（应用化学专业论文）天然抗氧剂改性及应用研究.pdf

摘要 摘要 本课题主要研究了黄酮化合物葡甲胺盐的制备，结构分析，溶解度实验，清除自由 基性能及对酪氨酸酶的抑制作用研究。 采用溶剂热回流法成功制备了水飞蓟宾、甘草素、异甘草素、槲皮素、芦丁、大豆 黄素、葛根素的葡甲胺盐，通过紫外分光光度法叫v ) 、差示扫描量热法( d s c ) 鉴定，推断， 黄酮化合物分子上的酸性酚羟基与葡甲胺上的胺基成盐形成黄酮葡甲胺，有别于原料与 葡甲胺的简单混合。黄酮葡甲胺盐在溶液中容易解离成黄酮与葡甲胺，黄酮的物理、化 学性质没有改变。d s c 曲线可以作为黄酮葡甲胺质量的一种参考标准。 采用标准曲线法测定了黄酮葡甲胺盐在2 5 的溶解度，发现能与葡甲胺成盐的黄酮 化合物比自身的溶解性能有明显提高，水溶性很好。 采用三种分光光度法，测定了黄酮葡甲胺盐对羟自由基( o h ) 和超氧自由基( 0 2 - ) 的 清除作用，结果表明，黄酮葡甲胺盐基本上不改变黄酮化合物自身具有的良好的清除自 由基能力，且对部分金属离子具有很好的络合作用。由于黄酮化合物在碱性条件下可能 产生自氧化作用，研究黄酮化合物对超氧自由基的清除能力采用邻苯三酚自氧化法产生 超氧自由基模型是不妥的。 采用水作溶剂，酪氨酸为底物的抑制体系研究了黄酮葡甲胺对酪氨酸酶活力的抑制 作用，可以有效避丌丙二醇等溶剂的影响。结果表明，黄酮葡甲胺对酪氨酸酶的活力具 有良好的抑制作用，在相同浓度下，芦丁、葛根素、甘草素、异甘草素的葡甲胺盐的最 高抑制率低于熊果苷；槲皮素、大豆黄素、水飞蓟宾葡甲胺盐的最高抑制率强于熊果苷。 尤其是水飞蓟宾葡甲胺在相同浓度下具有最高的抑制率，说明其是一种比较理想的美白 添加剂，可以在化妆品中广泛应用。 关键词：黄酮、葡甲胺、水飞蓟宾、自由基、酪氨酸酶 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ep r e p a r a t i o no ff l a v o n o i d - n - m e g l u m i n es a l t s ，t h e s t r u c t u r e s ，t h es o l u b i l i t y ，t h e s c a v e n g i n ge f f e c t so nf r e er a d i c a l sa n di n h i b i t o no nt y r o s i n a s ew e r ep r i m a r i l ys t u d i e di n t h i s t h e s i s t h em e g l u m i n es a l t so fs e v e ns e l e c t e df l a v o n o i d s ( s i l y b i n ，l i q u i r i t i g e n i n ，i s o l i q u i r i t i g e n i n ， q u e r c e t i n ，r u t i n ，d a i d z e i na n dp u e r a r i n ) h a sb e e np r e p a r a t e db ys o l v e n t - h e a t i n gr e c i r c u l a t i o n m e t h o d t h e i rs t r u c t u r e sw e r es t u d i e db yu v ，d s c i tw a ss h o w nt h a tf l a v o n o i d n - m e g l u m i n e e x i s t si nf o r mo fs a l t s ，w h i c hi sd i f f e r e n tf r o ms i m p l em i x t u r e b e c a u s eo fa c i d i ch y d r o x y b e n z e n eo ff l a v o n o i d sm o l e c u l ec o m b i n ew i t hb a s i ca m i d oo fm e g l u m i n e f l a v o n o i d - n m e g l u m i n e c a nb ee a s i l yd e c o m p o s e di n t of l a v o n o i da n dm e g l u m i n ei ns o l u t i o n s ，a n dt h ep r o p e r t i e so f f l a v o n o i dw e r en o tc h a n g e d t h e r e f o r e ，t h ed s cc u r v ec a nb eu s e dar e f e r e n c eb a s i st o e v a l u a t et h eq u a l i t yo f f l a v o n o i d n m e g l u m i n e t h ee q u i l i b r