（光学工程专业论文）微流通道荧光检测技术研究.pdf

浙江大学博士学位论文 微流通道荧光检测技术研究 摘要 基于微流通道的生物分析技术是目前生物检测的研究热点，它涉及微细加工、生物 工程、分析化学、高分子科学、光学工程等多个学科领域。我国在相关技术及其应用的 研究中虽然已有很大发展，某些方面己达到或接近国际先进水平，但在相关科学仪器的 关键技术如快速，高灵敏度检测研究方面，仍明显落后于世界先进水平。本论文研究应 用于悬浮荧光微球阵列和毛细管电泳d n a 分析的微流通道系统及其快速高灵敏度荧光 检测技术。 研制的基于微流通道的悬浮荧光微球阵列并行检测系统，采用脉冲氙灯对微流通道 中二维分布的流动荧光微球连续曝光，并用c c d 进行多微球成像，对获取的荧光图像 进行微球识别，实现并行检测，首次获得了微流通道中直径6 p m 荧光微球的动态图像。 系统的检测限可达荧光分子密度1 0 p m 2 以下，检测速度可达每秒钟3 0 0 0 0 个荧光微球， 比流式细胞术检测提高l 2 个数量级。 研制的毛细管电泳d n a 分析系统，采用4 8 8 n m 或5 3 2 n m 激光激发毛细管中电泳分 离的染色d n a ，以f - t h e m 物镜收集荧光并由光电倍增管进行共焦探测。利用实验优化 的电泳条件，在系统上进行了双链d n a 片段样品的单碱基分辨分离；以有效长度1 4 c m 的毛细管完成了s t r 基因位点的电泳分析，在2 3 分钟内使全部基因位点基本达到基线 分离，检测速度比同类的a b i3 1 0 仪器快2 倍。模拟与实验研究毛细管微流通道中d n a 电泳荧光检测的荧光和噪声空间分布，发现筛分介质的瑞利散射噪声和毛细管内外壁的 折反射噪声相比可以忽略，最佳荧光收集方向位于与激发光成7 5 。方向。 论文提出了一种微芯片上微流通道检测的新结构，该结构以棱镜耦合激发光，以椭 球反光碗将荧光会聚到微芯片外的远焦点，缩小荧光发散角，理论上物镜工作距离要求 可以降至无限小，荧光收集效率可以提高6 3 倍。 关键词：微流通道；荧光检测；毛细管电泳；d n a 分析；微芯片技术 浙江大学博士学位论文 r e s e a r c ho nt h ef l u o r e s c e n c ed e t e c t i n gt e c h n o l o g yi nm i c r o f l u i d i c c h a n n e l a b s t r a c t b i o l o g i c a la n a l y s i st e c h n o l o g yb a s e do nm i c r o f l u i d i cc h a n n e li saf o c u sf o rs c i e n t i s t si n t h ef i e l do fb i o l o g i c a ld e t e c t i o n , w h i c hc o v e r sm u l t i d i s c i p l i n e ss u c ha sm i c r o f a b r i c a t i o n , b i o l o g i c a le n g i n e e r i n g ，a n a l y t i c a lc h e m i s t r y , p o l y m e rs c i e n c e ，o p t i c a le n g i n e e r i n ga n ds oo n c o r r e l a t i v et e c h n o l o g i e sa n da p p l i c a t i o n sh a v ed e v e l o p e dg r e a t l yi nc h i n a s o m er e s e a r c h r e s u l t sh a v er e a c h e do rh a v e b e e nc l o s e dt oi n t e r n a t i o n a lt o pl e v e l b u ti ns o m ek e y t e c h n o l o g i e ss u c ha sh i g hs p e e dd e t e c t i n ga n dh i 曲s e n s i t i v i t yd e t e c t i n g ，o u rr e s e a r c hs t i l lh a s al a r g eg a pw i t i lt h ei n t e r n a t i o n a lt o pl e v e l t h i sd i s s e r t a t i o nc a r r i e so nt h er e s e a r c ho n f l u o r e s c e n c ed e t e c t i n gt e c h n o l o g yw i t l lf a s ts p e e da n dh i g hs e n s i t i v i t yu s e df o rs u s p e n s i o n f l u o r e s