（应用化学专业论文）树脂吸附法分离银杏酸的研究.pdf

树脂吸附法分离银杏酸的研究 瘦弱豫学专渡 磷究生张洪蓬摇导老努李簿 摘要：本论文采用反相高效液相色谱法测定锻杏酸，分析了流动相组成，p h 值 对银鸯酸色谱保罄行为的影响。建立了种以银杏酸c 1 3 ：0 为对照品，以r p c 1 8 为固定相，甲醇4 永溶液( 体积眈为9 0 ：1 0 ) 为流动相的等度洗脱外 标定爨测定分析方法。结果袭明，在确定的分离条件下，此方法可成用于银鸯 制莉中银杏酸含量测定。 本文首次尝试了不同极性的大孔i 彀附树月旨对银杏提取物( g i n k g ob i l o b a e x a c t ) 中银蠢酸的分离提取研究。在静态吸附的蔽醚效果和洗脱效聚院较基穑 上发现，a d s 7 树腊效果最好。在考察a d s 7 树脂吸附性能的各种因素时，结 果表明，p h 值2 5 ，n a c i 浓度o 0 5 m o l l ，锻杏酸上样浓度5 m g m l 廷该啜辩 树脂吸附银杏酸的最佳条件。利用l a n g m u i r 方程对其吸附等濑线进杼拟和，肖 良好的线缝关系( r _ 锄9 9 8 ) ，说露簿会肇分子层狡瓣理论。该树瑟动态蔽辩戮 究表明，a d s 7 树脂对g b e 中银杏酸有很好的吸附分离效累，而且该树脂至少 经l o 次啜辩，解吸磷生螽哥耋复筏精。所戳本磅究拐步建纛了一稗囊g b e 巾 提取分离银沓酸的大孔树脂吸附法。 闰辩本文翻孺翔箍毫子驻徽镜、荭羚竞港经、魄表覆势耩纹、数字鍪象憝 理系统等化学和物璎手段，对其四种吸附树脂的化学和物理性能进纾了研究。 结果袭暖，a d s 。7 辩耱蔽瓣分离镊袭羧效暴好是嚣必该挺爨靛径臻匈，含毒溅 功能基团( n r n ) 。物理结构比较研究表明，随着比袭面积增大，吸附量增加。 蜃班，可激谈秀台成耱誓过程孛，绦蜜茭n r n 基鏊，适当壤麴班：表嚣。哥熊会 有效地提高树脂对银杏酸提取分离效果 关键词：银杏酸定薰分析 吸搿幸解吸啜黼树膳 s t u d yo ns e p a r a t i o no fg i n k g o l i ca c i d sb y r e s i na d s o r p t i o n m a j o ra p p l i e dc h e m i s t r y p o s t g r a d u a t ez h a n gh o n g g u o a d v i s o rl ih u i a b s t r a c t ：am e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no fg i n k g o l i ca c i d sb yr e v e r s e dp h a s eh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p l a yh a sb e e nd e v e l o p e d 。e f f e c t so fm o b i l ep h a s e f o r m a l ：i o n ，m o b i l ep h a s ep hw e r ed i s c u s s e d t h eh p l ca s s a yw a sp e r f o r m e do na r e v e r s e d - p h a s ec l sc o l u m nu s i n gm e t h a n o l 4 a q u e o u sa c e t i ca c i da sm o b i l e p h a s et h ea s s a yw a ss u c c e s s f u l l ya p p l i e dt od e t e r m i n a t i o no fg i n k g o l i ca c i d s r e s u l t si n d i c a t et h a tt h ed e v e l o p e dh p l cc a nb eu t i l i z e da saq u a l i t yc o n t r o lm e t h o d f o rg i n k g o l i ca c i d s an e wm e t h o do fs e p a r a t i n gg i n k g o l i ca c i d sb yr e s i na d s o r p t i o nw a sr e p o r t e d ， t h ep e r f o r m a n c eo fa d s o r p t i o na n dd e s o r p t i o nf o rg i n k g o l i ea c i d sw i t hd i f f e r e n t p o l a rm i c r o p o r o u sr e s i n sw a sc o m p a r e di nt h i sp a p e r t h er e s u l to fs t a t i cp r o c e s s s h o wt h