（应用化学专业论文）核酸、蛋白质的有机光谱探针研究.pdf

西南科技大学硕士研究生学位论文第1 页 摘要 脱氧核糖核酸( d n a ) 和蛋白质都是重要的生物大分子。进行d n a 和蛋白质与小分子作用的研究和建立高灵敏度、低检测限的d n a 和蛋 白质的定量测定方法在新型的药物设计、抗癌药物的药理和毒性的研 究以及临床检测等方面具有重要意义。 本论文以紫外一可见吸收光谱、荧光光谱为研究手段，研究了有 机小分子( 对二甲氨基偶氮苯邻羧酸和锌试剂) 与生物大分子的相互 作用，并建立了测试方法。共分为四个部分： 第一部分，综述了核酸、蛋白质等生物大分子的各种光谱( 紫外 一可见吸收光谱、荧光光谱) 研究方法；概述了分子光谱法研究这些 生物大分子与有机小分子的相互作用。 第二部分，利用荧光光谱法及紫外一可见吸收光谱法研究了对二 甲氨基偶氮苯邻羧酸( j j r ) 与d n a 的相互作用，以d n a 为研究主体， 以j j r 为研究客体，讨论了有机小分子与d n a 的相互作用及机理，并 建立测试d n a 的方法。共分为两个小节： l 、利用紫外一可见吸收光谱法，发现在p h 为4 5 5 5 的缓冲溶 液中，d n a 与j j r 相互作用，生成红色配合物，该配合物的最大吸收 波长为5 2 5 n m 。反应前后的吸收光谱有明显的变化，配合物的吸收峰 与试剂本身比较红移了9 1 n m 且明显增强。可用于d n a 的定量测定。 d n a 的线性响应范围为o 1 0 1 2ug m l ；最大结合数n = 4 ：表观摩尔 吸光系数e = 5 。6 5 1 0 4l c m o l ；最低检出限为1 1 2ug 皿l 。方 法用于样品分析，结果满意。 2 、采用荧光光谱法研究了j j r 与d n a 结合反应的特征。由 s te r n v o l m e r 方程和双倒数曲线l i n ew e a v e r b u r k 方程获得了反应 的猝灭常数k 。，= 1 2 1 0 6 l m o l 、结合常数k 一o 5 1 0 6 m o l l 以及对 猕灭的类型做出了推断。并通过热力学参数、离子强度实验讨论并得 蛩它们以氢键、嵌插入、范德华力等几种方式作用以及反应的最佳实 验条件。 第三部分，利用荧光光谱法和紫外一可见吸收光谱法研究了对二 甲氨基偶氮苯邻羧酸( j j r ) 与蛋白质的相互作用。以人血清白蛋白 ( h s a ) 为研究主体，以j j r 为研究客体，利用荧光猝灭法和非辐射 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 i 页 能量转移理论，研究了有机小分子对人血清白蛋白的猝灭机制，求出 了两者的结合常数，结合位点，并根据热力学函数，讨论了两者的相 互作用类型。并由其同步荧光光谱可知j j r 对h s a 的构象几乎没有影 响。 第四部分，采用荧光光谱法、紫外一可见吸收光谱法研究了牛血 清白蛋白( b s a ) 与锌试剂( z c n ) 结合反应的特征。当b s a 中加入适量 的z c n ，b s a 的荧光被部分猝灭。由s t e r n v 0 1 m e r 方程和双倒数曲线 l i n ew e a v e r b u r k 方程获得了反应的动态猝灭常数、静态猝灭常数， 并对猝灭的类型做出了推断。通过计算反应的热力学参数讨论了结合 反应的主要作用力类型。根据f j r s te r 非辐射能量转移机理，求算了 给体( b s a ) 与受体( z c n ) 间距离r = 5 0 7 n m 和能量转移效率e = 0 6 7 。 证实了该体系的荧光猝灭是通过能量转移机制产生的单一静态猝灭 过程。并由其同步荧光光谱可知z c n 对b s a 的构象不产生影响。 关键词：荧光光谱法紫外可见吸收光谱法同步荧光光 谱生物大分子猝灭 西南科技大学硕士研究生学位论文 第1 页 a b s tr a c t p r o t e i na n dd n aa r ei m p o r t a n tb i o i o g ym a c r o m 0 1 e c u l e s b e c a u s e i ti sh e l p f u lt od e s i g nt h en e wt y p eo fm e d i c i n ea n ds t u d yt h eh e a l i n g p n c i p l ea n dt o x i c i t yo fm e d i c i n e ，i ti so fs p e c i a lv a l u et os t u d yt h e i n t e r a c t i o no fs m a l lm o l e c u l e sa n db i o m 0 1 e c u l e s i tiso fs d e c i a lv a l u e a b o u tc l i n i c a ld i a g n o s i st oe s t a b l i s ht h eq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no f p r o t e i na n dd n a w