（应用化学专业论文）对氯苯基氨基甲酸酯化β环糊精手性固定相的合成及其在HPLC中的应用.pdf

摘要 摘要 对氯苯基氨基甲酸酯化1 3 1 环糊精手性固定相的合成 及其在h p l c 中的应用 专业：应用化学申请者：张振宾导师：。章伟光教授 键合型p 环糊精衍生物固定相的制备和应用是近年来色谱手性分离领域的一个研究热 点。本论文致力于发展新型的p 环糊精衍生物固定相的制备，并在高效液相色谱( h p l c ) 中考查所制备的固定相对各类手性化合物的拆分能力。 首先，我们制备了一种结构明确的对氯苯基氨基甲酸酯化d 一环糊精，并将其键合到氨 基化硅胶表面得到了一种新型的手性固定相。采用湿法装柱技术，用甲醇作为顶替液，制 备了对氯苯基氨基甲酸酯化d 一环糊精手性柱。考查了对氯苯基氨基甲酸酯化d 一环糊精手性 柱的柱效和拆分能力，在流动相为正己崩异丙醇= 9 0 l o ( v v ) ，流速为0 5 m l m i n 的条件下， 其理论塔板数可以达到4 1 1 0 4 m 。同样条件下，一种2 哌嗪二氢萘的衍生物( 外消旋) 在 手性柱上的分离度可达1 4 9 ；考查了进样量和流速对柱效的影响，在保证信噪比( s n ) 大于 3 的前提下，随着进样量的减小，柱效增高：在流速约为0 5 m l m i n 时，柱效最高；考查了 不同批次手性固定相之间的重现性，三批手性固定相中环糊精衍生物的键合量分别为1 4 0 9 x1 0 。2p m o l m 2 、1 4 5 8 x1 0 之l u n o l m 2 、1 4 4 4 x1 0 l u n o l m 2 ，对2 哌嗪二氢萘的衍生物的分 离度分别为1 2 3 、1 3 l 、1 4 9 ，表明不同批次手性固定相之间的重现性很好；通过对手性柱 进行定期评价我们考查了手性固定相的稳定性，发现在将近一年的时间内柱效及其手性拆 分能力基本没有什么改变，证明合成的手性固定相的稳定性较好。 本文还详细研究了在正相模式和反相模式下各种因素对手性拆分效果的影响，为建立 和优化手性h p l c 分析条件奠定了基础。在正相条件下，用异丙醇、乙醇、乙醚作为改性 剂时，异丙醇的效果最好；随着流动相中异丙醇含量的增加或流动相流速的增大，对映异 构体的保留因子和分离度都逐渐减小；进样量越小越有利于拆分；在反相条件下，用甲醇 或乙腈作为有机改性剂时，发现甲醇的选择性比乙腈更好；随着流动相中甲醇含量的增加， 对映异构体的保留因子和分离度都随之减小；流速和进样量对拆分效果的影响规律与正相 模式下一致；在流动相中加入适量的缓冲液( p h 值在3 - 7 之间) 有利于对映异构体与固定 捅要 i 相之间的手性识别作用。 我们用对氯苯基氨基甲酸酯化p 环糊精手性柱对分子中不含苯环、含有一个苯环、含 有两个苯环、含有多个苯环等一系列不同结构的手性化合物进行了拆分，均取得了较好的 拆分效果，并根据拆分结果与手性化合物的结构推断了可能的拆分机理。 首次在对氯苯基氨基甲酸酯化p 环糊精手性固定相上拆分了钌苯金属手性配合物，并 取得了较好的拆分效果。金属手性配合物的成功拆分进一步拓展了手性固定相的应用范围， 为制备分离提供了条件。 关键词：环糊精衍生物，手性固定相，高效液相色谱法，对映体分离 a b s t r a c t 量吕量量量置| 置量置置| | 量量鲁量量吕舅量曼曼曼量量量鼍曼量皇鲁量鼍置置鼍| | 置皇量量墨皇| t h e p r e p a r a t i o no f p - c h l o r o p h e n y l c a r b a m o y l a t e d1 3 - c y c l o d e x t r i nc h i r a l s t a t i o n a r yp h a s ea n di t sa p p l i c a t i o ni nh p l c m a j o r - a p p l i e dc h e m i s t r yn a m e - z h a n gz h e n b i ns u p e r v i s o r ：p r o f z h a n gw e i - g u a n g a bs t r a c t p r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no fc o v a l e n t l yb o n d e di b - c y c l o d e x t r i nd e r i v a t i v e c h i r a l s t a t i o n a r yp h a s e s ( c s p s ) i so n eo ft h ep r o m i s i n gr e s e a r c hf i e l d si ns e p a r a t i o ns c i e n c e s t h e o b j e c t i v eo ft h i st h e s i si st od e v e l o pan o v e le o v a l e n t l yb o n d e d1 3 - c y c l o d e x t r i nd e r i v a t i v ec s p