（应用化学专业论文）手性化合物的高效液相色谱分离及酶法拆分中的应用.pdf

浙江工业大学硕士学位论文中文搐耍 摘要 本文首先对手性药物研究的现状以及手性药物拆分方法、高效液相色谱分离 测定手性化合物进行了介绍，并对有机相酶催化反应以及酶催化转酯化反应的研 究与应用进行了概括性论述。菊酸、0 c 一氰基3 苯氧基苄醇( c p b a ) 是合成具有 高杀虫活性拟除虫菊酯类杀虫剂的重要中间体，本文对高效液相色谱手性固定相 法分离和测定c p b a 、菊酸手性中间体的含量及其分离机理进行了研究，并将建 立的可靠、快速的分离测定c p b a 对映体含量的方法用于脂肪酶在有机溶剂中 催化d 氰基3 苯氧基苄醇乙酸酯( c p b a c ) 的非对称转酯化反应合成s ，c p b a 的研究，得到了很好的结果。 首先对菊酸和氰醇手性中间体进行高效液相色谱分离研究，针对不同样品选 择了不同的手性柱，在此基础上选择了检测波长、不同的流动相体系及样品流速， 研究了柱温对分离的影响，并且通过热力学关系式求出了s c p b a 的h o 为 3 4 0 6 k j m o i i ，r - c p b a 的h 8 为- 3 7 1 9k j m 0 1 - i ，( + ) 反式菊酸的h 8 为一4 1 7 9 k j m o l 一，( ) 反式菊酸的h 。为4 2 9 7k j m 0 1 ，( + ) 顺式菊酸的h 。为4 9 0 6 k j m o l 。，f i ) j 顷式菊酸的钟为4 9 3 7 “m o l ，最后得到了优化的色谱分离条件， 其中，c p b a 的分离条件为：色谱柱为s u m i c h i r a l0 a - 4 4 0 0 ( 2 5 c m 4 6 蛐m ， 5 u m ) ，流动相为正己烷二氯乙烷乙醇( 8 7 ：1 0 ：3 ，体积比) ，流速为1 0 m l i n 1 ， 检测波长2 5 4 n m ，柱温1 5 ，进样量5 p1 。菊酸的分离条件为：色谱柱为双 s 啪i c h i r a lo a 2 2 0 0 ( 2 5 c m 4 6 m m m 。5 u m ) 柱串联，流动相为正己烷乙酸( 9 9 9 ： 0 1 ，体积比) ，流速为o 8 m 1 m i n ，检测波长2 5 4 啪，柱温1 0 ，进样量5 ul 。 在此条件下，分别对它们进行了线性关系和回收率的测定，并对它们分离的机理 进行了初步探讨。 然后将分离测定c p b a 对映体含量的方法用于脂肪酶在有机溶剂中催化 c p b a c 的非对称转酯化反应合成s - c p b a 的研究，选择了较好的酶反应体系。 通过对实验室现有催化转酯化反应活力较高的1 0 个酶进行筛选，选出了具有较 高活性和对映体选择性的7 撑、1 0 捍、1 3 # 酶。接着先后进行了反应溶剂和酰基受 体的选择，对1 5 种溶剂( 包括混合溶剂) 和1 4 种醇进行了比较，确定出较佳的 浙江工业大学硕士学位论文中文摘要 反应体系分别为7 群酶、四氢呋喃、甲醇和烈酶、二氯甲烷、甲醇。然后对各种 反应的影响因素进行了考察，结果表明该反应的较适条件为：反应温度为3 5 4 5 、脱水溶剂加水量为o 1 、反应时间应控制在4 天以内、摇床转速应大于 2 0 0 r p m 、c p b a c 和醇的比例应大于l ：0 5 、c p b a c 为3 3 7 0 8 r r u t l 0 1 1 0 左右时酶 量为1 0 m g m l 1 就可满足反应需要。研究结果还表明在两种溶剂中底物c p b a c 和产物c p b a 均会对反应产生抑制作用；酶在二氯甲烷中更容易失活，仅反应3 次酶活力就下降到不足初次反应的2 0 ，而在四氢呋喃中经过9 次反应酶活力还 可达到初次反应的5 0 ，1 7 次反应后为初次反应的2 l ，6 。接着进行了3 5 升规 模的放大实验，得到对映体过剩值( e c ) 大于9 8 ，产物得率为4 3 8 5 的良 好结果。 关键词：高效液相色谱、一氰基一3 一苯氧基苄醇、菊酸、手性拆分 1 1 浙江工业大学硕士学位论文 英文摘要 a b s t r a c t t h ec u r r e n ta d v a n c e si nc h i r a l p h a m l a c e 嘶c a l sr e s e a r c h ，也em e t h o d sf o r r e s o l u t i o n o fc h i m l p h a i l a c e u t i c a l s a n d s e p a r a t i o n a n dm e a s u r e m e n t b yh i g h p e r f 0 肌a i l c ei i q u i dc t i r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) w e r er e v i e w e d t h e r e s e a r c ha n d a p p l i c a t i o n o ft h e b i d c a t a l y s i s i n o 唱a