i t hh i g hs e n s i t i v i t ya n d1 0 wd e t e c t i o n1 i m i t i nt h i s p a p e r ，u s i n gm o l e c u i es p e c t r u m ( i n c l u d i n gn u o r e s c e n c e s p e c t r u ma n du l t r a v i o l e t v i s i b l es p e c t r u m )m e t h o d ， w es t u d i e dt h e i n t e r a c t i o nb e t w e e no r g a n i cs m a l lm 0 1 e c u l e sa n db i o m a c r o m o l e c u l e s ， a n dd e v e l o p e dt h ed e t e r m i n a t i o no ft h e i r q u a n t i t y t h e r ea r ef o u r c h a p t e r s p a r tir e v i e w e dt h ep r o g r e s so fn u o r i m e t r ya n ds p e c t r o p h o t o m e t r y a b o u tb i o m a c r o m o l e c u l e s( i n c l u d i n g p r o t e i na n dn u c l e i ca c i d ) a n a l y s i si nr e c e n t y e a r s ， a n ds u m m a r i z e dt h e p r e s e n ts i t u a t i o no f m 0 1 e c u l a rs p e c t r u mf o rt h er e a c t i o no fo r g a n i cs m a l lm o l e c u l e sa n d t h e s eb i o m a c r o m 0 1 e c u l e s p a r ti is t u d i e dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n2 - ( ( 4 一( d i m e t h y l a m i n o ) p h e n y l ) a z o ) 一b e n z o i ca c i d ( j j r ) a n dd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( d n a ) b y n u o r i m e t r ya n ds p e c t r o p h o t o m e t r y w ed e v e l o p e dan e wa n ds e n s i t i v e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( d n a ) d e t e r m i n a t i o nm e t h o d p a r ti i c o n t a i n s t w op a r t s ， 1 an e wa n ds e n s i t i v ed n ad e t e r m i n a t i o nm e t h o dh a db e e n d e v e l o p e d i na c i dc o n d i t i o n ( p h = 4 5 5 5 ) ，a b s o r p t i o no fj j rc o u l db e g r e a t l ye n h a n c e db ya d d i t i o no fd n a a n dt h es p e c t r ac h a n g e d ，r e s u l t i n g i nt h es h i f to fm a x i m u ma b s o r p t i o np e a kf r o m4 3 4 n mt o5 2 5 n m t h e o p t i m u mc o n d i t i o nf o rr e a c t i o nw a si n v e s t i g a t e d t h el i n e a fr a n g ei s 0 1 0 1 2 “g 。m l “f o rd n a t h eb i n d i n gr a t i oi s4 t h ea p p a r e n tm o l a r a bs o r p t i v i t y ( ) i s5 6 5 1 0 4 l c m m o l - 。