c e n c em i c r o s p h e r e s a r r a ya n dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i ss y s t e mf o rd n a a n a l y z i n g t h e p a r a l l e ld e t e c t i n gt e c h n o l o g yf o rs u s p e n s i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s p h e r e s a r r a yi nt h i s d i s s e r t a t i o na d o p t e dap u l s e dx e n o nl a m pt oe x p o s ef l o w i n gf l u o r e s c e n c em i e r o s p h e r e s s e r i a l l y , w h i c hh a da2 dd i s t r i b u t i n gi nm i e r o f l u i d i cc h a n n e l c c dw a su s e dt oc a p t u r e i m a g e so fm u l t i - m i c r o s p h e r ea tt h es a m et i m e m i c r o s p h e r e sw e r er e c o g n i z e di nf l u o r e s c e n c e i m a g e sa n dp a r a l l e ld e t e c t i o nw a sa c h i e v e d d y n a m i ci m a g e so ff l u o r e s c e n c em i e r o s p h e r e s w i t hd i a m e t e ro f6m i c r o n sw e r ec a p t u r e df o rt h ef i r s tt i m ei nt h es y s t e m l i m i to fd e t e c t i o n o ft h es y s t e mw a sf e w e rt h a n1 0f l u o r e s c e n c em o l e c u l e sp e rs q u a r em i c r o n d e t e c t i n gs p e e d c o u l dr e a c h3 0 0 0 0f l u o r e s c e n c em i c r o s p h e r e sp e rs e c o u d ，w h i c hw a sh i 【g b e rt h a nt h a to f f l o w i n ge y t o m e t r yb y1 2o r d e r so f m a g n i t u d e d n a a n a l y z i n gs y s t e mb yc a p i l l a r ye l e c l r o p h o r e s i si nt h ed i s s e r t a t i o na d o p t e dal a s e ro f 4 8 8 n mo r5 3 2 n mt oe x c i t ef l u o r o p h o r el a b e l i n gd n as e p a r a t e db ye l e c l r o p h o r e s i si na c a p i l l a r y f l u o r e s c e n c ew a sc o l l e c t e db ya l lg t h e t al e n sa n dw a sd e t e c t e db yap m t w i t h c o n f o c a lo p t i c a la r r a n g e m e n t t h ee l e c t r o p h o r e s i sc o n d i t i o nw a so p t i m i z e di ne x p e r i m e n t s d u et ot h es y s t e mo p t i m i z a t i o n , d s d n af r a g m e n t sw e r es e p a r a t e da n ds i n g l eb a s ep a i r r e s o l u t i o nw a sa c h i e v e di nt h es y s t e m e l e c t r o p h o r e s i sa n a l y s i so fs h o r tt a n d e mr e p e a t sl o c i i nac a p i l l a r yw i t he f f e c t i v el e n g t