n i c m e d i aa n dt h e e n z y m e c a t a l y z e d t r a n s e s t e d f i c a 6 0 n 、v e r eo u t i i n e = d ，( 、埘s a n t h e m i ca c i da n dq c y a n o 一3 p h e n o x y b e n z v i a l c o h o l ( c p b a ) a r ei m p o n a l l “n t e n n e d i a t e sf o rs y 血e s i so fp y r e t h r i o di n s e c t i c i d e s ， w l i c hh a v eh i 曲l e v e lp e s t i c i d ea c t i v i 啦i nt 1 1 i s a n i d e ，r e s e a r c ho fs e p a r a t i o na n d m e a s l l r e m e n to fc 1 1 i r a lc h r y s a n t h e m i ca c i da i l dc p b ac o n t e mb vh p l cc h i r a l s t a t i o n 棚- yp h a s e s 瑚e t l l o da n dm es e p a r a t i o nm e c h a l l i s mw e r ec o n d u c t e d a r e rt h e r e l i a b l ea n dq u i c km e a s u r e i n e n tm e t h o df o rc p b aw a ss e tu p ，t h i sm e t l l o d 、v a s 印p l i e d t om o n i t o rc p b ai nt h e u r s eo fl i p a s ec a 协l y z e da s y m m e t r 主c 枉a n s e s t e r i c a t i o no f c 【一c y a i l o 一3 - p h e n o x y b e n z y la c e t a t e ( c p b a c ) t os c p b a f i r s t ，c h j r a li n t e n n e d i a t e so fc 1 1 r y s a i l t h e m i ca c i da n dc p b a 、 r e r es 印a r a t e db y h p l c d i f r e r e n tc h i r a lc o l u 枷sw e r es e l e c t e df o rd i f i e r e n ts a m p l e s ，d e t e c t i o nw a v e l e n 或h ，m o b i l ep h a s ec o m p o s i t i o n ，s a m p l en o w r a t ea 1 1 dc 0 1 u m n t e m p e r a t u r ew e r ea l s o c h o s e nt oo p t i m i z e d t h er e s u i t ss h o w e dt h a tl o wt e m p e r a t l i r ef a c i l a t e ds e p a r a t i o n e 路c t ，a c c o r d i n gt ol h e n n o d y n 锄i cf o 脚u l a 也e h 。f o rs c p b a w a s 3 4 0 6 k j m 0 1 1 ， a 1 1 df b rr c p b a h ”w a s 一3 7 1 9l ( j m o l h 9f b r ( + ) 一仃a n s ，( ) 一t r a n s ，( + ) - c j s ，( 一) 一c i s c h r v s a i l 廿1 e m i ca c i d w e r e - 4 1 7 9k j - m o r l 、- 4 2 9 7k j - m o r l ，- 4 9 0 6k j m o l 一，一4 9 3 7 k j m o j - j 豫币e c t i v e l y f i n a i l yt h eo p t j m i 勰ds e p a 斌i o nc o n d i l j o n sw e r cf - o l l o w e d ：f o r c p b a ，c l l i m lc 0 1 啪：s 啪i c h i m lo a 一4 4 0 0 ( 2 5 c m 4 6 咖巾，5 p m ) ，m o b i l ep h a s e ： n - h e x a i l e 一1 ，2 一d i c l l l o r o e m a l l e e t h a i l o l ( 8 7 ：1 0 ：3 ，v o l u m er a t i o ) ，n o wr a t e ：1 om 1 m i n 1 ， u vd e t e c t i o nw a v e l e n 昏h2 s 4 眦l ，c o l u m nt e m p e m t u r c ：1 5 ，s 锄p l ei n j e c t i o nv o 】n m e ： 5 山；f o rc h r y s a n t h e m i ca c i d ，c h i r a lc o l u m n ：t w os m n i c h i r a lo a - 2 2 0 0 ( 2 5 锄4 6 嘞审， 5 岫) w e r eu s e di ns e r i e s ，n 1 0 b i l ep h a s e ：n - h e x a i l e - a c e t i ca c i d ( 9 9 9 ：0 1 ，v o l u m er a t i o ) ， n o wr a t e ：o 8m 1 m i n - 1 ，u vd e t e c t i o nw a v d e n 酉h2 5 4 蛳，c o l u n mt e m p e r a c u r e ：l o ， s a n l p j ei n i e c t j o nv 0 2 唧e ：5 以m d e r t h e s ec o n d j t i o n s ，e x p 甜m e n t a jr e s u l t ss h o wt h a t l i n e a r r e l a t i o n s h i p a n dr e p e a t a b i i t ya r e g o o d ，t h e nt h e i rs e p a r a t i o nm e c h a n i s m 、a s a n a l y s e db r i e n y t h em e m o df o rs e p a r a t i o na n dm e a s 】r e m e n to f c p b a 锄a n t i o m e rw a sa p p l i e d t o1 i p a s ec a t a l y z c da s y m m e 喇ct r a l l s e s t e r i f i c a t i o no fc p b a ct os - c p b a t h es u i t a b l e e n z y m ec a t a l y z e dr e a c t i o ns y s t e mw a sc h o s e n 3 6l i p a s e sf 如md i 珏宅r e n t s o u r c e sw e r e s c r e e n e d ，1 0o f m e ms h o w e dh i 曲e rc a t a i 州ca c t i v i t ya n dw e r es c r e e n e da g a i n ，l i p a s e s o f 7 撑、1 0 撑、1 3 萍s h o w e dh i 幽e re n 卸t i d s e l e c t i 够1 5d j 日色r e n to 曙a n i cs o l v e m si n c 】u d e m i x e ds 0 1 v e n t sa n d1 4d i f f 色r e n ta l c o h o l sw e r ec o m p a r e d ，t h fa n dd i c h l o r o m e m a n e i i i 浙江工业大学硕士学位论文英文诮姜 w e r et h eb e s to r g a l l i cm e d i a ，a n dm e t h a n o lw a st 1 1 e b e s t a c y la c c e p t e l t h u st h e p r c f e r a b l es y s t e mf o rm ea s y m m e t r i cr e a c t i o n 、e r e ：7 群、t h f 、m e m a n o l a i l d7 拌、 d i c h l o r o m e 幽a n e 、m e 伽a n 0 1 w h e nm er e a c t l o nc a 玎i e do u ti n h eo p t i m u ms y s t e m s a b o v e ，s e v e r a lf a c t o r sm a ta f r e c t i n g 也er e a c t i o nw e r ei n v e s t i g a t e di nd e t a i l t h er e s u l t s i n d i c a t e dt l l a tt r a c ew a t e “0 - 1 0 ) i sd e s i r e di nt h er e a c t i o n ； 1 ：0 5i st h ei d e a lm