（应用化学专业论文）球形氧化锆用于高效液相色谱固定相的制备与表征.pdf

中文摘要 本文探讨诱导聚合胶体凝聚法制备单分散微米级多孔氧化锆陶瓷球，以氧氯 化锆为起始原料，尿素和甲醛为固化剂，乙酰丙酮为稳定剂制备的z 的2 树脂凝胶 球经真空干燥、7 0 0 0 c 煅烧最终得到的氧化锆微球尺寸均一、粒径分布窄，球形 度好，机械强度高，具有合适的孔径、孔结构，相组成以四方、单斜为主，基本 满足高效液相色谱固定相的要求。 实验探讨了制备过程中的配方组成、p h 值、制胶温度、制胶时间、煅烧温 度等工艺条件对最终氧化锆微球粒径的影响，优化了工艺条件：甲醛和尿素与锆 离子的摩尔比为1 3 3 ( m o l m 0 1 ) ，尿素与甲醛的摩尔比0 8 ( m o l m 0 1 ) ，溶胶的 p h - - 1 5 ，制胶的温度、时间分别为9 0 0 c 、1 2h ，淡黄色的树脂球分别在1 2 0o c 、 1 7 0o c 真空干燥1 2h 以除去水份和部分有机物，而后在马弗炉中程序升温至 7 0 0 0 c 煅烧9 h 。本文利用f t - i r 和t g d t a 技术对成胶工艺和氧化锆凝胶球的热 处理过程进行表征；t e m 和s e m 观察凝胶球和微球的形貌和粒径分布，煅烧后 的氧化锆微球的平均粒径为2 6 1 a m ；x r d 分析微球的相组成以四方、单斜氧化 锆相为主；b e t 分析表明氧化锆微球的比表面积为3 2m 2 g ，孔径位于中孔范围 内；装柱实验表明煅烧后的氧化锆微球机械强度至少达到4 5 m p a 。 利用湿法装柱将自制的氧化锆微球填充到统一规格的液相色谱柱中 ( 4 5 0 m m x 4 6 m m ) ，优化检测条件对碱性体系以及酸性、中性、碱性体系进行分离 检测，得到较好的分离效果。并将所制备的氧化锆微球与市售的硅胶微球分别作 为固定相装入高效液相柱中，选取相应的检测条件对同一碱性体系进行分离比 较，实验结果表明当氧化锆、氧化硅作为正相色谱填料时，以氧化锆为填料的色 谱柱可实现对碱性化合物的选择性分离且得到了较好的分离效果，保留时间比硅 胶微球固定相缩短，峰型对称，证明z r 0 2 氧化物表面呈明显的碱性特征，这一 性能是正相硅胶填料无法比拟的。 关键词：诱导聚合胶体凝聚法氧化锆微球正相色谱固定相碱性化合物分离 a b s t r a c t m o n o d i s p e r s ea n dm i c r o no fp o r o u sz i r e o n i as p h e r e sw e r es y n t h e s i z e db yt h e i m p r o v e dp r o c e s so fp o l y m e r i z a t i o n i n d u c e d c o l l o i da g g r e g a t i o n ( p i c a ) i nt h i s p r o c e s s ，z r o c l 2 8 h 2 0w a su s e da s r a wm a t e r i a lw i t hf o r m a l d e h y d ea n du r e aa s s o l i d i f i e da g e n t s ，a c e t y la c e t o n ew a su s e da ss t a b i l i z i n ga g e n t p o r o u sz i r c o n i a p a n i c l e so b t a i n e da f t e rv a c u u md r y i n ga n ds i n t e r i n ga t 7 0 0 0 1 2w h i c hh a dan a r r o w p a r t i c l es i z ed i s t r i b u t i o na n da p p r o p r i a t ea p e r t u r e 、p o r es t r u c t u r e p h a s ec o m p o s i t i o n s w e r em a i n l yt e t r a g o n a la n dm o n o c l i n i c p o r o u sz i r c o n i am i c r o s p h e r e sw e r ea l s os t r o n g e n o u g ht ow i t h s t a n dt h ep a c k i n go f ah p l cc o l u m n t h eo p t i m u mp r o c e s sp a r a m e t e r sw e r ed e t e r m i n e dt h r o u g h o u re x p e r i m e n t s t h e r e s u l ts h o w e dt h a tp h 、t h et e m p e r a t u r ea n dt i m eo fs t a r t i n gs o l 、s i n t e r e dt e m p e r a t u r e a f f e c t e dt h ep a r t i c l es i z e ；w ea l s og a i n e do p t i m u mc o n d i t i o n ：t h ep o l y m e rp r e c u r s o r t o z i r e o n i ar a t i o ：1 3 3 ( m o i m 0 1 ) ；t h eu r e at of o r m a l d e h y d er a t i o ：0 8 ( m o l m 0 1 ) ；t h ep h o f s o l ：1 5 ：t h et e m p e r a t u r ea n dt i m eo f s t a r t i n gs o l ：9 0 0 ca