（应用化学专业论文）槲皮素粗品吸附特性的测定与保留时间的预测.pdf

鞍山科技大学硕士论文 摘要 摘要 槲皮素是黄酮水解的产物。黄酮存在于许多植物的花、叶、果实中。槲皮素 具有很高的药用价值。 吸附等温线是描述组分在固定相和流动相两相之间平衡状态的物化参数，是 色谱分离工艺设计和过程优化的基本参数。前沿分析法是测定吸附等温线的较为 准确、快速和经济的方法之一。本文的主要目的是利用前沿分析法测定槲皮素粗 品的吸附等温线，并以此为基础，计算出保留时间，再与实验中的保留时间进行 比较。 实验中，选择了测定吸附等温线的条件，在选定条件的基础上，测定了双组 分2 一苯乙醇和3 一苯丙醇的竞争性吸附等温线，又测定了三种不同槲皮素样品的吸 附等温线，将它们的吸附特性进行了比较。 结果表明，用单组分近似处理槲皮素粗品的吸附等温线是合理的，与标品及 生化试剂测定的结果比较，符合多组分吸附竞争特性，合理地反映了杂质对吸附 特性的影响。结果表明，在制备条件下通过计算得到的t 。与实验测得的t 。基本相 符。因此，本文的方法可以作为优化槲皮素分离条件的基础。在一定条件下，本 文的方法也可推广到一般粗品中有效成分的吸附特性测定与分离条件优化。 关键词：吸附等温线，槲皮紊，前沿分析法 鞍山科技大学硕士论文 a b s t r a c t a b s t r a c t t h eq u e r c e t i ni sh y d r o l y s i sp r o d u c to ff l a v o n o i d s t h ef l a v o n o i d se x s i ti nm a n y v e g e t a t i v ef l o w e r ，l e a f , f r u i t t h eq u e r c e t i np o s s e s s e sv e r yh i g hm e d i c i n ev a l u e a d s o r p t i o ni s o t h e r mi sap a r a m e t e rt od e s c r i b et h ee q u i l i b r i u mc o n d i t i o no ft h e c o m p o n e n t sb e t w e e nt h es t a t i o n a r yp h a s e a n dt h em o b i l ep h a s e ，a n di ti sa l s ot h e i m p o r t a n tp a r a m e t e r i ns e p a r a t i o np r o c e s sd e s i g na n ds i m u l a t i o ns t u d y f r o n t a la n a l y s i s m e t h o di so n eo ft h em o s ta c c u r a t e ，p r e c i s e ，f a s ta n de c o n o m i cm e t h o dt od e t e r m i n e a d s o r p t i o ni s o t h e r m i nt h i sp a p e r ，t h em a i np u r p o s ei sd e t e r m i n i n ga d s o r p t i o ni s o t h e r m o ft h eq u e r c e t i nm i x t u r eb yf r o n t a la n a l y s i sm e t h o d ，a n da c c o r d i n gt ot h er e s u l t ， c a l c u l a t i n gt h er e t e n t i o nt i m e ，t h e nc o m p a r i n gw i t ht h er e t e n t i o nt i m eo b t a i n e df r o mt h e e x p e r i m e n tu n d e rp r e p a r a t i v ec o n d i t i o n s i nt h ee x p e r i m e n t ，t h es u i t a b l em e a s u r e m e n tc o n d i t i o n so fa d s o r p t i o ni s o t h e r mw a s c h o s e n ，b a s e do nt h ec h o s e nc o n d i t i o n s ，t h ec o m p e t i t i v ea d s o r p t i o ni s o t h e r mo fb i n a r y 2 - p h e n y l e t h a m o la n d3 - p l e n y p r o p a n o lw a sd e t e r m i n e d ，t h e nt h ea d s o r p t i o ni s