t h ed e t e c t i o n1 i m i ti s 1 1 2 g m l t h er e s u l t so fd e t e r m i n a t i o nf o rs a m p l e sw e r es a t is f i e d 2 t h ec h a r a c t e r i s t i c so fb i n d i n gr e a c t i o nb e t w e e nd n aa n dj j r 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 v 页 w e r es t u d i e df l u or e s c e n c es p e c t r a t h eq u e n c h i n gc o n s t a n t ，i n t e r a c t i o n a s s o c i a t i o nc o n s t a n ta n dt h et y p eo fq u e n c h i n gw e r ed e t e r m i n e db y s t e r n - v o l m e ra n dd o u b l er e c i p r o c a ll i n e w e a v e r b u r kp l o t s t h er e s u l t s i n d i c a t et h a tt h eq u e n c h i n gc o n s t a n tk s vi sl 2 l0 6 l m 0 1 。1l m o l 。1 a n dt h ei n t e r a c t i o na s s o c i a t i o nc o n s t a n tk aiso 5 1 0 6 m o l l - 。f r o m t h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r sa n dt h ee x p e r i m e n to fi o ni n t e n s i t yw ec o u l d j u d g et h ei n t e r a c t i o n sf o r c e sb e t w e e nd n a a n dj j ri n c l u d i n gh y d r o g e n b o n ds i n t e r c a l a t i o na n dvand e rw a a l sf o r c e t h eb e s tc o n d i t i o no f e x p e r i m e n tw a sa l s oe x a m i n e d p a r ti i is t u d i e dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nh u m a ns e r u ma l b u m i n ( h s a )a n d2 - ( ( 4 ( d i m e t h y l a m i n o ) p h e n y l ) a z o ) 一b e n z o i ca c i d ( j j r )b y f l u o r e s c e n c ea n du l t r a v i o l e t v i s i b l e a b s o r p t i o ns p e c t r a a p p l y i n g f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gm e t h o da n de n e r g yt r a n s f e rm e c h a n i s m ，w eh a d s t u d i e dt h eq u e n c h i n gm e c h a n i s mo fh s aa n dj j r t h eb i n d i n gs i t ea n d b i n d i n gc o n s t a n t w e r eo b t a i n e d a c c o r d i n gt o t h et h e r m o d y n a m i c p a r a m e t e r s ，t h em a i ns o r t so fb i n d i n gf o r c ec o u l db ek n o w n f r o mt h e s y n c h r o n o u ss p e c t r u mj j rh e l dn oe f f e c to nt h ec o n f o r m a t i o no fh s a p a r ts t u d i e dt h ec h a r a c t e r i s t i c so fb i n d i n gr e a c t i o nb e t w e e n b o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) a n dz i n c o n ( z c n ) b yf l u o r e s c e n c es p e c t r a a n du l t r a v i 0 1 e t - v i s i b l ea b s o r p t i o ns p e c t r a a f t e rt h ez