（应用化学专业论文）氧负离子自由基诱导枯草杆菌失活过程的研究.pdf

中国科学技术大学预士论文 摘要 氧负离子自由基( 0 一) 是一种具有高活性和高反应性的自由基，在化学和 生物医学等诸多领域拥有广泛的用途前景。最近几年，我们研究发现 1 2 c a o 7 a 1 2 0 3 ( 以下简称c 1 2 a 7 ) 内部笼子里可以贮存氧负离子自由基( o 一) ， 形成c 1 2 a 7 - - o 一材料，在电场增强的热扩散作用下，c 1 2 a 7 一o 一笼中的o 一可以 迁移到材料表面并脱附到气相中，形成高强度的o 一。作为典型的活性氧，氧负 离子自由基具有很高的氧化能力并能够与小分子碳水化合物高反应性能的特点。 但是，关于氧负离子自由基对于微生物细胞的影响却未见报道过。 本论文利用我们开发的氧负离子束源，首次研究了氧负离子自由基对枯草杆 菌细胞失活过程的影响和氧负离子自由基对枯草杆菌细胞结构的影响。获得的主 要结果如下： 1 氧负离子自由基强度对枯草杆菌细胞失活效率的影响我们发现枯草杆 菌的失活曲线由两步构成( 快步骤和慢步骤) ，两步的失活效率都取决于氧负离 子自由基强度。在氧负离子自由基强度为2 3 3n a c m 2 时，经过5 分钟的处理时 间，枯草杆菌细胞从1 0 6c f u m l 减小到1 0 3c f u m l ，3 0 分钟后达到完全失活。 2 去壁枯草杆菌细胞失活过程去壁枯草杆菌细胞的失活曲线的快步骤与 完整枯草杆菌细胞失活曲线的快步骤不同，大约1 分钟去壁枯草杆菌细胞失活曲 线就可以到慢步骤，而完整枯草杆菌需要5 分钟到慢步骤。 3 不同环境条件下氧负离子自由基诱导枯草杆菌细胞失活效率的影响研 究了不同p h 值、温度、气氛、表面积、初始浓度等环境因素下，氧负离子自由 基对枯草杆菌细胞失活效率的影响。 4 氧负离子自由基诱导的枯草杆菌细胞结构的变化利用电子显微镜成像 技术对初始枯草杆菌细胞和氧负离子自由基辐照过的枯草杆菌细胞进行了观察 研究，发现氧负离子自由基可能严重损伤枯草杆菌细胞的细胞壁，导致枯草杆菌 失活，同时简单讨论了枯草杆菌的失活机理。 中国科学技术大学硕士论文 a b s t r a c t a st h ee x t r e m e l yh i g ho x i d a t i o np o w e ra n dr e a c t i v i t y ，a t o m i co x y g e nr a d i c a l a n i o n ( o 一) h a sw i d ep o t e n t i a la p p l i c a t i o n si nm a n yf i e l d ss u c ha sc h e m i s t r ya n d b i o m e d i c i n e i nr e c e n ty e a r s ，i th a sb e e nr e p o r t e dt h a tt h em i c r o p o r o n sc r y s t a lc 1 2 a 7 ( 1 2 c a o 7 a 1 2 0 3 ) c a ne n c a g ea b u n d a n to r a d i c a l s ( c 1 2 a 7h e r ec o u l db ed e f i n e da s c 1 2 a 7 - - o ) w i mf i e l d e n h a n c e dt h e r m o d i f f u s i o n ，t h ee n c a g e do c a nm i g r a t et o t h es m n p l es u r f a c ea n db ee m i t t e di nt h eg a sp h a s e ，w h i c hc o u l df o r mah i g h i n t e n s i t y 0 一f l u x a st h et y p i c a la c t i v eo x y g e nr a d i c a l ，a t o m i co x y g e nr a d i c a la n i o n ( o - ) h a s a ne x t r e m e l yh i g ho x i d a t i o np o w e ra n dh i g h r e a c t i v i t y t o w a r dh y d r o c a r b o n s s m a l l - m o l e c u l e s h o w - e v e r , t oo u rk n o w l e d g e ，l i t t l ei sr e v e a l e dw i t hr e g a r dt ot h eo e f f e c t so nc e l l so fm i c r o o r g a n i s m s as u s t a i n a b l ea n dh i g h p u r i t yo s o u r c ew a sd e v e l o p e db yu s i n gt h ec 1 2 a 