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悬浮式生物芯片中微流场系统的研究 摘要 生物芯片技术是生物信息技术领域中新兴发展并得到长足进步的一项高新 技术， 它实现了 对生物信息的快速检测和分析。 悬浮式生物芯片技术是对生物芯 片技术的继承和发展， 并且具有微球探针的反应面积大、 通量大、 灵敏度信噪比 好、 杂交反应场所理想和操作简便等的优点。 微流器件是悬浮式生物芯片信息检 +a 9 收集的平台， 流体流速的控制和待测试液的推射与微流器件共同组成微流场系 统。 微流场系统是悬浮式生物芯片检测技术中的重要组成部分。 本论文主要提出了悬浮式生物芯片的两维多探针进样并行检测方法，用 c c d对微球探针进行凝结成像， 得到被检测悬浮式生物芯片所需要的全部信息: 设计了实验装置，分析了其可行性，并且进行了实验验证;结合流体力学理论， 分析了 微流体的流动性质、 微球探针在微流场中的运动状态， 用 s t o k e s 方程求 解微流场。 并提出了用会切磁场约束微球探针; 详细介绍了机械方法、 激光烧蚀 法和湿法蚀刻制备微流器件的方法和原理，并给出了这三种方法制备的微流器 件， 对它们的微槽表面粗糙度、微槽的形状对检测结果的影响进行了比 较。 本论文还对微流场系统进行了实验， 给出了聚苯乙 烯微球在微流器件中的形 态。 提出了 一种减小背景噪声的 方法并且进行了实验验证。 用c c d对微通道中 的微球进行了连续凝结成像，分析了实验结果，对后续的研究工作进行了展望。 关键词:悬浮式生物芯片;并行检测;c c d ;微流场;微球探针;微流器件 s t u d y o n mi c r o fl u i d i c i n s u s p e n s i o n a r r a y ab s t rac t b i o c h i p w a s a n e m e r g i n g t e c h n i q u e in t h e f i e l d o f b io i n f o r m a t i c s a n d h a s t a k e n g r e a t d e v e l o p m e n t . i t r e a l i z e d f a s t m e a s u r e m e n t a n d a n a l y s i s o f b i o l o g i c a l i n f o r m a t i o n . s u s p e n s i o n a r r a y t e c h n o l o g y i n h e r i t e d a n d d e v e l o p e d t h e t e c h n o l o g y o f m i c r o a r r a y . i t u s e d m i c r o s p h e r e a s t h e b i o - m a t e r i a l s c a r r i e r , w h i c h r e s u l t e d i n c h a r a c t e r i s t i c s o f l a r g e a r e a f o r r e a c t i o n , h i g h t h r o u g h p u t a n d s e n s i t i v i仪g o o d s / n r a t i o a n d p r o v i d e u s a n i d e a l l o c a t i o n f o r h y b r id i z a t io n . t h e n e c e s s a ry o p e r a t i o n f o r t h i s t e c h n o l o g y w a s s i m p l e . m i c r o fl u i d i c d e v i c e w a s a n e l e m e n t f r o m w h i c h i n f o r m a t io n w a s c o l le c t e d i n s u s p e n s io n a r r a y t e c h n o lo g y . t h e m ic r o fl u id i c s y s t e m w a s c o m p o s e d o f v e l o c i t y c o n t r o l o f l i q u i d fl u i d , p r e s s u r e d r iv e n o f l i q u i d a s s a y a n d t h e m i c r o fl u i d i c d e v ic e s , w h i c h w a s a n i m p o r t a n t p a rt o f t h e w h o l e s y s t e m . i n t h i s p a p e r , w e p r e s e n t e d t h e t w o d i m e n s i o n a l m u lt i - p r o b e s a m p l i n g p a r a l le l d e t e c t i o n o f s u s p e n s i o n a r r a y . m i c r o s p h e r e p r o b e s w e r e f r e e z i n g l y i m a g e d b y c c d . t h e n a l l i n f o r m a t i o n o f t h e s u s p e n s i o n a r r a y t o b e t e s t e d w a s p i c k e d - u p f r o m t h e i m a g e s . e x p e r i m e n t a l s e t u p w a s d e s i g n e d . i t s f e a s i b i l i t y w a s a n a l y z e d a n d v a l i d a t e d b y e x p e r i m e n t . a c c o r d i n g t o t h e o ry o f h y d r o d y n a m i c s , t h e fl o w i n g c h a r a c t e r i s t i c s o f m i c r o fl u i d i c a n d t h e m o v e m e n t o f m i c r o s p h e r e s t h e r e o f i n m i c r o fl u i d i c d e v i c e s w e r e a n a l y z e d . m ic r o fl u i d i c w e r e a n a l y t i c a l l y e x p r e s s e d t h ro u g h t h e s o l v i n g o f s t o k e s e q u a t i o n s . m e t h o d a d o p t i n g c u s p e d m a g n e t i c f i e l d w a s p r o v i d e d t o l o c k m i c r o s p h e r e p r o b e . mi c r o fl u i d i c d e v ic e w a s f a b r i c a t e d t h r o u g h m e t h o d o f m a c h i n i n g , l a s e r a b l a t i o n a n d c h e m i c a l e t c h i n g a n d t h e i r p r i n c i p le s w e r e d is c u s s e d d e t a i l e d l y . c o a r s e n e s s i n t h e m i c r o fl u i d i c c h a n n e l s u r f a c e a n d i n fl u e n c e o f m i c r o fl u i d i c d e v i c e s h a p e o n t h e d e t e c t i o n r e s u lt f o r e x p e r i m e n t a l r e s u lt f o r t h e m ic r o fl u i d i c c h a n n e l w a s p r o v i d e d . a n d t h e s t a t u s o f p o l y s t y r e n e m i c o s p h e r e i n t h e d e v ic e w a s g i v e n . a m e t h o d f o r r e d u c i n g b a c k g ro u n d n o is e w a s p r e s e n t e d a n d v a l i d a t e d b y e x p e r i m e n t . mi c r o s p h e r e w a s f r e e z i n g l y i m a g e d i n m ic r o fl u i d i c c h a n n e l c o n t i n u o u s l y . s o m e f u t u r e w o r k w a s p r o s p e c t e d . k e y w o r d s : s u s p e n s i o n a r r a y ; p a r a l l e l d e t e c t io n ; c c d ; m i c r o fl u i d i c ; m ic r o s p h e re p r o b e ; mi c r o fl u i d i c d e v i c e 浙江人学删i j 学位论文 第一章绪论 1 1 生物芯片及其检测技术 生物芯片技术的出现不过1 0 ；g 左右，但它发展神速i “，已经吸引了人们的广 泛关注。