕士学位论文第1 章概述 和o n s a g e r l 2 2 】对文献1 3 1 1 的公式进行了补充c a l d w e l l 和b a b b p 0 , 3 4 】所采用的计算方法也 很成功，所要求的折光率值可根据干涉照片上的主要条纹数来求取。此外，w o o l f 等【3 5 1 ， h a r r i s 也对g o u y 干涉仪的计算方法进行了研究。 研究者们设计了不少干涉仪，除了单色g o u y 干涉仪以外，还有双池干涉仪如 r a y l e i g h 干涉仪，m a t h z e h a n d e r 干涉仪，b a n g d a h l 干涉仪【3 6 】等。有关这些干涉仪条纹 的数学分析及与扩散系数有关的数学处理见文献【3 7 1 。干涉法用于非挥发性液体测得的扩 散系数的精度一般在0 1 误差范围以内，对于挥发性液体约为1 。 随着全息技术的发展，近年来产生了一种很有前途的新方法金息干涉法。全息干 涉法是将全息摄影技术应用在经典干涉中，通过在全息干板上记录两个不同时刻的干涉 条纹，然后进行叠加，产生一组新的条纹，再对其处理，结合f i c k 第一和第二定律或条 纹的判读、可测得液相扩散系数。 全息干涉法根据曝光次数可分为实时全息干涉法( 单次曝光法) 和两次曝光法。实时 全息干涉法就是使全息图在t 。时刻曝光，然后精确复位，此全息图将同t 2 、t 3 时刻的 全息图发生干涉，这些干涉图共同拥有第一次t l 时刻的曝光；两次曝光法，是在t l 时刻 拍下全息图后，不进行立即处理，而是过一段时间等液体内部组成发生变化后再进行第 二次曝光，然后对干板进行处理，这样全息干板记录下两个时刻的全息图，当用和记录 时参考光束入射方向相同的光照射此两次曝光得到的全息图时将得到干涉条纹。近年 来，随着激光全息技术的发展，人们对传递界面现象的研究也在逐渐深入，研究者们从 不同角度对其进行研究。有些文章从光学方面寻找简单准确的实验方法和数学处理；有 些文章从扩散机理来讨论溶液的扩散过程，研究浓度和浓度差等一些相关的影响因素对 扩散系数测量的影响。另外，不同的体系测量也使研究者们拓宽了研究范围，使其测量 数据越来越完善，所有这些研究领域都说明了全息干涉法的应用越来越广泛，而且所测 定的数据准确，为进一步测定其它体系奠定了基础。相信会有更多的扩散系数测定数据 应运而生。 一五 1 2 5t a y l o r 分散法 t a y l o r 分散法是将一种溶质( 或浓溶液) 注入到呈滞流流动的溶剂( 或稀溶液) 中去， 然后测量流动相中溶质浓度分布，进而计算相互扩散系数。它有许多不足之处，要求管 长若干米，实际上要加工成螺旋形，这必然会导致误差。n u g e l l 3 8 l 推导了螺旋形管导致 的误差，为了测定流动相中浓度随时问的分布，需使溶液流经微容检测室。在检测室中， 6 东北大学硕士学位论文第1 章概述 溶质进一步分散也会给扩散系数带来误差。 1 2 6 微通道无膜扩散法 化学反应显色法的原理主要参考分光光度分析法。利用显微镜和数码相机相联观察 微通道内两种不同溶液发生化学反应后的现象，通过计算能得出扩散系数。 高灵敏度化学反应是利用光、电、磁、热、声等各种信号对物质进行定性或定量测 量是仪器分析研究的主要内容。物质对光的吸收作用在分析化学中的应用已有近百年的 历史，目视比色法当属光度分析的雏形。有机试剂的引入、多元络合物的出现以及表面 活性剂的应用，极大地促进了该领域的发展。反应体系的创新，以提高检测的灵敏度和 选择性。在吸收定律式中，摩尔吸光系数是衡量灵敏度的重要标志，摩尔吸光系数值越 大，灵敏度越高。目前分析工作者的注意力大多集中在高灵敏反应体系和探索以及应用 数学方法对多组分重叠峰的解析，这势必拉动新显色剂的合成及对多元体系的研究。因 此，分析化学必须借助相近学科的成果来武装自己，才能迈出化学分析的门槛，踏上分 敬。 析科学之路。 ： 1 2 7 其它方法 放射性同位素法是一种以物质和其放射性示踪物之间的相互扩散系数代替自扩散 系数的方法，广泛应用于自扩散系数的测量。