o t h e r mo f t h et h r e ek i n d so fq u e r c e t i ns a m p l e sw e r ea l s od e t e r m i n e d t h ea d s o r p t i o nc h a r a c t e r so f t h r e ek i n d so fq u e r c e t i ns a m p l e sw e r ec o m p a r e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h es i n g l ec o m p o n e n ta p p r o x i m a t i o ni ss u i t a b l et od e a lt h e a d s o r p t i o ni s o t h e r m o fq u e r c e t i nm i x t u r e t h er e s u l t so ft h r e ek i n d so fq u e r c e t i n s a m p l e sp r e s e n tt h ec h a r a c t e ro fc o m p e t i t i v ea d s o r p t i o n ，a n da l s op r e s e n tt h ei n f l u e n c e o fi m p u r i t i e si nt h em i x t u r eo nt h ea d s o r p t i o nc h a r a c t e r t h er e s u l t sa l s os h o wt h a tt h e r e t e n t i o nt i m ec a l c u l a t e do na d s o r p t i o ni s o t h e r mo ft h ep r e p a r a t i v ec o n d i t i o n sn e a rt h e v a l u eo b t a i n e df r o mt h ee x p e r i m e n t s s ot h em e t h o di nt h i sp a p e rc a nb et h ef o u n d a t i o n t oo p t i m i z et h es e p a r a t i o nc o n d i t i o n so fq u e r c e t i n ，a n du n d e rc e r t a i nc o n d i t i o n t h i s m e t h o dc a nb ee x t e n d e dt oo t h e re f f e c t i 、，ec o m p o n e n t si nc o r r e s p a n d i n gm i x t u r e s k e y w o r d s ：a d s o r p t i o ni s o t h e r m ，q u e r c e t i n ，f r o n t a la n a l y s i sm e t h o d 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特另, jj j l l 以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得鞍山科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料，与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了谢意。 签名：趣堡丛日期：趔釜旦幽 关于论文使用授权的说明 本人完全了解鞍山科技大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校 可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手 段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名： 鞍山科技大学硕士论文 引盲 第一章引言 1 1天然药物有效成分的分离及提取 随着科学技术的发展、新技术的应用，天然药物中有效成分的应用获得了前 所未有的发展，在世界范围内掀起了从天然药物中提取分离有效成分的热潮。我 国的天然药物资源十分丰富，然而，就目前世界天然药物的贸易额来看，我国仅 占1 8 左右。究其原因，主要是制各分离工艺落后所致。3 1 。 1 2 色谱及模拟移动床色谱( s m b c ) 在药物领域里的应用 色谱是一种现代分离、分析方法，也是一种研究物理化学过程很好的手段。 任何两种不同的物质，只要它们存在物理、化学或生物学性质上的差异及在不同 物相上分配系数的差异，便都可以在色谱过程中得到分离、分析和测定，从而可 以获得一些物理化学常数。 