a tt h ea d s - 7r e s i ni st h em o s ts u i t a b l ea b s o r b e n t a i jk i n d so fi n f l u e n c e d 陌蘸o r so fs e p a r a t i n gg i n k g o | i ta c i d sb yt h ea d s 一7r e s i nw e r es t u d i e d t h eb e s t c o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：p h2 5 ：n a c l0 0 5 r e e l l ；g i n k g o l i ca c i d ss m g m l t h e a g g r e g a t i o no f g i n k g o t i ea c i do na d s - ? r e s i no b e y sl a n g m u i rm o n o l a y e ra d s o r p 6 0 n ， t h ed y n a m i c sp r o c e s si n d i c a t et h a ta d s 一7r e s i nc a ns e p a r a t ew e l lg i n k g o l i ca c i d s f r o mg b e ( g i n k g ob i l o b ae x a c t ) a f t e ri th a sb e e nu s e dt e nt i m e s 。 t h ec o m p r e h e n s i v es t u d i e so nt h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e so fr e s i n s i n c l u d i n gs p e c i f i c r u f f a c ea r e a , p o r ev o l u m e ，a v e r a g ep o r ed i a m e t e ra n dt h e f u n c t i o n a lg r o u p sw e r ec o n d u c t e db ya p p a r a t u s t h er e a s o nt h a tw h yt h er e s i nn a m e d a d s 一7i st h eb e s ti 鲁e x p l a i n e da c c o r d i n g 镪t h et h e o r yo fa d s o r p t i o n - d e s o r p t i o n a m i d o c y a n o g e n ，t h ef u n c t i o n a lg r o u po fa d s 一7 ，i sf i tf o rs e p a r a t i n gg i n k g o l i ca c i d s t h ee f f e c to f t h ea d s 一7r e s i nw i l tb eb e t t e ri f t h es e p e c i f i cs u r f a c ec a nb ei n c r e a s e d ， k y e w o r d v g i n k g o l i ca c i d s ：q u a n t i t a t i v ea n a l y s i s ；a d s o r p f i o n ；d e s o r p t i o m r e s i n s ， m 器圳大学硕士学位论文 1 前言 银杏树为壤瓷稃锻杏弱植物 2 锵，蠹酪禽量 s 籍4 1 。篷是镶杏剿裁孛还禽骞 种有毒成分银杏酸( g i n k g o l i ca c i d s ) ，银杏酸是一炭6 烷基水杨酸化合 狻( 显强l ，1 ) ，6 经上匏烧基霹以是歪烧蒸毽霹皴楚壹链燎烃，其碳数1 3 一1 9 h o o r 2 c 1 3 ：o = c 1 5 ：0 h o r：c 1 5 ：1 = c 1 7 ：1 = c 1 7 ：2 = c 1 7 ：3 图1 1 银杏酸结构示意黼 不等州。银杏酸鹣漆酚酸类物质，这类物质主要存在予卡秀树的果实、锻杏的 外独皮和银杏叶中，银杏制裁中的禽量也不低8 ，9 1 ，在早期的研究巾也将锻杏酸 称为漆酚羧。 1 1 银杏酸类物质韵光谱性质 银杏簸分子结构决定了其光滋特性。据t y m a n 报道“，银杏酸最大紫外吸 翘圳丈学硬士学燕泣文 收出现在3 0 8 n m 左右，因此在梭测银沓酸时选择3 0 8 n m 作为检测波长，以取得 最佳效聚，银鸯酸楚缀努谱匿中较突密戆嚣1 6 5 0 c m 。 串缩摄琏峰，镊沓酸熬孩 核磁共振谱图中主要氢核的化学位移6 ( p p m ) ：1 1 0 ( o h ，c o 。h ) ，7 2 - - 7 3 7 ， 6 6 5 6 8 4 h a r ) ，5 。2 1 一s 。4 ( 一h e = c h 一) ，2 8 9 3 妫( 一e h 。