首先是w a l k e r 于1 9 5 0 年试探用接收扩散斡 过程中同位素发出的1 3 粒子的方法来测扩散溶液的浓度梯度，算出的扩散系数值误差 范围在4 以内。 核磁共振法( n m r ) 【3 9 1 具有抗干扰、测速快、适于高温高压下测定等优点，但只适 用于一定的物质。光散射法l 删适用于测量高分子溶液的扩散系数，对于一般二元有机溶 液，高浓度的测量精度大于低浓度的测量。另外还有离心旋转法、电导法、光电吸收法 等，它们使用不广泛，不再介绍。 液相扩散系数的测定方法较多，其中，光干涉法精度最高，但对设备及操作要求较 严格。t a y l o r 分散法的优点是操作简单，在普通实验室即可实现。有较高精度，而且测 定周期短，适于大批量数据的测定。但综合比较，全息干涉法操作简便，可实现实时测 量，是最有发展前途的一种方法。 7 东北大学硕士学位论文 第1 章概述 1 3 蛋白质 1 3 1 蛋白质的概念 ( 1 ) 重要性一蛋白质是生命的物质基础 蛋白质是细胞内含量最高的组分，酶、抗体、多肽激素、运输分子乃至细胞的自身 骨架都是由蛋白质构成的，蛋白质占许多生物体干重的4 5 5 0 以上。 ( 2 ) 元素组成一蛋白质是含氮元素恒定的生命物质 蛋白质中的主要元素c 、h 、o 、n 的含量分别是5 0 5 5 ，6 8 ，2 0 2 3 ， 1 5 1 8 ；其中n 元素的含量在各种蛋白质中很相近，平均为1 6 ，故n 为蛋白质的 特征性元素，即蛋白质是一类含氮的生物大分子。 1 3 2 蛋白质的分类 现在采用的蛋白质的分类主要有3 种：一是根据蛋白质分子的形状；二是根据蛋白 质组成的繁简；三是根据蛋白质的溶解性质。 根据溶解度可将蛋白质分为下列几类： 清蛋白：又称白蛋白，是溶于水的，如血清白蛋白、乳清白蛋白等。 精蛋白：溶于水及酸性溶液，含碱性氨基酸较多，故呈碱性。 组蛋白：溶于水及酸溶液，含碱性氨基酸较多，故呈碱性，它们常是细胞核染色质 组成成分。 球蛋白：微溶于水而深于稀中性盐溶液，如血清球蛋白、大豆球蛋白等。 谷蛋白：不溶于水、醇及中性盐溶液，但溶于稀酸、稀碱、如米、麦蛋白。 醇溶蛋白：不溶于水，溶于7 0 8 0 乙醇。 硬蛋白：不溶于水、盐、稀酸、稀碱溶液，如胶原蛋白、丝蛋白等。 1 4 微流控分析技术 1 4 1 微流控分析技术概述 微流控分析技术从九十年代初研究兴起，到现在对该技术已有了多种名称，如：微 流控系统( m i c r o f l u i d i cs y s t e m ) 1 4 1 1 ；微全分析系统( m i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m ，即u - t a s ) 【4 2 】；芯片上的实验室( 1 a b o nac h i p ) ；微诊断系统( m i c r od i a g n o s t i cs y s t e m ) 【4 3 】；平板芯片 8 现微机控制的自动化的快速定量操作。自从微全分析系统的概念提出以来、由于芯片分 析本身具有试样消耗少、分析时间短、效率高、尺寸小、集成度高和便携等优点、在短 短的1 0 余年中就已经发展成为当前世界上最前沿的科技领域之一。其中微流控芯片是 1 9 9 0 年代初中期在分析化学领域发展起来的一门新型的分析科学。该门学科以分析化学 为理论基础，结合微机电( m i c r oe l e c t r i c a lm e c h a n i c a ls y s t e m s ，m e m s ) 加工技术方法， 主要以微管道网络为结构特征，被广泛应用于分离分析、生物科学和生命医学研究等众 多领域，是当前微全分析系统领域发展的重点。基于微通道的特点而发展起来的多相层 流技术分析方法，由于其结构加工简单、操作方便易行、分析功能强大和应用前景广泛 等优势而得到人们的普遍关注m 。 1 4 2 微全分析系统( u t a s ) 的发展 微全分析系统( u t a s ) 是为了适应信息时代的需要，最早在1 9 9 0 年提出的。