色谱技术自从2 0 世纪5 0 年代以来作为一种分析技术迅速发展的同时，也逐 渐发展成为一种高效率的分离手段，被应用于化工、制药及生物制品的生产过程 i “3 1 。色谱分离技术以其高选择性而著称，它能将物理和化学性质很相近的不同组 分分离开来。许多其他方法难以分离的混合物都可以通过色谱法进行分离。色谱 法能够处理的物质涵盖了从氢气到蛋白质的所有分子量范围。 2 0 世纪6 0 年代初g i d d i n g s 等人对色谱理论的研究成果为高效液相色谱的发 展奠定了理论基础。但直到2 0 世纪6 0 年代后期由于新型柱填料、高压输液泵和 高灵敏检测器的出现，才使液相色谱快速地发展起来，并发展成为高效液相色谱 ( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 1 4 _ 1 司。 近年来，随着制药工业和生物技术的发展，特别是重组d n a 和杂交瘤技术的 广泛应用，对于某些以生物活性大分子为主的重要生物制品和药剂( 如标准蛋白 质、干扰素、生长激素等) ，采用传统的分离技术，如超离心、沉淀、萃取、超滤 等往往达不到所需的纯度要求。因此，人们在对高效的分离与纯化技术的探索中， 将研究的重点转向了色谱法，使色谱分离在理论上从线性色谱发展到非线性色谱， 在实践中，从分析规模发展到制备规模和生产规模。近十年来，高效制备色谱已 鞍山科技大学硕士论文引言 经成为当代高效分离与纯化技术的研究前沿”。 近年来在制药、生物技术、精细化工等领域里，液相制备色谱已经得到了越 来越广泛的应用。液相色谱有许多其他方法无法替代的优点，如能耗小、分离纯 度高以及可常温操作等，但同时也有操作费用较高和不可连续操作的缺点，阻碍 了其在工业生产中的进一步应用。基于这些情况，人们发明了许多改进的技术， 如循环色谱、连续色谱和模拟移动床色谱等，而其中最具吸引力的是模拟移动床 色谱。 模拟移动床色谱( s i m u l a t e dm o v i n gb e dc h r o m a t o g r a p h y ，s m b c ) 是提纯化 合物的一个强大的分离手段 2 1 。由于s m b c 技术减少了为达到特定分离所需的固 定相及流动相的体积，成本的节约使色谱分离更加经济可行。但应用于制药及精 细化学品的制备分离技术却一直发展缓慢，直到2 0 世纪8 0 年代随有关s m b 理论 框架的形成和模拟程序的出现，以及p l c 在硬件方面的不断完善，s m b 技术得以快 速发展。9 0 年代以来，s m b 技术开始用于药物尤其是手性药物的分离。与手性药 物化学分离和酶法拆分相比，模拟移动床色谱有着低成本和生产周期短的特点， 而且模拟移动床色谱也非常适合两组分的分离，只要选择合适的手性固定相及一 定的操作参数，就可以有效地得到高纯度的对映体产物。因而，在手性药物大规 模拆分领域中，模拟移动床色谱已经获得了广泛的应用。目前，国际上几个主要 工业发达国家如美国、法国及1 7 1 本都已出现了以上述分离技术为核心的产业，如 美国的u o p 、a s t ，法德联合组建的n o v a s e p ( 主要服务于药物分离和精细化工) 及日本的s o k e n 综合化学公司( h i s e p ) 2 3 i 。 将模拟移动床色谱技术与我国的药物规模化精细分离结合，必将有利于中药 和天然药物中的有效成分的提取，从而开发出更安全有效的治疗药物，并推动我 国中药现代化的长足发展【2 4 】。 1 3 吸附等温线在色谱规模化精细分离中的作用 利用色谱技术尤其是模拟移动床色谱技术进行规模化精细分离天然药物的有 效成分时，测定其吸附等温线是一个重要的前提，因为规模化色谱过程，进样量 大，分离过程基本上处在非线性状态，只有测定吸附等温线才能把握整个分离过 程，因为吸附等温线表达了从低浓度到高浓度的吸附特性全貌。 鞍山科技大学硕士论文 引言 色谱分离中固定相的物化性质对色谱的高效分离起着关键作用。吸附等温线是 描述组分在固定相、流动相两相之间平衡状态的物化参数，它表征了固定相在特 定流动相条件下对待分离组分的吸附性能，是色谱分离工艺设计和过程模拟研究 中最基本的参数【2 5 】。 1 4 吸附等温线在色谱中的应用 近年来，吸附等温线在优化色谱分离条件，为生产工艺特别是在模拟移动床 色谱分离技术中的应用非常广泛。李蓉，耿信笃口6 】等利用不同进样量条件下测定 的容量因子和进样量求出组分在气固两相达到分配平衡时的分量，然后根据气一 固两相体积计算出组分在两相分配平衡时的浓度，实验证明，吸附等温线呈线性 的色谱，在一定进样范围分配系数不随气相组分浓度发生改变；而吸附等温线为 非线性的色谱，分配系数是气相组分浓度的函数。对凸型吸附等温线，分配系数 随气相组分浓度的增加而减小，而对凹型吸附等温线，分配系数与浓度关系正相 反。由于色谱分析中的容量因子与分配系数紧密相关，因此，色谱保留值也与吸 附等温线有内在联系。孙培冬，彭奇均1 2 5 】等以木糖、木糖醇为例，利用静态法和 吸附脱附法测定单、双组分在固定相上的吸附等温线，结果表明，静态法存在一 定的误差。