- - a r ) ，1 。8 6 2 1 8 ( 一 c h ：- - c h = c h - ) ，1 o - i 8 ( 一( c h 。) z 一) ，0 7 1 0 ( - - c h 。) 。其中值得注意的是银杏 羧孛熬羧基憨形藏分予斑耪分子粒氢键( 冤嚣i 。2 ) ，联软其羟基氢移羧基氢的 化学位移出现在同一处。对此t y m a n 也有论述“”，由于在反相色谱进彳亍银杏酸 分离霹，酸蛀较弱熬锓杏酚总懋在镊鸯酸翦嚣浚脱出来。出毖阿判断银杏酸形 成了分子内氢键，从丽降低了分子的极性，增加了银杏酸的保瞪时间。 o h 鳗1 2 镁杏酸羽分子内戴键和分子闯氢键示意图 l 。2 银杏酸的物理化学性质 镶杏酸为滗色油状或粉末袄物质。该类登纯合物主要溶予i 极佼溶裁，滚 解性质接近于脂肪酸，难溶予低级醇炎，不溶于水，可溶予碱水溶液“”。由锻 杏酸的结构式掰戳预测，其苯环上楣遘豹羧鏊较易发生脱羧反应，鑫零专零l “” 介绍了从卡秀果中分嘲漆树酸的方法，明确指出漆树黻在2 0 0 1 3 左右会脱羧， 对热不稳定，所阻不可以采用绷热蒸馏法迸幸亍分离。筠一蟊零文献“”翔专门磷 究了漆树酸的脱羧反威将其经热处理前后的红外谱豳进行比较发现1 6 5 0 c m 。 楚的羧基酶 率缩振动撩会鞠鬟躐小，谣3 3 5 0 c m - 楚豹鹣羟墓镩缩振动蜂帮臻受 增大，由此证明了脱羧反应的存在。幽于银杏酸的结构中的酚基和羧基存在， 因i 琵其有一定酸性，在菜釜分离方法审就是羁瘸其酸经t1 9 6 8 年g e r l l e r m a n 等对从银杏中分离得到的银杏黻类物质的化学性质，包括其羧基、酚羟基的甲 2 粤塑奎篓塑圭兰垒造墨 基化及应活幢，银香酸酶乙酰化反应活性，津环上烃基傩链中双键的蕊亿反艨 活性簿徽了比较全面嬲谚究。用少量舶e l ：n ：处理，银奄酸的羧基裁会发生选挺 性酪纯，而要使酚羟蕊发生选择往甲蒸亿，髓需要丽c h ：n 。与浸泡在食2 0 涟 c h 。o h 的乙醚中锻杏酸避行长时间反应才可。锻蛮酸的乙酸化反应需要在i 0 0 0 显有h 毪啶存在静条件下，霜醋酸爵斑懑4 5 m i n 才可究成。 1 3 锻杏酸的检溅方法 银杏作为种天然药物融广泛应用于临床。但银杏制剂中银杏酸姆数过敏、 致突变鸯关”83 ，麓了保 正锻密裁裁懿安全瞧，矮严穰控裁锻杏酸麴含量，溪 际标准要求银杏酸要低于5 m g k g “，因此银密酸的分析显得尤为重要。色谱技 零是锻杏酸窥注及定鬟分耩的常震方法，镶杏酸嚣色港疆究始予二卡健鳃霉 代，早期采用薄层色谱技术( t l c ) ，髓着色谱技术的控展，气相色谱( g c ) 、商 效滚糖色谱( h p l c ) 麓续应愆裂镶杏酸静努橱骚究书；峦予镶谱技术对势桥瓣 象的豁别功能较差，所以要与其它方法配合使用，近年来检测手段不断发展， 菠褥锻奁酸努褥蕊潍绥凄不鞭挺裹。霹疼努髓裁禳杏酸戆定缝及定爨分褥霰过 报道，但目前还没有形成一个公认的定量分析标准。 1 3 1 银杏酸的t l c 分析 薄蘑色溪涟是较翠鑫蔫予镊杏酸势辑夔方法，壤龌色谱条锌，掇搜稷运魏 质用非极性固定相才肖选择性。流动相最好髓极性或半极性“”，所以固定相一 般采爝硅荻，震浮裁选择籍育不霹。g e r t t e r m a n 等天“氍震蚕已靛( s k e l t y s o l v e b ) ：乙酸乙脂：乙酸( 体积比为1 8 ：1 8 ：1 ) 混合液作展开荆，在紫外光照射 下镊杏骚会产生强麴兰色荧先。样燕孛大量存在麴l 羹媵簸对测定缝票影壤蚕太， 实验证明l m g 的脂肪酸也不能掩盖l o l g 的银杏酸的袋光。t y m a n 等人“”利用石 潼醚：乙酸己疆：己酸体积魄烫7 0 ：3 0 ：1 ) 嚣会作曩嚣剡，发璐照辗襄乎 处理过的硅肢可以将几种支链不饱和的漆酚酸分离歼。随后的t l c - - m s 和t - - u v 熬磺究寝鞠，t 淡- - m s 主要嚣子支链不魄窝豹银蠢羧载定璧分辑，共可提巅 定餐分析的速度与精密度“”。t l c u v 与g c 眈较，准确度鬣然没有g c 高，健 姥方法器撞绱差铰低黧现性好脚3 。t l c 展嚣剃靛选择墩为l c 流动摆f | 孽选择提供 了参考依据。t l c 具有快速、价廉、翁操作簿特点。通常霜于定性分析，适禽 3 四川大学硕士学位沧文 于生产过程中的监测，但由于误差大，且精密度有限而不能作为产品最终的定 量分辑。 1 3 。2 锻杏酸豹g c 分拆 g c 用气体做流动相，主要优点是气体的黏腹小，因而在色谱柱内流动的阻 力小，同时因为气体的扩散系数大，因忿组分在嚣福闻的健质速度唳，有裂予 商效快涟的分离”“。与t l c 比较，g c 法快速，定量分析方便。由于漆树酸的高 温脱羧反应，g e t i l e r m a n 等”1 用重氮甲烷在2 0 9 6 甲醇的条律下进行处理，褥到 漆树酸甲酯，过爨的重氦甲烷也会使羟基甲基化，为了防止这种现象可以用熏 氯甲烷的乙醚溶液在0 进行反应，保证了有选择性的定量漆树酸甲酝的生成 “”。用壁氮甲靛处理普遍应用于银杏酸g c 分析的样品前处理中。