7 0 一 a sa no s o u r c e i nt h i ss t u d yw es t u d i e dt h eo e f f e c t so nt h eb a c i l l u ss u b t i l i sm s u b t i l i s ) c e l l s i n a c t i v a t i o na n dt h ec h a n g e so fc e l ls t r u c t u r e sc a u s e db yo f o rt h ef i r s t t i m e o u rs t u d yc o n t a i na sb e l o w ： 1 t h ei n a c t i v a t i o ne f f i e i e n e i e so f 丑s u b t i l i sc e l l sd e p e n do nt h eo - i n t e n s i t y ： w ef o u n dt h a tt h ei n a c t i v a t i o nc u r v ee x h i b i t sb i p h a s i cc u r v e s ( f a s ta n ds l o w p r o c e s s e s ) t h ei n a c t i v a t i o ne f f i c i e n c i e s ，b o t hi nt h ef a s ta n ds l o wp h a s e s ，d e p e n do n t h eo i n t e n s i t y f o rt h ec e l lc o n c e n t r a t i o no f10 6c f u m l ，t h es u r v i v a ln u m b e ro fc e l l s d r o p p e df r o m1 0 6c f u m lt o10 3c f u m ll e v e la f t e ra b o u t5m i n u t ei r r a d i a t i o nb ya nf l u x i n t e n s i t yo o f2 3 3n a c m 2 t h es u r v i v a ln u m b e ro fc e l l sr e a c h e dt on e a r - z e r ol e v e l a f t e ra b o u t3 0m i n u t ee x p o s u r eb ya no f l u xi n t e n s i t yo f2 3 3n a c m 2 = 2 t h ei n a c t i v a t i o no ft h e 且s u b t i l i ss p h e r o p l a s t s ：t h es u r v i v a lc u r v e so fb s u b t i l i ss p h e r o p l a s t si nt h ef a s tp r o c e s s e sa r em u c hd i f f e r e n tf r o mt h o s eo fb s u b t i l i s i n t a c tc e l l s t h es u r v i v a ln u m b e r so fb s u b t i l i ss p h e r o p l a s t sq u i c k l yd e c r e a s e dt ot h e s l o wp h a s e sw i t h i n1m i n u t ew h i l ebs u b t i l i si n t a c tc e l l sr e q u i r ea b o u t5m i n u t e 5 坠里些垫i 鲨堂婴主丝窭 3 t h e0 i n t e n s i t yi n f l u e n c e so nt h ei n a c t i v a t i o n o f 丝j 6 f f 强，c e i i su n d e r d i f f e e n te n v i r o n m e n t ：t h ei n f l u e n c e so ft h eo i n t e n s i t y , t e m p e r a t u r e ，p h v a l u e ， a m b i e n c e ，e x p o s u r ea r e aa n di n i t i a lc e l lp o p u l a t i o no nt h e 丑j “b t i l i si n a c t i v a t i o nw e r e i n v e s t i g a t e d 4 t h ec h a n g e so ft h e 且s u b t i l i sc e l ls t r u c t u r e si n d u c e d b y0 一：w ei n v e s t i g a t e d t i l ei n t a