ho f1 4 e mc o u l db ec o m p l e t e d r e s o l u t i o nf o ra l ll o c ic o u l d u 浙江大学博士学位论文 b ec l o s e dt ob a s e l i n el e v e li n2 3m i n u t e s ，w h i c hw a ss h o r t e rt h a nh a l f o f t h et i m eu s e db ya b i 3 1 0 r e s e a r c ho ns p a t i a ld i s t r i b u t i o no ff l o r e s c e n c ea n dn o i s ei n d i c a t e dt h a tc o m p a r e dw i 也 t h en o i s ec a u s e db yr e f r a c t i o na n dr e f l e c t i o nf r o mi n n e ra n do u t e rw a l l so f t h ec a p i l l a r y , n o i s e r e d u c e db yr a y l e i g hs c a t t e r i n gc o u l db ei g n o r e d t h eo p t i m a la n 斟eb 时w nt h ef l u o r e s c e n c e c o l l e c t i n gd i r e c t i o na n dt h ee x c i t i n gl a s e rb e a mw a s7 5 。 a tl a s t , an e wa r c h i t e c t u r eo ff l u o r e s c e n c ed e t e c t i n gf o rm i c r o f l u i d i cc h a n n e li n m i c r o f l u i d i cc h i pw a sp r e s e n t e d i nt h i sd e s i g n , ap r i s mw a su t i l i z e dt oc o u p l ee x c i t i n gl a s e r i n t ot h em i c r o f l u i d i cc h a n n e la n da l le l l i p t i c a lr e f l e c t o rw a su s e dt of o c u sf l u o r e s c e n c eo u t s i d e o ft h em i e r o f l u i d i cc h i pa n dt or e d u c et h ed i v e r g e n ta n g l eo ff l u o r e s c e n c e t h e o r e t i c a l r e q u i r e m e n tf o rw o r k i n gd i s t a n c eo fo b j e c t i v ef o rt h i s s t r u c t u r ec o u l db er e d u c e dt ob e i n f i n i t e l ys h o r t f l u o r e s c e n c ec o l l e c t i o ne f f i c i e n c yw a si m p r o v e df o ra b o u t6 3t i m e s k e yw o r d s ：m i c r o f l u i d i cc h a n n e l ；f l u o r e s c e n c ed e t e c t i n g ；c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ； d n a a n a l y s i s ；m i c r o c h i pt e c h n o l o g y n i 第章绪论 第一章绪论 随着社会进步与生活水平的提高，人类对自身健康产生了极大的关注，生命科学成 为当代科学研究的前沿领域。二十世纪下半叶以来科学技术日新月异的进步，促进了分 子生物学、分子遗传学和生物化学的整体迅猛发展，使人们对生命的认识逐步从器官、 细胞水平深入到分子水平。尤其是九十年代以来实施并完成了1 9 8 6 年由美国能源部提 出的人类基因组计划( h u m a ng e n o m ep r o j e c t , h g p ) 1 】，也为这种关注提供了更加有利的 条件和有力的技术保障，后基因组时代促使人们对基因检测的需求越来越大，各种检测 技术应运而生，自二十世纪九十年代初开始陆续出现了各种快速d n a 检测装置。其中 包括固态平板式生物芯片技术、液态悬浮式生物芯片技术、毛细管电泳技术，其中悬浮 式生物芯片技术和毛细管电泳技术使样品在微流通道中运动，在固定的检测窗口对样品 进行检测。光学技术在生物中的应用历史悠久，显微镜的发明正是为了观察细胞。