它有可能破译深减在生物体内巨大的遗传信息，揭示生命的本质，阐明 疾病的治病机理，从而治愈困扰和折磨人类多年的疑难杂症。生物芯片将大量的 生物信息以及许多不连续的分析过程集成在一个芯片上【2 】，从而实现对d n a 、蛋 白质、细胞以及其他生物组分的准确、快速、并行和大信息量的检测和分析，能 在很短的时间内完成上万次的生物化学反应，具有高通量、高集成度、并行分析、 微型化的优点。正是生物芯片的这些突出优点，世界各国的众多科研工作者都致 力于生物芯片相关工艺、设备、检测技术及处理软件的研究与开发。 1 1 1 生物芯片 生物芯片( b i o c h i p ) 的概念来源于计算机芯片。 生物芯片技术是2 0 世纪9 0 年代中期发展起来的一项尖端技术。他以玻片， 硅为载体，在单位面积上高密度地排列大量的生物材料，从而达到一次试验同时 检测多种疾病或分析多种尘物样品的目的。基因芯片、蛋白芯片等都属于生物芯 片的范畴。由于生物芯片综合了分子生物学、半导体微电子、激光、化学染料等 领域的最新科学技术，可广泛应运于人类基因研究，医学诊断，环保，农业研究 方面。比如，在肝炎等感染性疾病的渗断上，利用基因芯片可以一次同时测出多 种病原微生物，医生能在极短的时间内知道病人被哪种微生物感染，作出快速而 准确的诊断。同样利用基因芯片，在产前检查中，只要取少量羊水或父母血液就 可以测出胎儿是否患有遗传疾病( 或可能患病的机率) ，同时鉴别的遗传性疾病 可达到数十种甚至上千种。 狭义的生物芯片是指微阵列生物芯片( 图1 1 a 、b ) ，即为采用光导原位合成 1 3 - s l 或微量点样件4 1 】等微加工、自动化和化学合成技术方法，将大量核酸片段( 寡 核苷酸p n a 、e d n a 、基因组d n a ) 或多肽分子【3 】以预先设计的方式固定在面积 较小的基片( 玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体) 上，这些有序排列 浙江大学硕i ：学位论文 ( a ) 用十d n a 分柝的生，物芯j ( b ) n a n o g e n 公司的骰电极芯” 图1 1 微阵列生物芯片 的核酸片段或多肽分子就形成了带有标记物的可寻址识别分子致密点阵，当荧光 标记的未知靶分子与芯片上的识别探针分子进行杂交后，通过激光共聚焦扫描或 电荷偶联摄影像机( c c d ) 对荧光信号的强度进行检测，再通过计算机软件分析， 从而获得被测样品中靶分子的数量和序列信息。这种固态生物芯片首先由美国的 a f f y m e n - i x 公司发展起来的。它具有高通量、并行检测、快速解读的优点，用于 进行d n a 序列测定，基因多态性检测 9 1 ，基因突变的检测，基因表达的检测 浙江火学硕士学位论文 分子扩增与样品分离。 生物芯片是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学进展。生物 芯片能为现代医学科学及医学诊断学的发展提供强有力的手段，促进医学从“系 统、血管、组织和细胞层次”( 通常称之为“第二阶段医学”) 向“d n a 、r n a 、蛋 白质及其相互作用层次”( 第三阶段医学) 过渡，使之快速进入实际运用。人类 基因组计划( h g p ) 是人类为了认识自己而进行的一项最伟大和最具影响的研究 计划。至1 9 9 7 年术，h g p 计划己提前完成遗传图和物理图的制作，人类的基因 组序列已完成2 。预计2 0 0 5 年前将完成序列分析。此外，还测定了8 0 万个e d n a 片断( e s t s ) ，相当于4 - 5 万个基因，占7 1 0 万个人类总基因的5 0 左右。目前 的问题是面对大量的基因或基因片断序列如何研究其功能，只有知道其功能j 。能 真正体现h g p 计划的价值破译人类基因这部天书。后基因组计划、蛋白组计划、 疾病基因组计划等概念就是为实现这一目标而提出的。不同个体基因变异、不同 组织、不同时间、不同生命状态等基因表达差异的分析是连接基因组计划和蛋白 组计划最关键的一个环节，他不仅能利用基因组计划的研究成果在疾病诊断、药 物筛选等领域发挥重要的作用而且还可为蛋白组计划的实施提供大量非常重要 的线索。这一环节计划的补充又是蛋白组计划的航标，基因芯片技术就是为实现 这一环节而建立的。 生物芯片根据芯片上的探针不同，可分为蛋白芯片和基因芯片。如果芯片上 固定的是肽或蛋白，则称为肽芯片或蛋白芯片。如果芯片上固定的分子是寡核苷 酸探针或靶d n a ，则称为基因芯片。基因芯片有寡核苷酸芯片和e d n a 芯片， 包括二种模式：一是将靶d n a 固定于支持物上，适合于大量不同靶d n a 的分 析，二是将大量探针分子固定于支持物上，适合于对同一靶d n a 进行不同探针 序列的分析。 生物芯片的大小一般只有几个平方厘米，在这样大小的空间内需要排列几百 甚至几百万个信息单元，所以，生物芯片的制作是一个复杂而精密的过程。生物 芯片的制备主要依赖于微细加工、自动化及化学合成技术。根据不同的使用要求， 可以采用微加工技术在芯片的基底材料上加工出各种微细结构，然后再施加必要 的生物化学物质并进行表面处理。