c nw a sa d d e d i n t ob s as o l u t i o nt h ef l u o r e s c e n c eo fb s aw a sq u e n c h e dp a r t i a l l y a c c o r d i n gt os t e r n v o l m e re q u a t i o na n dl i n e w e a v e r b u r ke q u a t i o n ，t h e q u e n c h i n gc o n s t a n ta n dt h et h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r sw e r eo b t a i n e d f r o mt h et h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r st h eb i n d i n gp o w e rb e t w e e nz c n a n db s ac o u l db ej u d g e d t h eb i n d i n gd i s t a n c e ( r = 5 0 7 n m ) a n de n e r g y t r a n s f e re f f i c i e n c y ( e = 0 6 7 ) b e t w e e nd o n o r ( b s a ) a n da c c e p t o r ( z c n ) w e r eo b t a i n e db yf o r s t e r sn o n - r a d i a t i v ee n e r g yt r a n s f e rm e c h a n i s m i t w a sc o n f i r m e dt h a tt h ec o m b i n a t i o r e a c t i o nb e t w e e nz c na n db s a w a sas i n 9 1 es t a t i cq u e n c h i n gp r o c e s s f r o mt h es y n c h r o n o u ss p e c t r u m z c nb e 】dn oe f f e c to nt h ec o n f o r m a t i o no fb s a k e yw or d s ：f l u o r i m e t r y ；s p e c t r o p h o t o m e t r y ；s y n c h r o n o u ss p e c t r u m b i o l o g ym a c r o m 0 1 e c u l e ；q u e n c h i n g 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南科技大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名： 日期：一知目；口日 关于论文使用和授权的说明 本人完全了解西南科技大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留学位论文的复印件，允许该论文被查阅和借阅；学校可以公布该论文的全部 或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此规定) 戳弛 新躲留鲜慨抄f 矽、 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 页 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ h - _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ - - - _ - _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ 一 1 绪论 1 1 引言 核酸、蛋白质和多糖是三类主要的生物大分子，其中核酸和蛋白 质是生物体的重要组成部分。核酸是遗传的物质基础，在生物的生成、 发育和繁殖等活动中具有十分重要的作用。核酸的结构直接影响其功 能，并与致癌、抗癌有关。而蛋白质在重量上占细胞干重的一半以上， 是肌肉、皮肤、血液和毛发等的主要成分，蛋白质几乎参与所有的生 命活动。总之，核酸和蛋白质具有极其重要的生物学意义。 正是由于核酸和蛋白质本身的熏要性，所以对其进行深入的研究 很有必要。但是又由于它们的分子巨大、结构复杂，使得对核酸和蛋 白质的理论、结构进行研究及其应用受到限制。二十世纪七十年代至 今，随着一系列新技术、新方法的不断涌现，现代生物科学得以迅速 发展。生物学家已经作出了许多前所未有的重大发现，开拓了不少新 的研究领域，从而全面地革新了生命科学的研究现状。近年来核酸和 蛋白质探针的研究为解决前面所提及的受到限制问题提供了很大的 可能性。以药物为例，研究药物如抗生素、抗癌药物作为生化探针， 有益于阐明药物在体内的运输及其与疾病的作用机理。