c tb s u b t i t i sc e l l sa n dt h es p h e r o p l a s t sb ye l e c t r o nm i c r o s c o p e t h ee l e c 仕o n m i c r o g r a p h sr e v e a l e dt h a t0 一c a nq u i c k l yr e a c tw i t ht h e 且5 “b t i l i sc e l l sa n ds e r i o u s i v d a m a g et h ec e l lw a l l s ，l e a d i n gt oaf a s ta n di r r e v e r s i b l ei n a c t i v a t i o n 。t h ei n a c t i v a t i o n m e c h a n i s mo f t h e 丑s u b t i l i sc e l l si n d u c e d b yo w a sd i s c u s s e d 6 中国科学技术大学硕士论文 1 1 引言 第一章研究背景与文献综述 我们知道在食品和药品等领域，杀菌是保证食品、药品、医疗材料和设备安 全的个很重要的过程 1 7 。杀菌也就是微生物细胞发生不可逆的失活过程，在 这一过程中一切微生物的营养体、芽孢、孢子都被杀灭。到目前为至杀菌技术得 到了快速发展，经常使用的杀菌技术包括高温高压，化学杀菌剂( 例如过氧化氢， 环氧乙烷，臭氧，氯等) ，辐射杀菌( 例如紫外光，7 射线，电子束和等离子体) 等多种杀菌技术小7 。 活性氧，例如过氧化氢、羟基自由基、单线态氧等是生物化学过程中重要的 化学物种，并且对微生物组织有着重要的影响。众所周知，活性氧可以导致脂质 过氧化、蛋白质失活、d n a 损伤和生物体内的酶失活。由于活性氧的高活性， 所有的细胞组分，例如脂质、蛋白质、核酸和碳水化合物都可能同活性氧反应遭 到严重破坏，从而导致新陈代谢和细胞紊乱甚至细胞死亡。越来越多的证据表明 许多疾病，例如炎症、肺损伤、癌症、衰老等都与活性氧关系密切。另一方面， 活性氧对生物组织并不一定总是有害的。例如，活性氧可以作为基因表达中的信 号传导物种，还可阻破坏肿瘤细胞和组织。作为典型的活性氧，氧负离子自由基 具有很高的氧化能力和与小分子碳水化合物高反应性能的特点，但是，关于氧负 离子自由基对于微生物细胞的影响却没有文献报道过。 枯草杆菌是一种能形成内生孢子的非致病性革兰氏阳性菌，它的营养需求简 单，适宜生长温度较宽。因此，枯草杆菌常常是生物化学和分子生物学研究中理 想的菌种。用紫外辐射、等离子体照射、高静压和化学消毒剂使枯草杆菌失活过 程已经得到广泛研究。下面就关于杀菌技术，活性氧的作用以及枯草杆菌的研究 作一下简单介绍。 中国科学技术大学硕士论文 1 2 杀菌技术综述 1 2 1 高温高压杀菌技术 就像对其他生物一样，环境的温度对微生物也有很大的影响f 8 1 3 1 。事实上， 由于微生物通常是单细胞型生物，它们的温度随周围环境温度的变化而变化，所 以它们对环境温度的变化特别敏感。正因为如此，微生物细胞温度也直接反应了 所处环境的温度。温度通过影响蛋白质、核酸等生物大分子的结构与功能以及细 胞结构如细胞膜的流动性及完整性来影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢。温度 对微生物生长影响的一个决定性因素是微生物酶催化反应对温度的敏感性。在低 温条件范围内，温度升高可加快生长速度，因为酶催化反应与一般的化学反应一 样，反应速度随温度每提高1 0 而加倍，由于细胞内各种反应都加速，整个新 陈代谢活动在较高的温度下更加活跃，微生物生长更快。当温度升高到一定程度 时，继续升温会使生长速度下降，而过高的温度会导致微生物死亡，因为在高温 条件下，微生物酶、运输载体及其他蛋白会发生热变性，细胞脂质双分子层膜在 高温下熔化崩解，从而使细胞受到损害。因此，尽管酶催化反应在高温下进行的 更快，但由于上述原因使细胞受到难以恢复的损伤，导致生长受到抑制。在很低 的温度下，细胞膜会冻结，酶也不能迅速工作。每种微生物只能在一定的温度范 围内生长，低温微生物最高生长温度不超过2 0 ，中温微生物的最高生长低于 4 5 ，而高温微生物能4 5 以上的温度条件下正常生长，某些极端高温微生物 甚至能在1 0 0 以上的温度条件下生长。微生物群体生长、繁殖最快的温度为其 最适生长温度，但它并不等于其发酵的最适温度，也不等于积累某一代谢产物的 最适温度。总之，如果超过了微生物生长的最适宜温度，其功能和细胞结构均会 受到影响；如果温度很低，虽然功能受到影响，但是细胞的化学组分和结构不一 定会影响。 由于温度对微生物生长有利与不利两方面的共同影响，微生物生长具有相当 明显的温度依赖性，有最低、最适和最高生长温度这几个基本温度。尽管微生物 不同或条件不同时生长的温度依赖性曲线会有变化，但最适温度总是更靠近最高 生长温度而不是最低生长温度。 中国科学技术大学硕：i ：论文 当温度超过微生物生长的最高温度时，微生物就可能因为微生物酶变性而导 致死亡，高温杀菌技术就是根据这一点来杀死食品等领域里的有害微生物。