i u ms o l u b i l i 够o ff l a v o n o i d - n - m e g l u m i n ei nw a t e ra t2 5 w e r em e a s u r e db y s t a n d a r dc u r v em e t h o d i ts h o w st h a tt h es o l u b i l i t yo ff l a v o n o i d si nw a t e rc a nb ei m p r o v e d s i g n i f i c a n t l yv i af l a v o n o i d s - n m e g l u m i n ea n dt h e i rw a t e r - s o l u b i l i t ya r ev e r yg o o d t h es c a v e n g i n ge f f e c t so nh y d r o x y lf r e er a d i c a l ( o h ) a n ds u p e r o x i d ea n i o nf r e e r a d i c a l ( 0 2 。) o ff l a v o n o i d n m e g l u m i n ew e r ed e t e r m i n e db yu s i n gt h r e ep h o t o m e t r i c m e t h o d s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tf l a v o n o i d - n m e g l u m i n eb a s i c a l l yd on o tc h a n g eg o o d c a p a c i t yo ns c a v e n g i n g 。o hf r e er a d i c a la n d0 2 f r e er a d i c a lw h i c hf l a v o n o i do n e s e l fo w n s a n dt h e yc a nc h e l a t e ds o m em e t a li o n s s t u d y i n gt h es c a v e n g i n ge f f e c t so ns u p e r o x i d ea n i o n f r e er a d i c a l ( 0 2 ) o ff l a v o n o i db ym o d e lo f p y o r g a l l o la u t o x i d a t i o nm e t h o di sn o tv e r ys u i t a b l e b e c a u s eo ff l a v o n o i d sb el i k e yt oh a v es e l f - o x i d a t i o ni na l k a l ic o n d i t i o n ， t h ei n h i b i t o no ff l a v o n o i d - n m e g l u m i n eo nt y r o s i n a s ew a ss t u d i e d ，u s i n gl - t y r o s i n ea s s u b s t r a t e ，w a t e ra ss o l v e n t ，a v o i d i n gt h ee f f e c to fp r o p y l e n eg l y c 0 1 t h er e s u l t ss h o w e dt h a t f l a v o n o i d n m e g l u m i n eh a v eag o o di n h i b i t o no nt y r o s i n a s e i nt h es a m ec o n c e n t r a t i o n ，t h e u p m o s ti n h i b i t o no fm e g l u m i n es a l t so fr u t i n ，p u e r a r i n ，l i q u i f i t i g e n i na n di s o l i q u i r i t i g e n i na r e l o w e rt h a na r b u t i n ，b u tm e g l u m i n es a l t so fq u e r c e t i n ，d a i d z e i na n ds i l y b i na r eh i g h e rt h a n a r b u t i n 。