如蒽醌类抗癌 新药米托葸醌插入癌细胞脱氧核糖核酸碱基对中，阻止癌细胞脱氧核 糖核酸的复制。阿霉素与牛血清白蛋白之间作用力主要为疏水作用 力，而与人血清白蛋白之间的作用力主要为范德华力，认为血液中的 金属离子与药物竞争，减少了白蛋白与药物的结合力，缩短了药物在 血浆中的储留时间，增加了药物的最大作用强度。因此研究核酸尤其 是脱氧核糖核酸( d n a ) 探针、蛋白质探针，有益于研究核酸和蛋白 质的高级结构以及阐明其生物学意义；可以建立完善的、快速准确的 核酸、蛋白质的定量测定方法；可以指导新药的合成及体外筛选工作， 尤其是抗肿瘤药物的研究。 1 2 核酸及其光谱探针 1 2 1核酸的组成和结构 核酸分为核糖核酸( r i b o n u c l e ica c i d ，r n a ) 和脱氧核糖核酸 西南科技大学硕士研究生学位论文第2 页 ( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，d n a ) ，所有生物都含有这两类核酸。核 酸的组成单位是核苷酸，核苷酸由含氮有机碱( 碱基) 、戊糖和磷酸 三者构成。此戊糖是一个d 一核糖或是一个在2 位碳原子上被还原的 2 一脱氧一d 核糖。根据不同的核糖( 核糖或脱氧核糖) 可以将核酸分成 两大类即核糖核酸和脱氧核糖核酸。通过脱磷酸反应可以将核苷酸变 成核苷。根据不同的戊糖同样可将核苷分成核糖核苷和脱氧核糖核 苷。 核酸，特别是脱氧核糖核酸( d n a ) ，在生物界中，堪称生物大分 子中最重要者，主宰着一切生物体维持其生命的各种机能正常运行， 也使每个物种一代一代繁衍于世。如果在其结构上稍有变动、差错、 缺少或增多，将会出现突变、缺陷以及疾患等等现象。所以核酸已成 为生物化学、遗传学以及其它有关生命的学科的研究热门课题，其覆 盖面之广，进展之速，为其它学科所望尘莫及。我们知道核酸分为脱 氧核糖核酸和核糖核酸两类。核酸的构件分子是四种核苷酸，其连接 键是3 ，5 一磷酸二酯键。组成d n a 和r n a 的四种核苷酸不同，但 是都可分为核糖( 脱氧核糖d r 和核糖r ) 、磷酸基( p ) 和变化的含 氮碱基( n ) 三部分。在聚合成核酸时，一分子的核糖和另一分子的 磷酸基形成磷酸二酯键，将许多核菅酸串起来，就构成了核酸的主链。 而碱基不参与其中，这种情况类似于蛋白质中氨基酸残基的r 基团， 故称碱基为核酸的侧链。这样d n a 之间或r n a 之间在结构上的不同就 表现在碱基排列顺序的不同，因此人们常用碱基序列代表核酸的核苷 酸序列。 核酸分子量很大，其中d n a 是迄今为止分子量最大的分子。通过 电镜我们能观察到d n a 分子的细线状外貌。由于核酸的糖环和碱基都 是平面结构，碱基在化学上很稳定，因此核酸分子构象比较简单，尤 其是d n a ，它有两条多核苷酸链，两条链的碱基彼此按碱基配对规则， 即a t 、g c ，以氢键结合，使分子只能采取轴向螺旋结构。已经证 明所有天然d n a 都是右手双螺旋，这个结构是由w a t s o n 和c r i c k 发 现的，也称为w a ts o n c r ic k 双螺旋。d n a 双螺旋的两条链反向平行， 通过碱基互补结合，两链围绕同一轴按右手逆时针方向螺旋，螺旋体 直径2 n m ，螺距0 3 4 n m ，每圈1 0 对核苷酸。碱基堆积在螺旋体内， 磷酸核糖骨架缠绕在外。因为是螺旋结构，分子表面就有宽而浅和窄 而深交替的两种凹槽。显然，d n a 有如此稳定构象是与其功能相适应 西南科技大学硕士研究生学位论文第3 页 的，核酸的功能主要是储存和传递遗传信息- 。 脱氧核苷酸之间由3 ，5 一磷酸二酯键连接起来形成单链，称为d n a 的一级结构。两条单链之间的碱基由氢键联系起来，形成两种特定的 碱基配对：a t 和g c 。相邻碱基对平面之间的间隔处于v a n d e rw a a ls 距离内，因此碱基平面上分布的n 电子云系统之间的吸引力、碱基 上永久性偶极间的作用力和诱导偶极的相互作用等分子间的作用力 使碱基之间存在着堆积作用。堆积作用的大小表现出嘌呤一嘌呤 嘌呤 一嘧啶 嘧啶一嘧啶的趋势，而且还受排列顺序的影响。氢键和堆积作 用使两条脱氧核苷酸单链组成一条双螺旋，形成d n a 的二级结构。 碱基对与糖环的连接不是在碱基对的相反两侧而是在同侧，这种 不对称的连接导致双螺旋表面形成两个凹下去的沟，宽的称为大沟， 窄的称为小沟。大沟携带了其它分子能阅读的信息( 碱基顺序) ，沟足 够大，能允许蛋白质分子进入。相比之下，小沟的信息较少些。 d n a 螺旋的进一步扭曲就形成三级结构，包括双链中可能有的扭 结和超螺旋，多重螺旋和分子内单链形成的环及环状d n a 或者如扭 结、超螺旋和连环之类的各种拓朴学状态，其中超螺旋最常见。 r n a 结构与d n a 有很多相似之处，但也有明显的差别。r n a 分子 通常没有互补的碱基，而且以单链形式存在，能处身回折，局部区域 内碱基可以像d n a 那样以氢键配对，形成a 型构象的右手双螺旋。一 般来说，d n a 分子携带着指令蛋白质中氨基酸顺序的信息，而r n a 起 着把这种遗传信息翻译成蛋白质的氨基酸顺序的作用。 1 2 2 核酸光谱探针的研究现状 通过前面的介绍我们知道，脱氧核糖核酸( d n a ) 的研究是分子 生物学的重要领域，也是研究分子生物学和生命科学的重要内容。