而更为简单的芯片制备如d n a 芯片的制备， 则是在基底上利用自动化或化学合成方法直接施加或合成必要的生物化学物质， 浙江大学顾l ：学位论文 对基底材料并不做任何微细加工。通常比较典型f l d n a 芯片制备方法有4 种。第 1 种是a f f y m c t r i x 公司开发的光引导原位合成法。该方法是微加工技术中光刻工艺 与光化学合成法相结合的产物。第2 种方法是i n c y t ep h a r m a c e u t i c a l 公司采用的化 学喷射法。该方法是将合成好的寡核苷酸探针定点喷射到芯片上并加以固定化来 制作d n a 芯片。第3 种方法是斯坦福大学研制的接触式点涂法。在d n a 芯片制各 中通过高速精密机械手的精确移动让移液头与玻璃芯片接触而将d n a 探针涂敷 在芯片上。第4 种方法是通过使用4 支分别装有a 、t 、g 、c 核苷的压电喷头在芯 片上并行合成出d n a 探针。不管何种方法，目的都是希望能快速、准确地将探 针放黄到芯片上的指定位置上。将经过标记( 同位素或荧光) 的样品核酸和固定 在芯片上的成千上力的探针分子进行杂交反应杂交的基本过程l ”1 ( 图1 - 2 ) 是： 图1 2 生物芯片的杂交反应过样 首先从待测细胞和参考细胞中提取出相应的r n a 信息。经过一系列生物化学过 程后r n a 被转录成d n a 并标记上不同的荧光燃料( 目前大多数为c y 3 和c y 5 ) ， 标记过的d n a 和已知结构的生物芯片进行杂交反应，若生物芯片上有此基因的 互补基因，该基因就会与之结合，固定在生物芯片上，否则该基因就会在漂洗过 程中被清洗掉。然后，经过杂交反应的生物芯片被烘干后，用生物芯片荧光分析 仪扫描得到相应的荧光图像，荧光的强度间接地反映了杂交反应的程度。生物芯 片检测的流程如图1 3 。 生物芯片的检测就是获取标记物变化的信息的过程 t 3 - 1 5 l ，是生物芯片相关技 术的一个重要组成部分。近年，人们已经提出和发展了多种生物芯片检测方法【1 6 1 ， 包括荧光法、质谱法、化学发光和光导纤维、二极管方阵检测、乳胶凝集反应和 浙江大学颂- 学位论文 直接电荷变化检测等。相应地产生了各种检测仪器，如共焦扫描荧光探测系统和 芯j l 的准蔷 方法i 直接购买 商品化芯 方法2 自行设 计并向 j 家定 做：出 | | l j 买，台j 0 。g o ，人 点样及高 样品的准祷 待测样品核睃纯化 i 撵针制稀揶标记探 针纯化 杂交 图像采集和分析 反转录标记 ，p c r 标记，髓 机引物标记 酗1 3 生物芯片检测流样 c c d 荧光探测系统，量子生物化合反应生物芯片探测系统，单分子微荧光探测 系统，近场光学与微光学生物芯片探测系统等。荧光测试方法因其分辨能力和灵 敏度高，定位功能强而被普遍采用，并取得了相当的成功。其中最重要的是共焦 扫描荧光探测系统和c c d 荧光探测系统，已经相当成熟，并实现产品化。 由于利用生物芯片可以一次性地得到大量实验数据，因此需要一个专用的软 件系统来处理数据。完整的生物芯片数据处理系统，应该包括芯片图像分析和数 据提取，芯片数据的统计学分析和生物学分析，芯片的数据库积累和管理，芯片 表达基因的国际互联网检索，表达基因数据库分析和积累等功能，图1 - 4 为生物 芯片信息处理过程数据流示意图。 1 1 2 微流控芯片 广义的生物芯片除了上述的微阵列生物芯片外，还包括另外一类芯片微 流控芯片( m i c r o f l u i d i c s ) ，也称为微全分析系统( m i c r o - t o t a la n a l y s i ss y s t e m 浙江人学坝k 学位论文 图1 4 生物芯片数据流 图1 5 微流控分析芯片 1 0 浙江人学顾i ：f f 位论史 u t a s ) ，或者芯片实验室( l a bo nac h i p ) 。它是利用光刻微加工技术在玻璃 或者石英基质的表面加工出条条微型的液体通路，从而将传统实验室中的样品 处理、热反应器、电泳分离、p c r 等过程集成在一个芯片上完成【 。2 1 】。微流控 芯片的初衷是利用其毛细管及电渗流来做毛细管电泳分析，但微通道的优异性能 使其应用得到了广泛扩展。1 9 9 8 年，m ab u r n s 等将样品处理、热反应器、电 泳分离、荧光检测、半导体芯片、加热清洗等装置集成到一块芯片上f 2 到，引起了 广大科学家的重视。2 0 0 2 年，t t h o r s e n 等研制成功了一种微流控大规模集成 芯片田j ，将上千个阀和几百个反应器集成到一个芯片上，实现了真正意义上的微 流控芯片。 微流控芯片的主要部件包括：与进样及样品处理有关的透析、膜、固相萃取、 净化；用于流体控制的微阀( 包括主动阀和被动阀) 、微泵( 包括机械泵和非机 械泵) ；微混合器、微反应器、微通道和微检测器等。图卜5 为一个较为完整的 微流控芯片f 2 2 l ，为三层结构，底层为p c 板，中间层为硅片，上层为玻璃片。该 芯片集成了微流控通道、加样部件、热反应器、温度探测器、电极、电泳通道、 荧光探测器等，可进行纳升级的d n a 分析。整个系统除了激发光源、压力源和 控制部分外，其他部分都通过光刻技术加工在硅片和玻璃片上。