g e r l i e r m a n 等”1 将极性固定相与菲极性固定檑的分离效果避行比较，；# 极性固定摆用f i d ( 火焰离子检测器) 或t c d ( 熟导检测精) 检测。可以分离检测出银杏隈甲酯。 t y m a n 等”剥用非极性的固定楣，将聚二甲基硅氮烷( s e - 3 0 ) 与含5 苯基聚 甲基硅油( o v 一1 7 ) 傲了比较。o v 1 7 比s e - - 3 0 可戳在更高的温度下进行快 速的分聿厅。为了避免拖尾现象将漆树酸的不饱和的基团进行氢化反应，将不饱 和基团转化为饱和的基团“。融于f i d 没有足够的选择性检测出所有的银杏酸， v e r o t t a 等。”将样品经甲基硅烷化后用毛细管气相色谱和质谱分板鉴定，同时 分析了纛种银杏酸。与t l c 比较仪器设备要求较高，德准确度也有所掇高。由 于是测定银杏酸的衍生物，而样品处理过程中有聚合物出现影响了定量分析。 瞧哥舀前为止还没有准确的橹斑限报道。 1 3 3 镊杏酸h p l c 分轿 反相h p l c 已成为目前使阁最广泛，技术最成熟的方法。t y m a n 等汹1 采用反 楱梯度洗脱法，选用s p h e r i s o r b o d s ( 2 5 0 r a m 4 6 嘲，5 弘商色谱柱，茭流动相 a 为乙搬：水：己酸( 体积比为6 6 ：3 3 ：2 ) ，b 为四氰呋喃，线性梯度：1 0 0 a ( 0 3 m i n ) ，? 撇( 3 1 3 m i n ) ，1 0 0 b ，3 0 分钟内检邂了c 1 5 ：o 帮c 1 5 ：1 。魏 刚等人采用s p h e r i l s o r b c l 8 ( 2 0 0 m m 4 6 m m ，3um ) 色谱柱，流动相为甲醇： 水：乙酸( 体积魄为9 0 。0 ：9 7 ；0 3 ) 等发洗魏，3 e 分锋内检密了c 1 7 ：l ，c 1 5 ：l 。 银杏酸是混合物，可采取某些攒旌增加发相h p l c 的选撵性。银离子是电子受体， 本 。一一一，。一。型i銮矍堡圭兰黛鎏奎 黪逸铎性毒镣誊兹黎链双毽俸嚣，形戏摄熬嚣毽络合魏御；戳就餐羚 二等人诤朝 在瀛动相中白n 入银离予，从而设交了禽不饱和纂团的的银杏簸分子的保留时溺， 聚爨k 、w ( 2 鞠蕊1 5 0 v j i 。5p 瑗) 也避轻，潺臻捃为帮簿一勰懿五酸承潼渡( 髂 积融海9 0 ：i 0 ) ，并添加a g n 魏于流动福中褥掰结论。a g + 的浓度为0 0 3 t o o i 瓣分离散聚最佳，鼹时一浚努蜒了兰秘镊蠢羧c 1 5 ：0 ，c 1 5 ：l ，c 1 7 ：l ，该方法攫现 链较好。v a n b e e k 等入逸褥段e 往( 1 5 c m x 4 6 栅，5 讧 j ) 与一段锻纯鹳粥 裘予交换戡1 0 0 5 s a ( 2 0 c m x 4 啪, 5 m ) 进行鹅联，流劫姻为甲醚：水：己酸( 体 积钱灸9 2 9 ：7 0 ：1 ) ，残璃媳一次藏氍分析了五种镊套酸c 1 3 ；0 ，c 1 4 ；0 ，e s ： 1 ，c 1 7 ：i ，c 1 7 ；3 。k a r i n en d j o k o 啪3 等采耀r p 一4 挫( 1 2 5 m m x 细，4 “m ) ，制 雳a 粥e 例) 与b ( s 翦乙鼗) 混合避雩亍撵隧洗聪，蠛姓攒凄为a ：1 0 潞与嚣； 5 0 ( 6 m i n ) ，m o o ( 4 m i n ) 。定量分析时对徽离子进行选择辫子扫描( s i m ) ，谢 予像薷奁滚秘耪中懿入适羹莪承。碱链条髂商剩于受离子憨黪成。漆璇，倏逮， 高强敏度和蘸现性好是银套酸定量分析的最终目的，目前的转析方法述存程着 襻菇簸理遥予复杂。撵砟繁瑷等闲瑟， 1 , 4 镁香黧瓣生理活姓 银杏酸熟有致过敏性，缴突变撵性“”1 。使皮肤发生麋烂o “，激近研巍述 菠璇镶杏酸遥可髓诱发神羟漾嚣亡，罨最骞饕褒黪( g b e ) 孛豹骞寮藏分e 镁 杏提取物( g b e ) 用予临床必颁满足嵌全标凇，1 9 9 1 雄德国s c h w a b e 公司专裥所 提撼羲杏裁瓣串锻侉酸类翡疆害羹要枣子t o 擎g g ，1 9 9 7 筚德嚣羹爱嚣避疹 要求银杏摁取物中锻杏酸的宙量小予5 p g g “”，否则取消萁注册母* 但是锻沓 酸滁了有鞭。乏毒鳇之舞，跫凑霹突袭鼹，壤骞馥黯蔡鏊瘸秽骞一定黪浚疗 餐耀t 因为用辩诞的观点滑，对糠性成分米说撼本身就矩一种擞理活槐的体现。西 诲羚瑟磺黧寝弱，镶鸯酸楚娄重鬻浆垒爨溪装匏，其毒茶薤，熟蘧、抗炎、 抗病毒及瓢虫、杀融等作用。国外燕于银密酸生臻活性的撤道较多m1 9 8 6 举， k u 强萼擐懑m ；，戴爨酸耱攫簿子谶多髯整滁塞器杰鼹簧搔* 露莲过瀵兹携带避 病菌的蜗牛而起刘肖效作嗣，1 9 8 7 年，i t o k a l r a 等嘲对锻沓的抗肿瘤活性进行 了辨究，袭疆势囊爨褥魏缀套蘩粪撩嚣县鸯藏袭溪健。1 9 9 0 年，爨本匏松零鼗 等报道锻杏叶提取物对勰病毒商抑制佟硒，并对其活梭成分避褥研究靛现 嚣瞧罄努楚镶套酸孛嚣专屯酸辩链拳罄羧，瓣致癌您动嚣予惫绲强的抑剃效果 四川大学硕士学位论文 】9 9 1 年rg r a z z i n i 等”“报道了银杏酸类物质的多种用途，可以作为前列腺生物 合成抑制剂。