e s p e c i a l l y ，s i l y b i n - n m e g l u m i n eh a st h eh i g h e s ti n h i b i t o n ，s h o w si tc a nb eu s e di n c o s m e t i c sa b r o a d l ya sap e r f e c tn a t u r a ls a f es k i n l i g h t e n i n ga d d i t i v e k e yw o r d s ：f l a v o n o i d ；m e g l u m i n e ；s i l y b i n ；f r e er a d i c a l ；t y r o s i n a s e i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 日 期： 伊譬7 g 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，- j - 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：丛尘王神挠玉竺 日 期： 趁盈壹二2 目蛰旦 第一章综述 第一章综述 人们对于美总是趋之若骛，因此化妆品行业是永不衰退的行业。当今世界化妆品发 展的新趋势是绿色、环保、安全、功效。目前同本天然化妆品已占整个化妆品市场的6 0 以上，欧美市场上含天然物质的化妆品也占到5 0 。在过去的几年罩，中国的化妆品 市场平均每年以1 5 左右的速度快速递增，随着经济的增长和人民生活水平的提高，化 妆品消费也将继续快速增长，因此我国的化妆品消费市场具有巨大的上升空间。顺应世 界化妆品的发展潮流，天然安全的功能型化妆品也将成为我国化妆品的发展主题1 1 】【2 】。 功能性化妆品己被证实能有效抗氧化、增强细胞新陈代谢、保湿、嫩化皮肤、祛斑、 防晒等功效，而且极其安全无副作用。这些物质的研制、生产及其应用研究采用了许多 高新技术，如医学、生物工程学等。因此，现代化妆品己不再是简单的轻工业和精细化 工产品，而是兼容了生理学、医学、药学、生物工程学的科技成果。现代功能性化妆品 的出现标志着化妆品已进入一个全新的时代，预示了化妆品行业具有更加广阔的市场前 景l 引。 人的皮肤因氧化、紫外线的照射会变得老化，出现色素沉着、粗糙、发皱等现象， 皮肤老化的重要原因之一是自由基的作用。皮肤在衰老过程中不断地产生着自由基，如 果能及时清除这些自由基或抑制这些自由基的产生，那么就能减缓皮肤的衰老，保持皮 肤的光泽。在化妆品中，适量地添加抗氧化剂，如s o d 、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化 酶、维生素e 和维生素c 等，可以补充皮肤内这些物质的不足，使皮肤永葆青春的光泽， 抵抗衰老1 4 】。随着中老年人口的快速递增，皮肤老化现象也越来越普遍。因此，皮肤的 老化作为人类衰老的一种外部特征和表现已经成为美容界关注的焦点，延缓皮肤老化的 研究仍是人类社会永恒的主题之一，也是世界化妆品发展潮流中的主流之一【5 】。 人类皮肤的颜色与皮肤中存在的色素的种类和数量有关，黑色素对皮肤颜色影响最 大。东方人希望通过美白护肤品的使用而得到白晰、光洁的皮肤，而欧美消费者主要利 用功能性美白化妆品来减轻和消除老年斑、黄褐斑等色素沉积。利用中草药、生物制剂 等丌发能抑制酪氨酸酶的活性，防止黑色素形成，安全而有效地祛除皮肤色斑的生理性 美白化妆品，也是2 l 世纪世界美容及化妆品行业的一个重要领域【6 | 。 对于黄酮化合物在化妆品领域的应用研究，国外的化妆品公司和研究机构( 如同本、 德国、法国和美国等) 远远处于领先水平。研究表明，黄酮具有抗氧化、抑制大豆脂肪 氧合酶与酪氨酸酶和弱的雌激素等生物活性，具有抗菌、抗光敏、解毒、增白等作用， 在延缓皮肤衰老上拥有很大的潜力。而且黄酮化合物毒性极低，对皮肤无副作用，因此 是一类优良的天然的化妆品助剂。 因为黄酮类化合物具有独特的生物活性，国外的研究者很早就丌始研究它们在医疗 保健和食品添加剂使用方面作用，但由于大部分的黄酮类化合物都只有极低的水溶性与 脂溶性，限制了它们在医药、食品、化妆品领域中的广泛使用。 江南人学硕十学位论文 本课题j 下是在这样的前提下，并参考了大量的中外学术书籍及刊物并经过对化妆品 原料市场的调查论证后确立的。通过对黄酮类化合物改性的研究，开发研究黄酮类化合 物的可溶性复合物，为进一步丌发利用黄酮类化合物提供依据。研究不同黄酮类化合物 复合物对酪氨酸酶的抑制效果，从而得出最佳的酪氨酸酶抑制剂，以满足目前和今后医 药、食品、化妆品工业发展的需要。 1 2 黄酮类化合物一一天然抗氧剂 1 2 1 天然抗氧化剂简介 由于氧自由基和氧化反应的普遍存在，由氧自由基和氧化反应引起的负面影响已经 引起人们的高度重视。瘁灭生物体内的过多氧自由基，阻断由氧化反应引起的食品氧化 腐败，可以通过添加抗氧化剂来实现。因此，抗氧化剂的研究和丌发已成为近年来生物、 医药、食品、化妆品和饲料界非常令人关注的一个研究领域。 抗氧化剂是指能够清除氧自由基，抑制或清除以及减缓氧化反应的一类物质。在生 物体中各类抗氧化剂主要由以下作用机制单个或联合发生作用而起到抗氧化效果：( 1 ) 减少氧化底物中的局部氧浓度；( 2 ) 消除启动脂质过氧化的引发剂；( 3 ) 结合金属离子， 使其不能启动脂质过氧化的羟基自由基或使其不能分解脂质过氧化产生的脂过氧化氢； ( 4 ) 将脂质过氧化物分解为非自由基产物；( 5 ) 阻断脂质过氧化的反应链，即脂质过氧化 的中间自由基，如脂自由基、脂氧自由基和脂过氧自由基。 