s f o rs e p a r a t i o no fe n a n t i o m e r sb yh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) f i r s to fa l l ，an o v e lc y c l o d e x t r i n ( c d ) d e r i v a t i v e - m o n o ( 6 a - a z i d o 一6 a - d e o x y ) p e r p - c h l o r o p h e n y l c a r b a m o y l a t e d ) d - c dw a ss y n t h e s i z e da n dc h e m i c a l l yi m m o b i l i z e do n t ot h e s u r f a c eo fa m i n o - f u n c t i o n a l i z e ds i l i c ag e lt oa f f o r das t r u c t u r a l l yw e l l - d e f i n e dc s pf o rh p l c t h es l u r r ym e t h o dw a sa p p l i e dt op a c kt h eh p l cc o l u m nw i t hm e t h a n o la st h ep a c k i n gs o l v e n t t h ec o l u m n e f f i c i e n c y a n di t s e n a n t i o s e p a r a t i o na b i l i t y w e r e i n v e s t i g a t e d ， w i t h h e x a n e i p a - - 9 0 1 0 ( v m 硒m o b i l ep h a s e ，f l o wr a t ea t0 5 m l m i n ，t h et h e o r e t i c a lp l a t en u m b e r s o ft 1 1 ep a c k e dc o l u m nr e a c h e d4 ix10 4 m a tt h es a m ec o n d i t i o n , ar a c e m a t eo f2 - p i p e r a z i n e d i h y d r o n a p h t h a l e n ed e r i v a t i v eh a sb e e ns e p a r a t e do nt h ec o l u m nw i t ht h er e s o l u t i o nf a c t o ro f 1 4 9 t h ee f f e c to fi n j e c t i o nv o l u m eo ft h es a m p l ea n dt h ef l o wr a t eo ft h em o b i l ep h a s eo nt h e c o l u m ne f f i c i e n c ya l s ow e r es t u d i e d , w i t hap r e c o n d i t i o no fs n 3 ，t h et h e o r e t i c a lp l a t en u m b e r o ft h ec o l u m nw a si n c r e a s e dw i t ht h ed e c r e a s eo ft h ei n j e c t i o nv o l u m ea n di tr e a c h e dm a x i m u m a tt h ef l o wr a t eo f0 5 m l m i n i no r d e rt os t u d yt h er e p r o d u c i b i l i t yo fc s p sa n de n a n t i o s e l e c t i v i t y o fd i f f e r e n tb a t c h e s ，w eh a v es y n t h e s i z e dm o r et h a nt e nb a t c h e so ft h en o v e lc s p s t h r e eb a t c h e s w e r ec h o s ef o rr e p r e s e n t a t i o n , w i t ht h es u r f a c ec o n c e n t r a t i o no ft h e1 3 - c dd e r i v a t i v e so nt h ec s p o f1 4 0 9 1 0 。