o l a r r a t i oo fc p b a c ：a l c o h o lf o rm er e a c t i o n ：3 5 - 4 5 i san i c ec h o i c ef o rt h er e a c t i o n ； s h o n e nt h er e a c t l o nt i m e ( 2 0 0 r p m ，t h ee x t e m a ld i 丘h s i o nl i m i 协t i o no ft l l e 陀a c t i o n 、o l l l db eo m i n e d ；1 0 m g - m l 叫l i p a s ei 5e n o u 曲w h e n3 3 7 0 8 唧o l l uc p b a ci su s e d ； t h ei i 血i b i t i o n so fs u b s t r a t ea n dp r o d u c tw e r eo b s e r v e d ； 9 0 o f 血ec a t a l y t i ca c t i v i t y o ft h el i d a s ew a sl o s sa n e r4a n d2 4m so fu s ei nd i c h l o r o m e t l l a n ea n dt h f r e s p e c t i v e l y w h e nt l l e 形t i o nc a i t i e do m i nt h ff o rp r e p a r a t i o na4 3 8 5 y i e l do f s c p b aw i t h 9 8 e e w a so b t a i n e d k e yw o r d s ： h p l c 、0 c - c y a n 0 3 一p h e n o x y b e r 了la l c o h o l 、c h r y s a l l t l l e m i ca c i d 、 c h i r a lr e s o l u t i o n i v 浙江工业大学硕士学位论文第一幸文献综述 第一章文献综述 1 1 引言 1 1 1 手性及手性药物简介 一个物体若与自身镜象不能叠合，就称该物体具有手性【1 】。手性是自然界的一 种普遍现象，构成生物体的基本物质如氨基酸、糖类等都是手性分子，手性分子 的化学、物理和生物活性都是与手性环境密切相关，生命现象离不开手性，生物体 系统内部的受体酶、核酸、蛋白质及多糖等都具有与其功能相适应的手性结构。 手性药物( c h i r a ld n l g ) 是指其分子立体结构和它的镜像彼此不能够重合，互为 镜像关系而又不能重合的对药物对映体【2 】或称含手性因素的药物【3 】。手性药物的 不同立体异构体往往表现出不同的生理活性，药物、农药以及其它生物活性物质 的手性对其生物应答关系，如在体内的吸收、转运、组织分配、与活性位点作用、 代谢和消除等都有重要影响【4 1 。手性药物的选择性作用( 不同异构体的不同生理活 性) 通常可用受体理论来解释，受体分子是生物体内一类对特定分子结构的结合 位点有较高亲和作用的蛋白质，受体与药物的相互作用类似于酶与底物的结合， 早在1 9 2 6 年就有人提出了药物受体相互作用的对映体选择性思想，目前广为接受 的药物异构体受体相互作用模型为e a s s o n - s t e d m a l l 模型如图1 1 ，图中x y z 为药 物手性中心周围的三个基团，x ，y 7 z 为受体蛋白的结合位点，这种模型能够很好地 解释手性药物的不同异构体与受体的相互作用【引。 uu xz y x 弋：7 z y z x y x 弋：7 z y m a t c h i n g m i s m a t c h i n g 图l le a s s o n s t e d m a n 三点作用的模型 随着研究的深入，人们发现手性药物光学异构体的药理活性大致有以下几个 类别【2 ，4 】：( 1 ) 无药理活性或药理活性很低的光学异构体，如抗菌药氧氟沙星其活 浙江工业大学硕士学位论文第一幸文献缘连 性主要是s 一( 一) 异构体产生，而r ( + ) 异构体几无药理活性；抗生素类药物氯霉素 ( s ，s ) 一异构体无药理活性，只有( r ，r ) 异构体有活性：d 一肾上腺素受体阻断剂普萘 洛尔( 心得安) ，左旋体比右旋体强1 0 0 倍等。( 2 ) 药理活性相等或相近的光学异 构体，属于这类药物已见报道的有：抗凝血药华法林，解痉利尿药丙羟茶碱，抗 组织胺活性药异丙嗪，抗肿瘤药呋氟啶等。( 3 ) 药理活性不同的光学异构体，如 丙氧芬的右旋体( 2 s ，3 r ) 为镇痛药，但左旋体( 2 r ，3 s ) 具有镇咳作用；索他洛尔r ( ) 异构体为p 一受体阻滞剂，s ( + ) 异构体则是很具有前途的抗心率失常药等。( 4 ) 药 理活性相反的光学异构体，如扎考必利，r - 异构体为5 一h t 3 受体拮抗剂，而s 异构体则为5 一h t 3 受体激动剂，利尿药依托唑啉，仅左旋体( ) 有利尿作用，而右 旋体( + ) 则有抗利尿作用。