1 9 9 3 年，h i s a e 等“”报道了银杏酸的抗菌活性，特别是在防止龋 齿，抗s m u t a n s 病毒方面有显著疗效。1 9 9 5 年，k u b o 等。”报道了长链酚酸能 抑制多种真菌和细菌，能用于治疗粉刺、皮肤病等银杏酸具有强烈的抑菌杀菌 作用，对枯草菌、大肠杆菌、酵母菌、金色葡萄球菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌等 均有作用，对2 0 多种真菌有抑制作用。1 9 9 6 年，j u n k o 等【4 0 】贝0 在文章中指出银 杏酸可对甘油三酯的合成中重要的酶g p d h 起抑制作用，因而可以预防人体许 多高脂血症而引起的疾病。野村正人“等做了银杏酸抑制透明质酸酶的活性以 及清除游离自由基实验，发现它们能高效的抑制酶活和清除自由基，抑制率高 达9 6 4 ，而清除率可达8 6 5 。因此银杏酸可以用于日化用品，具有保护皮 肤弹性和增白的效果。国内关于银杏酸生理活性的报道也不少。许丽丽等报道 “：银杏酸对二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀，角叉菜所致的大鼠足肿胀，乙酸所 至的小鼠腹腔毛细血管通透性增高等均有明显的抑制作用。对大鼠棉球肉芽组 织增生和完全福氏佐剂所致的大鼠足肿胀亦有明显的抑制作用，与阳性对照药 地塞米松作用相似，对炎症早期的毛细管深透性增高，炎性渗出和水肿有很好 的抑制作用，对慢性炎症和免疫性炎症同样有效。张洪泉“等做了银杏酸抗过 敏的研究，研究表明银杏酸( 20 m g k g ) 对小鼠被动性皮肤过敏反应( p c a ) 、 对大鼠颅骨骨膜肥大细胞脱落粒释放具有具有抑制作用；当浓度为1 0 0 1 g m l 时对抗原( 卵白蛋白) 诱发的致敏豚鼠回肠最大收缩反应有抑制作用，其抑制 率达5 2 。当剂量在5 0 i ，t g m l 时对过敏介质组胺( h a ) 和慢反应物质( s p s - a ) 所引起的豚鼠回肠收缩有结抗作用。金巧秀等“”做了银杏酸对免疫功能的影响 研究，结果表明银杏酸对细胞免疫和体液免疫有抑制作用，作用性质与环磷酰 胺和的塞米松相似。腹腔注射银杏酸2 0 4 0 m g k g 能明显减轻小鼠免疫器官重 量，抑制小鼠碳粒廓清速率，抑制s r b c 致敏小鼠溶血素的形成和足垫迟发型 超敏反应( d t h ) 。杨世林等发现“：银杏叶水煎液对金葡菌、痢疾杆菌及绿脓 杆菌均有抑制作用，有效成分为接有不同侧链的漆酚酸，可用于烫伤、烧伤、 放射病等的急救。居保国等1 利用银杏外种皮水提物对大鼠离体心脏灌流实验 表明，主动脉输出量逐渐减少，冠动脉流量则渐增，总的心输出量减少。并且 还能增加离体兔耳血管流量和提高小鼠耐氧能力，可降低耗氧量，延长存活时 间。徐立春研究表明“7 ：银杏酸抑制真菌生长有效率达9 2 ，0 5 克酶唑为 四j i i 大学硕士学位论文 6 8 ，还发现银杏酸抑制猪小孢子菌、新隐球菌c 、新隐球菌e 、副克柔式念球 菌、克柔式念球菌等浅表和深部真菌均使其不生长；对许兰氏毛藓菌、奥杜盎 氏小孢子菌、絮状表皮藓菌、伪热带念球菌、热带念球菌等亦有明显的抑制作 用。同时银杏酸还对酶有抑制作用，银杏酸是甘油3 一磷酸脱氢酶的抑制剂。楼 风昌等”“研究表明：银杏酸对赤霉菌、镰孢霉菌、轮枝霉菌、根霉菌和疫霉 菌均有不同程度的抑制作用。对赤霉菌、根霉菌和疫霉菌的作用优于多灵霉菌， 彳i 同浓度的银杏酸对镰孢霉菌和轮枝霉菌的抑制率高达8 0 ，而多灵菌则对它 们无效。据前所述银杏酸具有强烈的抗霉菌、抗病毒活性，也有报道认为银 杏无虫害状况是由于银杏叶中银杏酸的作用。余碧钰等4 “指出从银杏外种皮中 提取的银杏酚酸和白果酚有杀虫、杀菌作用可代替农药防治蚜虫、蛴螬、菜青 虫、红蜘蛛、桑蟥、稻螟和其他咀嚼口器的昆虫，可减少化学农药污染。郑许 松等5 ”研究表明：银杏叶提取物对桃蚜有较强的据食作用、胃毒毒杀作用和生 长发育抑制作用。可使桃蚜寿命缩短，生殖力下降，并导致个体死亡，对初产 仔蚜的杀伤力尤为明显，可有效抑制桃蚜种群的增长。最近杨小明等“”，孟昭 礼等“”研究指出银杏酸能抑制金葡菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌等g + 菌，并对 临床耐青霉素金葡菌株有抑制作用。青霉素与银杏酸联用显示了良好的抑制耐 青霉素金葡菌的协同作用。 1 5 银杏酸分离的研究现状 国内外从6 0 年代就已经开始银杏叶中提取分离银杏酸的研究。1 9 6 2 年傅 永丰等”利用9 5 乙醇浸提白果肉，浓缩浸提液，加乙酸铅溶液，银杏酸成分 形成铅盐沉淀，分别用水、乙醇和乙醚洗涤，加稀盐酸研磨，使其铅盐分解， 用乙醚提取其酸性成分，在用水洗涤乙醚层至无氯离子反应为止，干燥乙醚液， 即得银杏的总酸性成分。在一定温度下有晶体析出，用不同溶剂重结晶变化， 分离出银杏酸。1 9 6 8 年g c r l l e n n a n 等“1 利用溶剂氯仿和甲醇( 2 ：lv v ) 浸取 银杏叶得到脂溶性物质，再利用银杏酸的酸性，使用皂化反应将酸性物质从总 脂溶性物质中分离出来，其中包含脂肪酸和银杏酸。