2t t m o l m 2 ，1 4 5 8 1 0 乏l x m o l m 2 , 1 4 4 4 1 0 l x r n o l m 2 ，r e s p e c t i v e l y , a n dt h e r e s o l u t i o nf a c t o r so f 2 - p i p e r a z i n ed i h y d r o n a p h t h a l e n e d e r i v a t i v ew e r e 1 2 3 ，1 3l ，1 4 9 ， r e s p e c t i v e l y , w h i c hp r o v e dt h ew e l lr e p r o d u c i b i l i t yo fc s p sa n de n a n t i o s e l e c t i v i t yo fd i f f e r e n t b a t c h e s b e s i d e s ，t h es t a b i l i t yo ft h ec o l u m na l s ow a si n v e s t i g a t e db yp e r i o d i c a le v a l u a t i o no f i t se f f i c i e n c ya n di t se n a n t i o s e p a r a t i o na b i l i t y w ef i n dt h a tb o t ho ft h e ms t a ya sac o n s t a n tf o r n e a r l yo n ey e a rw h i c hp r o v e dt h ee x c e l l e n ts t a b i l i t yo ft h ec s e s e c o n d l y , t h ee f f e c to fv a r i o u sf a c t o r so nt h ee n a n t i o s e p a r a t i o nb o t hu n d e rt h en o r m a l p h a s ea n dr e v e r s e dp h a s em o d eh a v eb e e ns t u d i e di nd e t a i l ，w h i c he s t a b l i s h e daf o u n d a t i o nf o r o p t i m i z i n gt h ea n a l y z i n gc o n d i t i o no fc h i r a lh p l c u n d e rt h e n o r m a lp h a s em o d e ，u s i n g i i i a b s t r a c t i s o p r o p a n o l ( i p a ) ，e t h a n o l ，e t h y le t h e r 勰m o d i f i e r , i p ap r o v e dt ob eb e t t e rt h a no t h e r s ；w i t ht h e i n c r e a s eo ft h ei p ac o n c e n t r a t i o ni nt h em o b i l ep h a s e ，o rt h ef l o wr a t eo ft h em o b l ep h a s e ，o rt h e i n j e c t i o nv o l u m eo ft h es a m p l e ，t h er e t e n t i o nf a c t o ra n dr e s o l u t i o nf a c t o ro ft h ea n a l y t 鹤 d e c r e a s e d u n d e rt h er e v e r s e dp h a s em o d e ，w i t hm e t h a n o lo ra c e t o n i t r i l ea so r g a n i cm o d i f i e r , w e f i n dt h a tm e t h a n o le x h i b i t sab e t t e rs e l e c t i v i t yt o w a r d st h er a c e m a t e si no u rl a b t h er e t e n t i o n f a c t o ra n dr e s o l u t i o nf a c t o ro ft h ea n a l y t e sd e c r e a s e dw i 【t h t h ei n c r e a s eo ft h em e t h n a o l c o n c e n t r a t i o ni nt h em o b i l ep h a s e t h ee f f e c to ft h em o b l ep h a s ef l o wr a t ea n d 也em j e c t i o n v o l u m eo ft h es a m p l eo nt h er e t e n t i o nf a c t o ra n dr e s o l u t i o nf a c t o ru