n d1 2 h ；t h ey e l l o wh y d r o g e l s w e r es e p a r a t e l yp r e h e a t e dt r e a t m e n ta t 12 0o c 、17 0o ca b o u t12 ha tv a c u u md r y i n g c h a m b e ri no r d e rt oe v a p o r a t em o i s t u r ec o n t e n ta n dp a r t i a lo r g a n i cm a r e r ，t h e nt h e z i r c o n i ao fp r e h e a t e dt r e a t m e n tw e r e s i n t e r e da te l e c t r i cm u f f l ef u r n a c ef r o m r o o m t e m p e r a t u r et o7 0 0o ca n dk e p tt h i st e m p e r a t u r ea b o u t9 hi n o r d e rt oi m p r o v e t h e i rm e c h a n i c a ls t r e n g t h t h ee s t a b l i s h m e n ta n dh e a tt r e a t m e n tp r o c e s s t or e s i n s p h e r e sw e r ec h a r a c t e r i z e db yf t - i ra n dt g - d t a ；t h ep a t t e r na n ds i z ed i s t r i b u t i o nt o r e s i ns p h e r e sa n dm i c r o s p h e r e sw e r eo b s e r v e db yt e ma n ds e m ，t h ef i n a ld i a m e t e r o ft h ez i m o n i as p h e r e sw e r e2 6 p r o ；p h a s ec o m p o s i t i o n sw e r em a i n l yt e t r a g o n a la n d m o n o c l i n i cb yx r d ；s p e c i f i cs u r f a c ea r e aw a s3 2m 2 gb yb e t , t h ea v e r a g ea p e r t u r e b e l o n g e dt om e s o p o r er a n g e ；t h em e c h a n i c a ls t r e n g t h w a sa t l e a s t4 5m p ab y c o l u m np a c k i n gt e c h n i q u e z i r c o n i as p h e r e s l o a d i n g m a t e r i a lw e r e p u t i n t ou n i f i e ds t a n d a r d s c h r o m a t o g r a p h i cc o l u m n ( 4 5 0 m mx 4 6 m m ) b yw e tp a c k i n gm e t h o d ，t h e n a l k a li n e s v s t e ma n dn e u t r a l 、b a s i c 、a c i ds y s t e mw e r es e p a r a t e da n dp u r i f i e d u n d e rt h e a p p r o p r i a t ed e t e c t i o nc o n d i t i o n t h es a t i s f i e ds e p a r a t i o n r e s u l tw a sa c h i e v e d t h e h o m e m a d ez i r c o n i as p h e r e sa n dt h es i l i c o no x i d es p h e r e ss u p p l i e di nt h em a r k e tw e r e s e p a r a t e l yl o a d e di n t oc h r o m a t o g r a p h i cc o l u m na ss t a t i o n a r yp h a s e t h es a m ea l k a l i n e s y s t e mw a ss e p a r a t e du n d e rt h ec o r r e s p o n d i n gd e t e c t i o nc o n d i t i o n t h ee x p e r i m e n t a l r e s u l t ss h o w e dt h a th o m e - m a d ez i r c o n i as p h e r e sw e r ef e a s i b l et os e p a r a t ea l k a l i n e c o m p o u n db yt h ec h r o m a t o g r a p h i cc o l u m n t h er e t a i n i n gt i m ew a ss h o r t e rt h a nt h a t o fs i l i c aa n dt h ep e a ks h a p ew a sa l s os y m m e t r y s oi tc o u l db ec o n c l u d e dt h a tt h e s u r