整个芯片长为 4 7 m m ，宽为5 m m ，高为1 m m 。随着微机电系统( m e m s ) 技术、x 光深层刻蚀 ( l i g a ) 技术和纳米技术的引入和应用，微流控芯片的集成化程度也越来越高， 它将与微阵列生物芯片共同形成生物芯片的发展趋势。 1 1 3 生物芯片技术应用 俄罗斯科学院恩格尔哈得分子生物学研究所和美国阿贡国家实验室的科学 家们最早在文献中提出了用杂交法测定核酸序列新技术的想法，当时用的是八聚 寡核苷酸探针。同时，英国牛津大学生化系的s o u t h e m 等也取得了在载体固定寡 核苷酸及杂交法测序的国际专利。有了这些技术储备，美国和俄罗斯的科学家率 先研制出了一种生物芯片，并在测定b 地中海贫血病人血样的基因突变中进行了 实际应用，速度比传统的测序方法快1 0 0 0 倍。随后，初始实验的成功和微光学、 微系统技术的发展，使得生物芯片在商业资本的投入下处于激烈的技术竞争装体 中。生物芯片的点阵密度由低到商，杂交、扫描检测和数据分析处理系统不断完 浙江人学硕 卜 学位论文 ft- t a s ) ， 或 者 芯 片 实 验室( l a b o n a c h ip ) 。 它 是 利 用光 刻 微 加 工 技 术 在 玻 璃 或者石英基质的表面加工出一条条微型的液体通路， 从而将传统实验室中的样品 处 理、 热反 应器、电 泳分 离、 p c r等 过程集成在一个芯片上完成 i， 一 。 微 流控 芯片的初衷是利用其毛细管及电渗流来做毛细管电泳分析， 但微通道的优异性能 使其应用得到了广泛扩展。1 9 9 8年， m.a . b u r n s等将样品处理、热反应器、电 泳 分 离、 荧光 检测、 半导 体芯片、 加热 清洗等装置 集成到 一块芯片上2 2 1 ， 引 起了 广大科学家的 重视。 2 0 0 2年， t . t h o r s e n等研制成功了一种微流控大规模集成 芯 片 2 3 1 ， 将上千个阀 和几百 个反 应器集 成到一个芯片上， 实 现了 真正意义上的 微 流控芯片。 微流控芯片的主要部件包括: 与进样及样品处理有关的透析、 膜、 固相萃取、 净化: 用于流体控制的微阀 ( 包括主动阀和被动阀)、 微泵 ( 包括机械泵和非机 械泵);微混合器、微反应器、 微通道和微检测器等。图1 - 5 为一个较为完整的 微流 控芯 片 2 2 1 ， 为 三层结 构， 底层为 p c板， 中间 层为 硅片， 上层为 玻璃片。 该 芯片集成了微流控通道、加样部件、热反应器、温度探测器、电极、电泳通道、 荧光探测器等，可进行纳升级的d n a分析。 整个系统除了激发光源、压力源和 控制部分外，其他部分都通过光刻技术加工在硅片和玻璃片上。整个芯片长为 4 7 m m,宽为5 m m ，高为i m m。随着微机电系统 ( me ms ) 技术、x 光深层刻蚀 l i g a ) 技术和纳米技术的引入和应用， 微流控芯片的集成化程度也越来越高， 它将与微阵列生物芯片共同形成生物芯片的发展趋势。 1 . 1 .3 生 物芯片 技术应用 俄罗斯科学院恩格尔哈得分子生物学研究所和美国阿贡国家实验室的科学 家们最早在文献中提出了用杂交法测定核酸序列新技术的想法， 当时用的是八聚 寡核昔酸探针. 同时， 英国牛津大学生化系的s o u t h e r n 等也取得了 在载体固定寡 核昔酸及杂交法测序的国际专利。 有了 这些技术储备， 美国和俄罗斯的科学家率 先 研 制出 了 一种生 物芯片， 并 在$m l1 定卜 地中 海贫血 病人血 样的 基因 突 变中 进行了 实际应用， 速度比传统的测序方法快1 0 0 0 倍。 随后， 初始实验的成功和微光学、 微系统技术的发展， 使得生物芯片在商业资本的投入下处于激烈的技术竞争装体 中。 生物芯片的点阵密度由 低到高， 杂交、 扫描检测和数据分析处理系统不断完 浙江大学硕 1 : 学位论文 善。 生物芯片技术虽然尚在幼年阶段， 但已 展示出 它潜在的广阔 应用前景。 在基 础 研究 领 域， 生 物 芯片 主 要 应 用于 新 基因 发 现2 4 -2 7 1 、 基 因 表 达 谱分 析 2 8 -3 2 1 、 基因 突变3 3 -3 6 1 及多态性分析3 7 -4 0 1等， 在揭开生命之谜的历程中发挥了 重要作用。 在医 药 研究 领域4 1 4 5 1 ， 生 物芯片用于药 物筛 选 和药 物毒副作用的发 现和验证， 大 大降 低了 药物设计的成本， 缩短了新药开发的周期， 成为攻克重大疾病的一个有效手 段4 6 .5 3 1 。 生物芯片作为一种快速的检测手段， 将传统的 许多复杂、 不精确的医学 检测变成简单、 可靠的常规检测， 使传统的疾病诊断发生革命性的变化。 不难想 象， 一旦生物芯片将肿瘤、 肝炎等高发疾病的诊断变成只需一滴血即可完成的常 规检测， 将给人类带来很大的福音。 有两个例子最能说明问 题， 一是人类基因组 计划5 4 -5 8 1 。 生物芯片的 研究成功， 极大地促进了人类基因组计划的完成， 由 于生 物芯片在基因表达谱和测序方面的突出优点，使得原计划于2 0 0 5年才能完成的 人类基因组计划提前至2 0 0 1年2月完成。 