而 d n a 的结构、理化性质、代谢过程的研究及其定量测定又是d n a 研究 领域中的一项重要内容，仍然是人们关注和研究的课题之一。有机小 分子作为核酸光谱探针与d n a 相互作用的主要依据是作用后吸收光 谱和荧光光谱发生了变化，且该探针技术是研究核酸结构、功能、定 性、定量的重要手段，因此核酸光谱探针对于研究核酸的生物化学反 应，发展核酸医药制品以及对疾病的诊断和防治均有重要的意义。 1 2 2 1紫外吸收分光光度法 西南科技大学硕士研究生学位论文第4 页 由于核酸中的嘌呤碱与嘧啶碱具有共扼双键，使碱基、核营、核 苷酸和核酸在2 4 0 2 9 0 n m 的紫外光区有一个强烈的吸收峰，最大吸收 峰位于2 6 0 n m 附近。不同的核苷酸有不同的吸收特性，根据此性质可 用紫外分光光度法对核酸进行定性和定量测定”，方法简便、快速。 但是由于核酸和蛋白质( 最大吸收波长 m a x = 2 8 0 n m ) 的吸收峰接近， 如果同时存在，则相互干扰，造成相当大的测定误差。 1 2 2 2 定磷法 d n a 分子中含有机磷，在d n a 分子中磷含量约为9 2 。只要从样 品中测出含磷量，就可以计算出样品中d n a 的含量，每测得l m g 磷， 就含有1 1 m g 的d n a 。其过程是先将d n a 和核苷酸用强酸消化，使有 机磷变成磷酸根，再用一般测定磷的试剂显色，根据磷的含量即可推 算出核酸和核苷酸的含量m 。但由于d n a 和r n a 都含有磷，所以在测 定时必须将两者分开，分别测定。 1 2 2 3 测糖法 在酸溶液中，d n a 分子中的嘌呤核苷酸易于水解断裂而产生含有 戊糖醛基的水解产物，称为去嘌呤酸。去嘌呤酸在酸中进一步变成糖 醛衍生物。后者可与某些试剂呈颜色反应，由此可对d n a 进行定量测 定。根据所用的试剂可分为以下几种方法： ( 1 ) 二苯胺法 二苯胺法是测定d n a 方法中较为古老且至今仍使用较多的一种 方法。1 9 3 0 年被d is c h e 首次提出用于测定d n a ，在强酸性条件下， 水解后的d n a 能与二苯胺反应，并有蓝色产物生成，最大吸收波长位 于6 0 0 n m 处，由此可以测定样品中d n a 的含量。然而该法需要时间长 ( 1 6 2 0 小时) ，条件苛刻，且在测定过程中易造成样品的损失。 b u r t o n 对方法加以改进，从而提高了其灵敏度，并将其用于组织中 d n a 的测定w 。文献”进一步加以改进，缩短了分析时间。 ( 2 ) 二氨基苯甲酸法”， 将d n a 和氨基苯甲酸混合液加热至6 0 ，3 0 分钟后，用分光光 度计在4 2 0 n m 处测定d n a 。 ( 3 ) 硫代巴比士酸法”， 在硫酸中水解后的d n a ，再加高碘酸和硫代巴比士酸，则有粉红 西南科技大学硕士研究生学位论文第5 页 色反应物生成，最大吸收波长( m a x ) 位于5 3 2 n m 处，可用于d n a 的测定，r n a 和蛋白质不干扰测定。 1 22 4 染料结合法 在光度分析中，染料与核酸的结合，也是核酸光度分析中较为重 要的一种方法，该方法主要是基于多核苷酸中两个单核苷酸残基之间 的电离具有较低的p k 值( p k = 1 5 ) ，当溶液的p h 值高于4 时，全部 解离，呈现多阴离子状态”，具有与某些阳离子染料结合的能力。染 料结合法用于研究、测定核酸具有简便、快速、灵敏、准确的特点， 但蛋白质对体系的干扰严重，如有蛋白质存在，需采取适当的方法预 先除去n 。目前，作为标记物研究和测定核酸的常用阳离子染料或鳌 合阳离子有以下几种： ( 1 ) 甲基绿1 单独的甲基绿溶液极易褪色，一定条件下，核酸的加入能使甲基 绿保持不褪色，据此性质可用于核酸的定量测定。在一定条件下，甲 基绿与核酸的混合液的最大吸收峰位于6 3 0 n m 处，吸光度与一定浓度 的核酸成正比，将该方法用以测定d n a ，其测定范围为o 3 0 0 m g l ， 检出限为2 m g l 。 ( 2 ) 甲苯胺蓝n ” 甲苯胺蓝的水溶液在6 2 9 n 处有一最大吸收峰，当有痕量d n a 存在时，会导致最大吸收峰降低，吸收峰的降低程度与一定浓度的 d n a 成正比。该法灵敏度高，反应迅速，且操作简单，是目前测定痕 量d n a 较好的方法。 ( 3 ) 甲基紫1 在中性条件下，甲基紫的九m a x 位于5 7 9 n m 处，随着核酸的加入， 发生明显的减色效应，减色强度随着核酸浓度的加大而增强，据此可 用于测定核酸。 ( 4 ) 乙基紫n ” 在p h 值为6 4 7 4 的条件下，乙基紫的九m a x 位于5 9 5 n m 处， 当加入d n a 后，乙基紫的吸收峰显著下降，而在5 0 7 n m 处出现新的吸 收峰。以乙基紫作为标记物，根据其5 9 5 n m 处吸收峰下降的程度，可 用于对d n a 的定量测定。 ( 5 ) 金属鳌合离子 西南科技大学硕士研究生学位论文第6 页 在碱性条件下，金属鳌合阳离子c o ( i i ) 一5 一c 卜p a d a b 与核酸反应 后，有紫红色三元络合物生成，最大吸收峰位于5 4 5 n m 处。由此建立 了痕量核酸的测定方法”，线性范围o 4 oug m l 。