一个 实现所有自动分析步骤( 包括：取样、预处理、样品转移、化学反应、待测物分离、测 定、产品分离和数据处理等) 的集成系统被称为微分析系统( t o t a la n a l y s i s ，t a s ) 4 8 】。 其最终目的是通过化学分析设备的微型化与集成化，最大限度把分析实验室的功能转移 到便携的分析设备中，实现分析实验室的个人化、家用化。因此，微全分析系统也被称 为芯片实验室( l a p c h i p ) 。 微全分析系统的概念首次由瑞士g i b a g e i g y 公司的m a n z 与w i d m e r 提出【4 9 1 ，次年 他们即在平板微芯片上实现了毛细管电泳与流动注射分析，从而把微流控系统的主要构 型定位为一般厚度不超过5 毫米，面积为数平方厘米至十几平方厘米的平板芯片【5 0 1 。从 1 9 9 4 年开始，美国橡树岭国家实验室r a m s e y 等1 5 1 】在m a n z 的工作基础上发表了一系列 论文，改进了芯片毛细管电泳的进样方法，提高了其性能与实用性，引起了更广泛的关 注。首届会议在荷兰e n c h e d e 以工作室的形式举行，起到了推广微全分析系统的作用。 9 东北大学硕士学位论文第1 章概述 1 9 9 5 年美国加州大学伯克利分校的m a t h i c s 等人【5 2 】在微流控芯片上实现了高速d n a 测 序，微流控芯片的商业开发价值开始显现，而此时微阵列生物芯片已进入商品开发阶段。 同年9 月，首家微流控芯片企业c a l i p e rt e c h n o l o g i e s 公司在美国成立，又将基因分析中 有重要意义的聚合酶链反应( p r c ) 扩增与毛细管电泳集成在一起【5 3 l ，展示了微全分析 系统在试样处理方面的潜力，次年他们又实现了微流控芯片上的多通道毛细管电泳d n a 测序，从而为微流控芯片在基因分析中的实际应用提供了重要基础。1 9 9 8 年之后专利之 战日益激烈，一些微流控芯片开发企业纷纷与世界著名分析仪器生产厂家合作，利用各 自的优势技术平台抢先推出首台微流控分析仪器。 与此同时，随着微全分析系统的发展，已举行了五届国际微全分析系统会议使相关 的各学科学者在同一个会议中进行交流。1 9 9 4 年在荷兰e n s c h e d e 举行了首届国际微全 分析系统国际会议，当时仅有1 6 0 余人参加，但起到了推广微全分析系统的作用。1 9 9 6 年在瑞士巴塞尔举行的第二届会议上，与会人数增至2 7 5 人，于1 9 9 8 年在加拿大b a n f f 举行的第三届会议上又猛增至4 2 0 人，于是决定由每两年举行一次会议改为每一年半举 行一次。2 0 0 1 年5 月又一次在e n s c h e d e 举行的第四届会议，与会人数又增至6 0 0 以上， 使组织者不得不设立分会场。为了保证会议的高质量，在会议收到的2 3 0 篇稿件中，只 采用1 4 3 稿。会议充分反映出这一科技前沿领域的异常活跃及高速发展，同时也反映各 科技强国在此领域的激烈竞争。 1 4 3 微流控分析系统的主要应用领域 微流控芯片在分析仪器微型化，集成化和便携化方面的巨大潜力为其在生物医学、 高通量药物合成筛选、农作物的优选优育、环境监测与保护、卫生检疫、司法鉴定、生 物战剂的侦检和天体生物学研究等众多领域的应用提供了广阔的前景。 生物医学是当前微流控芯片的主要应用领域，针对人类基因与疾病关系的研究，研 究适用于单核菅酸多态性( s n p ) 检测、d n a 测序及后基因组时代的蛋白质测序的微流 控芯片是当务之急。用于临床检验的微流控芯片在我国将拥有最广泛的市场。 新药物的合成与筛选是微流控芯片另一个可发挥重要作用的领域。由于进行的是微 型化的反应及在线测定，筛选过程可大大加速，费用大大降低。微流控分析芯片在新一 代药物问世的过程中将可能起到至关重要的作用。 微流控分析是一种具有小型化、自动化、集成化、一体化和廉价、节省等优点的分 析体系，有可能被用于生产与过程的在线监控、生命科学、环境科学等许多领域。