对其进行酯化反应，利用 脂肪酸和银杏酸酯化反应的活性不同，控制反应条件使脂肪酸转化为脂肪酸酯， 而银杏酸保持不变。将产物使用柱层析分离方法将两者分开，获得银杏酸产品 1 9 8 6 年hj d ej i 等m 1 使用简单柱层析分离方法将银杏酸类物质分离出来。银杏 四j i l 大学硕士学位论文 外种皮用甲醇浸提，将脂溶性物质浸取出来，加适量水，用氯仿对其进行二次 萃取，将此萃取物分别使用硅胶柱和氧化铝柱纯化，使用c h c l 。：m e o h = 9 ：1 和 m e o h ：a c o h = 9 9 ：l 的洗脱液进行洗脱，可获得银杏酸产物。硅胶柱处理后再 将产物经过o d s 柱分离，甲醇一乙醇( 9 9 ：i ) 洗脱即可获得银杏酸的纯样。谭 卫红等在做类似处理后，再经薄层制备，得到侧链不同银杏酸化合物的混合物， 最后经h p l c 多次重复制备得到6 种纯度在9 0 以上的烷基酚单体化合物。而 蒋永红等采用相同手段，得到三种银杏酸纯品。1 9 9 6 年j u n k oi r j e 等“”使用 己烷分三次浸提银杏叶溶液，然后经硅胶柱分离用三种溶剂进行梯度洗脱，其 中的甲醇洗脱液收集后，再经制备层析柱分离可得四种银杏酸产物。 n a g a b h u s h a n a 等“”利用调节洗脱液中的醋酸和三乙胺的含量来达到分离银杏酸 的目的。样品用有机溶剂浸提后，使用硅胶柱层析，先用含三乙胺的洗脱液洗 脱得银杏酚类物质，再用含乙酸的洗脱液洗脱得银杏酚酸类物质。v a n b e e k 。1 用石油醚偶尔搅拌的条件下萃取，在过硅胶柱后用环己烷：乙醚：乙酸( 9 0 ： 1 0 ：1 ) 洗脱，最后用中压反相液相色谱，选用银化的阳离子交换柱进行分离可 获得银杏酸纯品。v e r o t t a 等”报道了用c o 。超临界流体萃取( s f e ) 分离银杏 酸类化合物。银杏叶在浸提、浓缩后，经反萃取富集和柱层析纯化银杏酸产品， 再经两步梯度法完成超临界流体萃取分离，得出五种银杏酚酸。最近姚刚等报 道”：银杏酸超临界萃取处时由于银杏酸苯环6 一位上的长烷基链使其在纯c o 。 中的溶解度较低，必须加入改性剂方能提高其萃取率，研究发现采用甲醇为改 性剂，在一定压力温度下，随甲醇量的增加提取率也不断增加。然而考虑到过 高浓度的改性剂可能会导致g b e 中内酯等有效成分及其它杂质的提出，利用8 的甲醇作改性剂的超临界二氧化碳对银杏酸进行萃取可以选择性的将三种银杏 酸分离出来。n d j o k o 等1 用氯仿浸提银杏叶溶液，然后过硅胶柱，用石油醚与 乙酸乙酯混合液梯度洗脱( 9 0 ：1 0 一2 0 ：8 0 ) ，产生六个部分，再用m p l c 和制 备h p 。c 联用进行分离，水与乙氰混合梯度洗脱( 1 0 ：9 0 一0 ：1 0 0 ) 可以分离三 种银杏酸。赵成林等嘲1 将银杏外种皮在室温下提取回流3 次，而后以浓度为1 0 的n a 。c o ：，从乙醚中抽提，水层用稀盐酸中和，再用乙醚从水层中抽提，乙醚干 燥蒸发后得到褐色油状物经柱层析，甲醇一醋酸洗脱分离出三种银杏酸。 1 6 课题的研究目的、意义及内容 坚型查兰堕主兰垡堡塞 我国是银杏的原产地，银杏资源占世界总量的7 0 以上。但目前状况是在 银杏果实采摘中，大量的银杏果外种皮被当作废弃物扔到，未被利用，它们含 有大量的银杏酸类物质，有可能转化为优质的生物农药“。如果遗弃在外，不 仅会污染环境，甚至会引起人畜中毒。充分研究和利用银杏外种皮中酚酸类物 质，对我国银杏资源开发有重要意义。国内生产的g b e 在黄酮和内酯这两个有 效成分含量一般可以达到标准，但在银杏酸含量的控制上却不尽如人意，产品 在国际市场上缺乏竞争力。假如与g b e 生产过程中除银杏酸过程结合起来，在 除去g b e 中银杏酸的同时，提取分离银杏酸。不仅可以保证银杏制剂安全性， 还可银杏对酸的活性做进一步研究，同时也解决了工业污染问题。 目前分离银杏酸的方法还存在着一定问题，铅盐沉淀法沉淀中有效成分夹 带损失较大。且产品中存在铅残留。超临界萃取法，在技术和设备方面要求很 高不适于工业化生产。硅胶柱具有不可逆吸附性造成银杏提取物中有效成分损 失较大。液液萃取方法费用较高，得率较低，对银杏制剂还存在溶剂存留效应。 利用液相色谱分离属分析型分离，由于昂贵的价格而限制了它们在制备型分离 中应用。考虑到这些因素，本实验选择采用大孔树脂吸附的方法进行银杏酸分 离研究。吸附树脂是一类多孔性的，高度交联的高分子聚合物，出现于6 0 年代。 这类高分子材料具有较大的比表面积和适当的孔径，可以从气相或溶液中吸附 某些物质“。吸附剂包括有机的、无机的、天然的和人工合成的等许多种类。 吸附树脂是吸附剂中的一大分支，有时也称高分子吸附剂，是吸附剂中品种最 多应用最晚的一个类别。1 9 8 0 年以后我国才开始有工业规模的生产和应用。现 在吸附树脂的应用已遍及许多领域。大孔吸附树脂在各个领域已经形成一种独 特的吸附分离技术。由于吸附树脂的多样性，吸附树脂可以根据实际用途进行 选择和设计，制造许多有针对性的用途的特殊产品。同时大孔树脂具有适应性 强、应用性广、吸附选择性好、稳定性高、成本低、效率高、容易再生等特点。 