按照抗氧化剂的来源可将其分为天然抗氧化剂和人工合成抗氧化剂。天然抗氧化剂 有时也称为生物抗氧化剂，主要是指生物体内合成的具有抗氧化作用或诱导抗氧化剂产 生的一类物质。生物体可以是植物、动物，也可以是微生物。如维生素类，类胡萝卜素 类、植物多酚黄酮类，酶类、蛋白质和氨基酸类等1 4 | 1 7 1 o 天然抗氧化成分的来源包括：某些草本植物、香辛料、茶叶、油料种子、果蔬、酶 及蛋白质水解物等。大部分的天然抗氧剂的化学成分与化学合成的抗氧化剂，! h b h a 、 b h t 的结构有相似之处，如含有芳香环结构且至少含有1 个羟基，有些则表现有还原性或 螯合金属离子的能力1 8 j 。 目前同本已列入批准允许使用的品种有：葵花、曲霉、丁香、米糠、茶叶、芝麻酚、 生育酚、银杏叶、水芹、向同葵子和迷迭香提取物等。我国8 0 年代以来对天然抗氧化 剂的研究不断发展，取得了一定成绩一j 。随着人们生活水平提高后对健康、长寿的新需 求，天然抗氧化剂以其安全、无毒等优点而越来越受到消费者的信赖和欢迎。 1 2 2 黄酮类化合物 黄酮类化合物( f l a v o n o i d e s ) 是指存在于天然界的，具有2 苯基色原酮( f l a v o n e ) 结构的 一类化合物。黄酮类化合物中仅有羟基存在的称为苷元，化合物连接有糖基的称为黄酮 苷。黄酮类化合物是在植物中分布最广泛的一类物质，几乎每种植物体内都有，它们常 以游离态或与糖结合成苷的形式存在，它们对植物的生长、发育、开花、结果以及抵御 异物的入侵起着重要的作用。由于其分布广泛且部分化合物在植物的含量较高，而且多 数化合物易以结晶的形式获得，所以它们是较早被人们发现的类天然产物。黄酮类化 合物广泛存在于植物界，尤其在双子叶植物中更为常见，低等植物中却很少见。含黄酮 2 第一章综述 类化合物的中草药很多，它们分布在植物的各个部分，在花、叶、果、心材中较多。【4 】【l o 】 1 2 2 1 基本结构和分类 黄酮类化合物是指存在于天然界的，具有2 苯基色原酮结构的一类化合物，结构如下： o o 2 苯基色原酮色原酮 天然黄酮类化合物母核上常有o h 、o c h 3 等取代基。黄酮类化合物的结构类型较多， 如：黄酮类化合物中仅存在羟基的为苷元，化合物连接有糖基的称为黄酮苷，但基本都 以c 6 _ _ c 3 c 6 为主骨架，不同之处有中间三个碳原子的不同氢化程度，苯取代的位置 以及卜吡啶环的丌环等等的异构变化。化妆品中用入的黄酮类化合物主要为以下类型： 黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、查尔酮、双黄酮、黄烷醇、异黄酮、花色素等。 在植物体中往往与糖苷结合成苷的状态1 4 j l9 1 。 1 2 2 2 黄酮类化合物的抗氧化性 黄酮类化合物抗油脂过氧化的活性在2 0 世纪6 0 年代就已经被证实，由于许多黄酮化 合物都有3 - 羟基一4 一羰基、5 一羟基4 羰基或连二酚羟基的结构，这样的结构可以通过与金 属离子相鳌和而具有显著的抗氧化性，所以认为它是作为一级抗氧化剂而起作用的。2 0 世纪8 0 年代以来，对黄酮类化合物的研究逐渐转向其对活性氧自由基的清除及老年病的 防治功效上。最近就有报道称，黄酮类化合物( 黄酮、黄酮醇、黄烷酮、黄烷酮醇、异 黄酮和异黄酮醇等) 以及黄酮类化合物的前体物( 酚酸和儿茶酸等) ，作为一类天然抗氧化 剂在不久的将来可能最有希望在商业上得到开发利用。 1 2 2 3 黄酮类物质的抗氧机理 黄酮类化合物的抗氧机理【l 圮】有两类：一类是络合具有促进氧化作用的金属离子， 另一类是清除自由基。当会属离子存在时，金属催化的氢过氧化物的分解是游离基的主 要来源。铁和铜等金属离子无论是低价氧化态还是处于高价氧化态，都可以促进氢过氧 化物的分解，所以金属离子具有促进氧化的作用。黄酮类化合物可与金属生成螫合物， 黄烷酮醇与会属离子螯合发生在3 羟基、4 羰基；如果a 环在5 位是羟基时，螯合作用 发生在5 羟基、4 羰基。b 环上的邻醌结构也有络合金属离子的作用。从而可减少金属 离子对氧化作用的催化活性，提高了氧化反应的活化能，从而阻碍了氧化反应的发生。 另一方面，黄酮类化合物能提供氢原子的物质，氢原子能与过氧化物自由基r 0 0 反 应，生成稳定的氢过氧化物r o o h ，而且，黄酮类化合物中的酚羟基与氧自由基反应， 形成共轭稳定的半醌式自由基，从而中断游离自由基链式反应，因此共轭半醌式自由基 和氢过氧化物r o o h 的稳定性与抗氧化剂活性成正相关。此时，抗氧化作用的强弱还 取决于酚羟基上氢原子的活性和酚羟基自由基的位阻，位阻大，酚基自由基自动氧化链 反应的传递速度减慢，使链反应中断而提高抗氧化性。 研究发现，黄酮类化合物邻二酚羟基清除自由基的活性强于间二酚羟基，同时发现 黄酮类各个环上的酚羟基活性相差较大，b 环酚羟基活性最高，当c 环是色原酮时， 江南大学硕+ 学位论文 其上的酚羟基也有一定的作用，a 环的酚羟基最弱。 可见，影响黄酮类化合物抗氧活性的因素，最主要的是羟基化的程度和羟基的位置。 