n d e rt h er e v e r s e dp h a s em o d e w e r e 嬲s a m ea su n d e rt h en o r m a lp h a s em o d e t h ea d d i t i o no ft h eb u f f e ri nt h em o b i l ep h a s ec a n i m p r o v et h ee n a n t i o s e p a r a t i o nr e s u l t s t h i r d l y , e n a n t i o m e r i cs e p a r a t i o n so faw i d er a n g eo fv a r i o u ss t r u c t u r e l yd i f f e r e n ta n a l y t e s h a v e b e e ns u c c e s s f u l l ya c h i e v e do nt h i scs pi nt h en o r m a la n dr e v e r s e dp h a s em o d e s ，p r o p o s e d m e c h a n i s ma l s ow e r eb r o u g h tf o r w a r da c c o r d i n gt ot h ee n a n t i o s e p a r a t i o nr e s u l t sa n dt h e s t r u c t u r eo ft h ea n a l y t e t h er e s o l u t i o no fac h i r a lr u t h e n a b e n z e n e sc o m p l e xh a sb e e na c h i e v e ds u c c e s s f u l l yo nt h i s c s pf o rt h ef i r s tt i m e ，w h i c hb r o a d e d e dt h ea p p l i c a t i o nr a n g eo ft h en o v e lc s pa n dp r o v i d e da p r e c o n d i t i o nf o rt h ep r e p a r a t i v ec h r o m a t o g r a p h y k e yw o r d s ：c y c l o d e x t r i nd e r i v a t i v e s ；c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e ；h i g h p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ；e n a n t i o m e rs e p a r a t i o n i v 华南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确的方式标明。 本人完全意识到此声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名：狄振宾 化义作有登铂：呱0 狄伏 日期：2 0 0 q 年6 月旁日 学位论文使用授权声明 本人完全了解华南师范大学有关收集、保留和使用学位论文的规 定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华南师 范大学。学校有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版，允许学位论文被检索、查阅和借阅。学校可以公布学 位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印、数字化或其他 复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的论文在解密后遵守此规定) 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在年后解密适用 本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权 书。 论文作者签名：乡茛 日期：如d 绛莎月弓日言嚣施日期：勿新年乡月 日 第1 章绪论 1 1 手性的定义及研究手性拆分的重要性 1 1 1 手性的定义 两种化学组成、分子式完全相同的化合物，园组成化合物的原子在空间的取向不同， 而成为镜像化合物，它们像人的两只手一样彼此不能重合( 如图1 - 1 所示) ，称为手性化合 物( c h i r a l c o m p o u n d ) 或称为对映体( e n a n t i o m e r ) 。 圆 眇 _ 电l _ 图1 - 1 手性是自然界的基本特性 f i g1 - 1 c h i r a l t y i s t h e b a s i cc h a r a c t e r o f t h e i l a t l l m 1 1 2 研究手性拆分的重要性 手性是人类赖以生存的自然界的本质属性之一。