其灵 】0 东北大学硕士学位论文第1 章概述 活多样性和广泛的适应性预示着它的应用前景十分广阔，它将促进光谱分析仪器在微型 化的基础上更加简易化、专用化、便携化和智能化，从而进入生产现场、病房、乃至千 家万户，使分析科学空前普及。有人估计其未来市场将在五十亿美元以上，但毕竟它的 研究时问尚短，还有许多问题有待解决，尤其是在灵敏度、响应速度不丧失的条件下， 如何把检测集成在芯片上。这些问题的解决需多学科的融合与协作。微流控分析方法虽 然尚不够成熟，但已显示出它的巨大优越性，它的研究发展将会给分析化学带来一个新 天地，并使分析实验室进入低消耗、低污染、低毒性的绿色分析时代。 1 5 微流控芯片的多相层流无膜扩散理论模型 1 5 1 层流扩散分离的理论基础 1 5 1 1 层流原理 雷诺实验表明，流体的流动状况不仅与液体的流速有关，而且与液体的密度p ， 粘度t 和流体通道的几何尺寸( 如圆形管道的管径d ) 有关。由此得到r e = d u p , u ，其中 r e 即为雷诺数，用以判断液体的流动形态：该式表明雷诺数与管径、流体流速、流体 密度成正比，与流体的粘度成反比，其实质反映了流体流动中惯性力与粘滞力的对比关 系。流体的流动型态根据雷诺数r e 的大不可分为层流和湍流两种型态。当流体流速较 小时，流体质点只能沿流动方向做一维运动，与其周围的液体间无宏观的混合，即分层 流动，而且流体的流速稳定，这种流动型态即为层流；当流体流速增大到某个值后，流 体质点除流动方向上的运动之处，还向其它方向做随机运动，即存在流体质点的不规则 脉动，彼此混合即为湍流【5 4 1 。当惯性力占主导地位时，r e 较大，湍流程度较大；当粘 滞力占主导地位时，则r e 较小，将抑制流体的湍动，以层流为主。 典型的微流控通道结构需要样品和试剂量在1 0 0 n l 和1 吮l 之间，甚至更少，微流 控通道的直径范围在几十到几百微米。根据r e = d u p , u 可知，在微流控通道中流体的流 速越低，试剂的粘度越大则流体的r e 越小。基于微芯片上通道的尺寸特点可以了解到 流体在通道内均呈现层流特性。因此，当两种或更多不同试剂流同时流入同一通道中， 各试剂流能够同时保持自身的流型不变而只在相与相的接触界面上发生反应或分子扩 散现象，并且具有较高的稳定性和重现性。大量的文献报道了应用前景广泛等优势而得 到人们的普遍关注。 1 5 1 2 层流形成 1 1 东北大学硕士学位论文第1 章概述 与常规液相流动分析系统相比，微流控分析系统通道尺度的减少，带来的一个重要 变化是在微通道内的液相流体一般为十分稳定的层流的流动状态，这一点也是目前微流 控系统与宏观系统相比的主要特殊性之一。 利用雷诺数的数值大小可以判断流体的流动形态。在特定的流体流动形态下，雷诺 数r e 是一个与惯性力和黏力之比有关的无量纲参数，对于圆形通道其定义为： r e - # d c v ( 1 - 8 ) 式中：p 为流体的密度；v 为流体的流速；d c 为管径；为流体的黏度。 通常r e 4 0 0 0 时，液体流动表现为 湍流；2 0 0 0 r e 4 0 0 0 时为过渡流，属不稳定流。【5 5 1 通常在芯片上微加工区得到的通道是梯形槽，可近似认为矩形槽，其雷诺数的表达 式为( 1 9 ) t 5 6 1 ： r e - 世竽( 1 - 9 ) 式中：彳为交界面面积；p 为润湿周边长；4 p ) 表示液体动力半径 在微流控芯片中，通道深仅为数十至百微米。而在1 0 0 t m 深的通道中，对1 0 m m s 流速的水，其r e 值约为1 0 。因此正常流速下，在微米尺寸的管道中，稀溶液的雷诺 数远小于1 ，此时，流体中的惯性效应可以忽略，流体总是表现为极其稳定的层流状态。 这种情况下，控制两种溶液经交叉点混流后，如不采取强制混合措施，则两束流动的流 体在同一通道中可以平行流动，形成不相混合的两相。 利用此层流效应一方面造成了溶液充分混合的困难，同时也相应地产生了新的应 用。多相层流控制技术在微流控系统中的应用非常广泛，应用最多的部分是试样的前处 理系统，包括无膜过滤、渗析、萃取等。其次是在进样系统中，如夹流进样、门式进样、 二维电泳时的二次进样等系统。