b 环中的邻二羟基对黄酮类化合物的抗氧化活性起主要作用。b 环中的对位醌醇结构比 邻位的醌醇结构的活性大，间位体没有抗氧化活性。3 位上的羟基是很重要的结构，3 位上的羟基和2 、3 位之间的双键可以发生异构化，变成二酮式，此结构式在2 位上产 生具有较高活性的c h - 基团。 1 3 黄酮类化合物在化妆品中的应用 天然黄酮类化合物由于具有一级抗氧化性和“绿色”无毒，对人体无害而应用于高档 化妆品中，主要应用于美白、祛斑、抗衰老、防脱发、抑菌、防晒等方面。应用于美白、 祛斑、抗衰老、防脱发主要由于它们的鳌合作用，能与人体内的一些酶的活性中心的金 属鳌合，或者清除反应中产生的自由基中间产物从而使酶无法发挥作用。 发达国家的化妆品公司和研究机构远远处于领先水平，相关的研究非常热。相比而 言，我国在这一方面相对落后，对黄酮的研究和应用主要集中在医疗保健方面。在这里 简单介绍一下黄酮类化合物在美容方面的应用及其作用机理。 1 3 1 美白防晒 黄酮类化合物可以通过螯合金属离子以抑制酪氨酸酶的活性，从而减小黑色素的生 成。黄酮类化合物在紫外区域2 2 0 - - 3 0 0n n l 范围有强烈的吸收，在3 0 0 - - 一4 0 0n r l l 范围也 有一定的吸收，如果将它们与其他美白、防晒剂复配使用可起到协同作用，发挥出更佳 功效。 1 3 2 治疗痤疮 痤疮，也叫粉刺，俗称“青春痘”，是一种毛囊皮脂腺结构的慢性炎症性疾患，多发 生于青年男女当中。由于青春期男女体内的雄性激素水平增高，使皮脂分泌旺盛，同时 也使表皮和角质的增殖加快，角质堵塞住毛囊孔和皮脂腺开口部，妨碍皮脂的正常排泄， 导致皮脂淤积，形成毛囊口角化栓塞。增多的皮脂不能及时排除，因而形成粉刺。黄酮 的苷元，如染料木素和大豆黄素，具有弱的雌激素样作用，低浓度即能抑制组氨酸脱羟 酶、儿茶酚氧甲基转移酶的活性，从而控制皮脂的过分分泌3 1 。因此，添加在护肤品中， 可以预防和治疗日常生活中常见且比较顽固的痤疮。 1 3 3 保湿 黄酮类化合物的糖苷，如大豆苷( d a i d z i n ) ，染料木苷( g e i n s t i n ) 、鸢尾苷( i r i d i n ) 等由 于含有葡萄糖基而具有多个羟基，能与水分子以氢键形式结合，防止皮肤角质层中水分 的流失，起到保湿的功效【9 】。而有些黄酮的苷元，如染料木素就能改善皮肤的干燥程度， 可能部分就归功于其本身的多酚羟基结构。此外，有些黄酮的弱雌性激素作用还能够刺 激真皮中成纤维细胞合成出骨胶原和透明质酸。由此可见，添加了黄酮类化合物的护肤 品可起到多重的保湿效果。 1 3 4 延缓皮肤衰老 4 第一章综述 人到了衰老阶段，皮肤纤维组织逐渐退化萎缩、弹性松弛，汗腺、皮脂腺的新陈代 谢功能逐渐减退，引起皮肤干燥、松弛，脸部特别是艮角和前额等处出现皱纹。而氧化、 紫外线的照射会加速皮肤老化，出现色素沉着、粗糙、发皱等现象1 1 3 l 。有关于皮肤老化 的机理很多，与自由基、皮肤中骨胶原的聚合、紫外光作用以及人体内的激素尤其是雌 性激素含量的下降有很大关系。 衰老的自由基学说是目前国内外最流行的学说之一，已经得到国际上同学科领域专 家学者的普遍公认。这个学说最本质和核心的内容，就是指自由基是一类化学性质非常 活泼且具有未配对电子的原子或原子团，它能迅速造成机体中最重要的生命物质蛋白质 和核酸的破坏，甚至可以直接作用于组织和细胞，也是引起或促进皮肤老化的重要内在 因素，因此，亦有人把自由基称为皮肤的致老因子1 5 j 。所以在化妆品中适量添加自由基 清除剂或者抗氧化剂，可使皮肤永葆青春的光泽，抵抗衰老1 7 l 。由本实验可知黄酮类化 合物都有一定的自由基的能力，因此可以延缓皮肤衰老。 1 3 5 防止脱发 有外文专利报道，人体的脱发与两种酶有关：脂肪氧合酶和环氧合酶，若能抑制其 中的一种即可预防脱发的产生。黄酮类化合物对脂肪氧合酶有强烈的抑制作用| 1 4 1 ，因此， 在发用品中加入一定量的黄酮类化合物有预防脱发功能。 1 4 酪氨酸酶一一黑素形成过程中的关键酶 1 4 1 酪氨酸酶介绍 酪氨酸酶( t y r o s i n a s e ) ，又称多酚氧化酶，是一类可催化含酚基化合物( 如酪氨酸、酚 类化合物等) 氧化成醌的酶。此类酶广泛存在于自然界，植物中分布很广，如马铃薯、 茶叶、漆树乳汁中含量相当高。蘑菇等菌类及其他微生物中也产生此类酶。通常可从野 蘑菇中提取，是含有铜离子的蛋白质。该酶在皮肤、黑色瘤( 痣) 内含量较高。已采用酪 氨酸酶的抑制剂添加护肤用化妆品中，以达到增白皮肤的作用。 它具有多种特征性催化活性，既可以作为酪氨酸羟化酶、多巴氧化酶，又可以作为 5 , 6 二羟基吲哚氧化酶，在黑色素生成过程中起着至关重要的作用。它不但用于色素增 加性皮肤病( 黄褐斑、雀斑等) 的临床治疗，而且可用于化妆品使肤色增白，还有可能应 用于农业生产上作为一种害虫调控剂和食品工业上作为食品添加剂。 1 4 2 酪氨酸酶结构 人体内的酪氨酸酶由c d n a 编码的5 6 6 个氨基酸残基构成。前1 2 个氨基酸中有l o 个 为疏水氨基酸，推测该段为信号肽序列。