生命现象中的化学过程都是在高度不 对称的环境中进行的。生物大分子如蛋白质、多糖、核酸等都有手性，除细菌以外的蛋白 质都是有左旋的l 氨基酸组成：多糖和核酸中的糖则是右旋的d 构型；在有机体的代谢和 调控过程中所涉及的物质，如酶和细胞表面的受体，一般也具有手性，它们在生物体内造 1 一 第1 苹绪论 成手性环境。正是这种立体化学的手性特征，使生物体系通常对药物中的一对对映体表现 出不同的生物反应。手性药物进入生物体内后，其药理作用多与它和体内靶分子之间的手 性匹配和手性识别能力有关。因此手性药物的不同对映体显示出不同的药理作用和毒副作 用。一般认为对映体之间药理活性的差异可分为三类： ( 1 ) 对映体之间有相同或相近的某一活性。属于这一类的有平喘药丙羟茶碱、抗心率 失调药氟卡尼等。对映体除了同具有某一活性之外，其中一个异构体还可能具有另一活性， 如局部麻醉剂布比卜因两个对映异构体具有相近的麻醉作用，而( s ) 异构体又具有收缩血 管作用，这样它就能增加局部麻醉的效果。噻吗洛尔两个对映体都具有降低眼压治疗青光 眼的作用，而( s ) 异构体是一个已上市的b 阻滞剂，用它作治疗青光眼的滴眼液时曾引起 支气管收缩，造成有支气管哮喘者致死，所以仅( r ) 异构体治疗青光眼是安全的。 ( 2 ) 一个对映体具有显著的活性，但另一个对映体的活性很低或无此活性。如d 苯异 丙胺是一种十分有效的中枢神经兴奋剂，而它的异构体几乎没有药效；抗菌素氯霉素是 ( r ，r ) 异构体，而( s ，s ) 异构体无此活性( 过去曾以消旋体上市称为合霉素) 。普萘洛尔是一 个肾上腺素b 阻滞剂，其( s ) 异构体的活性是( r ) 异构体的1 0 0 倍以上。非甾体抗炎药 ( n s a i d ) 0 t - 芳基丙酸类化合物，如萘普生、布洛芬等。其阻断前列腺素合成酶的活性来自 ( s ) 异构体。抗高血压药物拉贝洛尔存在两个手性中心，以4 个异构体的混合物上市，其 中( r ，r ) 异构体是非选择性b 阻滞剂，( s ，s ) 异构体是甜阻滞剂，它们的对映体活性均较低。 抗癌药环磷酰胺，其手性中心不是碳原子而是磷原子，( s ) 异构体活性是( r ) - 异构体的2 倍， 然而对映体毒性几乎相同。抗凝剂华法林s r 活性比为5 左右。 ( 3 ) 对映体具有相反的活性。如曲托喹酚( 喘速宁) 的( s ) 异构体是支气管扩张剂，( r ) 异构体则有抑制血小板凝聚的作用。有些对映体还会引起毒副作用，一个灾难性的例子就 是反应停( 沙利度胺) 的使用，沙利度胺早在1 9 6 0 年开始用作镇静剂和安眠药，用于治 疗妊娠期的不良反应。但后来发现，怀孕早期的妇女服用此药会引起胎儿严重畸形，使该 药停止使用。1 9 7 9 年发现，仅限) 一( + ) 对映体沙利度胺具有镇静或安眠作用，而( s ) - ( ) 对映 体对胎儿有致畸作用【l 】，而且这种对映体对镇静或安眠作用并不重要。巴比妥类药物的对 映体对中枢神经系统发生相反的作用，如1 甲基5 苯基一5 一丙基巴比妥酸，其异构体有 镇定、催眠活性，而( s ) 异构体会引起惊厥。 随着人们对手性药物对映体间药理活性、毒副作用巨大差别的充分认识，手性药物对 映体的拆分测定己成为当今药学领域最热门的研究课题之一。近年，单一对映体药物获准 上市的年增长率已超过2 0 ，到2 0 0 5 年全球约有6 0 的上市新药为光学纯药物【2 1 。美国国 一2 一 第1 苹绪论 家食品药品管理局( f d a ) 规定，今后凡是研制含手性中心的药物，必须对各个对映体进行 测定和药理毒理学评价。建立快速、灵敏的药物对映体拆分测定方法，对于研究手性药物 的体内药动学过程、确定药动学参数、阐明药理毒理机制以及在手性药物的合成和质量控 制方面具有重要意义【3 1 。 1 2 手性色谱拆分技术 色谱拆分技术可以满足各种条件下对映体拆分和测定的要求，能够进行简便快速的定 性定量分析，也能进行制备规模的拆分和测定，具有很多明显的优越性。目前，色谱拆分 技术已成为光学拆分最有用的方法。这些方法包括气相色谱( g c ) 、高效液相色谱( h p l c ) 、 薄层色谱( t l c ) 、超i 临界流体色谱( s f c ) 、毛细管电泳( c e ) 和模拟移动床色谱( s m b ) 。 1 2 1 气相色谱( g c ) 手性气相色谱法是手性色谱学( c h i r a lc h r o m a t o 铲a p h y ) 的重要分支f 4 】，一般可分为直接 拆分法和间接拆分法。这两种方法都是以气相色谱( g c ) 为基础，引入新的不对称中心，使 对映体的性质产生差异，进而被拆分。间接拆分法又称手性试剂衍生化法( c h i r a l d e r i v a t i z a t i o nr e a g e n t ，c d r ) 。这种方法先通过共价结合作用，在对映体分子中引入另一个 手性中心，形成非对映体对后，再用非手性g c 拆分。 g c 直接拆分法是通过使用手性固定相，来提供拆分所需要的手性环境，因此称作手性 固定相法( c h i m ls t a t i o n a r yp h a s e s ，c s p ) 。