检出限位于 4 0 4 9 n g m l 。1 之间，该方法的重现性、灵敏度和选择性均令人满意。 ( 6 ) 近年来本课题组在核酸及其碱基光谱探针方面的部分研究 成果 本课题组对腺嘌呤( a d e ) 与3 一 二( 羧甲基) 氨甲基卜1 ，2 一二羟基 葸醌3 一甲基胺一n ，n 一二乙酸( a f b ) 反应体系”“、5 一鸟苷酸与茜素红s 的作用以及胞嘧啶与3 ，3 ，5 ，5 一四溴问甲酚磺酞反应体系m 进行 了研究。 1 2 2 5 荧光法 对核酸含量及结构的测定是生物科学研究的基础。科学工作者们 从认识到核酸在生命体中的重要作用以来，直都在寻找有效的测定 和研究核酸含量及结构的方法。随着荧光法的应用和发展，人们发现 这是一种灵敏度很高的分析方法且往往选择性好，操作简便。于是科 学工作者们考虑是否可以将荧光光度法用于核酸的研究。但是，人们 发现，核酸的内源荧光很弱，要想直接测定核酸是很困难的一件事情。 研究人员们便在核酸的体系中引入了荧光探针，希望利用间接的方法 研究核酸的结构和性质。目前有许多有机荧光小分子试剂用于d n a 的研究测定，其原理是根据d n a 对探针分子的荧光强度的影响。探针 分子荧光强度的变化和加入d n a 的量有明显的线性关系，从而可以测 定d n a 的含量。荧光法主要包括荧光增强法和荧光猝灭法。通常较光 度法有更高的灵敏度。这方面的研究从1 9 6 9 年，l ep e c pjb 和 p a i l e t tcj 等使用溴化乙锭分析测定d n a 的含量开始，逐步发展成 研究核酸的一个重要方法“。l ep e c pjb 和p a 儿e t tcj 使用的溴 化乙锭是一种有机荧光分子，它遇到d n a 分子时，便进入d n a 的双 螺旋结构内部，并与d n a 分子产生瞬间偶极后产生诱导力或氢键或范 德华力。这种溴化乙锭荧光分子的嵌入作用能够使测定体系发生有效 的能量转移，荧光强度增强5 0 1 0 0 倍，该法的检测限为3 0 3 1 0 8 m o l 几。溴化乙锭作为核酸的荧光探针发展到现在它不仅用于核酸的 的定量定性分析，也可用于研究核酸的杂交动力学特性。杂交体系中 少量的溴化乙锭的荧光强度随着核d n a 浓度的增加而增强。可以通过 西南科技大学硕士研究生学位论文第7 页 荧光强度对时间的作图来表示杂交反应的动力学过程。但它对人体的 毒害很大。目前，用于d n a 研究和测定的荧光试剂有金属离子、有机 荧光试剂及金属配合物。 ( 1 ) 金属离子 近年来，以金属离子作为荧光探针研究和测定核酸得到了很大的 发展，尤其是以三价镧系元素，它们的共振能带正好与核酸受紫外光 激发时的三重态相重叠，能有效的发生从有机配体到中心离子之间的 能量转移“一w ，使得具有弱内源荧光的中心离子荧光得到加强，从而 成为荧光量子产率高的荧光探针。 常用作核酸探针的金属离子有t b ( i i i ) ，e u ( i i i ) n ”n ，这些金 属离子与核酸浓度成正比，据此可用于核酸含量的测定。此外， c e ( i i i ) “w 也是一种较好的金属离子探针，其在弱酸性条件下的荧 光被核酸猝灭，利用核酸对c e ( i i i ) 的这种荧光猝灭特性可以灵敏的 测定不同核酸。z h o uj ，c o n ggo 等人，用l a ”与栎精的络合物m ，作 为核酸的荧光探针；c a oqe ，z h a oyk 等用自行合成的5 一( 3 一氟一4 一 氯苯偶氮基) 一8 一氨基磺酸喹啉与c o ( i i ) 的络合物作为核酸荧光探针 都取得了不错的结果“。 ( 2 ) 有机荧光试剂 溴化3 ，8 一二氨基一5 一乙基一6 一苯基菲啶翁( e t h i d i u b r o m i d e ， e b ) e b 是一种菲啶类染料，它能直接插入到核酸双链之间与核酸相 结合，得到的反应产物的荧光强度将大大增强，其增大值正比于加入 r n a 或d n a 的浓度。通过研究作用机理建立了测定d n a 的方法。 3 ，5 一二氨基苯甲酸 d n a 在无机酸介质中与3 ，5 一二氨基苯甲酸反应形成的荧光性产 物，可用于d n a 的定量测定n “。方法对d n a 的测定具有很强的选择性， r n a 的浓度2 0 倍于d n a 不干扰测定n “。 4 ，6 二脒基一2 苯基吲哚( d a p i ) d a p i 是由d a n n 等于19 7 1 年首次合成，19 7 5 年，w i l l i a m s o n 等 一，发现，在p h 值为5 l o 的介质中，d a p i 与d n a 形成配合物的荧 光强度比其本身的荧光强度约大2 0 倍，荧光强度与d n a 的浓度成正 比，可用于d n a 的定量测定。 h o e c h e s t3 3 2 5 8 西南科技大学硕士研究生学位论文第8 页 这是一种二苯并咪唑染料，曾用于测定细胞和组织中d n a 的含 量，激发波长为35 0 n m ，在其发射波长4 5 5 n m 处测定荧光强度，测定 的检测限为1 0 n g m l ，。 小檗碱 在p h 为3 o 9 1 的介质中，当核酸和小檗孽碱同时存在时，会 导致溶液荧光显著增强，其激发波长为3 5 2 n m ，发射波长为5 3 1 n ， 用于核酸的测定，显示了很好的光敏性m ，。 