酪氨酸酶含有2 个铜离子，4 个连续的组氨酸位于 2 个半胱氨酸富集区之间，另外6 个连续的组氨酸靠近羧基末端，在离羧基末端6 2 个氨基 酸处，有一区域仅由疏水氨基酸或中性氨基酸组成，推测该区为跨膜区。两个铜离子分 别与蛋白质分子中的组氨酸结合，另有一个内源桥基将两个铜离子联系在一起，构成酪 氨酸酶催化氧化反应的活性中心。 化学及分光镜的研究表明，酪氨酸酶的双核铜离子活性位点能以3 种不同的形式还原 5 江南人学硕+ 学位论文 型( e m e t ) 、氧化型( e o x y ) 和脱氧型( e d e o x y ) 存在于酶促反应中1 1 6 】。 三种形式的酶的结构见图1 1 | 1 7 1 h 2 , o 眨o ! 笋f nn n - 、c u 。h 芦f n m 洲m f n n e o x ye r a e t e d e o x y = e r e d 图1 - 1 酪氨酸酶活性中心的三种形式 f i g 1 1 3f o r m so ft y r o s i n as ea c t i v ec e n t e r 1 4 3 酪氨酸酶的作用机理【1 8 】 1 4 3 1 酪氨酸酶的抑制特征 酪氨酸酶的抑制特征为可逆抑制。酪氨酸酶具有单酚加羟酶和二酚氧化酶的活性， 酶在催化作用中的存在形式有3 种：还原型( m e t ) 、氧化型( o x y ) 矛i 脱氧型( d e o x y ) 。m e t 型 和o x y 型酶具有二酚氧化酶活性，而o x y 型酶才有单酚加羟酶活性，只有d e o x y 型的酶能 够结合氧分子，l ! p o x y 型酶催化l 酪氨酸生成l d o p a ，而以l d o p a 为底物测定的酶活 力为二酚酶活力。酪氨酸酶的抑制特征符合可逆抑制，表现为抑制剂为酶的结合建立在 解离平衡基础上。增大抑制剂浓度导致酶活力的下降，是由于酶活力受到抑制，催化效 率降低，而不是通过导致有效酶量的减少引起酶活力的下降。同一抑制剂作用下，随着 抑制剂浓度增大，相同酶量的酶活力降低。 1 4 3 2 酪氨酸酶的抑制机理 酪氨酸酶的可逆抑制又分为竞争性、非竞争性、混合型及缓慢结合型4 种，其主要机 理见表1 1 。 表1 1 酪氨酸酶的4 种抑制机理 类型主要机理 竞争性 非竞争性 混合型 缓慢结合型 底物类似物结合酶的活性中心抑制酶活性。 抑制剂与酶活性中心以外的氨基酸残基结合及抑制剂对过氧自由基的 清除作用。 抑制剂对酶活性中心的内源桥基的影响。 抑制剂与酶快速形成复合物，此后经历一个缓慢的可逆异构化过程。 1 4 4 酪氨酸酶在黑素形成过程中的作用 哺乳动物的皮肤和毛发的颜色由许多种因素决定，最重要的是黑色素形成的程度和 分布。黑色素是由专门的色素生成细胞形成的，叫做黑素细胞，它起源于胚胎神经脊， 它的分布由胚胎在发育过程中决定1 1 。7 1 。黑色素是一类有着复杂结构、非均质的类多酚聚 合体，其决定人体皮肤及毛发的颜色，它的形成涉及人体许多方面的因素，对这些因素 的研究，尤其是对黑色素形成机理的研究引起了化妆品和医学界的广泛关注。 黑色素是吲哚和醌与蛋白质结合的高分子聚合物，黑色素的合成( 参考图1 2 黑色素 的合成) 必须有三种基本物质：( 1 ) 酪氨酸是蛋白质代谢的产物，为一种稳定的氨基酸。 为制造黑色素的主要原料。( 2 ) 酪氨酸酶是酪氨酸转变为黑素的催化剂，为铜及蛋白质的 6 第一章综述 o 0 h o l - 酩氨酸 o h t y r + 1 l | 1 2 0 一h 2 0 l p 一( 3 ，- - 羟基) 苯丙氨酸( i ，d o p a ) 多巴醒( d q ) h 2 n h 2 n h 2 n 酪氨酸酶 酪氨酸酶 h 5 , 6 口引噪醒( 黑色素原 图i - 2 黑色素的合成 f i g 1 2t h es y n t h e s i so fm e l a n i n 至皇垩黑色索 多巴酸( 3 ，4 - 羟基笨丙酸) d o p a o 半胱氨酸多巴醌 h o h o印 酪氨酸酶 5 ，6 _ 羟基吲哚( d h i ) 5 ，6 - 二羟基吲哚羧酸( d h i c a ) 酪氨酸酶 ( c o o h ) 一j 卜- 酪氨酸酶 d h i 低聚体 d h i c a 低聚体 真黑色素+ 氧黑色素 类黑色素+ 术色素 图1 - 3 产生真黑色素、类黑色素和相关色素的途径 f i g 1 3t h es y n t h e s isp r o c e sso fr e a l - m e l a n i n g e n u s m e l a n i na n di n t e r r e l a t e dp i g m e n t 7 屯 hp 咖 江南火学硕+ 学位论文 复合物，是在黑素细胞的粗面内质网中合成，后转移到高尔基空泡在此参与合成黑色素。 人类所有细胞中只有黑素细胞能合成酪氨酸酶。( 3 ) 酪氨酸在酪氨酸酶的作用下产生黑色 素，此种作用为一种氧化过程，必须与氧结合才能转变为黑色素。很显然，酪氨酸酶在 黑素合成过程中起到非常关键的限速酶作用l l 引。 从比较生物化学角度以及酪氨酸酶的作用机理来看，酪氨酸酶在黑色素形成过程中 专一，催化两个特定的反应：( 1 ) 酪氨酸的羟基化，生成多巴( d o p a ) ；( 2 ) d o p a 的氧化， 生成多巴醌( d q ) 。