由于 激光诱导荧光检测具有高灵敏度及选择性，因此广泛用于微流通道生物分析。 本章首先从固态生物芯片引出了压力驱动微流通道检测的悬浮式生物芯片的概念， 从平板凝胶电泳引出了电泳驱动微通道，包括毛细管电泳和微芯片电泳的概念，并介绍 了两种微流通道技术的发展及应用；然后介绍了荧光检测技术的原理及主要系统结构： 通过对其在微流通道检测中应用研究现状的评述，点出提高的途径和方法，引出了论文 的立论依据，给出了论文的研究内容和主要创新点；最后对论文的学术内容进行归纳和 评估。 1 1 微流通道生物检测技术 论文涉及的微流通道检测按驱动方式可分为压力驱动和电泳驱动两种，前者由固态 生物芯片发展而来，又称为悬浮式生物芯片，以气压或微量迸样器为驱动力，使样品在 微通道中流动；后者由平板凝胶电泳技术发展而来，样品在毛细管中电泳。在通道上固 定位置设置检测窗，通过对检测窗的信号采集，检测微流通道中的样品。 1 1 1 固态生物芯片 固态生物芯片】基于生物分子杂交反应原理，将信息己知的生物样品，如d n a 片 段，蛋白质等，通过光导原位合成【2 4 1 或芯片外合成后机械点样技术【5 1 点阵排布于基片上 浙江大学博士学位论文 形成探针阵列，基片材料为玻璃，塑料或硅片等具有生物兼容能力的材料。待测样品或 探针分子上标记报告分子，使待测生物样品与探针阵列进行杂交反应，则样品中与特定 探针具有互补性的生物物质会与其发生反应并使报告分子发出信号，通过对信号的检测 便可获知待测样品中所包含的生物信息，报告分子的标记可以是单标记或多标记，如双 波长荧光标记1 5 1 。图1 1 是一种典型的固态生物芯片产品，由于点阵排列的密度可以高 达6 0 0 0 c m 2 ，一块载玻片大小的基片上可以排布数万探针，包含很高的信息量，实现一 次同时对多个样品进行多指标检测，进行分别分析或对比分析，在基因测序、基因表达 研究、蛋白质测序、疾病诊断、药物筛选、环境监测和食品检测等领域具有广泛应用。 f 皓1 1s c h e m a t i co f p r o b ep r e p a r a t i o n , h y b r i d i z a t i o n ，s c a n n i n ga n di m a g ea n a l y s i s 1 1 2 悬浮式生物芯片 固态生物芯片信息量大，检测便利，可以利用成像方式进行并行高通量检测，解读 速度快，但也存在以下缺点： 1 制作工艺复杂，技术要求高，成本昂贵； 2 所有探针分子固定于同一基片上，不便于根据每次实验或特定检测对象进行探 针阵列的灵活设计与配置； 3 只能反映蛋白表达相对差异，无法对其绝对表达值检测； 4 杂交信号弱，对检测设备要求高，需要光电倍增管( p h o t o m u l t i p l i e rt u b e ，p m t ) 或高灵敏度c c d 进行探测； 。 5 样点与芯片亲和力弱，样品与探针阵列反应后，需要对芯片小心冲洗。 微球作为载体结合流式细胞术应用于生物研究始于2 0 世纪7 0 年代，但由于标记和 第一章绪论 检测技术的限制，直至9 0 年代才得到较快发展。k e t t m a n 等1 6 荆用流式细胞仪对一组6 4 种微球进行了分类与定量检测，m a n d y t - 于2 0 0 1 年首次提出了悬浮式生物芯片技术 ( s u s p e n s i o n a r r a y t e c h n o l o g y , s a t ) 的概念，很好地克服了固态平板式生物芯片的缺点。 n o l a n 等i s , 9 详细研究总结了s a t 技术及其应用。 如图1 2 所示，悬浮式生物芯片单元由微球、探针分子、待测分子、报告分子和标 记物组成，微球为生物物质载体，探针分子固定于微球表面。先将待测样品进行染色标 记后，样品中的目标待测分子通过报告分子与标记分子( 通常为荧光) 结合。将待测样 品与微球和探针分子试液混合反应，则待测分子通过杂交反应与探针分子结合。根据用 途不同，待测分子和探针分子可以是寡聚d n a 片段，蛋白质，缩氨酸，单核苷多肽等。 t f l u o r o p h o r e m i c r o s v h e r e s a m p l em o l e c u l e f i g 1 2e l e m e n to f s u s p e n s i o na r r a y 由于同一悬浮式生物芯片体系并行检测多种待测分子，因此须对其中每个微球上携 带的探针分子进行识别，相当于固态平面生物芯片中对探针的定位识别( 即空间编码) 。 随着以微球为载体进行生物化学研究的需要，微球编码技术【1 0 协到了迅速发展，包括光 学编码 1 l j 2 1 、电子编码、图形及物理编码。悬浮式生物芯片中利用荧光编码【8 ，1 3 1 进行探 针识别。微球探针分子标记多波长荧光染料，实现对微球，从而对探针分子的荧光编码， 染色方澍h l 包括吸附法、包覆法、球外悬挂法和共聚法。其原理如图1 3 所示，以两种 荧光物质a 和b 同时对微球进行标记，a 和b 具有相同的激发光吸收峰，但是发射峰 不同。