在用静态法测定时，固定相对组分是静念吸附，与色谱分离时固定相 对组分的动态吸附不同，这是测定时出现误差的原因之一：静态法测定吸附量时， 树脂浸泡在组分溶液中，树脂吸附量与溶液中组分量相比是很少的，溶液质量浓 度大，吸附前后溶液质量浓度变化小，因此，当液相质量浓度较大时，这种变化 不易精确测出，这是测定时出现误差的另一原因。而吸附脱附法则可弥补这些缺 点，所以可准确测出固定相的吸附等温线。边六交，耿信笃1 27 l 等利用连续前沿色 谱法和断续前沿色谱法测定了七种蛋白质的吸附等温线。实验结果表明，在相同 实验条件下，不论是吸附量还是吸附等温线形状，用这两种方法所测结果存在着 明显的差别。因此，有必要对引起这种差别的原因进行深入地讨论。彭奇均，徐 玲2 8 1 测定了在不同温度下柠檬酸的吸附等温线，实验结果是随温度升高，柠檬酸 的饱和吸附量降低。欧锦如，林炳昌1 2 9 l 等用前沿分析法测定了苯酚的正相和反相 的吸附等温线，根据实验的条件和结果，并进一步讨论了非线性色谱保留时间与 进样量的关系。戴闽光，杨齐愉i3 0 】等用迎头色谱穿透曲线法，用环己烷作为吸附 质，通过测定各种活性炭对环己烷的吸附等温线，详细讨论了环己烷荷量作为评 鞍山科技大学硕士论文 引言 价活性炭吸附性能的条件。此实验共测定了四种比表面差别比较大的活性炭对 环己烷的吸附等温线，前三种等温线上的饱和荷量随着它们比表面的增大而增加； 后一种饱和吸附量大，其比表面反而小，这表明虽然有了比表面和饱和荷量数据， 还不能完全了解炭样的孔结构情况。吸附和扩散特性是进行色谱过程的基础，杨 军，郝雅林1 3 l 】测定了紫杉醇及其类似物三尖杉磷碱在多孔硅胶上的吸附及扩散特 性，结果表明，紫杉醇和三尖杉磷碱在硅胶上的吸附不符合l a n g m u i r 单分子层吸 附理论，但在低浓度下可用溶剂调整型l a n g m u i r 模型描述。扩散研究表明：紫杉 醇和三尖杉磷碱在硅胶上吸附较弱，表面扩散可以忽略。相同条件下，紫杉醇的 吸附量受强溶剂影响较大，强溶剂组成的增加会造成紫杉醇吸附量很快下降，这 和在正相色谱中紫杉醇先于三尖杉磷碱流出色谱柱的事实是相符的。苏海云，赵 传钧口2 j 用静态法和动态法测定不同温度下十二烷基苯磺酸钠在石英砂上的吸附等 温线，结果表明：从静态法和动态法测得相同形状的吸附等温线，温度升高吸附 量降低；在同样条件下动态法测得的吸附量比静态法测得的吸附量要小的多。张 唯心，赵红阳【33 j 用顶空色谱法测定了活性炭对有毒蒸气的吸附等温线，并计算了 比表面积、微孔容积及其孔径分布等，结果表明：采用顶空色谱法可以测定活性 炭对低挥发度有毒蒸气的吸附等温线和计算孔结构，其数值与其他方法测定的结 果相比较是吻合的。张莹，施兆鹏1 3 4 j 对茶氨酸制备色谱分离时其在反相c 。色谱分 离柱上的热力学及动力学色谱行为进行了研究。采用前沿分析法对其吸附等温线 进行表征，对其在不同超载方式和超载程度时的超载点进行定量表达：并研究在 超载状态下茶氨酸的各分离参数的变化关系及其对分离操作的影响。结果表明， 为提高茶氨酸产率，以采用体积超载方式为好，并可采用峰宽对体积超载进行表 征，当w 增宽1 5 - 2 0 时，表示色谱柱处于体积超载状态：为提高制备量，可采用 较大颗粒的填料。瑞典化学家j o h a nl i n d h o l m ，p a t r i kf o r s s e n 等【35 】用微扰法测 定了1 1 。一羟基孕酮非手性系统和扁桃酸脂手性系统四种物质吸附等温线的参数， 用这些参数模拟的流出谱图与实验得到的谱图一致。a j o yv e l a y u d h a n 等1 3 6 j 在用 离子交换柱测定吸附等温线时，在流动相中加入调节物来测定吸附等温线，并讨 论了吸附等温线的情况。z i d um a ，g e o r a g e sg u i o c h o n 等刚讨论了把简单波理论 应用到竞争性吸附等温线中的情况。 鞍山科技大学硕士论文 基础理论 第二章基础理论 2 1槲皮素的性质和药用价值 槲皮素的二水合物为黄色针状结晶，在9 5 9 7 。c 成为无水物，熔点3 1 4 。c ( 分 解) 。l g 槲皮素溶于2 0 0 m l 无水乙醇，2 3 m i 沸乙醇：槲皮素溶于冰醋酸，碱性水 溶液呈黄色，几乎不溶于水，乙醇溶液味很苦。 槲皮素的结构式如图2 一l ： 0 h h o 图21 槲皮素的基本结构 f i 9 2 一lt h es t r u c t u r eo fq u e r c e t i n 槲皮素是黄酮水解的产物，黄酮存在于许多植物的花、叶、果实中，多以甙 的形式存在，如芦丁( 芸香甙) ，槲皮甙，金丝桃甙等，经酸解可得到槲皮素。槲 皮素具有抑制促癌剂的作用、抑制离体恶性细胞的生长、抑制艾氏腹水癌细胞d n a 、 r n a 和蛋白质的合成。槲皮素有抑制血小板聚集和5 一羟色胺( 5 - h t ) 的释放作用。 槲皮素对a d p 、凝血酶和血小板活化因子( p a f ) 诱导的血小板聚集均有明显抑制 作用，其中对p a f 的抑制作用最强，槲皮素也能明显抑制凝血酶诱导的兔血小板 3 h 一5 一h t 的释放。槲皮素不溶于水，故导入亲水性基团会增加其溶解性，令其便于 吸收，从而增强其药理作用。合成的槲皮素氧乙酸赖氨酸盐，水溶性增加f 3 8 i 。 