( 5 ) 有严重副作用的的光学异构体，如反应停r 对映体 起镇静作用，s 对映体有强烈的致畸作用；d 青霉胺为铅、汞中毒治疗剂，l 青 霉胺会使嗅觉、视觉衰退等。 1 1 2 手性药物拆分与测定的重要性 一个半世纪以前，人们就对手性分子有了认识。1 8 4 8 年，l o u i sp a s t e i l r 用放 大镜和镊子成功地分离了酒石酸铵盐的外消旋体，他的先驱工作标志着手性分离 的开始。随着生命科学和有机立体化学的发展，提供药效高、毒副作用小的光学 纯医学和农药己成为现代医药学和农药学研究的重要内容。生物体内的手性环境， 如酶、受体、抗体等与药物对映体的生物活性密切相关，药物对映体和它们的代 谢物常常表现出不同的药理和药代特性【5 刊，使用外消旋体药物能导致错误的药代 行为和作用模式。但遗憾的是在过去相当长的时间里，在制备医药、农药时这种 差别没有予以充分的考虑，大多数手性化合物只以外消旋体化合物开发出来就作 为产品叽 在美国医药药物名称词典所列出的2 0 5 0 种药物中，大约有半药物分子中至 少包括一个手征性中心，有4 0 0 多种药物以外消体或非对跌体异构化形式服用， 限于分离测定技术上的困难，其大部分对映体的疗效及药物动力学、对哺乳动物 的毒性、体内的吸收、代谢等方面的差别远未被深入研究嫡l 。基于已发现许多手性 药物各对映体生物活性的显著差别和产生的严重后果，1 9 9 0 年，美国食品药物管 理局作出第一个政策性规定：今后凡研制具有不对称中心的药物，必须对其各个 对映体进行测定和评价 引。 获得手性药物的途径主要三个即从自然界中分离、非对称合成、外消旋体拆 浙江工业大学硕士学位论文摹一章又款维莲 分，具体有如下方法【1 0 忙】：( 1 ) 从天然存在的光活性化合物即“手性池，中获得， 自然界中本身存在很多手性化合物如萜类、氨基酸、羟基酸、糖类、生物碱等， 这些化合物通常统称为“手性池”( c 扯r a lp 0 0 1 ) ，直接从天然来源获得手性化合物， 原料丰富，价廉易得，生产过程简单，所得产品旋光度高( 个别例外) ，通常产量 较大，可达1 0 2 1 0 3 吨年，用此法生产的产品有l 赖氨酸、山梨醇、抗坏血酸等， 但由于产品种类有限，此法难以广泛实施。( 2 ) 不对称合成( a s y m m e 埘cs y n t h e s i s ) ， 不对称合成法是在化学催化剂或酶的作用下合成得到单一对映体化合物的方法。 化学不对称及生物不对称合成近2 0 年来取得了长足进步，并且已开始进入工业化 生产，化学不对称合成需要手性源，而且使用的手性催化剂大多数含有重金属， 因此在制药工业上的应用受到一定限制，生物催化不对称合成不需要手性源。并 且具有很高的对映选择性，因此具有较好的研究前景。( 3 ) 外消旋体拆分，外消 旋体拆分是将外消旋体分离得到纯单一对映体，这种方法已被广泛使用，据统计 大约有6 5 的非天然手性药物是由外消旋体或中间产物的拆分得到的。目前制备 得到这些高效的单一手性化合物具有广泛的应用价值，但如何检测制各方法的效 率，又必须建立一套准确可靠又简便可行的分析方法。因对耽体在非手性环境中， 由于它们的结构、性质相似，因此表现出相同的化学性质，另外它们的物理性质 如熔点、沸点、折光率和光学性质( 除旋光性不同) 也都相同。因而对它们的分 离和测定是件十分因难的工作。因此除了对这些手性化合物的制备外，其检测 与分析也成了手性研究的热点和难点。因此，对映体的分离和光学纯度的确定己 普遍引起人们的重视。 1 。i 3 手性药物拆分的迫切性 对于药物而言，倘若外消旋混合物的两种异构体对标靶生物的选择性有很大 程度的不同( 如其中一种异构体失无效的或接抗的、或作用方式或作用部位点有 差异的) ，将手征性药物以药效更商的单一对映体使用是合理的。随着立体化学的 发展和对药物光学结构研究的不断深入，人们更多地关注光学活性产品的开发。 目前单一拇型手性药物及其中间体的合成与药理学研究是现代有机合成工业秘医 药工业中的一个热点研究领域。手性药物己成为国际新药研究与开发的新方向之 一，现在手性药物市场以每年2 0 以上的速度增长，2 0 0 1 年全球的手性药物销售 额达到1 3 3 0 亿美元，占到整个药物市场的4 0 ，在1 9 9 4 弱1 9 9 6 的三年中全世界 批准上市的新药中有一半以上是单一对映体，预计到2 0 0 5 年全球上市的新化学药 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献缘述 品将有超过6 0 为单一异构体【3 】。在农药中手性问题也很突出，目前已商品化的 6 5 0 余种农药中，有1 7 0 余种属于手性农药，在这商品化的1 7 0 余种手性农药中， 年销售额超过1 亿美元的有3 0 余种，超过2 5 0 0 万美元的6 0 余种，其中含高活性 手性体成分的手性农药销售额超过1 0 0 亿美元，纯手性异构体的手性农药年销售 额己接近3 0 亿美元，手性农药占到全球农药市场的3 5 【1 3 】。 