将a 和b 的标记量分为n 个等级，每种微球选取n 个等级中的一种进行标记， 则它们受到激发后，其荧光强度也分别分为n 个等级，用二色镜将两种荧光分离，检测 其强度，就可以知道微球上a 和b 的标记量，从而实现对微球探针分子的编码识别， 可编码微球的种类数为n x n 。x u ”1 和骆等1 1 q 分别利用量子点标记也实现了对微球的编 码识别。 。 悬浮式生物芯片的检测通常采用流式细胞术【”习，如图1 4 所示，流式细胞仪的喷 嘴分为内外通道，微球( m i c r o s p h e r e ) 悬浮液通过流式细胞仪喷嘴内通道( i n n e r c h a n n e l ) ， 鞘液流( s h e a t hf l o w ) 则在泵驱动下在喷嘴外通道中循环，鞘液流作用是确保试液中的 3 咖 芦 浙江大学博士学位论文 微球逐个顺序通过检测窗。用两束激发光( e x c i t i n g l a s e r ) 同时照射到检测窗1 ：3 ，两束 国霸辔黪黪9 0 国囝国谚谚国国9 谚 移谚国国黪谚穆穆 囝囝囝穆9 谚参 囝国9 囝谚黪国辔9 囝国穆移穆国国国囝 国9 黪国国谚黪 国国国国镑9 国囝 穆囝痨黪国翁囝黪镑 国移移国黪彩9 谚移 f l u o r o p h o rb f i g 1 3f l u o r e s c e m e 勖c o d i n go f m i c r o s p h e r e 1 k m e rc h a n n e l , 2m i c r o s p h e r e , 3 s h e a t h f l o w , 4 e x c i t i n gl a s e r f 嘻1 4 s u s p e n s i o na r r a y d e t e c t e d b yf l o w c y t o m e t r y 光的波长分别为编码荧光染料吸收峰和待测分子标记的报告荧光分子的吸收峰，则微球 上携带的三种荧光物质同时发出荧光，荧光通过由二色镜，滤色片和透镜等组成的光学 系统后，分别由三个光探测器接收进行光电转换，光探测器通常为p m t 或雪崩光电二 极管( a v a l a n c h ep h o t o nd i o d e ，a p d ) ，电信号输入计算机进行数据分析，得到微球上的 信息。 悬浮微球阵列的检测还出现了其它方法，w a l t 等【l t l 8 1 在光纤头上蚀刻微坑，使微球 吸附与光纤头，形成光纤微传感器，实现悬浮阵列的检测。b r e n n e r 掣1 9 荆用液流盒成 像对微球阵列检测进行了基因表达测序并行分析，h a y e s 2 0 f 玎b u r a n d a 等叫分别在微流 控芯片上实现了微球阵列的检测，s a t o 等 2 2 , 2 3 1 利用热透镜显微镜在微通道中检n t 微球 阵列，w a l t o n l 2 4 1 , $ j j 对条纹金属微球通过光学成像进行了检测。s t e v e n s 2 5 瑚l 结合悬浮式生 物芯片与平面阵列式生物芯片的优点，将平面阵列中每个样品点位置固定上微球阵列， 4 jol口20j写 第一章绪论 从而实现更高通量的并行检测。 悬浮式生物芯片由于通量高，将细胞流式研究技术扩展到分子研究领域，获得了广 泛的应用。f a u c h e r l 2 刀将s a t 应用于h i v 病毒检测，d u n b a r 等1 2 8 1 将其用于s n p 分析， y a h 等口9 1 将s a t 用于流感病毒分析，s e h m i t t 等1 3 川对乳头瘤病毒进行了基因分型， d r e s s m a n 3 1 】进行了基因变化检测。b d p h a r m i n g c n 公司的c b a 【3 2 l ( c y t o m e t r i c b e a d a r r a y ) 和q i a g e n 公司的l i q u i c h i p l 3 3 1 两种s a t 产品相继发布。 1 1 3 微通道电泳 电泳是微通道中样品驱动的另外一个主要手段，广泛应用于生物样品分离分析1 ：弭- 3 6 。 电泳分离技术经历了平板凝胶电泳，毛细管电泳，芯片毛细管电泳三个发展阶段。平板 凝胶电泳目前仍然是分子生物学研究的主要工具，毛细管电泳自动化程度高，检测效率 和精度具有平板凝胶电泳无法比拟的优势，因此在要求较高的生物学研究，尤其是大规 模基因组测序中担当了重要角色，芯片毛细管电泳样品消耗量低，速度快，但仍有一些 问题待解决，目前实验室研究较多，商品化仪器仅局限于较低要求的生物分离应用。毛 细管电泳与芯片上毛细管电泳均属于微通道电泳分离。d n a 分子等生物样品在特定缓 冲液环境中携带一定量电荷，可以在电场作用下在微流通道中迁移，不同尺寸，结构或 分子量的样品的电泳速度不同，利用速度差异可以实现对样品的高效分离。 微通道电泳分离生物样品的原理如图1 5 | 3 7 所示，毛细管电泳系统由电泳高压 ( a p p l i e dv o l t a g e ) 、毛细管( c a p i l l a r y ) 、缓冲液池( b u f f e rr e s e r v o i r ) 及检测器( d e t e c t o r ) 或检测窗组成，有些还包括毛细管冷却装置。