目前， 在处理液态食品时广泛使用的是超高温杀菌( u l t r ah i g ht e m p e r a t u r es t e r i l i z a t i o n ， 简称u i - i t s ) 。超高温杀菌是指在温度和时间分别为1 3 5 1 5 0 和2 - - 8s 的条件 下对牛乳、果汁饮料、茶、酒及矿泉水进行处理的一种工艺，其最大优点是既能 杀死产品中的微生物，又能较好地保持食品品质与营养价值。 大多数微生物在陆地或水体表面生活，这些地方大气压为1a r m ，气压对这 些生物没有明显影响。而在占海水水体7 5 的1k m 或更深的深海，那里的渗透 压高达6 0 0 1 1 0 0a r m ，温度为2 3 ，在这种极端环境中，有些细菌能适应并 生存i 1 4 - 2 1i 。但对于大多数微生物来说，当压力高于大气压时，特别是高压时， 就可能影响微生物细胞的渗透平衡，从而导致微生物细胞死亡。 所谓高压杀菌 2 2 2 7 | 是指将食品等放入液体介质中，加1 0 0m p a 1 0 0 0m p a 的压力作用一段时间后，如同加热一样，杀灭食品、药品等中的有害微生物的过 程。高压灭菌通常认为蛋白质在高压下立体结构( 四级结构) 崩溃而发生变性而 使细菌失活，但也有人认为凡是以较弱的结合构成的生物高分子物质如核酸、多 糖类、脂肪等物质或细胞膜都会受到超高压的影响，尤其通过剪切力而使生物体 膜破裂，从而使生物体的生命活动受到影响甚至停止，这就可以达到杀菌、杀虫 的效果。高压灭菌避免了热处理而出现的影响食品、药品等品质的各种弊端，保 持了食品、药品的原有风味、色泽和营养价值。由于是液体介质的瞬间压缩过程， 灭菌均匀，无污染，操作安全，且较加热法耗能低，减少环境污染。励建荣等研 究了经高压处理后的果汁和蔬菜汁，实验证实了高压处理后能达到杀菌效果，而 且维生素c 损失很少，残存酶的活性只有4 ，色香味等感官指标不变，其综合 效果优于热力杀菌：动物食品也能达到杀菌效果2 8 1 。目前，国外已将其用于肉、 蛋、蛋白、水果、香料、牛奶、果汁、矿泉水、啤酒等物品的加工中 2 9 1 。我国 在该技术的开发应用方面仅仅处于实验室研究阶段一淌未有批量生产的报道。 1 2 2 化学杀菌 化学杀菌剂是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒杀菌的方法。能 中国科学技术大学硕= b 论文 破坏细菌的代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂，如重金属离子等，只是 抑制细菌代谢机能，使细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂，如磺胺类及大多数抗 生素等。化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学药品浓 度的高低，处理微生物的种类以及微生物所处的环境等有关。 常用化学杀菌剂的应用范围和浓度见表1 3 0 】。 表1 常用化学杀菌剂应用范围和常用浓度表 消毒与杀菌不仅是从事微生物学和整个生命科学研究必不可少的重要环节 中国科学技术大学硕：l ：论文 和使用技术，而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要 的应用价值。可根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌方法。 1 2 3 辐射杀菌技术 我们生活的这个世界充斥着各种各样的电磁辐射，辐射就像水面上的波浪一 样以波的形式在空中转播，邻近波峰或波谷的距离称为波长。当波长减小，辐射 的能量增加，y 射线和x 射线比可见光和红外线具有更高的能量。电磁辐射还像 一股由光子组成的能量流，每个光子都具有一定能量，能量的高低取决于辐射的 波长。 阳光是地球上各种辐射的主要来源，包括可见光、紫外线、红外线和无线电 波。可见光是我们周围环境中最常见和最重要的一种，所有生命都依赖于光合生 物从阳光获得的能量。太阳辐射有6 0 在红外区，而不是在可见光部分，红外 线是地球热量的重要来源。在海平面高度，只能探测到很少的波长在2 9 0 3 0 0 m 的紫外辐射，波长低于2 8 7n m 的紫外辐射被大气中的氧吸收，从而在地表上 空2 5 3 0k m 处形成臭氧层，臭氧层吸收部分波长较长的紫外线并释放0 2 ，因 为紫外辐射对生物有很强的负作用，臭氧层对紫外辐射的消除对地球上的生命有 至关重要的作用。由于阳光中各种波长的光在可见光范围均匀分布，所以阳光基 本为“自”色。 许多电磁辐射对微生物非常有害，特别是短波长、高能量的电离辐射，会导 致原子失去电子而发生电离。有两种主要的电离辐射，一种是人工产生的x 射 线，一种是放射线同位素衰变过程中发出的y 射线。低剂量电离辐射会使细胞产 生突变并可能导致死亡，而高剂量电离辐射则直接具有致死效应。尽管微生物比 大型生物更耐受电离辐射，但在辐射剂量足够高的情况下，微生物也会被杀死。 电离辐射可用来消毒，但某些细菌如耐放射异常球菌和细菌芽孢能在大剂量电离 辐射条件下保持存活。 