生产中通常是通过水解黄酮来制备槲皮素，黄酮主要水解成槲皮素 ( q u e r c e t i n ) 、山奈酚( k e a m p f e r 0 1 ) 、异鼠李素( i s o r h a m n r t i n ) 这三种为主要成分 【3 9 】。目前检测槲皮素的方法是色谱法，其中，最常用的是高效液相色谱法。槲皮 素含量的测定方法主要是外标法1 4 0 1 。 鞍山科技大学硕士论文基础理论 2 2 色谱分离基本原理h ” 2 2 1 色谱的物理模型 色谱是一个建立在吸附、分配、离子交换、体积排阻等基础上的分离过程。 在这个过程中组分的主要运动形式是吸附、扩散和相间传质，就其本质来说，色 谱过程是物质在多孔介质中吸附、扩散和相间传质的过程。其物理模型如图2 2 所示 g c i 创疋a 厂一 ，仃，7 ， “ 流动相 xx + x 图22 色谱物理模型 f i 9 22p h y s i c a lm o d e lo fc h r o m a t o g r a p h y u 为固定相所占有的体积比，s 为柱横截面积，q 为流动相流量，e 为柱中 间的流动相体积比，线流速为u ：q se ，组分在固定相中的浓度为q ，组分在流动 相的扩散系数为d ，流动相与固定相之间的传质阻力，其倒数即传质阻力系数为k ， 物质随流动相进入柱系统，物质在系统之内主要进行三种运动：i 、在固定相表面 进行吸附与分离：2 、在流动相内进行对流扩散：3 、在两相之间进行传质。在整 个过程中的任一时刻和任意点位置，物质的分配都遵守质量守恒定律。 各组分在液相色谱中分离的过程主要有两种：i 、样品中各组分的迁移速度不 同( 差速迁移) ：2 、每种组分分子的纵向( 轴向) 扩散分布( 谱带扩散) 。 根据热力学理论，物质在吸附分离过程中，在柱系统内分别在固定相和流动 相上进行吸附和分离，在系统内流动相、固定相和溶质( 物质) 决定了溶质在系 统内的运动情况，其运动过程符合吸附等温线。 在流动相内，由于不同位置具有不同的物质浓度，于是存在浓度梯度( 篆弘和 ( 篆) ，+ 。的差别，所以在浓度不同的地方存在传质。扩散系数d 是传质项 鞍山科技大学硕士论文 基础理论 l ，：一d 善的系数，表示扩散速度的大小。 在两相之间，其传质模型符合詈= 一足 g 一厂( c ) 】，f ( c ) 是平衡时固定相中应有 的物质浓度，传质阻力系数为k 。由于k 不为0 ，物质在两相中进行分配就需要时 间，在实际的分配过程中物质往往来不及达到平衡就进行下一次分配，所以我们 只能求近似过程。 2 2 2 色谱的数学模型 根据以上物理模型，我们可以建立相应的数学模型。一般色谱过程包括对流、 扩散与吸附分配。最简单的平衡色谱过程的数学表达式为：先以单组分的理想分 配色谱模型为例：设扩散系数d = 0 ，传质阻力系数k = 一，即设无扩散，分配瞬间 平衡。在x x + x 的微元长度内，在t t + a t 的微元h t i 目j 内，组分在色谱柱系 统内，按照质量平衡方程，运动的数学描述如下： f 黔50 。甓+ a x , t ) x gu s a t 妣= l c ( xt + a t ) s a x + a t ) xu ，) s 鼢州列ms a x r ， 占 + g g ，妣j 一【c g ，) s 鼢+ g ( x ，) j s 为柱截面。 得 “箜+ o _ c + f 塑：o 苏西o t ( 2 - 2 ) f 为相比( f ：竺) ，因为传质阻力系数k = 一，所以q = q = ( c ) ，所以( 2 2 ) 式可以表示成 f 1 + f 塑) 丝+ “箜：0 ( 2 3 ) d ca f融 ( 2 - 3 ) 式表示单组分的理想分配色谱过程中的质量守恒关系。 如果在柱系统内有扩散，即扩散系数d o ，作类似的分析可得 ( 1 + f 堕) 丝+ “丝：d 8 2 c 、d c o t缸 o x 2 ( 2 - 4 ) 称为平衡色谱方程。 如果相间传质阻力不忽略，k c o ，这样的色谱方程称为非平衡色谱方程，方 塑坐翌垫查兰翌主垒茎墨燮 程表示为： “瓦o c + 百o c + f 鲁= 。等 粤k ( qg + ) 其中q = 厂( c ) 。 对一般的色谱来说，其初始条件为c ( x = o ，t ) = q ( x = o ，) = 0 边界条件有两种： 一是无限长柱，即 一o ，归雠 另一是有限长柱，采用d a n c k w e r t s 条件： 卜唾k 觚t 为及飘= 。 2 2 3 理想、平衡、非线性色谱保留时间f 。的理论计算1 在线性情况下，当操作条件一定，色谱保留值的大小与进样量无关，此时色谱 流出曲线对称呈高斯( g a u s s ) 函数分布，如图2 - 3 ( a ) 。实际制备中，进样量常过 载，这时，过程呈非线性状态，流出曲线偏离g a u s s 分布，呈不对称峰，在扩散 和相间传质阻力都趋近于零时，即在理想、平衡、非线性时，色谱峰呈直角三角 形，保留值随进样量发生改变4 2 。5 1 ，如图2 - 3 ( b ) 。 ( a ) 高斯型 ( b ) 激波型 图2 - 3 色谱流山曲线 f i g2 - 3 c h r o m a t o g r a p h i ce l u t i o np r o f il e s 9 一 鞍山科技大学硕士论文基础理论 在理想、平衡、非线性条件下，对于矩形波输入，在l a n g m u i r 方程q = 0 拿的 l + b c 吸附条件下，由a r i s 与a m u n d s o n 的讨论得 r f r p + o i1 + f g l 1 l 这里r 。为注入宽度，c 0 为注入浓度，g ，b 死时间，l 为柱长。 ( 2 6 ) 为l a n g m u i r 方程中的常数，f 。：一l “ 2 2 4 非理想、非平衡、非线性条件下扩散对保留时间的影响。9 当有扩散与相间传质阻力存在时，非线性色谱的流出曲线有激波层，这时 c ， 保留时问比起理想平衡时有相当的改变。 图2 - 4 由理想、非平衡非线性色谱方程计算出的谱带曲线 f i 9 2 4t h ec h r o m a t o g r a mw a sc a l c u l a t e db yt h ee q u a t i o no fi d e a l 、n o nb a n l a n c e a n d n o n 一1 i n e a r 图2 4 中实线代表。= 。，f 1 = 。理想平衡时组分的保留时间，虚线代表的是。 和古都不等于零时的情形。 豆眠 塑坐翌垫查兰翌主垒茎兰堑! 墨鱼 c 图2 - 5 虬与d 对流出曲线的影响 f i 9 2 5t h ei n f l u e n c eo fc h r o m a t o g r a mw i t hk ra n d do nt h ee l u t i o np r o f i l e 图2 5 中，实线代表的是呻古较j 、的情形，圈线代表的是d 和古戤匕较 大的情形。 从以上各图中可以看出，扩散和相间传质阻力对保留时间的影响，都是使保 留时间延长。 2 3v a n d e e m t e r 方程 理论塔板高度日和理论塔板数都是表示分离效率的参数。塔板数n 被认为 是柱效的量度，更精确地说被认为是相对于色谱峰移动距离的色谱峰展宽的量 度 4 6 0 = 箬= 等 ， 盯一一 日：一l ( 28 ) 式中： ，。一保留时间； w 一谱带宽度： 由式( 2 1 0 ) 可以看出，塔板数主要依赖于谱带的扩展。而谱带的扩展是由涡流 鞍山科技大学硕士论文基础理论 扩散、分子扩散和传质阻力三方面因素决定。关于这方面内容，范第姆特 ( v a n d e e m t e r ) 做了很详细的叙述。v a n d e e m t e r 方程如下： 等+ 卜志荽+ 等 。， 上述方程也可写成： h = a + b u + c “ 其中，一一涡流扩散项； 一b 一分子扩散项； c “一传质阻力项； 九一与填充均匀紧密有关的填充校正因子； v 一与填充物有关的校正因子； d 。一溶质在流动相中的扩散系数； 口一几何因子，与柱填料的形状有关； d 。一固定相的有效厚度； d 。一溶质分子在固定相中的扩散系数； 形一与填充情况有关的系数。 2 4 l a n g m u ir 吸附等温线方程 2 4 1 单组分l a n g m u ir 吸附等温线方程 l a n g m u i r 吸附等温线方程可以从统计力学的方法得到，也可以从动力学方法 得到。 詈动力学方程主要考虑的是组分分子已经达到固定相表面的情形，这时决定 鲁的是吸附与脱附。一个简单的模式是 吸附速率为女。( 爿一g ) 。 脱附速率为l ( b c ) q 这里a 是固定相的吸附容量，b 是流动相的饱和度，。，k 。，分别为吸附与脱 鞍山科技大学硕士论文 附过程的速率系数。这个表达式况明，吸附 成正比，而脱附速率与q 成正比，也与流动 鲁咆( a - q ) c _ n ( b - c ) q 这即是相间传质的动力学方程。它的出 相平衡。这时，动力学方程给出的平衡极限 。： 生兰! 。 k a b + ( k 。一k d ) c 这里q 指平衡时组分在固定相的浓度。 令望k=g，生盘=b，即有ab k a b _ 。g c g2 丁五 此为l a n g m u i r 吸附等温线。 2 4 2 多组分l a n g m u ir 吸附等温线方程 多组分吸附等温线的l a n g m u i r 方程是 旷而而亭焉 ( 2 一1 1 ) 当i = 2 时，上述方程就是双组分l a n g m u i r 吸附等温线方程。 2 5 吸附等温线的测定方法及其基本原理 吸附等温线测定方法主要有静态法，吸附脱附法，微扰法，矩形脉冲法，前 沿分析色谱法，前流速分析法等。本文主要介绍静态法，吸附脱附法和前沿分析 色谱法。 2 5 1 静态法 静态法( s t a t i cm e t h o d ) 是将固定相置于一定质量浓度的组分溶液中，放置较长 时间，使固定相达到吸附平衡。根据吸附前后溶液质量浓度的变化计算出固定相 的吸附量。作出吸附等温线 鞍山科技大学硕士论文 基础理论 d ：v ( c o - c ) 1 矽 ( 2 1 3 ) 式中：q 为组分在固定相中的吸附量：v 为溶液体积：c 。为溶液中组分的初始浓度： c 为吸附平衡时的溶液浓度；w 为固定相的质量。