毛细管进样端距离检测窗的距离称为毛细 管电泳的有效分离长度，毛细管电泳分离分为预电泳、进样、电泳分离三个步骤。预 电泳时毛细管两端和电源阴极与阳极分别插入两个缓冲液池，使毛细管中的物质分布均 匀，并使毛细管温度达到预设值；进样过程中，按待分离物质携带电荷极性不同，电源 阴极端或阳极端和毛细管一端插入样品池，另一端插入缓冲液池，毛细管进样端应该是 距检测窗较远的一端，控制进样电压和进样时间，达到要求的进样量。电泳阶段将电极 和毛细管两端分别插入缓冲液池，开启检测器，样品迁移速度决定了其到达检测窗的时 间，样品带的电量差异使其到达检测窗时间不同，形成随时问变化的电泳信号。 毛细管电泳技术的发展可以上溯到2 0 世纪6 0 年代，h j e r t 6 n 1 3 8 1 首次在3 m m 内径的 玻璃管中进行了电泳分离。m i k k e r s 【3 9 1 等于1 9 7 9 年在内径1 0 0 1 t m 的p t f e 管内进行了高 效电泳分离，1 9 8 3 年正式提出了毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) ， 浙江大学博士学位论文 j o r g e n s o n 和l u c k a 【删首次在内径7 5 p m 的熔融石英毛细管上旌加3 0 k v 电压，进行了氨 基酸电泳分离，成为毛细管电泳发展史上的里程碑。随后毛细管区带电泳与色谱和等电聚 s a m p l e d b u f f e rr e s e r v o 缸 b u f f e rr e s e r v o 廿 f 螗1 5 呻c 够l eo f c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s s a m p l ef l o w e df r o mt h es a m p l er e s e r v o i rt ob u f f e rr e s e r v o i ru n d e rt h ee l e e t r o p h o r e s i s e f f e c to fa p p l i e dv o l t a g e s a m p l ec o m p o n e n t sw i t hd i f f e r e n tc h a r g e so rr e s i s t a n c e sh a v e d i f f e r e n tv e l o c i t i e sa n dr e a c h e da tt h ed e t e c t o r 越v a r yt i m e t h e nt h es a m p l ew 3 s s e p a r a t e d 焦技术结合，分别形成了毛细管胶束电动色谱1 4 1 , 4 2 1 ( m i c e l l a re l e c t r o k i n t i ec a p i l l a r y c h r o m a t o g r a p h y , m e c c ) 和毛细管等电聚焦电泳( c a p i l l a r yi s o e l e e t r i cf o c u s i n g ，c i e f ) 技术 1 4 3 , 4 4 ，1 9 8 7 年，c o h e n 和k a r g e r l 4 5 1 将平板电泳中用的凝胶引入毛细管电泳作为筛分介质， 实现了按分子量对生物大分子进行分离，产生了革命性的毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r yg e l e l e e t r o p h o r e s i s ，c g e ) 技术湖，s l a t e r 和v i o v y 系统建立了凝胶电泳理论的物理模型1 4 9 】， 电泳中的区带展宽 0 0 - 6 4 1 机制逐步清晰，在理论和实际应用中都取得了许多激动人心的重 大进展。高分子溶液替换凝胶作为筛分介质【6 5 嗣后，发展了聚合物分子筛分生物大分子 的交缠溶液理论【6 7 删，计算机模拟技术的发展加速了电泳模型的数值计算检验。无胶筛 分方便了筛分介质的替换，为进样和筛分介质更换的自动化创造了条件。芯片毛细管电 泳是随着微细加工技术的进步发展起来的，1 9 9 0 年，瑞士c i b a - g e i g y 公司的m a n z 等提 出了微全分析系统( m i c r ot o t a la n a l y t i c a ls y s t e m , p 1 a s ) 概念1 7 4 1 ，旨在将整个实验过程集成 化，在一个尽可能小的空间完成，从而降低样品消耗量，提高检测速率，并使一些需要 实时实地完成的实验成为可能。1 9 9 1 会议上发表了用玻璃作基体的电泳芯片的实验装置 1 7 5 , 7 6 j ，标志着芯片毛细管电泳技术的正式诞生。 芯片毛细管电泳1 7 7 - 7 9 1 是指在基板上加工分离微通道，基板材料包括石英玻璃 s o - s 3 l 6 第一章绪论 和p m m a 钳1 ，p d m s l 8 5 1 及s u 8 跖i 等有机聚合物。