现代社会对单一异构体药物需求快速增长的原因之一是药物异构体具有不同 生理活性：有的手性药物的异构体没有活性，如许多杀虫剂只有一种异构体具有 杀虫活性：有的手性药物的异构体有严重的副作用，如反应停，化学名为肽胺哌 啶酮( 2 ，( 2 ，6 一d i o x o 3 - p i p e t i d i n y l ) 1 h i s o i n d o l e 一1 ，3 一( 2 h ) - d i o n e ) 是上个世纪五六十年 代西方广泛使用的一种镇静剂和止吐药，用于缓解孕妇的妊娠反应，但是许多孕 妇服用后产下畸形婴儿。有文献报道在1 9 5 6 1 9 6 1 年间反应停就导致1 2 万个类似 “海豹”没有胳膊和手的畸形婴儿出生，随后的研究发现肽胺哌啶酮是一个手性 化合物，有r 和s 两个对映体，起镇静功效的是r 一对映体，s 对映体有强烈的致 畸作用【】。此类事件的发生促进了单一构型手性药物的研究与开发，也引起了社 会各界的重视，如美国和欧洲的新药管理部门就己作出特别法规，要求在申报手 性药物时必须给出其各个异构体的具体含量，并尽可能提供各纯对映体及其混旋 体的毒理学和药理学数据 1 5 】。2 0 0 1 年诺贝尔化学奖授予给了w - s 诺尔斯k b 夏普利斯野依良治三位化学家，以表彰他们在手性催化研究领域作出的卓越贡 献，他们的研究成果已经在手性药物合成中得到了应用【1 4 】。 1 2 主要的手性拆分方法 最近几十年来，手性拆分已成为分析化学中的热门课题，取得了很大的进展j 目前己提出以下凡种主要的拆分法【1 1 1 ：机械分离法：晶体接种法；生物法；化学 法；色谱和毛细管电泳法等。 1 2 1 机械分离法 若对缺体能以晶体形式析出，并且不同构型对缺体的晶体有明显差别，则可以 在放大镜帮助下，将对映体的晶体分别拣出，达到分离的目的。1 8 4 8 年，l o u i s p a s t e u r 完成的第一次外消旋拆分，就是采用这一方法。晶体机械分离法所存在的 困难是它过于烦琐，而且不能应用于外消旋固体溶液。它只能应用于两种对映体 浙江工业大学颐士学位论文第一章文敲绦莲 的晶体可以被看出区别的那些外消旋混合物。虽然现在己认识到：右旋光性和左 旋光性的晶体总是显出半面的晶面并不都呈现较明显的差别以致从实用的观 点来看，经常毫无用处。 1 2 2 晶体接种拆分法 晶体接种分离法主要是指：向外消旋混合物的热饱和溶液中加入纯对映体之 的晶体，然后冷却，则同种的对映体将附在晶体上析出，滤去晶体后，母液重新 加热，并补加外消旋体使之达到饱和，然后加入另一种对映体的晶种，冷却使另 一对映体的晶体析出，这样交替进行可以方便地获得大量纯对映体的晶体。如 果没有纯的对映体的晶体也可以用来接种，有时别的结构相似的手性化合物( 有 时甚至非手性化合物) 作晶种，也能获得成功。例如：为使( + ) 一酒石酸铵钠盐 自其外消旋体的溶液中结晶析出，不仅可以用此( + ) 一盐的一个纯晶体，而且 也可以用( ) 一天门冬氨酰胺h ：n c o c h 。( n h 。) c o o h 的一个晶体接种。 晶体接种分离法工艺简便，成本较低，而且效果也较好。在不断的探索下，现 在已知可用这种方法分离的外消旋约2 5 0 例，并且工业上已有若干产品用这类方 法分离( 见下表1 1 ) ， 表1 1 ：用晶体接种分离法分离的若干外消旋体 另外，此法应注意选用合适韵溶裁稂溶帮比，操作对的投料量租温度等也应严 格控制，才能获得较好的效果。近年来，发现了另一种原理的接种晶体分离法， 即析出来的和加进去的为不同类构型的晶体，这被认为是由于所投入的某种构型 “相同”而组成不同的添加物干扰了母液中具有“稻两”构型对映体的结晶过摇。从而 导致相反构型对映体的析出。 1 23 化学法 化学法是指，通过化学反应的方法用手性试齐口将外消旋中的两种对欧体转化 浙江工业大学硕士学位论文算一幸文款绦述 为非对映体异构体，然后利用非对映体异构体之间的物理性质和化学性质都不同 的原理，将其分开的方法。其一般步骤如下图l 一2 所示 外消旋底物 “) ( ) 和( 一) ( 一) 非对映异构体混合物 物理分离( 根据不同的性质) ( ! ( 二2 堡塑= 进型丝盒塑( - ) ( 一) 底物一试窭0 化台物 厂与厂， ( + ) 废物 二) i 避二2 壅塑 图卜2 ：化学法拆分对映体步骤 例如： 化学法韵成功关键是选择合适的手性试齐j 和溶莉。一般合适拆分试剂必须具备 以下条件：( 1 ) 必须容易与外消旋体中的两个对映体结合生成非对映异构体，经 拆分后，又容易再生出原来的对映体化合物； d ；一c c h ：，。n h c 。一手h n h c o n h 一 c h r g c h 3 c h 3 图3 2o a 4 6 0 0 手性柱的结构 3 图3 3o a 2 2 0 0 手性柱的结构 注：标+ 的碳原子为手性碳原子，其结构为r 构型 显然，对映体和c s p 之间的手性识别是通过上述一种或几种相互作用来实现 的。因为这种c s p 是类似于反相键合的单分子层，所以色谱效率很高，对映体选 择性强。在固定相的合成中，由于手性部分的选择可根据想象设计，故能进行多 种变化和优化组合。还可根据被拆分化合物的结构特征，进行针对目标化合物的 c s p 设计合成，因而可达到很大的对映体选择性( 如a = 1 2 5 ) 。