它与c d r 法的区别是不需要柱前衍生化反应。 目前g c 中用于拆分对映体的固定相主要有三类【5 】：第一类是手性氨基酸衍生物固定相， 主要是手性氨基酸衍生物及手性氨基酸接枝聚硅氧烷衍生物；第二类是手性金属配合物固 定相，主要是用手性b 二酮如樟脑酸等与c u 2 + 、n i 2 + 等离子形成的配合物作固定相；第三 类是环糊精衍生物手性固定相。前两类固定相存在拆分手性化合物的应用范围窄、使用温 度范围低的缺点。g c 流动相简单，柱效高，而且适合拆分一些不带芳香环的对映体化合 物( 这类对映体在液相色谱条件下通常很难被拆分和检测) 。g c 中对映体拆分一般要在较 高的温度下进行，而这容易导致手性选择剂的消旋化，从而降低其手性识别能力；g c 一 般只能拆分易于气化和热稳定性高的对映体化合物。另外，由于分离多在小尺度的毛细管 中进行，使其无法应用于对映体的制备。 一3 一 第1 章绪论 1 2 2 高效液相色谱( h p l c ) 高效液相色谱在拆分对映体时通常有3 种方法：1 ) 利用手性试剂与被拆分物进行衍生 化反应生成非对映异构体，从而可被传统的非手性h p l c 所拆分；2 ) 在流动相中加入手性 添加剂，利用非手性固定相h p l c 进行拆分；3 ) 利用手性固定相( c s p s ) 的h p l c 进行拆分。 其中最有效的方法是手性固定相法。c s p s h p l c 法之所以能拆分对映体，是因为在手性固 定相与外消旋体相互作用时，两者与固定相生成稳定性不同的非对映体络合物，造成保留 时间不同，从而达到拆分的目的。手性固定相主要分成以下几类：1 ) 纤维素类衍生物手性 固定相【6 ，7 】：2 ) 蛋白质键合手性固定相；3 ) p i r k l e 型手性固定相；4 ) 大环类手性固定相； 5 ) 配体交换色谱手性固定相；6 ) 分子印迹类手性固定相( m i p c s p s ) 。 1 2 3 薄层色谱( t l c ) 薄层色谱( t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y , t l c ) 是一种快速、简便、高效、经济的色谱分析 方法，广泛应用于手性拆分。朱全红等【8 】用t l c 法拆分了氨基酸对映体。r o o n g n a p a s u e d e ee ta 1 【9 】用八种纤维素苯基氨基衍生物作为t l c 固定相成功拆分了心得安和 b u p r a n o l o l 。方艳红等研究采用r p t l c 拆分d ，l 苯丙氨酸对映体【l o 】和d ，l - 组氨酸对映体 i h 在反相c 1 8 薄层板上点样，以i b - c d 饱和溶液甲酸甲醇( 9 2 1 ) 和j 3 - c d 饱和溶液甲酸 甲醇0 0 4 2 5 ) 为展开剂，利用p c d 作为手性流动相，在最佳的流动相组成、配比和展开 温度下，使d ，l 苯丙氨酸对映体和d ，l _ 组氨酸对映体得到很好的拆分。王伟等【1 2 】用超声 法合成了三种纤维素苯甲酸酯类手性固定相：三( 苯甲酰基) 纤维素、三( 4 氯苯甲酰基) 纤维素和三( 2 一氯苯甲酰基) 纤维素，并将其用于t l c ，成功地拆分了2 - ( 9 一葸基) 2 甲氧 基乙酸、2 ( 9 葸基) 2 羟基乙酸、苯丙氨酸、组氨酸及扑尔敏5 种手性物质。朱全红等【1 3 】 合成了苯基异氰酸酯衍生化 3 - c d 键合固定相，用作t l c 手性固定相。研究表明该固定相 性能稳定，适用于正相和反相色谱，并成功拆分了氯喹、布洛芬、卡维地洛、异丙嗪、氧 氟沙星六种手性化合物。 1 2 4 超临界流体色谱( s f c ) 超临界流体色谱( s f c ) 是以超临界流体作为流动相进行分离的一种色谱技术。具有 高效、快速、操作条件易于变换等特点，在手性拆分方面可与h p l c 、g c 相互补充，具有 良好的应用前景。s f c 的优越性体现在以下四个方面：( 1 ) 流体的粘度接近于气体，比液 体低得多，可减少传质过程的阻力，采用细长色谱柱可以增加柱效。超临界流体的扩散系 数在气体和液体之间，可使用较高的最佳线速，与h p l c 相比，s f c 分析时间缩短，具有 4 第1 章绪论 单位时间内更高的分离度【悼1 6 】。( 2 ) 流体的密度与液体相似，因此，它的溶解能力较强， 适于拆分难挥发和热稳定性差的物质，这是g c 所不及的。s f c 可在比g c 操作温度低的 条件下进行手性药物的拆分，减少了药物消旋化和手性固定相分解的可能性。( 3 ) s f c 系统 既可以用h p l c 系统的检测器，也可以用g c 系统的检测器，如紫外检测器u v ) 、氢火焰 离子化检测器( f i d ) 、电子捕获检测器( e c d ) 等，并且很容易实现与质谱( m s ) 、傅立 叶变换红外光谱( f t - i r ) 等的联用。( 4 ) 可以作为流动相的超临界流体物质种类多，与 h p l c 系统相比，对环境的污染及操作人员的毒害较小。s f c 的流动相易于去除，使得s f c 成为制备光学纯药物很有潜力的技术1 7 1 。 