由于反应途径不同，从而主要生成两种黑色素：真黑色素和类黑色素。 产生真黑色素和类黑色素和相关色素的主要途径见图1 3 。 酪氨酸酶催化黑色素形成是开始的最关键的一步，即酪氨酸酶转化为多巴醌。一般 认为，酪氨酸酶的活性程度对色素沉积起着主要的作用。另外，还有一些黑色素的规整 调节酶( 如谷胱甘肽还原酶等) 也起着关键的作用。但对这些规整调节酶的作用机理目前 知之甚少。 当前，除了上面提到的两种主要黑色素外，还伴生有其他一些含量较少的黑色素微 粒，如与真黑色素合成途径相同而色泽与类黑色素相同的氧黑色素及与类黑色素合成途 径相同的木色素等。 1 4 5 增白剂的应用 现代皮肤美白剂是在黑色素形成、代谢的某个阶段加以控制，能阻止甚至逆向黑色 素的生物合成，从而达到使皮肤美白并对由于黑色素合成过多或不均匀引起的局部色素 沉积造成的雀斑、老年斑等色斑有治疗作用。我们把这类美白剂称作化学抑制型增白剂。 现有的美白化妆品中添加的美白活性成份以酪氨酸酶抑制剂为主。一些常见的增白 剂及其作用机理如表1 2 所示【9 】【2 0 】【2 。 表1 2美白剂及其作用机理 t a b 1 1w h i t e n i n ga g e n ta n dt h e i ra c t i o nm e c h a n i s m 活性物作用机理 熊果：舒 睦酸及其衍生物 v c 及其衍生物 甘草提取物( 油溶部分) 胎盘提取物( 宫宝素) 内皮素拮抗剂 对苯二酚 邻苯二酚衍生物 抑制酪氨酸酶活性 抑制酪氨酸酶活性；减少多巴色素向d h i c a 的互变 酪氨酸酪氨酸酶的反应中起抗酶化作用，还原黑色素中间体多巴色 素，阻断多巴至黑色素的氧化反应过科，并能促进角原蛋白的生成 抑制酪氨酸酶和多巴色素互变酶的活性 确切机理尚不清楚，有一种观点认为是促进角质化，加快黑色素排泄 抑制紫外照射产生的内皮素对黑色素细胞分化和酪氨酸酶的激活作用 抑制酪氨酸酶活性 破坏黑色素细胞 一些水溶性的酪氨酸酶抑制剂及内皮素拮抗剂往往较难有效地渗透到皮肤的表皮甚 至是真皮发挥作用，影响其增白效果。 v c 在增白活性组分中有着很好的应用价值，但是它极不稳定，易被氧化。为此在增 白化妆品中常用v c 的棕榈酸酯和磷酸酯镁盐等，但其效果均逊于纯v c 增白效果f ：2 1 。 目前，还没有发现一种单一的增白剂能同时抑制多种酶和内皮素，要想达到较好的抑制 8 第一章综述 效果，须通过两种以上增白剂的复配。 1 5 水飞蓟宾 1 5 1 水飞蓟的介绍 水飞蓟【s i i y b u mm a r i a n u mf ，三夕g a e r t n 】，别名乳蓟，为菊科水飞蓟属一、二年生草 本植物，原产于南欧和北非，是欧洲民间的用于保肝一种草药。水飞蓟素( s i l y m a r i n ) 为 果实及种子的提取物，于1 9 6 8 年被h w a g n e r 等西德药学家发现。水飞蓟素是药用有效成 分，为混合物，其主要成分为水飞蓟宾( s i l y b i n ) 、异水飞蓟宾( i s o s i l y b i n ) 、水飞蓟宁 ( s i l y d i a n i n ) 和水飞蓟亭( s i l y c h r i s o n ) ，所占比例依次为3 ：l ：1 ：1 。均为同分异构体。其 中以水飞蓟宾的含量最高，抗肝炎活性最强。因此，药理作用和临床应用皆以水飞蓟宾 为代表吲。 1 5 2 水飞蓟宾的介绍 水飞蓟宾溶于丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、微溶于氯仿，不溶于水【2 钔，是由一分 子黄杉素( t a x i f o l i n ) 和一分子松柏醇( c o n i f e r y la l c o h 0 1 ) 偶合而成，是自然界中第一个被发 现的黄酮木脂素类化合物( f l a v o n o l i g n a n s ) ，其结构首先由p l t e r 在1 9 7 5 年通过降解的方法 确立口引。因此，水飞蓟宾同时具备黄酮和苯丙素的结构特点。典型的黄酮木脂素，其黄 酮单元与苯丙素单元通过氧桥相连，形成苯并二氧六环结构，均含有c 6 c 3 c 6 c 3 c 6 结构单元。 水飞蓟宾具有清除活性氧、抗自由基闭、抗脂质过氧化【2 刀、抑制一氧化氮( n 0 ) 的 产生、抑制5 脂氧合酶、保护肝细胞膜、促进肝细胞修复l 8 1 、再生、免疫调节、抗肝纤 维化例、抗谷胱甘肽( g s h ) 排空作用、抗肿瘤、降血脂3 0 1 3 1 1 等药理学效应，对四氯化碳、 毒蕈碱等肝脏毒物引起的各种类型肝损伤具有保护作用1 3 2 1 、在保肝、降血脂、保护心肌、 保护脑出血、抗血小板聚集、防治动脉粥样硬化等方面显示出良好的治疗效果【3 3 1 ，另外， 药理研究发现水飞蓟宾还有抗炎、抗肿瘤等活性。因其确切的疗效和极低的毒性【2 7 】，在 肝病治疗领域得到广泛的应用，已积累了3 0 多年的临床使用经验。 1 5 3 水飞蓟宾制剂及应用进展 水飞蓟宾在临床上应用的制剂主要有片剂、胶囊剂和注射剂等。由于水飞蓟宾难溶 于水1 3 4 j 【3 5 1 、口服吸收差、生物利用度低，影响其临床应用，限制了它的应用价值。