。 电离辐射会使细胞发生很多变化，可破坏氢键，氧化双键，破坏环状结构， 并使某些分子发生聚合。氧可以增加这些效应，可能是由于羟基自由基( o h ) 的产生。尽管有很多细胞组分受到影响，d n a 被破坏是导致死亡的最重要原因 r 3 1 4 7 j 。 中国科学技术大学硕士论文 由于波长短( 1 0 4 0 0r i m ) 且能量高，紫外辐射( u l t r a v i o l e tr a d i a t i o n ) 能杀 死各种微生物。致死能力最强的紫外辐射的波长为2 6 0f f f n ，最容易被d n a 吸收， 导致d n a 一条单链上相邻两个胸腺嘧啶形成二聚体，从而抑制d n a 复制及其 功能。但这种损伤可以通过一些途径得以修复。在光复活作用中，一种光复活酶 利用蓝光，使胸腺嘧啶二聚体分开：在暗复活作用中，含有胸腺嘧啶二聚体的一 小段d n a 被切除并替换成正常的d n a 片断。损伤也能被重组修复和s o d 修复 系统中的r e c a 蛋自修复。若紫外线剂量太大，造成的损伤过于严重，则不可能 被修复 4 8 5 2 1 。 虽然低于2 9 0 3 0 0n n l 的紫外射线不能到达地球的表面，但是波长在3 2 5 4 0 0n m 范围的近紫外辐射也能损伤微生物，使色氨酸被降解成有害的光产物 ( p h o t o p r o d u c t ) ，这些产物与近紫外辐射共同作用，使d n a 断裂，这种作用的 具体机制与2 6 0n m 紫外线作用机制不同，但目前尚未了解清楚。 可见光是光合作用的能量来源，对生物有益，但过强的可见光也可损伤或杀 死微生物细胞，通常情况下，一种称为光敏剂( p h o t o s e n s i t i z e r ) 的色素和氧参与 这一过程。微生物都具有色素，如叶绿素、细胞色素和黄素，它们能吸收光能而 被激活作为光敏剂，激活的光敏剂( p ) 能将能量传递给0 2 产生单线态氧( s i n g l e t o x y g e n ) ： p 鸟p ( n n n ) p ( 激活态) + 0 2 1 0 2 ( 单线态氧) 单线态氧是反应性非常强的强氧化剂，能迅速破坏细胞，也是吞噬细胞消灭 被吞入细菌的主要因素。 许多空中或生活在暴露于空气中的物体表面的微生物利用类胡萝h 素来防 止光氧化作用，类胡萝h 素能有效地猝灭单线态氧，吸收单线态氧的能量并使其 转变成非活化的基态。光合微生物和非光合微生物都利用色素来达到这样的目 的。 ” 食品辐射源大致可分为3 种：v 射线、x 射线及电子束。辐射时能量以电磁 波的形式透过物体，当物质中的分子吸收辐射能时，会激活成离子或自由基，故 辐射又称为物质的离子化。此时会引起化学键破裂，使物质内部结构发生变化， 最重要的是，遗传物质d n a 会因化学键裂解而失去复制能力。在细菌细胞中， 中国科学技术大学预= 匕论文 d n a 的任何微小变化都会损毁整个细胞体，影响其正常功能。虽然1 g y 的辐射 剂量所引起的化学键破裂还不到整个的千万之一，但这足抑制破坏许多有害细 菌。所以，辐射处理是通过损害细胞内遗传物质而有效地阻止它们继续生存的生 物过程，从而实现了杀虫、灭菌、抑制生长发育和新陈代谢。辐射杀菌几乎不能 产生热量，可保持食品在感官和品质方面的特性，并适合对冷冻状态的食品进行 杀菌处理。与传统的加热法相比更易于准确控制，且耗能低。世界卫生组织已将 辐射法纳为安全有效的食品处理方法并制定相应的标准。 辐射杀菌已在许多国家得到政府的认可并批准使用。在西欧国家运用辐射法 对鸡肉、对虾和青蛙腿灭菌；同时辐射法也广泛应用于各种调料的消毒。美国已 用在草莓、葡萄、西红柿、鸡肉等方法，受到公众的普通接受。在我国已对稻谷、 小麦、玉米、蔬菜、水果、鱼肉辐射保藏技术取得成效，日益显示出广阔的前景， 但总的来说辐照法在我国食品工业的运用起步时间较晚，人们对它的作用和优点 还不清楚，应加大这方面投入和研究，使之赶上国际先进水平 5 3 1 。 1 3 活性氧种类及其作用 1 3 1 氧浓度对微生物的影响 能在有氧条件下生长的微生物称为好氧菌( a e r o b e ) ，能在无氧条件下生长 的称为厌氧菌( a n a e r o b e ) 。几乎所有的多细胞生物都必须在有氧条件下生长， 称为专性好氧生物。在好氧菌的呼吸过程中，氧作为电子传递链最终电子受体。 另外，好氧真核生物利用氧合成甾醇和不饱和脂肪酸。兼性厌氧菌( f a c u l t a t i v e a n a e r o b e ) 不需氧可以生长，而在有氧条件下生长更好。在有氧条件下，它们进 行好氧呼吸。像粪肠球菌等耐氧厌氧菌在有氧和无氧条件下生长状况相同。相反， 拟杆菌、梭杆菌、巴氏梭菌及甲烷球菌等专性厌氧菌( o b l i g a t ea n a e r o b e ) 完全不 = _ _ 耐氧，有氧时就死亡。耐氧及专性厌氧菌不通过呼吸产生能量，而是通过发酵或 厌氧呼吸途径获得能量。最后，有少数好氧菌如弯曲杆菌被称为微好氧菌 ( m i c r o a e r o p h i l e ) ，在正常大气0 2 水平( 2 0 ) 条件下不能生长，而需要在2 1 0 的低氧浓度条件下生长 5 4 5 6 1 。