这项计划解读了人类的遗传密码， 揭 示了 生命的大量奥秘， 使人类能够清楚地了解一个人为什么会成为色盲， 为什么 会发胖、 秃顶， 易患这种疾病而不是另外的疾病等等。 因此， 它是一项改变世界、 影响到我们每一个人的科学计划， 是人类科学史上的一项重大工程。 二是胶囊内 窥 镜的 发 明 5 9 -6 2 1 ，目 前 最小 的 胶 囊内 窥 镜 直 径仅 为5 .8 m m ， 长 度为1 5 m m ， 集 成 有 c c d , 镜头、 光源、电 源、 无线通讯等装置。患者可以直接吞食，与 现有的 内窥镜相比， 可极大地减轻患者的痛苦， 体内的图像既可以实时观察， 又可以 在 患者排泄出胶奕后读出。 此外， 生物芯片还将在环境监测、 流行病和传染病检疫、 生物和化学试剂检测、 农业和畜牧业、 军事和司法等方面扮演重要的角色。 其它 特殊设计的生物芯片还可用于基因扫描及基因文库作图等领域， 也在商品检验检 疫的工作中发挥重要的作用。“ 二十一世纪是生命科学的世纪” 是“ 生物工程时 代” 和“ 高度信息化的时代” ， 生物芯片技术这项信息技术领域高新技术的迅速 使得人们有效地、大规模地获得生物信息越来越高效口 固态生物芯片及微流控芯片的局限性 固态生物芯片的制作工艺复杂、 成本昂贵， 不宜根据每个不同检测对象制作 展.4 发l.j 不同的生物芯片。并且在制作过程中，点阵的均匀性很难达到较高水平，另外， 浙江大学硕l ：学位论文 菩。 生物芯片技术虽然尚在幼年阶段，但已展示出它潜在的广阔应用前景。在基 础研究领域，生物芯片主要应用于新基因发现【2 4 - 2 7 、基因表达谱分析 2 8 - 3 2 】、基因 突变 3 3 - 3 6 】及多念性分析1 3 7 - 4 0 i 等，在揭丌生命之谜的历程中发挥了重要作用。在医 药研究领域 4 1 - 4 5 l ，生物芯片用于药物筛选和药物毒副作用的发现和验证，大大降 低了药物设计的成本，缩短了新药丌发的周期，成为攻克重大疾病的一个有效手 段【4 “”】。生物芯片作为一种快速的检测手段，将传统的许多复杂、不精确的医学 检测变成简单、可靠的常规检测，使传统的疾病诊断发生革命性的变化。不难想 象，一旦生物芯片将肿瘤、肝炎等高发疾病的诊断变成只需一滴血即可完成的常 规检测，将给人类带来很大的福音。有两个例子最能说明问题，一是人类基因组 计划 5 4 - 5 8 】。生物芯片的研究成功，极大地促进了人类基因组计划的完成，出于生 物芯片在基因表达谱和测序方面的突出优点，使得原计划于2 0 0 5 年才能完成的 人类基因组计划提前至2 0 0 1 年2 月完成。这项计划解读了人类的遗传密码，揭 示了生命的大量奥秘，使人类能够清楚地了解一个人为什么会成为色盲，为什么 会发胖、秃顶，易患这种疾病而不是另外的疾病等等。因此，它是一项改变世界、 影响到我们每个人的科学计划，是人类科学史上的一项重大工程。二是胶囊内 窥镜的发明【5 9 - 6 2 ，目前最小的胶囊内窥镜直径仅为5 8 r a m ，长度为1 5 m m ，集成 有c c d 、镜头、光源、电源、无线通讯等装置。患者可以直接吞食，与现有的 内窥镜相比，可极大地减轻患者的痛苦，体内的图像既可以实时观察，又可以在 患者排泄出胶囊后读出。此外，生物芯片还将在环境监测、流行痫和传染病检疫、 生物和化学试剂检测、农业和畜牧业、军事和司法等方面扮演重要的角色。其它 特殊设计的生物芯片还可用于基因扫描及基因文库作图等领域，也在商品检验检 疫的工作中发挥重要的作用。“二十一世纪是生命科学的世纪”是“生物工程时 代”和“高度信息化的时代”，生物芯片技术这项信息技术领域高新技术的迅速 发展，使得人们有效地、大规模地获得生物信息越来越高效。 1 1 4 固态生物芯片及微流控芯片的局限性 固态生物芯片的制作工艺复杂、成本昂贵，不宜根据每个不同检测对象制作 不同的生物芯片。并且在制作过程中，点阵的均匀性很难达到较高水平，另外， 浙江人学硕l 。学位论文 其杂交反应亲和力弱、并需小心冲洗，这对芯片的检测带来很大的不便，因而大 大限制了它的应用。微流控分析芯片系统当前总体上既不够“微”，分析功能也 远达不到“全”，主要原因是集成度不够高，多数检测器的体积过大，实现真正 的集成化还有很漫长的过程 6 3 1 。其次目前加工条件下的微流控芯片制作的成本还 难以满足有关成果推广的要求，一块供研究用的标准玻璃芯片价值1 0 0 2 0 0 美 元，一块供分析1 2 试样的一次性专用芯片售价1 0 荚元。另外，当前的大部分微 流控分析系统不包括试样的前处理功能，即功能不够全，为了解决实际试样的分 析，这方面的研究需进步在实用过程中大大加强。 综上所述，传统生物芯片技术的局限性制约了这项信息技术领域崭新技术的 进一步发展与推广。随之，悬浮式生物芯片技术应运而生。 1 2 悬浮式生物芯片技术 1 2 1 悬浮式生物芯片技术简介 悬浮式生物芯片技术是利用微球( m i c r o s p h e r e ) 作为载体，流式细胞仪( f l o w c y t o m e t e r ) 作为检测平台洲，对蛋白质、核酸、肽等分子进行大规模测定的一种 技术。微球、探针分子、待测分子、报告分子是悬浮式生物芯片的4 个主要构成 部分( 图1 6 ) 。 