这种测定方法操作简便，所需仪 器简单，样品用量小，且计算容易，因此国内文献报道大多采用这种方法测定等 温线【4 7 5 ”。 2 5 2 吸附脱附法 吸附脱附法( a d s o r p t i o n d e s o r p t i o nm e t h o d ) 是将固定相装于色谱柱中， 先测定柱内空隙率，然后将不同质量浓度的组分溶液长时间流经该柱，使柱中固 定相达到吸附平衡，再用脱附剂将已被吸附的组分从固定相上洗脱，测出沈脱液 中组分的量，扣除柱空隙中的组分，即得固定相的吸附量，并可作出吸附等温线。 q = 鱼堕生壁二监堂 ( 2 一1 4 ) 式中：c 洗脱是洗脱液中组分浓度；v 洗脱是沈脱液体积；s 为空隙警；v 拄为 柱体积：o 组分为流动相中组分的浓度。 这种方法在固定相吸附时，组分以流动的形式经过固定相，而后又被洗脱剂洗 脱，这与色谱分离中样品在固定相上动态吸附一致；而且它的操作和计算也较方 便，因此它是国内外文献中经常报道的一种方法【2 5 】。 2 5 3 前沿分析色谱法 本文使用的就是这种方法。前沿色谱法( f r o n t a l a n a l y s i s ) 又叫动态法，是测 定吸附等温线的最精密、准确、快速和经济的方法之一，并且与静态法测定结果 一致。十几年来，人们已用这种方法研究了不同的小分子和生物大分子在不同色 谱填料上的吸附行为。可是，严格来讲，前沿色谱法应当有两种增大流动相中组 分浓度的方式：一种即文献报道的方法，在进行一个低浓度组分的前沿分析后， 不必将吸附在吸附剂上的组分清沈干净，随之增大流动相中该组分浓度，我们称 之为连续前沿色谱法( c o n s e c u t i v ef r o n t a lc h r o m a t o g r a p h y ，以c f c 表示) ；计 算公式为： v o ( q ，一q 。) = ( ，一，) ( c 一c 。) ， 鞍山科技大学硕士论文基础理论 由此式可得 铲坠半媳一 或 q ，=堕玉掣+ q 产r 。 ( 2 一1 5 ) ( 2 1 6 ) 式中c ，和q 。分别为第f 次建立平衡时溶质在流动相与固定相中的浓度；，( f 。) 为穿 透点的保留体积( 对应保留时间) ；( f 。) 为色谱柱的死体积( 对应死时间) ：为 色谱柱中吸附剂的体积：，为色谱柱内固定相与流动相体积比( 相比) 。连续通过 一组浓度依次增加的溶质溶液，即可得一系列的c ，对应的，o 。) ，再测定死时间， 即可计算出相应的g ，进而可作出吸附等温线1 5 “】。 下图是连续前沿色谱法测定吸附等温线的流出曲线图。 图2 - 6 前沿分析法测定吸附婿温线的流出曲线幽 f i 9 2 6c h r o m a t o g r a mo f a d s o r p t i o ni s o t e r mb yf a 图中，两个平台的中点是穿透点，穿透点所对应时间是保留时间。 另一种是在测定一指定浓度下某组分的前沿色谱图后，将色谱柱清洗干净， 再作下一指定浓度下的前沿色谱图，我们称之为断续前沿色谱法 ( n o n c o n s e c u t i v ef r o n t a lc h r o m a t o g r a p h y ，以n c f c 表示) 。计算公式与吸附 脱附法一样2 “。 双组分的l a n g m u i r 吸附等温线方程，如下所示 a 。= ! ! ! ! i 二：! ! ! ! i ! 二二三二! ! ! j ；! i ! 二：! ! 型+ a ，一( z 一，) 其中，i - i ，2 对应的是组分，j 对应第j 次建立平衡的平台，m 对应子平台。 根据实验所得的c 与q 作图，就可以绘出组分的吸附等温线，然后根据所得 鞍山科技大学硕士论文 基础理论 的c - 和q ”用最小二乘法一元线性回归法求得三q2 丽1 + 鱼g 中的g 和b ，将g 和b 代入等温线方程，这样就可以求出吸附等温线方程。 2 6 一元线性回归分析”2 1 一元回归处理的是两个变量之间的关系，即两个变量x 和y 之间如果存在一 定的关系，则通过观测所得数据，找出两者之间的关系式。如果两个变量的关系 大致是线性的，那就是一元线性回归问题。 对两个现象x 和y 进行观察或实验，得到两组数值：x l ，x 2 ，x n 和y l ， y 2 ，y n ，假如要找出一个函数y = f ( x ) ，使它在x = x 1 ，x 2 ，x n 时的数值 f ( x 1 ) ，f ( x 2 ) ，f ( x n ) 与观察值y 1 ，y 2 ，y n 趋于接近。 在一个平面直角坐标x o y 中找出( x 1 ，y 1 ) ，( x 2 ，y 2 ) ，( x n ，y n ) 各点， 将其各点分布状况进行察看，即可以清楚地看出其各点分布状况接近一条直线。 对于这种线性关系，可以用数学公式表示： y = a + b x( 2 1 8 ) 这条直线所表示的关系，叫做变量y 对x 的回归直线，也叫y 对x 的回归方程。 其中a 为常数，b 为y 对于x 的回归系数。 对于任何具有线性关系的两组变量y 与x ，只要求解出a 与b 的值，即可以写出回 归方程。