图1 6 是一种典型的t 型进样结构电 w a s t e r e s e r v i o r s p kr e s f f l n i o r f i g 1 6e l e e t r o p h o r e s i s m i e r o c h a n n e lc h i p s a m p l ew a se l e c t r o p h o r e s l sf r o ms a m p l er e s e r v o i rt ow & s t er e s e r v i o rd u r i n gm j e e t i a a g s a m p l e 如t h es q 删吨c h a n n e lb e t w e e nc h a n n e l1a n dc h a n n e l2w a ss e p a r a t e da t t h ee l e e t r o p h o r e s i ss t a g e d i s t a n c eb c t i v c h a n n e ll a n dc h a n n e l2d e c i d e dt h e s a m p l ev o l u m e 泳微芯片。芯片毛细管电泳相比传统毛细管电泳，散热性能好蜘，由于进样结构i s s , 驯 可以进行设计，所以进样量可以进行优化控制，由初始区带展宽引起的峰值展宽大大降 低，可以应用更高的分离电压，加快了分离速度，改善了分离效果。并且在一块芯片上 可同时制作多个通道p 0 4 1 ，降低实现并行检测的成本，且易于实现自动化，易于与d n a 检测中的样品处理步骤结合 1 0 s j 0 6 ，形成多功能集成化的芯片实验室( l a bo nac h i p ) 【1 0 7 , l o g 。 微通道电泳分离广泛应用于生物大分子分析，包括d n a 突变点检测【1 0 9 1 、d n a 片 段【1 1 与p c r 产物川1 分析、d n a 测序1 1 睁1 0 y l 、蛋白剧习及多肽叫1 分析、单糖、多糖分 析n 1 4 1 、免疫分析n 1 y l ，氨基酸分离1 1 6 1 、细胞分析【1 1 7 1 、s t r 分型i n s 等，领域涉及生物与 临床研究、法医鉴定、环境保护、分析化学和食品检测等。其中报道最多，影响最大的 应用是d n a 测序及片段分析，该技术的进步受益于h g p ，该计划1 9 9 0 年开始实施， 计划1 5 年完成，由于毛细管电泳测序技术的发展，导致提前两年时问完成。k a r g e r 首 先报道了用聚丙烯酰胺凝胶毛细管电泳实现寡核苷酸片段基线分离的实验【1 1 9 1 。随后又 将聚丙烯酰胺凝胶改为线型聚丙烯酰胺( 1 i n e a rp o l y a c r y l a m i d e ，l p a ) 溶液i 埘，解决了不易 更换筛分介质的问题，并提高了毛细管柱的寿命，其它筛分介质还包括p d m a ，p e o ， p v p ，p e g ( e n d - c a p p e d ) ，p o l y ( a a p ) ，羟乙基纤维素( h e c ) 等【1 2 9 1 。1 9 9 2 年提出的毛细 管阵列电泳【”u 使多个样品同时检测，大大提高了测序速度。自此多个研究组开展了毛 细管阵列电泳自动化，仪器化的努力及提高检测灵敏度和速度。m a t h i e s 1 2 1 l ，k a m b a r a 和t k o k a h a s h i m 】，y e u n g 和u e n 0 1 1 2 3 l ，j 、组分别报道了阵列毛细管电泳系统设计，并被开 浙江大学博士学位论文 发为商品化仪器。m a t h i e s p 4 , g s , 9 9 , j 0 1 3 0 2 | 与e h d i c h 【1 0 3 , 1 0 4 , 1 2 4 , 1 2 5 在微芯片阵列毛细管芯片上 进行了d n a 片段电泳分析，芯片进样【1 2 6 1 与分离结构不断进步，发展了“十”字型进样 【1 2 7 1 ，“t ”型进样1 2 8 1 ，双“t ”型进样 1 2 9 1 ，收缩进样【1 3 0 1 3 “，双“l ”型进样【1 3 2 】等结构， 为增加电泳有效长度，分离通道由单一直道发展为弯曲形通道。样品在微通道中的迁移 理论研究得到了持续进步。芯片中通道弯曲对样品区带展宽的影响1 1 3 3 6 1 ，进样条件， 焦耳热1 3 7 1 3 8 1 等对分离效果的影响研究不断深入。芯片通道数不断增加，从8 通道1 9 0 , 9 5 ，9 6 ， 1 2 通道【9 “，1 6 通道【1 0 0 1 ，4 8 通道阮9 2 明，9 6 通道1 9 4 , 9 s ，3 8 4 通道 1 0 1 , 1 0 2 j 直至7 6 8 通道【1 0 3 , 1 0 4 1 。 1 2 微流通道的荧光检测 微通道的检测技术是微流通道技术的一个重要组成部分，主要有质谱法、同位素标 记、化学发光方法、表面等离子共振和激光诱导荧光。其中灵敏度最高，应用最广的是 激光诱导荧光检测。