微生物与氧之间关系可以简单实验加以确 定，将微生物接入装有固体培养基或巯基乙酸培养基( t h i o l y c o l l a t eb r o t h ) 的试 中国科学技术大学硕士论文 管中，巯基乙酸是还原剂，可降低培养基中氧含量。经培养后，根据微生物培养 基中生长位置，可判断其与氧之间的关系。 同一类型微生物与氧的关系可能有多种类型，细菌和原生动物同时存在上述 几种类型，真菌一般为好氧菌，其中少数种类( 特别是酵母菌) 为兼性厌氧菌， 而藻类几乎都是专性好氧生物。值得注意的是，在好氧和厌氧环境中均能生长的 能力使微生物具有相当大的灵活性，并且是一种生态优势。 尽管专性厌氧菌会被氧杀死，但在有氧环境中仍可分离到它们，这是因为它 们一般与兼性厌氧菌混杂在超，后者消耗环境中可利用的氧，为专性厌氧菌造 成一个局部厌氧环境。例如，在口腔中生活的专性厌氧菌牙龈卟啉单胞菌 ( b a c t e r o i d e sg i n g i v a l i s ) 可在厌氧的牙周裂隙中生长。 微生物与氧之间关系的差别是由多种因素决定的，包括蛋白质在有氧条件下 失活以及氧对微生物的毒害作用。巯基等敏感基团被氧化可造成酶失活，例如固 氮酶对氧非常敏感。 因为氧原子外周的两个电子没有配对，所以它很容易接受电子并被还原。黄 素蛋白和一些其他细胞组分及辐射都可以促进氧的还原作用，形成超氧化物自由 基( s u p e r o x i d er a d i c a l ) 、过氧化氢( h y d r o g e np e r o x i d e ) 和羟基( h y d r o x y lr a d i c a l ) 等还原物： 0 2 + e - 一0 2 ( 超氧化物自由基) 0 2 一+ e 一+ 2 h + 一h 2 0 2 ( 过氧化氢) h 2 0 2 + e 一+ h + h 2 0 + o h ( 羟基) 这些还原产物是极其有毒的，因为它们是强氧化剂，能迅速破坏细胞组分。 一个微生物必须具有防御这些氧还原产物的能力才能免于被杀死。 许多微生物具有一些酶来对抗有毒的氧还原产物，专性好氧菌和兼性厌氧菌 通常具有超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，他们分别催化超氧化物自由基和过氧化 氢的破坏。过氧化物酶也能用来破坏过氧化氢。 2 0 2 一+ 2 h + 里里! 0 2 + h 2 0 2 2 h 2 0 2j 塑型骂2 h 2 0 + 0 2 h 2 0 2 + n a d h+ h + j 塑些骂2 h 2 0 + n a d + ( n a d h 、n a d + 分别为 中国科学技术大学硕士论文 烟酰胺腺瞟呤二核苷酸的还原型和氧化型) 。 耐氧型微生物缺乏过氧化氢酶但具有s o d ( 超氧化物歧化酶) ，而耐氧性的 植物乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ) 以m n 2 + 代替s o d 来分解超氧化物自由基。 所有专性厌氧菌都缺乏上述两种酶，或其含量太低，因而缺乏耐氧能力。 活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 是由氧直接或间接转变的氧自由基 及其衍生物，它们包括氧的单电子反应产物0 2 一、h 0 2 一、h 2 0 2 、o h 及其衍生 物1 0 2 和笫二章所述的o 一以及膜质过氧化中间产物l o ：l o o ：l o o h 等比分子 氧活泼的物质 5 7 6 3 1 。生物体内活性氧的生成与清除处于动态平衡状态，当各种 因素打破这一平衡而导致活性氧浓度超过生理限度时就会损伤生物大分子。目 前，活性氧对生物大分子的氧化损伤是自由基生物学与自由基医学的前沿研究领 域。 1 3 2 活性氧生成体系及生物体内的自由基反应 1 3 2 1 活性氧生成体系 活性氧生成体系有许多种，以体内和体外来划分的体外因素有紫外线、高能 电离辐射、吸收臭氧等，体内有线粒体的电子传递、微粒体细胞色素p 一4 5 0 氧 化、一些酶促反应及吞噬细胞的吸收爆发等。 1 3 2 2 生物体内的自由基反应 活性氧自由基有两个特性，一是非常活泼、一旦产生就立即和别的物质进行 反应，因此有人称为为瞬时中间体：二是链锁反应，分为3 个阶段：触发阶段、 扩增阶段和终止阶段。触发阶段就是产生最初自由基的阶段，扩增阶段即极活泼 的自由基一旦产生就立即和周围的物质进行反应，本身消失又产生出新的活性更 强的自由基。一般有4 种类型的反应：抽取氢的反应、加成反应、取代反应和裂 解反应。所谓终止阶段，就是反应反复循环若干次而不断扩增，产生大量自由基， 这些自由基最后以自由基之间的作用生成稳定的化合物，它分为偶联终止和歧化 终止两类，其中偶联终止在生物体内占重要地位，许多蛋白质的交联、失活等都 中国科学技术大学硕= l 论文 属于这种反应类型。 1 3 3 活性氧对生物大分子的损伤作用 1 3 3 1 活性氧对蛋白质的损伤作用 1 功能降低或丧失：酶区别于其他蛋白质的显著特征是它具有催化功能，经 活性氧损伤后的酶活性降低或丧失，其机理有下几点6 4 1 ： ( 1 ) 同一活性氧体系作用于不同酶其失活机理不同，如抗坏血酸- - f e ”所 致磷酸葡萄糖变位酶失活，与酶分子中磷的丢失有关，而磷酸甘油酸变位酶的失 活则没有磷的丢失。 ( 2 ) 不同活性氧体系所致同一种酶的失活机理也不同，如h 2 0 2 所致铜锌超 氧化物歧化酶失活与酶分子中c u ”还原为c u + 有关，而抗坏血酸- - f e ”所致该酶 的失活与酶分子中的c u ”的丢失有关。 ( 3 ) 活性氧所致蛋白质损伤中，过渡态金属离子f e ”或f e ”和c u ”等发挥 着重要作用。另外，经活性氧氧化后蛋白质的免疫学性质也发生改变，目前其机 理尚不清楚，可能与其构象改变或疏水性增强有关。 2 结构变化：活性氧可引起蛋白质肽键断裂，断裂方式有两种，一种是肽 键水解，另一种是c 【一碳原子处直接断裂肽键的水解常发生在脯氨酸处，其机制 为活性氧攻击脯氨酸使之引入羰基而生成旺一吡咯烷酮，经水解与其相邻氨基酸 之间断开，a 一毗咯烷酮成为新的n 一末端，它可进一步水解成谷氨酰胺，肽链 的直接断裂方式是活性氧攻击c l 一碳原子生成q 一碳过氧自由基。同时，蛋白质 分子中半胱氨酸的- - s h 可被氧化形成二硫键，酪氨酸可被氧化形成二酪氨酸， 这样可造成蛋白质交联。交联有两种方式，即分子内交联和分子间交联。对于某 一种蛋白质而言究竟以哪种形式交联取决于其分子中半胱氨酸和酪氨酸的数目， 并且活性氧作用于蛋白质导致其分子中碱性氨基酸( 组氨酸、精氨酸、赖氨酸) 含量降低，而酸性氨基酸( 谷氨酸、天冬氨酸) 含量增多，使酶分子中正电荷减 少而负电荷增多 6 5 l ，因此，氧化型蛋白质的等电点往往下降。另外，活性氧对 蛋白质的氧化损伤还涉及到其高级结构，例如h 2 0 2 氧化后铜锌超氧化物歧化酶 中无规则卷曲的含量增加，p 折叠含量减少 6 5 1 。 中国科学技术大学硕士论文 1 3 3 2 活性氧对d n a 的氧化损伤 活性氧可以与碱基发生加成反应，形成异化的自由基，破坏碱基之间的氢键 和层堆积力，这两种力量使维系d n a 双螺旋结构的主要力量，它的损伤无异会 导致d n a 立体构象的改变，改变d n a 聚合酶、r n a 聚合酶等酶的可识别性， 产生严重后果。活性氧还可以从d n a 链上的戊糖上夺走氢原子，使之在c 4 位 上形成自由基，然后，该自由基再在6 位断链，直接破坏d n a 链。此外，由活 性氧作用于膜脂，产生丙二醛等，可扩散的醛类使富含游离氨基的组蛋白交联， 而d n a 的高级结构和组蛋白含量、位置息息相关，它们的交联改变了核酸的构 象。 1 3 3 3 活性氧对糖类的氧化作用 糖类也是生物体内不可缺少的物质，透明质酸使生物体内分布最广的一种酸 性粘多糖，存在于结缔组织的基质中，是填充于细胞间的粘稠物质，具有将细胞 粘合起来，以保护组织不受细菌等微生物侵入的功能，而自由基特别是羟自由基 使透明质酸降解，失去粘性，造成细菌的侵入和感染的扩散。 1 3 3 4 脂质过氧化 脂质使生物体内各组织的重要组成部分，自由基往往首先作用步饱和脂肪酸 的一亚甲基碳，使之脱去烯丙基氢而形成自由基，它在有氧的条件下，生成氢 过氧化物，在金属离子的催化下易分解生成两个新自由基，起动了自由基的分支 的链锁反应，此过程即为脂质过氧化，例如铁介导的脂质过氧化机理【6 6 1 如下： 当已存在的脂质过氧化物l o o h 浓度低时，主要时通过f e n t o n 反应产生的o h 参与形成新的l o o h ，即o h 攻击不饱和脂肪酸l h 中烯丙基的c h 键，抽提 其氢原子形成脂烷自由基l ：该脂烷自由基可以快速与分予氧结合生成脂过氧自 由基l o o ：之后l o o 。再通过抽提其它l h 中的烯丙基可以快速以l o o h 的形式 释放出来，同时另一个脂烷自由基l 也已形成，次步生成的脂烷自由基l 继续 启动链式过氧化过程m i n o t t i 把次过程称为脂质过氧化的l o o h 无关引发 6 7 1 。 当已存在的l o o h 十分丰富时，将发生l o o h 相关引发过程，即丰富的l o o h 中国科学技术大学硕士论文 被f e 2 一所分解，生成高反应活性的烷自由基l o ；该自由基象- o h 一样抽提l h 中的烯丙基的氢原子形成l ：启动新的链锁反应。 1 4 活性氧对生物大分子的损伤作用与某些疾病的关系 自由基可以引起蛋白质变性及交联性改变，甚至导致某些异常蛋白质的出 现，而蛋白质或酶不仅是生物体的重要组成成分，而且在生命活动中还担负着许 多重要功能，活性氧对损伤势必会引发或加重某些疾病研究已经证实衰老、恶性 肿瘤、动脉粥样化、糖尿病、某些自身免疫性疾病、放射病、肺气肿、白内障等 许多疾病与活性氧所致蛋白质的氧化损伤有关。同时，自由基引起的d n a 的 氧化与交联，使核酸变性，结果导致d n a 发生突变，对热的稳定性改变、单链 断裂等，从而影响了它们传递信息的功能以及转录与复制的特性，导致蛋白质的 合成能力下降和合成差错。而当蛋白质的合成能力下降时，可引起记忆力减退、 智力障碍、肌肉收缩和艾滋病等。蛋白质的合成差错，可引起多种生物酶的减 少和失活，或虽有活性但遇热不稳定：尤其是r n a 或统管信息的酶合成差错的 进行性积累，会影响蛋白质合成的准确性，甚至危及整个机体的蛋白质合成。