此外，“刷型”c s p 和 对映体之间的相互作用可以用手性识别模型合理的推断，这使得在许多情况下可 预言欲拆分化合物在一个给定的c s p 柱上分离的可能性及根据其绝对构型预测一 李 浙江工业大学硕士学位论文第三章氰醇暑毒酸争寓机理穰讨 对对映体的相对洗脱顺序。 刷型手性固定相能拆分大量的外消旋手性化合物，其手性柱早已经商业化。 利用刷型手性固定相手性固定相不但用于对映体的纯度测定，还可用于对映体的 制备分离。特别是模拟流动床色谱( s m b ) 法分离手性化合物在工业化制备纯的对映 体具有很大的潜力。同时，在分子水平上进行对映体的识别机理研究，为深入理 解手性识别发生的位置、作用力及其色谱过程提供了理论依据，手性识别机理研 究对研制新的具有不对称手性中心或手性识别能力固定相，解决不同类型手性化 合物的分离，及药物动力学研究和分子设计都有着十分重要的意义。 目前比较成功能解释分离机理只要是三点作用原理：c s p 含有a ，b ，c 三个 作用点，能与溶质相应的三个点a f ，b ，c 作用，虽然溶质中两对映体都有两点 能与c s p 作用，但只有其中一种对映体可以同时有第三种作用。而另一个则不能， 同时三点能对c s p 有作用的对映体被保留的时闻较长。反之，如果第三点不是吸 引，而是排斥，被保留的时间反而短。见图3 - 4 一i k 一淞 1 r ? h _ a n s h 1 s m a n s 0 h 浙江工业大学硕士学位论文 摹三章氰醇与菊酸分离机理探讨 h l r - c l s1 s c i s 图3 5 菊酸对映体的结构 2 ) 分离机理 菊酸对映体中的基团0 一h 既能给o a 2 2 0 0 手性固定相结构中基团n h 中的氮 原子提供质子，同时其氧原子也能接受n h - ，由于手性固定相右半部分就是菊酸 的结构，因而此时其烯键正好能同时跟手性固定相中的烯键电荷形成n “电荷转 移相互作用，从菊酸对映体的结构可以看出这三个作用力是有立体结构，因此菊 酸能在o a 2 2 0 0 分开。 3 3 2 氰醇的分离机理 1 ) c p b a 和c p b a c 的结构如图3 6 所示。 c p b ac p b a c 图3 6c p 融和e p b 矗c 的结构 2 ) 分离机理 当c p b a 中的苯环基团跟萘环发生n n 电荷转移相互作用时，根据它们的立体 结构，此时r 构型的o h 跟手性固定相结构中基团一n h - 中正好能形成两个氢键， 而s 构型却只能是c n 接受手性固定相结构中基团n h 中的质子而形成一个氢键， 因此它们的作用力发生了差别，从这里也可知道，r - 构型跟手性固定相作用力较 强，因而较晚出峰，跟实验完全一致。 3 3 3 两个不同柱子分离氰醇的比较 将同一氰醇样品在不同的两个手性柱( 其结构如图3 2 和3 3 所示) 下分离， 其它分离条件如：流动相：正己烷乙醇( 9 5 ：5 ，体积比) ，流速：1 0 m i m i n - i ， 检测波长2 5 4 n m ，柱温2 0 ，进样量5 “l 等相同，记录色谱图，色谱图见图2 1 和2 2 。根据公式2 1 、2 2 及2 3 分别计算出不同柱子下r - c p b a 、s c p b a 的容 量因子k i ，以及分离因子( q ) 、分离度氏，结果见表3 一i 。 4 0 蛩 浙江工业大学硕士学位论文第三章氰醇与鸯酸分离机理攘讨 为s - c p b a 的容量因子，k 。! 为r c p b a 的容量因子 从表3 1 可看出，0 a 4 6 0 0 对c p b a 分离没有选择性，而0 a 4 4 0 0 分离因子有1 0 8 ， 两从两个手性柱结构( 图3 1 和图3 2 ) 上看，两手性柱结构相似，其中o a 4 6 0 0 含有立体位阻较大的基团一c ( c h 3 ) 3 ，这样极有可能阻碍了一c n 或一0 h 跟一n h 形成氢 键，使得c p b a 对映体均在此没有跟手性固定相的一n h 形成氢键，因此不能形成第 三个不周作用力的点，同时由于作用力减少，因两保留时间也减少。 3 4 本章小结 本章首先介绍了手性机理研究的方法，接着针对本实验使用的手性固定相类 的性质进行了介绍，紧接着用简单的三点模型理论解释了菊酸、氰醇在各自手性 固定相的分离机理，随后分析同样条件下o a 4 6 0 0 与0 a 4 4 0 0 在分离氰醇时的差别。 浙江 业大学硕士学位论文 第四章酶催化合成s 一岛豺中的应用 第四章酶催化合成s c p b a 中的应用 4 1 引言 在基团转移反应中，对于一给定的底物，选择不同反应体系得到的结果可能 存在很大的差异，如在有机相中酶促拆分环氧丙醇的研究中就发现，猪胰脂肪酶、 酵母脂肪酶、假单孢脂肪茵、霉菌碱性脂肪酶分别在二氯甲烷、氯仿、正己烷、 苯中催化环氧丙醇与不同的酰基供体( 丁酸、己酸、葵酸、月硅酸) 酯化反应 结果由猪胰脂肪酶、丁酸、二氯甲烷组成的反应体系立体选择性最好，而其他有 些反应根本没有选择性1 7 们。因此在酶反应中选择合适的反应体系很重要。本实 验将利用前面研究的色谱分离条件对s ，c p b a 的转酯化合成反应过程进行测定， 通过考察了不同来源的脂肪酶、不同溶裁及酰基受体对反应的影确，选择反应效 率高、选择性好的酶及反应溶剂和酰基受体，并进一步对酶确定其它最佳的合适 反应体系。 