对于并行检测，激光诱导荧光检测可以通过两种途径实现，一是利 用c c d 对受激发的检测区域成像，另一种是对多个检测点进行扫描j 扫描结果由计算 机恢复为图像。对于压力驱动的悬浮式生物芯片，其检测主要通过流式细胞仪，相当于 移动样品的共焦扫描检测。电泳驱动的微通道阵列荧光检测也有两种实现途径，一种是 对多根毛细管进行共焦扫描检测，另一种将所有毛细管同时激发，利用c c d 对毛细管 成像。 1 2 1 基于c c d 的成像式荧光检测 基于c c d 的成像式荧光检测在平板凝胶电泳成像分析中已经成熟应用，也用于平 板式固态生物芯片及微通道电泳系统。如图1 7 所示为固态生物芯片的c c d 成像检测， 一次对整块芯片( m i c r o a r r a ys l i d e ) 成像，或芯片上的一个区域成像，然后将采得的多 幅图像拼接”9 1 。系统采用高亮度氙灯( x e n o nl a r a p ) 或高压汞灯为激发光源，由窄带 激发光滤色片滤色获得单色激发系统，或者对激光采用扩束整形，提高均匀度后照射在 芯片上一个子区域进行激发，也可以加入阵列发生器形成点阵照明进行多点对应激发 【1 删。被照明区域由光学透镜( 1 e n s ) 成像到c c d 上探测荧光信号，光学系统中加入发 射光滤色片以匹配芯片上的荧光染料。当芯片上进行多波长染料标记时，需要切换激发 光滤色片和发射光滤色片。由于c c d 读出噪声和暗电流的限制，系统的检测灵敏度比 p m t 检测系统低，通常采用c c d 制冷，增长曝光时间，像素合并的方法提高系统的信 噪比和检测灵敏度。 第一章绪论 s u e f i 也1 7i u s t r a t i o no f m i c r o a r r a yf l u o r e s c e n c e d e t e c t i o nb a s e d o nc c di m 画n g t h em i e r o a r r a ys n i d ec a r lb ei u m m 破e db yx e n o na l cl a m p s 锄i s s 加f d t e r sa l ei n s e r t e di n t h el i g h tp a t ht os e l e c ts p e c i f i cw a v e l e n g t h sa n de l k n i n a t eb a c k g r o u n d a ni m a g et h a ti s f o c u s e do na t w o - d i m e n s i o n a lc c da r r a yp r o d u c o sap a t t e r n 西c h a r g et h a ti sp r o p o r t i o n a lt o t h et o t a li n t e g r a t e df l u o r e s c e n c ef l u xi n c i d e n to ne a c hp i x e lt b e l m a lc o o l i n go f t h ec c dc s i i i m p r o v ed 积t i o ns e n s i t i v i 【vb vr e d u c i n gt h el e v e lo fc l e c t r o n i cn o k e d n a 测序使用四色染料进行四种碱基( a 、c 、g 、d 的标记【1 4 l 4 2 ，法医d n a 鉴定 试剂盒中，使用四色荧光标记和不同的引物长度来区分不同的基因位点，二者都需要在 检测系统中进行分光。基于c c d 的成像系统【1 2 2 , 1 牡1 4 5 1 由于像敏元为二维阵列，可以同 时获取多通道的多色荧光信息，进行阵列毛细管电泳的检测。图1 8 为a b i 公司推出的 ( a )( b ) f 窀1 8f l u o r e s c e n c ed e t e c t i n go p t i c a ls y s t e mf o r a b i3 1 0 0d n a a n a l y z e r d n a m 穗r a t e d mt h ec a p i l l a r i e sw a sl a b e l e db yf o u rc o l o rf l u o r e s c e n c e 惆w h i c hw e r er a g e dt o b a s e sac ge m dts e p a r a t e l y t h ec a p i l l a r i e sa r r a y sd e t e c t 谵w i n d o ww a si m a g e do nah i g h s e n s i t i v 睁c c dm o n 油o m ec 越- n o r ab y 锄o p t i c _ ls y s t e n xap r i s mw a sp l a c e dht h eo p t k a l s y s t c t nt os 啦t h em u l t i - w a v e l e n g t hf i n o r e n c ek n a g e 沁h i d