计算a 与b 值的公式为： 口= j ，一b x ( ，一x ) ( r b = i = 1 x 、2 ( 2 1 9 ) 式中：z 为变量x 的均值，x i 为第i 个自变量的样本值，j ，为因变量的均值，y i 为第i 个因变量y 的样本值。n 为样本数。 鞍山科技大学硕士论文 实验部分 第三章实验部分 3 1 仪器、试剂与药品 3 1 1 实验仪器 岛津l c 一1 0 a t 高效液相色谱仪 岛津l c 一1 0 a t 分析泵 岛津s p d i o a 紫外检测器 岛津r i d 一1 0 a 示差折光检测器 d i a m o n d 色谱柱 ( 5 阻，孔径5 0 a ，4 6 2 5 0 m m ，0 d s 不锈钢柱，迪马公司) ( 5 m ，孔径1 2 0 h ，4 6 2 5 0 m m ，0 d s 不锈钢柱，迪马公司) 安捷伦d bc 。柱( 4 6 1 5 0 m n j ，m a d ei nu s a ) 岛津分析池，制备池 浙江大学n 2 0 0 0 色谱工作站 制备单柱1 + 1 0 c m ( i d l ，大连伟大分析仪器厂) s b 2 2 0 0 超声器( 上海申波超声公司) w s t o 一1 型红外快速干燥箱( 上海宝山先进仪器厂) 柱温箱( h t - 2 2 0 a ，天津市恒奥科技发展有限公司) 进样针( 宁波市镇海玻璃仪器厂) 电子天平( o 1 m g 2 1 0 9 ，s t a r t o r i u s ) 3 1 2 实验试剂与药品 甲醇( 色谱纯 ( 色谱纯 甲醇( 分析纯 c ，。填料( 2 5 3 磷酸( 分析纯 苯酚( 分析纯 天津市永大化学试剂丌发中心) 天津市西华特种试剂厂) 北京化工厂) d m ，天津市化学试剂二厂色谱技术开发公司) 北京化工厂) 沈阳市新西试剂厂) 鞍山科技大学硕士论文 实验部分 3 一苯丙醇( 色谱纯aj o h n s o nm a t t e yc o m p a n y ) 2 一苯乙醇( 化学纯，北京金龙化学试剂有限公司) 9 9 槲皮素标品( n e wj e r s e y u s a ) 生化试剂槲皮素( 中国医药上海化学试剂公司) 9 0 银杏黄酮( 自制) 二次蒸馏水( 自制) 3 2 槲皮素的实验与结果分析的准备工作 3 2 i 实验设备和条件的选择 1 ) 检测器的选择 检测器是检测色谱柱后流出组分和组分浓度变化的装置。在实验中，要求检 测器具有灵敏度高、适应性广、线性范围宽、噪音小及受外界条件的影响小等特 点。 在实验中，选择了日本岛津公司生产的紫外检测器和示差折光检测器。图( 3 - 1 ) 和图( 3 2 ) 分别是利用紫外检测器和示差折光检测器测定的苯酚的吸附等温线。 图3 - 1 紫外检测器测定苯酚的吸附等温线 鞍山科技大学硕士论文实验部分 山 r 图3 2 示差检测器测定苯酚的吸附等温线 f i 9 3 2a d s o r p t i o ni s o t h e r mo fp h e n o lb yr i o 从图3 1 和图3 2 可知，当苯酚的浓度为9 1 0 m o 一时，就已经达到了紫外 检测器的响应值上限，而示差检测器则可检测更大的浓度范围，实验过程中，根 据具体情况可在二者之问进行选择。 2 ) 流速的选择 流速是影响吸附等温线测定的重要因素。原则上吸附等温线是反映吸附过程 的热力学特性，它与流动相的速度无关。但流动相流速过快，则会导致色谱柱的 理论塔板数降低，从而使激波层厚度增大，流出曲线穿透点的选择会增大误差( 见 v a n d e e m t e r 曲线) ，并最终影响吸附等温线的测量精度。而流速低，组分的流出 时间就会很长，浪费时间。常用的流速范围每分钟在o 5 m l 1 5 m h 之间。本实验 采用的流速是0 8m l m i n 。 3 2 2 实验方法的选择 测定吸附等温线的方法很多，常用的是吸附脱附法和前沿分析法。很多文献 鞍山科技大学硕士论文实验部分 都应用过这两种方法，两种方法测得的吸附等温线基本相似。但是，吸附脱附法 在测定吸附等温线的过程中，耗时长，步骤烦琐；前沿分析法在测定吸附等温线 过程中，耗时短，方法简单数据准确。实验中，分别用这两种方法测定了苯酚的 吸附等温线。得到的结果与文献中的一致。因此，在实验中应用的是前沿分析法。 3 2 3 单、双组分吸附等温线的测定 在实际制备分离过程中，槲皮素样品是混合物，成分复杂，当要分离纯化槲 皮素时，往往要考虑其它物质群的影响，因此，为了能更好的分析槲皮素样品的 吸附等温线，首先，分别测定了2 苯乙醇和3 一苯丙醇单组分的吸附等温线，然后 测定了2 一苯乙醇和3 一苯丙醇双组分的竞争性吸附等温线。 3 2 3 1 前沿分析法测定2 一苯乙醇吸附等温线 2 一苯乙醇储备液的配制：用电子天平准确称取1 2 2 7 9 0 9 2 一苯乙醇于1 0 0 m l 容量 瓶中，用纯甲醇稀释并定容至刻度，摩尔浓度为1 0 0 5 m o l l 。 实验的色谱条件： 岛津l c 一1 0 a t 高效液相色谱仪 岛津r i d 一1 0 a 示差折光检测器 岛津l c 一1 0 a t 分析泵 d i a m o n d 色谱柱( 5 p m ，4 6 2 5 0 m m 孔径 2 0 a ) 检测温度：2 5 流速