可以有效的吸附具有不同化学性质的各类化合物，这是其他吸附剂所不及的。 正是由于这种原因，吸附树脂仍在继续发展，新品种，新用途不断出现。吸附 树脂的吸附特性主要取决于吸附树脂表面的化学性质、比表面积和孔径。由于 大孔吸附树脂的基质是合成的高分子化合物，因此可以通过选择各种适当的单 体、致孔剂和交联剂，根据要求对空f n q 结构进行调整：同时还可以通过化学修 饰改变表面的化学状态，因此同常规的吸附材料相比品种更多，性能更优异1 朗j i f 大学硕士学位论文 舅多 大藐啜瓣橱骚翡瘦瘸范围广泛弗霹鞋爝零、蠢祝溶齐l 、羧、疆溶液等辩蔽 隧携遴行淡脱，键其爨梵方便。吸醛礴b 警酾暇尉分离技零奁工妊、科研秘入翻 生活的各个领域中熏要性越来越突出，因此越来越受到药物分离工作鬻重视。 将大扎吸毗挝脂瘸子银杏黢的分离提取虽未见文献报遂，但大孔吸孵树膳 已广泛瘦用于中草药青效成分的分离提取“”3 。因此本论文蓠次尝试剩用树脂 啜辩方法分离镶奁酸豹轿究。羧照褥膳鹣表灏瞧矮，啜辫裾鬻一觳分梵# 缀链、 中极性、檄性和强极1 生。所以本研究选取不同极性的x a d - 2 ( 非极性) 、a d s 一8 ( 中 较蔑) 、h z - 8 4 1 ( 巾摄稳 、j t 一2 0 3 ( 搬往) 、a d s 一7 ( 强辍魏) 纛耩褥糕，透孳予疆 吝酸啜黪势蹇硬突。逶避静态羧鼹试验包括啜斑爨跑较、洗瓣裁选择试验及瓣 脂的吸附动力学的研究，选出其最适宜的吸附树脂。考察影响吸附树脂吸附性 能鲍艘素，鲤鹾毽、熬浓度及上榉浓度对吸瓣搜貔豹影赡等，从恧褥剿吸陛撼 脂吸辩镦沓酸的最傣条件。另外，进行其树脂对锻杏酸的动态吸附研究和利用 纯学物莲分析手段，骈究箕褥i 旨钓翻：学及物疆结构，磷究其树精啜酣锻杏酸豹 差异i 生。这样的研究，为树脂法分离银杏酸奠定一定的实验与理论基础。 1 0 登垄盔兰窭主兰垒鎏塞 2 银香酸的定量分析方法研究 2 1 引言 锻鸯酸是银杏时中长链苯酚类位合物，热锻杏制裁中的霉副终曩成分，莺 际上对镶杏提取物及银杏制荆中的银杏酸含爨肖严格要求，必须控制在5 p p m 以卜。因此银杏酸的分析显得尤为重要。色谱技术是广泛威用于化合物分离和 测定熬技术之一，其有分辑速度快、样燕爆爨少、灵敏度斑等挽点。色谱技术是 银杏酸定性及定量分析的常用方法，银杏酸的色谱研究始予= 十世纪6 0 华代， 早期采用薄层色谱技术( t l c ) ，随着色谱技术的发展，气相色谱( 0 c ) 高效 滚鞠惫谱( h p l c 隈续应用刘锻套疑豹分辑磷究中。t l c 舆蠢快速、徐壤、 易操作等特点，通常用于定性分析，适合于生产过程中的濂测，但由于谈差大， 且精密度有限而不能作为产品最终的定量分析。g c 与t l c 比较仪器设备要求 鞍毫，壤确度氇有爨提裹。毽燕定耋分辑过黎孛测定豹是锻杏酸戆掰生耪，舞 以没有明确的检出限报道，因此这种方法的爱敏度不好评价。目前研究使用最 广泛的是h p l c ，h p l c 是利用粒度小、传质速率快的的薄巍型填料；使用高压 泵，热抉渡凄葙熬遽菠；嚣嚣啜歉类辍予气攘色谱熬检测授零，麸瑟使渡攘雹 谱和气相色谱一样，其有柱效离、分析时间缀的特点，且色谱柱可连续避复使 用【6 4 1 。近二十年逐渐地应用于锻誊酸的分析中，r p h p l c 舆有分离效果好，准 确淫簸，分掇速度浚及谈器耋动纯程度高等将赢，茏其透念子拜发蛙低，热稳 定性麓，分子量大及离子型化合物的分析，所毗银杏酸的艇相h p l c 分析发展 特别迅速。但是现谯的检测方式还存在着样晶处理复杂，煎复性不好等问题， 嚣翦遂没有公试豹栎难。 本义采用反相掰效液相色谱法，建立了以锻杏酸( c 1 3 ：0 ) 为对照品，以r p c 1 8 为固定相，甲醇：水：乙酸水溶液( 9 0 ：9 6 ：o 4 ) 为流动相的等度洗脱， 魏方法线往范嚣爨鬣梭密耋霹这羯0 4 1 m g l ，线性蓬藿竟9 m g l 1 5 0 m g , r l , ) ， 相关性好( r = o 9 9 9 ) ，回收率高( 9 6 8 ) ，此方法可应用于锻沓提取物中锻杏酸的 含量测定。 西雕丈掌醺士学位论文 2 2 实验部分 2 。2 。1 仪器与试剂 2 。2 。1 1 鼓嚣 a g i l e n t 公司h p l l 0 0 型高效液相也谱仪( 配置有可变波长紫外检测器、在线 真空脱气装置、四元梯度泵、柱憾温箱) ； h p 纯攀工终菇： 2 0 9 l 进样注射器； 溶剂过滤器及o 4 5 t i n 的微孔滤臌： b r a n d s n l c 超声波渣洗器( 6 0 w ，4 7 k h z ) 。 2 2 1 2 试荆 甲醇( 分析纯) 、冰己酸( 分析纯) 、正己烷( 分析纯) ： 氯嫠( 分疑缝) 、蠢濒醚( 分辑缝) ； 二次蒸馏承，经o 4 s m 微孔滤胺过滤； 银杏酸标准品( 由南京药科大学提供，9 6 ) ，缝h p l c ，n m r ，i r 鉴定 g b e ( 出成都藐世纪公司提供) 。 