在s f c 中，温度、流动相的组成和密度对对映异构体的保留值、系统的立体选择性及 分离度的影响很大【1 8 圳】。由于s f c 需要在高压下操作，对设备和技术要求较高，限制了其 在手性拆分上的应用。但是，随着理论和技术上的完善，s f c 在手性拆分方面的应用将得 到进一步的发展【2 2 1 。 1 2 5 毛细管电泳( c e ) c e 又叫高效毛细管电泳( h i g h p e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r c s i sh p c e ) ，指离子或 荷电粒子以电场为驱动力，在毛细管中按其淌度或和分配系数不同进行高效、快速分离的 一种电泳技术，是在1 9 8 1 年由j o r g e n s o 等人2 3 1 首先提出，是8 0 年代经典电泳技术和现代 微柱分离相结合的产物。h p c e 具有五个方面的突出特点：1 ) 更适合分析大分子样品。如 核酸、蛋白质、多肽类药物等。2 ) 分析速度快、分离效率高，柱效高。通常理论塔板数在 1 0 5 以上。3 ) 实验成本低。h p c e 分离多在水介质中进行，消耗的大多为价格低廉的无机盐 类。4 ) 需要的进样量很小。通常是止级或n g 级。5 ) 操作模式多。只需更换毛细管内溶 液的种类、浓度、酸度或添加剂，就可实现一台仪器多种分离模式。 毛细管电泳手性拆分有两种基本策略：一是构建手性拆分环境，二是手性消除。手性 消除反应需要昂贵的手性反应试剂，产物的手性不易恢复。构建手性环境只需将手性物质 引人到c e 分离通道中，样品通过手性相互作用来改变迁移速度，最终获得分离，不触及 样品本身，具有简便、快速、高效、发展空间大等特点，己被普遍采用并得到迅速发展。 较常用的有毛细管区带电泳法( c z e ) ，胶束电动色谱法( m e c c ) 和毛细管电色谱法( c e c ) 。 环糊精及其衍生物、抗生素、冠醚、胆汁盐、手性混合胶束、手性选择性金属络合物、蛋 白、糖类及表面活性剂等是目前毛细管电泳中使用较多的手性选择剂2 4 1 。毛细管电泳法也 不能用于对映体制备。 一5 一 第1 章绪论 1 2 6 模拟移动床色谱( s m b ) 模拟移动床色谱( s m b ) 就是在色谱分离中模拟固定相和流动相相对于进样口的相对 循环流动，使两种具有不同保留值的组分被固定相和流动相分别带向进口的两边，从而实 现分离。模拟流动床色谱既保持液相制备色谱的优点，又克服了液相色谱不能连续操作的 弱点，而且因为可循环使用降低了成本。 1 3 手性固定相的种类及其研究进展 1 3 1 纤维素类衍生物手性固定相 纤维素是天然的高分子化合物，是由d 吡喃葡萄糖酐( 1 5 ) 彼此以d ( 1 - 4 ) 糖苷键连接 而成的线形高分子，化学式为( c 6 h | o o s ) n ，n 为聚合度。天然纤维素的平均聚合度很高，如 单球囊藻( 2 6 5 0 0 4 4 0 0 0 ) ，棉花纤维的次生壁( 1 3 0 0 0 1 4 0 0 0 ) ，q 纤维素( n 2 0 0 ) ，p 纤维素 ( n = 1 0 2 0 0 ) 和丫纤维素( n 1 2 ，为制备色谱提供了条件。 达世禄等酬合成了甘氨酸衍生化和【广酪氨酸衍生化 1 - c d 键合固定相，考查了固定相 对位置异构体、丹磺酰化氨基酸异构体、苯丙酸类药物等的拆分性能。 p e s e ke ta 1 【6 5 】成功地利用硅烷化硅氢化法将2 羟基3 甲基丙烯酸酯基丙基化i b - c d 键合到s i 0 2 的表面。与其它手性烯烃基键合固定相相比。该固定相在反相模式下对被外消 旋物具有更优良的手性能力。 r a p h a e l e ta 1 6 0 3 通过硫醚键或砜键将单2 和单6o 戊烯基化i b - c d 键合到巯丙基硅胶 上制得的新型手性固定相，在h p l c 体系或s f c 体系中，对哌啶2 ，每双酮类药物，即氨 鲁米特和沙利度胺的拆分中表现有不同的对映体选择性。在s f c 体系中，能够有效地拆分 氨鲁米特，但对沙利度胺拆分效果不理想。作者认为环糊精中2 位或6 位取代基团的空间 位阻及空间臂上的杂原子对手性识别起着十分重要的作用。 c h e ne ta 1 【6 刀利用( r ，s ) 2 一羟丙基化i b - c d 键合手性固定相在反相h p l c 条件下成功拆 分了5 个结构相似，碱性相近的核酸的碱基和次黄嘌呤，性能优于未衍生化的b - c d 手性 固定相。其作用机理主要是包合作用。对映异构体分子的体积及其与环糊精2 位碳上羟丙 基的氢键作用影响对映异构体在固定相上的保留行为。 r a m o smck ve ta 1 6 8 1 用( 2 ，3 - - - 氧一甲基一6 一特丁基二甲基硅基) p 环糊精作为手性 固定相利用液相色谱拆分了t 一丁内酯的衍生物。研究表明，这种手性固定相的手性识别能 力更多依赖取代基几何构型而非丁内酯取代烷基的极性，作者认为环糊精的包合作用比环 糊精空腔外的极性相互作用更为重要，此外，氢键在手性识别过程中起了重要作用。 1 4 3 b 环糊精类手性固定相的作用模式 ( 1 ) 正相模式 所谓正相色谱就是指固定相的极性大于流动相的极性。