为此， 国内外f 积极丌发研制其新剂型，增加其溶解速度或改变其溶出和吸收特性，以提高其 的生物利用度。实验上采用了多种方法增加其在人体内的吸收程度，如采用聚乙二醇 ( p e g ) 、聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) 等辅料制成固体分散体，环糊精包合物、脂质体、卵磷酯 复合物，成盐等1 3 6 1 。 1 5 4 水飞蓟宾葡甲胺的简介 水飞蓟宾葡甲胺为水飞蓟宾的葡甲胺盐复合物。分子式：c 3 2 h 3 9 0 1 5 n ；分子量： 6 7 7 6 6 ；水飞蓟宾葡甲胺为黄色无定形粉末；几乎无臭，味微苦带涩；有引湿性。在水 9 江南人学硕十学位论文 中溶解，在甲醇或乙醇中略溶，在丙酮中微溶，在氯仿中极微溶解。 1 5 5 水飞蓟宾葡甲胺的合成研究进展 机理一：水飞蓟宾的分子中c 环上的羰基上有强的电子云，故有强的吸电子能力。 而葡甲胺分子中在氨基上的h 活性较强，容易结合在羰基上。葡甲胺的氨基与水飞蓟宾 b 环上的羰基结合，形成一个较弱的分子键，使得葡甲胺分子得以接在水飞蓟宾上形成 水飞蓟宾葡甲胺1 37 1 。 机理二：葡甲胺为成盐处方药中配对常用的作为阳离子的碱1 3 8 】，对一些难溶性药物 如美洛昔康等有良好的增溶作用【3 7 】，合成一个成功的盐，通常要求其共轭酸的p k a d , 于 共轭碱的p k a ，以保证有足够的质子从酸转移到碱【3 8 1 。相关文献报道水飞蓟宾的p k a 为 6 4 2 39 1 ，葡甲胺的p k a 为9 5 2 0 讲，所以，成盐是一个合理的解释。水飞蓟宾分子上的酸 性酚羟基与葡甲胺上的胺基成盐。 机理三：葡甲胺具有类似表面活性剂的增溶作用，或者因为分子中的多个羟基与药 物形成氢键。 1 5 6 水飞蓟宾葡甲胺的药物方面应用 临床试验表明，水飞蓟宾葡甲胺具有作用快、疗效强等特点，治疗慢性迁延性肝炎 2 5 6 例，总有效率为7 4 6 ，其中显效率为5 2 0 ，疗效高于水飞蓟总黄酮制剂益肝 灵片3 6 1 。 水飞蓟宾葡甲胺在体内可显著抑制脂多糖( l p s ) 诱导肿瘤坏死因子( t n f ) 产生；在 体外能抑制t n f 对肝细胞系g s d 7 7 0 1 和成纤维细胞系l 9 2 9 的细胞毒作用；在体内对l p s 诱导的座疮丙酸杆菌致敏的肝脏炎症损伤有保护作用。对主动脉组织脂质过氧化物( l p o ) 及晚期糖氧化终产物( a g e s ) 、糖氧化产物p e n t o s i d i n e 及脂质过氧化物加合物荧光产物均 有明显抑制作用。对c o x s a c k i l eb 5 病毒感染培养的心肌细胞有明显保护作用，可以提高 d n a 的合成率，降低受感染细胞培养液中病毒滴度1 4 。 1 5 7 国内外研究动态 对黄酮化合物的改性方法有很多种，我国已经有人利用同体分散技术，将水飞蓟宾、 槲皮素、葛根素等黄酮类化合物做成固体分散体；利用环糊精包合技术研究过芦丁、水 飞蓟宾、秦皮甲素等的环糊精包合物；或将黄酮类化合物水飞蓟宾等做成可溶性盐，如 水飞蓟宾葡甲胺盐、水飞蓟宾邻苯二甲酸单脂钠盐、水飞蓟宾二偏琥珀酸脂钠舱、水飞 蓟宾环糊精包合物、水飞蓟宾磷酸盐、水飞蓟宾磷脂酰胆碱复盐【3 6 】等，国内市场已有用 水飞蓟宾制成的成品药水飞蓟宾葡甲胺片、西利宾胺和利肝隆等为商品名的保肝药出 佳 口。 国外的研究者也正积极开发研制黄酮类化合物水溶性或脂溶性衍生物，研究它们在 医疗保健和食品添加剂使用方面作用，如其磷脂复合物和固体分散体。因此，对黄酮类 化合物的研究已成为国内外医药界研究的热门话题，丌发研制黄酮类化合物的可溶性复 合物将会成为新的热点。 l o 第一章综述 1 6 结论和立题依据 “绿色”是2 1 世纪化妆品的主题，天然活性化妆品顺应了回归大自然的发展潮流 和人们的消费心理。随着我国加入w t o ，国产化妆品与国外化妆品的竞争将加剧，天 然活性化妆品，特别是中草药化妆品是我国化妆品取胜的法宝。而从销售额和人均消费 水平看，我国的天然化妆品有很大的发展空间和潜力【4 1 。 黄酮类化合物来源广泛，普遍存在于中草药中，具有良好的抗自由基、延缓皮肤衰 老和美白效果1 43 1 ，还具有刺激毛发生长、抑汗、治疗痤疮、皮肤保湿等作用。而且黄酮 化合物毒性极低，对皮肤无副作用，因此是一类优良的天然的化妆品助剂。对它及其衍 生物在临床、医疗保健和化妆品等领域的应用研究也越来越多。但大部分的黄酮类化合 物都只有极低的水溶性与脂溶性，口服吸收差，降低了其生物利用度，从而限制了它们 的应用价值。 鉴于以上所述，本课题主要从事以下几方面的研究： 首先，通过研究水飞蓟宾葡甲胺的制备、结构分析等为突破口，开发研制黄酮类化 合物的葡甲胺盐复合物，扩大它们的应用范围。 其次，通过研究黄酮类化合物的葡甲胺盐复合物的溶解性能，考查葡甲胺对黄酮类 化合物的增溶效果。 再次，通过研究黄酮化合物的葡甲胺盐复合物的清除自由基能力来更加广泛的提升 功能性化妆品在同常生活中的地位，为化妆品中功能性原料的筛选提供理论依据。 最后，测定黄酮化合物葡甲胺盐对酪氨酸酶的抑制作用效果，筛选出对酪氨酸酶具 有高的抑