卟啉类 m e s o 一四( 对一三甲基氨基) 卟啉( t a p p ) 是一种水溶性阳离子卟啉， 在低离子强度和p h 大于7 4 8 的介质中，在6 3 8 n m 处产生荧光峰。当 体系中存在核酸时，卟啉分子将在核酸表面堆结进行组装而诱导核酸 分子构象发生变化，形成一种超螺旋结构，这种超螺旋结构的形成将 导致t a p p 的荧光猝灭。在一定范围内，核酸的浓度与荧光强度呈线 性关系”“。另一类水溶性阳离子卟啉m e s o 一四( 对一甲基吡啶基) 卟啉 ( t m p y p 一4 ) 具有同样的特性，也可用于研究核酸与有机分子的作用机 理和测定核酸“。 邻菲哕啉 在p h 为6 2 的六次甲基四胺缓冲溶液中，邻菲哕啉在紫外光的 照射下，能发出3 6 7 n m 的荧光，d n a 的加入会导致荧光的猝灭，根据 该反应可在较宽范围内灵敏地测定溶液中核酸的含量m ，。 ( d 藏红t ( s a f r a n i n et ，s t ) s t 为一种碱性醌亚胺类染料，在低离子强度和弱碱性的t r is 缓 冲溶液中，s t 的单体溶液在5 7 8 6 n m 处产生强荧光，加入核酸后， s t 的荧光被猝灭，体系的最大激发峰发生紫移，荧光发射峰不变， d n a 对s t 的荧光猝灭表现为线性猝灭”。 耐尔蓝( n i l eb 1 u e ，n b ) 耐尔蓝又名尼罗蓝，是一种碱性吩嗪类染料，具有平面、刚性结 构，本身具有荧光，加入核酸后，会导致荧光猝灭，根据此性质可用 于核酸的测定。 廷多p h o s p h in3 r ( p r ) p r 在4 6 8 n m 处发射较强的荧光，在中性条件下加入核酸后会导 致荧光猝灭。据此，可建立一种测定核酸的快速、灵敏、简便的荧光 测定法“。 西南科技大学硕士研究生学位论文第9 页 ( 3 ) 金属配合物 8 一羟基喹啉的金属络合物。 8 一羟基喹啉( 8 一h q l ) 能与金属离子如l a ( i i i ) 、y ( i i i ) 、sc ( i i i ) 、 a 1 ( i i i ) ”形成一种金属发光配合物，此二元配合物加入核酸后形成 的三元体系的荧光大幅度增强。与二元体系相比，三元体系荧光寿命 增长且最大发射波长有部分蓝移现象。根据不同的金属络合物以及不 同种类的核酸，其蓝移范围略有不同，荧光强度与核酸在一定浓度范 围内呈线性关系，可建立研究和高灵敏测定核酸的荧光法。 t b ( i i i ) 一邻菲哕啉络合物 在p h 为6 8 7 2 t r ish c l 缓冲溶液中，稀土金属离子t b ( i i i ) 能与邻菲哕啉和核酸、变性核酸、核苷酸、多核苷酸等m ，形成三元络 合物，其荧光强度远远强于二元络合物t b ( i i i ) 一邻菲哕啉，t b ( i i i ) 一 核酸。用于测定核酸，线性范围为 o 4 1 5 o 或2 0 o g m l 一，检出 限o 1 o 2 m g m l 。 e u ( i i i ) 一四环素络合物 在p h 6 8 7 2 t r is h c l 缓冲溶液中，e u ( i i i ) 四环素配合物能与 单链或双链d n a 结合，导致荧光强度增强，此时它几乎不与r n a 反应。 因此，可建立测定核酸中d n a 的灵敏方法，此法受干扰小，有较强的 选择性，使用时间分辨技术可以提高测定检出限，当有r n a 存在时， 不干扰d n a 的测定。 t b ( i i i ) 一钛铁试剂( t r ) 络合物 金属配合物对于核酸的测定多是基于荧光增强效应，而在p h 值 为6 9 的六次甲基四胺一h c l 缓冲溶液中，核苷酸、多核苷酸和核酸 能猝灭t b ( i i i ) 一t r 配合物的荧光，据此可以建立测定核苷酸、多核 苷酸和核酸的灵敏方法”。 ( 4 ) 染料二聚体 1 9 9 0 年，g l a z e r 等报道了双链d n a 能与溴化乙锭二聚体( e t h d ) 形成稳定的强荧光性的复合物，而r h y 等u “则报道了以合成的噻唑橙 二聚体( t o t o ) 和恶唑黄二聚体( y o y o ) 为荧光探针研究d n a 的方法。郭 祥群等m ，则研究了在表面活性剂作用下，现场形成吖啶橙及翻红花红 t 弱荧光二聚体的性质及其与核酸的作用机理，并用于核酸的定量分 析，结果令人满意。 西南科技大学硕士研究生学位论文 第10 页 1 2 2 6光化学荧光技术 李文友1 以具有光化学荧光活性的维生素k 。和9 ，l0 一葸醌一2 一磺 酸钠作为光化学荧光探针成功用于d n a 的测定。两种探针均为非荧光 探针化合物，在紫外光照射下转变成荧光物质，d n a 存在使其荧光猝 灭，猝灭的程度与d n a 的含量成线性的关系。 1 2 2 7 共振瑞利散射法( r e s o n a n c er a y ie ig hs c a t t e r in g 。r r s ) 核酸是最早用光散射技术来研究和分析的生物大分子物质。早在 1 9 8 4 年，k n 0 1 l 等就提出了用染料键合d n a 引起染料的共振光散射增 强进行d n a 的光散射标记，但是并未引起足够的重视和发展。1 9 9 3 年，p a s