图1 - 6 悬浮式生物芯片结构 悬浮式生物芯片由许多种不同的微球为主要基质构成，每种微球上固定有不 同的探针分子，将这些微球探针悬浮于待测试液中就构成了一个悬浮式生物芯 片系统，利用这个系统，可以对同一个待测试液中的多个不同分子同时进行检测。 图l 。7 是一个临床使用的悬浮式生物芯片系统。 浙江人学硕l ? 学位论文 1 2 2 悬浮式生物芯片的检测原理 为了寻找不同的探针分子，采用荧光编码技术，即在悬浮式生物芯片的液相 体系中，所有固定上探针分子的微球都用不同比例的红色分类荧光标记地址，每 种荧光的浓度又分为1 0 个等级。如果用n 种不同比例的荧光，就可以给1 0 “个 幽1 7 悬浮式生物芯片系统 图1 8 不同比例浓度的分类荧光 微球标记上地址。常用的方法是用两种不同比例的分类荧光，这样根据微球上的 红色荧光浓度不同，微球被分成了1 0 2 种。将1 0 0 种不同的探针分子分别固定在 这1 0 0 种微球上，检测装置可同时对一个液相体系中的1 0 0 种不同的待测分子进 行检测( 如图1 8 所示) 。 使用流式细胞仪作为分析平台，悬浮式生物芯片目前的检测原理 6 5 _ 6 8 】是让单 浙江人学硕i 擘位论义 个的微球探针通过检测区域，再使用不同波长的激光同时对微球探针上的红色分 类荧光和报告分子上的绿色标记荧光进行检测( 图l 一9 ) ，荧光的探测器通常采用 p m t 。一束激光激发微球探针上的红色分类荧光，根据不同的分类荧光信号，可 | 璺| 1 9 检测原理图 根据荧光的浓度等级将微球探针进行分类( 寻址) ，从而寻找到各个不同的反应 分子类型。另柬激光激发的是绿色标记荧光，用柬检测微球探针上结台的报告 分子标记荧光的数量，即可知道微球探针上结合的待测分子的数量。检测装簧通 过两束不同波长的激光同时进行检测【6 9 - 7 0 1 ，可以确定被结合的待测分子的种类和 数量。这种检测技术每秒钟可以检测几十个至上百个微球探针，判断微球探针是 否粘连的方法是检测微球探针的前向散射光和侧向散射光，这两种光的探测器通 常采用a p d 和p m t ，光路设计比较复杂，并且需要有高压偏置及低噪声放大电 路。流式细胞仪作为检测平台，实际上是串行检测，大大影响了检测分析速度。 这些问题使这种传统的检测方法系统复杂，成本较高，限制了悬浮式生物芯片技 术的进一步推广和应用。 1 2 3 悬浮式生物芯片技本的特点 ( 1 ) 微球体的反应面积大( 若直径为5 1 a m ，反应面积为，r d 2 = 7 9 # m 2 ) ，球 面上固定的反应试剂浓度高( 1 1 7 x 1 0 6 反应分子。5 m 直径的微球) 。 ( 2 ) 通量大，可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行分析，在3 5 - 6 0 分钟内可对9 6 个不同样本进行检测。 ( 3 ) 灵活性好。可适用于各种蛋白质分析，可以接受实验室已有的实验方 浙江大学硕 卜 学位论文 案，使用者可以自 行设计分析方案，也可使用成套试剂盒。测试参数、测试数 目 都可根据实际情况选择因。 ( 4 ) 液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象，也更有利于探针和被检测 物的反应。 ( 5 ) 灵敏度高，信噪比 好，只需要微量的样品即可进行检测。 ( 6 ) 操作简便，不需洗涤，耗时短。 1 . 2 . 4 微流场系统在悬浮式生物芯片检测技术中的 作用 流场系统是整个悬浮式生物芯片技术中的检测平台。 带有荧光信息的微球悬 浮 在 液 体中 ， 液体 从 专门 制 备 的 微流 器 件中 流 过 7 2 1微 流 器 件的 形 状和 尺 寸 参 数 是专门设计的， 通过对液体流速的控制， 使得专门设计的扫读装置把所有悬浮在 液体中的待测微球的荧光信号记录下来， 然后再通过计算机进行分析处理， 从而 获 得 所需 要的 生 物信息， 实 现生 物信息的多 探针进样并 行检测7 3 。 因 此， 整 个微 流场系统的性能， 将直接影响检测结果。 互 1 .3 本论文主要研究内容和目 标 为了克服传统的对悬浮式生物芯片进行串行检测的一系列问 题， 即达到降低 成本、 提高检测分析速度、 简化光路的目 的， 需要改 进检测方法。 整个改 进的 检 测方案研制工作是一项庞大的系统工作， 系统包括高能量、宽光束、 大口径、 均 匀分布的 脉冲激光输出 控制系统，高灵敏度、低噪声的c c d荧光探测系统， 连 续、 均匀、 平稳的流场系统， 微球探针的 荧光图像计算机分析处理系统。 结合本 人的专业特点和技术特长，主要研究工作及目 标是以下几个方面: ( 1 ) 根据悬浮式生物芯片多探针进样二维并行检测技术， 提出 连续、 均匀、 平稳的流场系统的整体方案及性能要求，并加以 分析阐述。 ( 2 ) 微流器件是悬浮体系的承载体， 选择合适的材料，并根据微球体和悬 浮液的特点， 对微流器件的形状和尺寸参数进行设计， 以满足整个系统的检测要 求。 分析微球探针在本系统设计的 微流场中的行为与特性， 并且根据分析结果来 优化设计微流器件. ( 3 )设计并采用机械、湿法蚀刻和激光烧蚀三种方法加工微流器件，并对 浙江大学硕十学位论文 三种方法加工的微流器件进行比较。 