在正相色谱中，常用的流动相 是弱极性或非极性溶剂异丙醇、正己烷等的混合物，这时流动相中极性最小的组分将占据 环糊精空腔，并不易被对映异构体取代。对映异构体的保留主要是与环糊精分子剩余羟基 或修饰基团中新位点的互相作用或形成立体选择性氢键所决定。在此模式下可以很快达到 柱平衡，基线较稳定。在正相模式中，主要通过位于环糊精空腔外衍生基团的苯基、萘基 一1 5 第l 覃绪论 和氨基甲酰基等与对映异构体间的7 相互作用而达到手性拆分的目的。衍生基团的构象 在手性识别过程中有重要作用。 ( 2 ) 反相模式 在反相模式下，固定相的极性小于流动相的极性。常用甲醇、乙腈、四氢呋喃和水的 混合物作为流动相。在这种体系下，有机改性剂将与对映异构体竞争进入环糊精空腔。由 于在环糊精的空腔内分布有糖苷键的氧，并非是完全非极性空间，而且母体环糊精的空腔 两侧实际上是敞开的，在环糊精键合固定相拆分体系中分子形状适宜的那些对映异构体凭 借与环糊精仲羟基间的氢键和疏水作用进入环糊精空腔形成包合物。对映异构体分子中的 酸性基团和醇羟基对手性拆分过程有重要贡献。对于环糊精衍生物手性固定相，如引入苯 基、萘乙基或烷基，除了环糊精本身的空腔结合位和边缘羟基的作用外，还增加了对映异 构体与取代基之间的相互作用，使形成的非对映异构体包结物的构象相对稳定，增强了对 映体拆分中的手性识别作用。 ( 3 ) 极性有机模式 流动相由乙腈与少许氢键改善剂甲醇、乙酸、三乙胺组成。此拆分体系中，手性识别 能力与衍生基团结构、对映异构体与环糊精仲羟基间氢键、偶极堆积和立体因素有关。少 量添加成分如甲醇能同时与固定相中的环糊精和对映异构体以氢键结合，甲醇含量过多 时，在一些情况下对手性识别过程有不利影响。 1 4 4 拆分机理 ( 1 ) 三点相互作用理论 d a l g l i e s h 在1 9 5 2 年提出的“三点相互作用 ( t h r e e - p o i n ti i l t e r a c t i o n ) 理论 6 9 1 。图l - 6 为三点相互作用模型的示意图。根据这一理论，在一对对映体和c s p 之间，为了形成稳定 性不同的非对映体络合物而达到手性拆分的目的，分子之间至少需要三个同时发生的相互 作用力存在，而且，三个作用力中至少有一个作用力与立体化学有关。 为了识别两个对映体，手性选择剂与一种对映体进入一个与立体作用相关的三点相互 作用的稳定状态，而另一对映体则只能以两点作用形成不稳定的状态。这种稳定性差别越 大，则相互分离的可能性就越大。这种络合作用可以定量地表达为与键合及排斥作用相关 的平衡常数。排斥作用通常为立体排斥，有时也可能是偶极偶极排斥，而键合作用则包括 氢键、静电引力、偶极偶极吸引、电荷转移和疏水作用等。在运用“三点相互作用一解 一1 6 一 1 章绪论 释实验结果时，必须考虑一些细节问题，因为所采用的手性拆分方法、拆分模式、手性选 择剂或固定相及色谱条件不同，则有可能通过各种不同类型的分子问相互作用而达到手性 识别。 j 目映体 图l 三点相互作用模型示意图 f i gt t h r e e p o i n t i n t e r a c t i o n m e c h a n i s m ( 2 ) 包台作用 由于环糊精的空腔是疏水的，所以，在反相模式条件下，相对疏水的对映异构体占据 环糊精的内腔并生成包合物是对映异构体保留和手性识别的基础：在正相条件下，疏水的 流动相占据了环糊精的内腔，对映异构体与环糊精空腔口的羟基或衍生基团的相互作用是 主要的。在反相模式下，对对映异构体的保留受包合作用的影响，这种包合作用包括对 映异构体分子的非极性部分与相对非极性的环糊精内腔之间的相互作用，作用的示意图如 图1 7 所示。包合物由于范德华力和氢键作用力而变得稳定。对映异构体的大小、形状是 影响包合物的稳定性的关键因素。 + o 叮。譬| 图l 一7 环糊精键合固定相包合物生成示意图 f i g1 - 7 t h es k e t c h m a po f t h e i n c l u s i o n b e t w e e n t h e c d c s p s a n d t h e a n a l y k q 降 第1 章绪论 ( 3 ) 构象诱导作用机理 v e n e m a a c ta 1 7 1 1 认为，在2 ，3 ，6 位的衍生化基团有利于分子间的相互诱导作用， 增强环糊精空腔的柔韧性，使被拆分分子的手性中心易于与环糊精的手性部分接近，因而 拆分能力增强。k n a ok e ta 1 7 2 】报道了通过x 衍射证明洳环糊精经全甲基化后，分子的 柔韧性增强，能与邻甲基苯甲酸形成稳定的包合物。 1 4 5 影响手性拆分的主要因素 研究结果表明，环糊精类固定相的手性识别能力受许多因素的影响，比如：基质材料、 固定相的制备过程【6 7 1 、环糊精衍生物的取代位置 4 9 】、取代程度以及在担体上的键合量、色 谱条件等。 固定相的基质材料可分为两大类：有机基质和无机基质。目前，无机基质是研究和应 用中的主流，包括硅胶、氧化锆、羟基磷灰石、氮化物以及碳等。此外，在生化分析上还 经常用可控孔径玻璃，其中硅胶具有机械强度高、比表面积大及表面易于修饰与控制的特 点，其优异的物理、化学和机械性能，使其成为色谱填料的一种不可替