自 由基还可以对细胞外的多糖高分子聚合物及其它可溶性成分发生比较明显的氧 化损伤作用。同时还可以引起脂质过氧化作用的发生，导致对生物膜( 包括细胞 膜、线粒体、微粒体、溶酶体膜等1 、小动脉和中枢神经系统的损伤。活性氧对 生物大分子的氧化损伤随着自由基生物学与自由基医学的发展受到广泛重视，取 得了可喜进展。在这一领域进行深入研究不仅有助于认识许多疾病的发生发展过 程，同时对于抗氧化研究还具有理论指导意义。 1 5 枯草杆菌的特性与失活研究 枯草杆菌是典型的革兰氏阳性菌，它的营养条件简单，适宜生长温度较宽。 枯草杆菌是非致病菌，不容易感染人类，同时枯草杆菌在一定的条件下，例如热、 营养缺乏、氧化等不利的环境条件下，容易形成内生孢子，来抵抗外界不利的环 境因素。因此，枯草杆菌是生物化学、基因学和分子遗传学中常用的菌种。由于 中国科学技术大学硕士论文 枯草杆菌容易培养和非致病性，既可以在实验中进行实验，又能够进行大规模杀 菌实验。 在食品、药品、废水处理等领域，用枯草杆菌作为实验菌种非常普遍，有关 枯草杆菌及其芽孢失活自目研究也相当活跃。例如用臭氧、氯、高压、辐射等方法 诱导枯草杆菌失活的研究就有很多 6 8 。7 5 】，在这里就不详细赘述了。正是因为这 种原因，本研究选用了枯草杆菌作为实验菌种，进行了有关典型的活性氧的物种 一氧负离子自由基诱导枯草杆菌的实验。 1 6 本论文开展的工作 本论文主要利用我们开发的c 1 2 a 7 0 一材料，作为发射高强度氧负离子( o 一) 的束源来研究氧负离子自由基对微生物细胞的影响，重点研究了氧负离子自 由基对枯草杆菌细胞的影响，包括失活效率和失活过程的影响；研究并探讨了 不同环境条件下氧负离子自出基诱导枯草杆菌细胞失活效率的影响：研究并探讨 了氧负离子自由基诱导的枯草杆菌细胞结构的变化和失活的机理。 9 中国科学技术大学硕士论文 参考文献 1 】j c y u ，h yt a n g ，j ，g y u ，h c c h a n ，l z z h a n g ，yd x i e ，h w a n g ，s p w o n g p h o t o c h e m a n d p h o t o b i o 爿：c h e m i s t r y1 5 3 ( 7 0 0 2 ) 2 11 - 2 1 9 2 3 3 4 】 5 】 6 7 r b u c h a l l a ，c s c h u t t l e r , k wb 0 9 1 r a d i a t p 枷c h e m4 6 ( 1 9 9 5 ) 5 7 9 5 8 5 w b h u g o i n t e r n a t i o n a lb i o d e t e r i o r a t i o n b i o d e g r a d a t i o n 3 6 ( 1 9 9 5 ) 1 9 7 2 1 7 t c h a u ，kc k a o ，g b l a n k ，f m a d r i d 1 9 9 6 b i o m a t e r i a l s1 7 ( 1 9 9 6 ) 1 2 7 3 一1 2 7 7 gw g o u l d n t f o o d m i c r o b i o l o g y 3 3 ( 1 9 9 6 ) 5 1 - 6 4 m m o i s a n ，j b a r b e a u ，s m o r e a u ，j p e l l e t i e r ，m t a b r i z i a n ，l h m i a i n t ，j p h a r m a c e u t i c s 2 2 6 ( 2 0 0 1 ) i 一2 1 ， c wb r u c h 1 9 7 3 f a c t o r sd e t e r m i n i n gc h o i c eo f s t e r i l i z a t i o np r o c e d u r e i n d u s t r i a ls t e r i l i z a t i o n ，2 n de d i ( e d u b yg b p h i l l i p s & ws m i l l e r , d u k e u n i v e r s i t yp r e s s ，19 7 3 ) m w w a d a m s a n n u r e v m i c r o b i 0 1 4 7 ( 1 9 9 3 ) 4 4 7 4 5 3 p b l o u n t ，p c m o e t r e n d sm i c r o b i o l7 ( 1 9 9 9 ) 4 2 0 4 2 4 a d b r o w n b a c t e r i ar e v 1 9 7 6 ，4 0 ( 4 ) 8 0 3 8 4 6 j c g o t t s c h a l ，ra p r i n s t r e n d se c 0 1 e v o l1 9 9 1 ，6 ( 5 ) 1 5 7 - 1 6 2 r m k e l l y , m w w a d a m s a n t o n i ev a