c 4 )设计液流的推进装置。根据检测时扫读装置的特点，设计与之相匹配 的液流推进控制装置。完成微流器件的实验验证，并对实验结果进行分析。 1 .4 本章小结 本章对生物芯片的概念、分类、 制备、 检测、 数据处理以及主要应用领域等 方面进行了 详实的介绍。 分析了 传统生物芯片技术的局限性， 介绍了悬浮式生物 芯片技术的概念、 检测方法和特点， 讨论了悬浮式生物芯片技术的优点。 在综合 分析基础上，提出了本课题的主要研究内容和 目 标。 浙江人学_ 1 0 l j 学位论文 第二章实验方案设计 2 1 悬浮式生物芯片检测系统方案设计 在继承了单探针串行检测的悬浮式生物芯片检测技术的优点基础上，为了实 现多探针二维并行进样检测，提高检测速度，设计了一种新型的悬浮式生物芯片 检测装置，图2 1 为原理图。 图2 - 1悬浮式生物芯片的新型多探钟井j 进样快速检测原理 相对于传统检测方法的流式细胞仪单微球探针通道，本方案设计了一个宽通 道的流场系统，流场的通道呈扁平状，通道的截面是个宽度和深度比很大的矩 形，其中微流场由精确的推射装置形成，见示意图2 2 。 步进电机控制着特殊的推进装置，使悬浮着用不同分类荧光标定的微球探针 的待测试液匀速流过流场通道。分别用经扩束镜l 。扩束的波长为5 3 2 n m 和6 3 5 n m 的均匀脉冲激光宽光束照射在流场的检测区域上，即悬浮式生物芯片的待测试 液。 浙江火学预i ：学位论文 凶2 - 2 特殊的液流推射装置 悬浮在待测试液中的微球探针被掺入了两种比例不同的红色分类标记荧光， 两种荧光的发射波长分别为6 6 0 n m 和7 2 0 n m ，每种荧光浓度又分为1 0 个等级， 一共有1 0 2 种分类( 微球探针地址) 。用波长为5 8 0 r l r n 的绿色荧光来标记报告分 子。三种波长的激光激发荧光被反射镜m l 反射，聚光镜l 2 将其收集会聚，然后 被分光镜dj 分丌，波长为5 8 0 n m 的荧光通过带通滤色片f i 后被c c d i 收集。再 使用分光镜d 2 将波长为6 6 0 n m 和7 2 0 n m 的荧光进一步分开，波长为6 6 0 n m 的 荧光通过带通滤色片f 2 后被c c d 2 收集，波长为7 2 0 n m 的荧光通过带通滤色片 f 3 后被c c d 3 收集。 c c d l 获得的图像可得出报告分子的绿色标记荧光强度分布； c c d 2 和c c d 3 获得的图像可得出微球探针的红色分类荧光信息，进而对微 球探针进行分类，即对应微球探针地址； c c d 4 获得的图像为全息干涉条纹，并将数据送至“计算机进行全息干涉图像 的数字重建，然后根据重建的全息图像获待测试液中微球探针的三维位嚣和尺寸 数据，进而判断微球探针的粘连情况。全息干涉条纹是通过6 3 5 n m 激光的微球 探针前向散射光和通过微球探针间隙的直射光干涉产生的。 根据这4 个c c d 获得的图像，再进行计算分析，可获得被检测的悬浮式生 物芯片所需要的全部信息。 本检测技术方案实际上是使用4 个c c d 记录了悬浮式生物芯片的待测试液 在检测区域的瞬时状态，也就是在一个激光脉冲的照射时间晕进行凝结成像。在 设计的流场中，待测试液形成了一条扁平的液流柱。为了提高分析检测的速度和 精度，保证每个微球探针所携带的荧光信息被记录一次，即不造成漏测和重复检 测，流场中检测区域的大小和选定的c c d 的光敏面太小( 流场的宽度) 及微球 探针之间的统计距离( 流场的深度) 相匹配。利用步进电机来控制特殊的推进装 置t 使流场中待测试液的流速与c c d 的记录速度相匹配。可对待测试液进行连 浙江人学钡f 。学位论文 续凝结成像分析。通过光刻和蚀刻的方法保证流场内部的表面光洁度，减小流场 中间和两边的流速梯度，使液流连续、均匀、平稳。 如此设计流场的目的是一方面使流场的深度小于两个微球之间的平均统计 距离，在统计意义上微球在激光的前进方向呈单排分布：另一方面，使流场的宽 度和c c d 的光敏面宽度相等，充分利用c c d 的光敏面。使用微球探针与待测试 液的体积配比为1 ：2 0 0 0 ，使用的微球探针直径为5 9 m ，微球探针之划的统计距 离为5 0 9 m ，流场中检测区域黾可以同时悬浮上千个微球探针。在检测时，计算 机通过对4 个c c d 记录的凝结图像进行处理，在相邻的两个激光脉冲间隔时间 内，可以同时获得上千个微球探针的所有信息。采用的激光脉冲频率为1 0 h z ， c c d 的帧频为1 0 帧秒，对这种浓度的待测试液进行检测，检测速度可以达到每 秒钟上万个微球探针要比悬浮式生物芯片的传统检测方法约高两个数量级，本 检测技术可以在几分钟内完成传统方法几小时彳能完成的检测任务。 根据微球探针的喜径和微球嵋j 的平均统计距离设计了特殊的流场，用步进电 机控制特殊的推进装置，不使用鞘液，使得整个待测试液流控制系统设计简便、 使用可靠；采用数字全息技术来精确地获得微球探针在待测试液中的三维信息， 提高了检测准确度，光路设计简单，不必另外引入激光光束进行图像重建，不用 全息干板，全息图像直接通过计算机数字重建获得；使用脉冲激光，提高了激发 荧光的光强度，直接用高灵敏度的c c d 探测，免去了使用p m t 及相应的