在夹流进样系统中，利用多相层流控制技术消除分散效 应对进样的干扰。在门式进样、二维电泳的二次进样系统中，利用多相层流控制技术应 用的领域还包括进行相间反应，液流切换、甚至芯片微加工过程等。 1 5 2 多相层流扩散芯片构型 利用多相层流不但可实现小分子、离子与大分子、微粒之间的分离，若采用适当的 检测方式，还可在分离的同时直接进行检测。y a g e r 等提出了h 一过滤( h f i l t e r ) 系统和 1 2 f i g 1 1b a s i cs t r u c t u r eo fm u l t i - p h a s el a m i n a rf l o wd i f f u s i o ns e p a r a t ec h i p a h 过滤芯片；b t - 传感器芯片 h 过滤系统由试样流和接受液流组成。1 、2 分别为接受液和试样液的进样口，3 、 4 分别为接受液和试样液的出液口。在重力或微注射泵的推动下，接受液和试样液分别 从各自的进样1 3 进入并汇合于主通道，以肩并肩的方式平行流过主通道( 见图1 2 ) 。由于 小分子扩散快，大分子或微粒扩散慢，因此，在一定时间内试样中只有小分子物质可扩 散进入接受液( 被接受液提取) ，最后可分别在3 、4 流出口处收集含提取物的接受液和除 去提取物后的试样液以供后面进一步分析，如图1 2 。 ( a )( b ) 图1 2 多相层流分离过程示意图 f i g 1 2s c h e m a t i co fm u l t i p h a s el a m i n a rf l o ws e p a r a t ep r o c e s s ( a ) 低雷诺数卜层流状态；( b ) 两稳定的液流 1 3 p 东北大学硕士学位论文第1 章概述 在t 传感器中，试样液和试剂溶液( 如酸碱指示剂、荧光标记试剂、抗体等) 在重力 或注射泵的推动下，从各自的进样口进入，并在主通道形成稳定的两相，试样中待测组 分如h + 、n a + 等小分子、离子快速扩散进入试剂相并在界面发生反应，利用两相界面间 试剂颜色的变化等，可定量测定待测组分的含量。如图1 3 所示。 1 5 3 多相层流扩散分离的应用 图1 3t _ 传感器 f i g 1 3 t - s e n s o r ( 1 ) 试样的净化 对含有不溶性微粒子的试样如血液，基于多相层流的扩散作用，根据粒子大小不同， 扩散系数不同，可快速实现小分子、离子与大分子及微粒之间的分离，对试样进行净化， 代替常规的离心、过滤、渗析等分离方法。 ( 2 ) 复杂试样中单组分分析 多数检测方法需要预先将试样中分析物与不相溶的试样组分或其测定有干扰的组 分分开、但在多相层流结构中，依靠层流和基于扩散的混合分离原理可直接检测复杂试 样中单个组分。 s a t o 5 7 】等利用多相层流、小分子扩散作用在界面反应形成有色络合物的原理，建立 了f e ( i i ) 的测定方法。将f e ( i i ) 和邻菲罗啉的水溶液分别从两进样口引入通道中，汇 合后在分离检测通道中形成两相，通过分子的扩散作用，f e ( i i ) 与邻菲罗啉在两相的界 。1 4 东北大学硕士学位论文 第1 章概述 面进行混合、反应形成红色配合物，在汇合点下游的4 m m 处，利用热透镜进行检测。 图1 4 为微通道系统，由三个进样通道( 参比液、检测液、试样液) 和一个分离检 测通道组成，可建立基于扩散的自我参比检测方法。y a g e r 等已将该方法用于人血液中 血清白蛋白，血液p h 等的测定。如在人血清白蛋白的测定时，以分子荧光探针白蛋白 蓝5 8 0 作为检测批示剂，一定浓度的血清白蛋白为参比液。当三束流体平行流过分离通 道时，在汇合点下游的一定距离处沿检测通道宽度方向用c c d 测得荧光信号图谱，从 图谱可以获取多方面的分析参数。 图1 4 自我参比的t - 传感器 f i g 1 4t - s e n s o ro fo n e s e l f r e f e r e n c e 1 起始液流的边界；2 参比液流；3 充满粒子的试样；4 检测液扩散进入参比液中；5 参比