2 2 2 高效液相色谱分析条件 2 2 2 1 高救液相色谱分析条件 色谱技：h ph y p e r s i lo d s 色谱穗( 1 0 0 m m 4 m m ，5 强e ： 流动楣；甲醇：水：乙酸( 体积比9 0 ：9 6 ：o ，4 ) ； 流速：l m l m i n ；柱温：3 0 ； u v 检测波长：3 1 0 n m ：进榉量2 0 “。 2 2 2 2 银番酸的工作曲线 精密称取一定量的锻杏酸标准品，如流动相溶解，配制成3 0 0 m g l 的贮备 液，分弱定囊移取藏贮餐滚，瘸滚臻鞠稳释藏浓度势爨灸1 5 0 m e d l ，9 0 m g l ， 6 0 m g l ，3 0 m g l ，9 m g l ，o 9 m g l 的系列对照液。采用离心的方式用0 4 5 1 - t i n 的滤膜过虑，去除大颗粮杂质。处理臌用注射器分别吸取2 0 1 t l 备浓度对照液进 襻，避抒h p l c 分辑，以峰嚣积( 袁) 进撵浓度( e ) 终图，褥到锻鸯酸豹工住熬 1 2 西j 鞋大学硬士学位论文 线见图2 1 。 _，2鼍00l 豳2 。1 银杏酸的标准曲线 线性回归得戮曲线方程：y = 8 。8 3 x + 1 2 4 4 相关系数：r = 0 9 9 9 避样薰在( o 9 m g l 1 5 0 r a g l ) 之间呈良好豹线性关系 2 2 3 样品溶液的制备 准确称锻杏提取物3 0 9 ，置于5 0 0 m l 烧瓶中，然后用9 0 甲醇窳容a 在5 0 c 瘩浴锈蠹糖熬溶解，过滤浚集。准确叛瑕梵潘滚2m l 于试警枣，麴入歪己烧 6 m l 、适量h c i n a c l 溶液( p h = 2 5 ) 振荡，静置，待分层后，准确吸取上层有梳 相3 m l 予另一千燥试篱中。测试前真空挥干萃取剂，残渣溶予甲醇5 m l ，供 h p l c 分折。 2 2 4 h p l c 方法精密度测定 取对照晶贮备液( 3 0 0 r a g l ) 稀释厝，连续进样5 次，每次j 艘样2 0 t l ，测 定箕酶瑟积，诗算荚糖鬻袭t 嚣捌大学磺士学位谂文 2 。2 。5 撵热如样嬲收翠浏定 豁鼓已测定锻鸯羧会量靛镊杏提取勃0 3 5 9 澄爨，分裂放入1 0 m l 褰爨糕孛， 餐翰入0 2 8 m g 银奔酸对照鑫，溺流动糖定容，采焉2 , 2 ，3 静方法制褥榉赫，逶 样2 0 _ t l 测定锻杏黻的峰面积。拔测褥童与鸯瓣入量计算方法溺收率。 2 。2 + 6 方法翡检测双潮定 墩对照品储备液( 3 0 0 m g l ) l m l 稀释至1 0 m l ，测定冀蜂面积，将稀释詹的锻 杏酸溶液取l m l 稀释至1 0 m l ，谶样2 0 r t l ，测定其峰稀禚，豢复上述j 遘程，纛 至h p l c 不能捻溅蔟蜂嚣积。 2 3 络果与讨论 2 3 ，1 群菇净纯方法靛选择 簸杏酸震鞲掇慷耨霞，簸袁粒捷彀貔溶液戆h p l c 分撅袭骥，棰晶潞渡不瑟 赢接避样分褥。镊撩婶提取匏溶液审弱援牲麴莛酮类纯合物，囊手啜竣蜂纛近镶 杏酸检测波长且含薰相对较高，怒干扰银杏酸测定的主要成分，本研究的结果见 鋈2 。2 。 一“百f = 二二蔓二 翳2 2 镊杏提取糖的色谱瓣 出阁2 , 2 可知锻杏酸的蜷慕本鬻不到，严重影响测定络栗，所戳必须辩镟 o 一 3 一 一 一 汹川大学磁士学位论文 杏酸进行样品前处理。因为锻杏酸易溶于菲极性有机溶剂，常用的样晶处理方 法是稳机溶剂萃取，本实验利用氯仿、石油醚鞫正己烷三种鸯机试剂进行了比 较试验。分别取g b e 溶液5 m l ，加入5 m l 萃敬帮，强摇2 m i n 静置分朦。去除 上层，取下层谯加入攀取剂，黧复以上操作，如此萃取三次，合并三次萃取液， 挥干摹取荆，用甲醇溶解，测定含量，其结聚见表2 1 。 表2 1 三种游裁萃取绪粟比较 融表2 1 可知正己烷的效栗最好，石油醚或氯仿萃取，效率较低，而且融 图2 , 3 和图2 4 可知，嚣油醚和氯仿萃取后杂质含量较多，样l l i l 纯度低，不利予 检测。对正己烷而言，结合图2 5 可知，正邑硫不仅分离效祭好t 丽盛所褥锾 杏酸的纯度也商。同时，本实验研究波明，磁己烷萃取银杏泼一次萃取率高达 9 8 2 。 强2 。3 嚣油襄摹彀黎杏装弱色谗翔 霹川大学硬攀位论文 42e8 翔2 4 簌镑萃取镊杏蘩的色_ i 萋圈 f _ 一1 = ：二二j 二二= 王二二 王：二 阁2 5 正张烷萃取锻杳酸的色谱圉 另外条件的教变对滋穗烷的攀取效采影响很大。在g b e 溶液中添加酸性盐 溶液能提赢萃取效率，其史要原因是由予簸析作用能改变银杏酸在有机相和水 稻中的分配系数，从而撼高了萃鞭效率。褥且酸往环境掷制银杏黢的电离，有利 予非极性滚剂的萃取。 2 3 。2 h p l c 流动棚及检测波长的选择 1 6 四川大学硕士学位论文 流动相的组成和性质对色谱柱效和分离选择性有很大的影响，改变流动相 的性质和组成是提高系统分离度和分析速度的重要方法。根据相关文献报道， 一般选择以甲醇、水和乙酸混合作为流动相。所以本文也选用甲醇、水和乙酸 的混合液作为流动相，并以不同比例混合，研究中发现4 的乙酸溶液与甲醇体 积比1 ：9 混合时要比1 ：5 混合时基线清晰度和峰形状好。同时考察了乙酸含 量对银杏酸分离度的影响，在甲醇：水体积比为l ：9 时不存在酸条件下各组分 可基本分离，但出现色谱峰拖尾现象。这主要是由于