4 2 实验原理 氰醇酯( c p b a c ) 具有r 和s 两种构型即r c p b a c 和s c p b a c ，在某一特 定的反应体系中一些骺珐酶可能表现出对殃体选择性，优先催化s - c p b a c 与另 一底物醇发生转酯化反应，而r c p b a c 则不反应或反应速度要慢得多。不对称 转酯化反应的结果是主要生成了s 构型的氰醇即s c p b a ，这样达到了动力学拆 分消旋体( r 。s ) c p b a c 合成s - c p b a 的目的。同样有些酶可能优先催化 r c p b a c 与底物醇发生转酯化反应，但结果也可实现( r ，s ) - c p b a c 的手性 拆分。但由于本实验所要的产物是s c p b a ，因此本实验最需要得到的酶是能够 优先催化s c p b a c 反应的脂肪酶，反应的方程式如图4 - l 所示。 n r 9 8 i cs d l v e n t s l i p 8 s e 穴 r o hr - 0 a c o h = 够心 a p h o a c ( r ，酚c p b a e【盼c p b a ( r ) c p b a c 图4 1 脂肪酶催化非对称转酯化反应拆分( 良，s ) c p b a c 4 3 实验方法 浙江工业大学硕士学位论文 弟瞬章酶催化合茂s 一拐铭w 寸的应用 1 ) 试剂预处理 由于氰醇是极不稳定的物质容易分解为3 苯氧基苯甲醛( m p b a ) ，单一异 构体也容易消旋化，水溶液可能会加剧氰醇的不稳定性【7 7 】，另一方面有机相酶 催化转酯化反应中水分的存在也会导致副反应的产生如水解反应。因此除注明外 反应前所有试剂都必须预处理以除去试剂中存在的水分，方法是先用蒸馏水将 4 a 分子筛清洗数次，直至洗液澄清为止，之后将分子筛置于电热鼓风干燥箱中 1 8 0 下干燥数天，冷却后加入到各试剂中，静置数天后滤去分子筛备用。 2 ) 反应方法 为了防止溶剂的挥发，反应均在密封反应瓶中进行。除注明外均按下面操作 进行，反应时先后向反应瓶内加入c p b a c 、醇( 按一定酯醇摩尔比例加入) 、溶 剂、脂肪酶，加入少量分子筛，最后将反应瓶密封放置在恒温振荡器中反应，温 度控制在4 0 ，转速调节至2 0 0 r p m ，或者将c p b a c 和醇先分别用溶剂配制成 母液，反应时取两种母液配制反应液，然后加入脂肪酶和分子筛。 3 1 色谱分祈条件 色谱柱：s 啪i c h i r a l0 a 4 4 0 0 ( 2 5 c m 4 6 m m 巾，5um ) ，流动相：正己烷一 二氯乙烷乙醇( 8 7 ：1 0 ：3 ，体积比) ，流速：1 0 m l m i n 1 ，检测波长2 5 4 n r n ， 柱温1 5 。进样量5u 1 。 4 ) 计算方法 s c p b a 的浓度按第二章s c p b a 的工作曲线计算得出，其得率和光学纯度 按式( 4 1 ) 和( 4 2 ) 计算。 删畅) = 导枷o 印，= 爰卺枷o 0 0“s ”r 其中c o 为c p b a c 的初始摩尔浓度，c s 为产物( s ) - c p b a 的测定摩尔浓度， 即测得的质量浓度( m m 1 ) 乘以稀释倍数后，再除以分子量，a s 和a r 分别为 测定的反应样品中产物( s ) c p b a 和( r ) - c p b a 的峰面积 4 4 脂肪酶的筛选 脂肪酶( t r i a c y i g l y c e r o l e s t e rh y d r o l a s e s ，e c3 1 1 3 ) 是界面催化的酶，活 性位点通常由丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸三个氨基酸残基组成，所有脂肪酶催化 的反应都会形成酰基酶复合物7 8 1 。作为生物催化剂脂肪酶可催化由不同底物出 浙江工业大学硕士学位论文弟四幸晦催化夸崴s 一俐卞的应甩 发的水解和合成反应，这些反应通常具有高度底物专一性、区域选择性或对映选 择性，使脂肪酶成为有机合成中重要的生物催化剂，广泛应用于油脂、食品、香 料、化妆品、医药、农药等有机合成领域7 9 1 。脂肪酶广泛存在于自然界中，几 乎所有的动物以及许多植物、细菌、真菌都含有型”】，微生物来源的脂肪酶通 常是胞外酶，纯度较高，而动物与植物来源的脂肪酶则通常含有其他杂酶如蛋白 酶等。微生物脂肪酶多数来源于真菌和细菌，大量的脂肪酶已商业化生产，最新 公布的3 4 种不同来源的商业化脂肪酶中有1 8 种来源于真茵，7 种来源于细菌。 不同来源的脂肪酶催化活性及选择性均有很大差异。如假丝酵母脂肪酶( c c l ) ， 猪胰脂肪酶( p p l ) 及l i p o z y m e 。m 分别在磷酸盐缓冲液中催化萘普生乙酯进行水 解，结果c c l 选择性最好，其产物光学纯度接近1 0 0 ，l i p o z y m e 催化萘普生 乙酯水解时虽亦有大量萘普生生成，但反应缺乏立体选择性，产物光学纯度几乎 为零，p p l 则不能有效催化萘普生乙酯的水解