f a c eo fz i r c o n i as p h e r e sh a d o b v i o u s l ya l k a l i n ec h a r a c t e r i s t i cw h i c hs i l i c as p h e r e s c o u l dn o tm a t c hw i t ht h e m k e y w o r d s ：p o l y m e r i z a t i o n i n d u c e dc o l l o i da g g r e g a t i o n ，z i r c o n i am i c r o s p h e r e s ， p o s k i v ec h r o m a t o g r a p h i cs t a t i o n a r yp h a s e ，a l k a l i n ec o m p o u n ds e p a r a t i n g 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名j 嘶 签字吼 矿7 年，月，日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨盗盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权苤壅盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 靴做储獬：獬 签字目期： 矿7 年月, t 7 日 导师签名= 马亚鲁 签字日期：驴了年f 月f6 日 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 高效液相色谱法( h p l c ) ，作为一种较新的分析、分离技术，虽然它的发展 至今为止不过短短二十几年的时间，但它已广泛应用于石油、化工、食品、医 药等部门，并引起了广大的化学、生物化学和其它分析工作者的重视，使其在 近年来获得了较快的发展。据m a j o r 统计，在相关领域中有8 0 的分离是通 过 玎? l c 分离技术实现的，这种技术不仅满足了不同组分混合物的分离和制 备，而且可以同时进行定性和定量分析【，它即克服了经典的柱色谱法分离效 能差，柱填充的重复性差，分离时间长的缺点，也克服了气相色谱法分离有机 化合物范围窄的缺点，使得h p l c 已成为目前最重要分离分析手段之一。在 h p l c 的发展过程中，始终伴随着高效液相色谱填料的不断改进和发展。理想 的h p l c 填料应具备：( a ) 较高的比表面积，表面能量分布均一：( b ) 物理、化 学性质稳定即耐高温、高压、耐酸碱以及不溶解各种流动相溶剂；( c ) 传质快即 要求有合适的孔结构、孔容和孔径；( d ) 微米级球形，粒径分布范围窄且粒径小 如2 7 微米。 高效液相色谱作为一种有效的分离技术，它的发展取决于合适的柱填料，因 为色谱柱是高效液相色谱的心脏部分。近年来，由于采用了一些新技术，填料生 产有了重大的突破，使色谱柱不论在分离效率还是在柱寿命方面都有了令人瞩目 的提高。 1 2 无机柱填料的研究现状 1 2 1 氧化锆作为高效液相色谱填料的研究 色谱工作者在不断追求和探索着新的基质填料：一方面是由于越来越多的 分离课题要求填料具有高化学稳定性，另一方面也是因为不同的基质具有各自独 特的表面化学性质，这种独特的表面化学特性使得基质对某类溶质体现出独特的 保留和选择。在对新基质的探索过程中，色谱研究工作者对过渡金属氧化物及相 关物质给予了很大关注，比如氧化锆、氧化钛，这主要是因为它们具有显著的机 械强度和物理化学稳定性。 氧化锆有多种结晶态和无定形态，但只有具备一定物理化学性能( 合适的孔 第一章绪论 结构和表面功能基、微米级、球形、机械强度高、比表面大等) 的氧化锆才能用 于高效液相色谱分离。市售的氧化锆粉末由于比表面积过小等原因不适合做高效 液相色谱的填料，所以氧化锆的制备方法成为研究的关键。目前主要有两种方法 制备高效液相色谱的填料1 2 ) 】：溶胶- 凝胶法( s o l - g e l ) 1 2 】和聚合诱导胶体凝聚法 ( p i c a ) 【4 】。氧化锆表面存在羟基，两个明显的羟基红外谱图表明即有桥联的羟 基又有孤立的羟基。桥联的羟基在两个金属离子间强烈极化具有酸性，而孤立羟 基具有碱性。氧化锆的这种特殊的表面表现为碱性氧化物，不溶于碱，在1 0 0o c 条件下，用lm o l l 的氢氧化钠清洗3 个小时后，未发现有锆溶解【5 】，而且在酸性 介质中( p h = 1 ) 也非常稳定。 z r 0 2 作为h p l c 填料始于1 9 7 9 年，g h a e m i 等1 6 j 人用十六烷基三甲基溴化 胺动态改性低比表面积z r 0 2 ，研究了h p l c 性能并与s i 0 2 进行了比较。在随后 近1 0 年时间内没有相关研究报导，直到1 9 8 8 年，日本的k a w a h a r a 等通过对比 z r 0 2 、a 1 2 0 3 、t i 0 2 和s i 0 2 的吸附性能预测了z r 0 2 作为h p l c 填料的可能性。 1 9 8 9 年u n g e r i r l 和c a r r i s t 均发表了z r 0 2 作为色谱填料的论文，从此z r 0 2 填料的 研究逐渐增多。 1 2 1 1 改性的氧化锆色谱固定相 虽然利用与z r 0 2 表面活性作用点间的不同作用可达到对某些溶质分离的目 的，但z r 0 2 固定相远不能满足多种化合物分离的需要。z r 0 2 表面的多种活性作用 点对一些溶质会产生特异吸附，造成拖尾或不可逆吸附，特别是对于生物大分子 的分离，存在兼容性差等问题。所以，对z r 0 2 表面进行改性可以减弱z r 0 2 固定相 对许多溶质的不可逆吸附，扩大z r 0 2 固定相的使用范围或增强对某些化合物分离 的选择性。目前应用较多的方法多借鉴于s i 0 2 的表面改性方法，目的是为了获得 均一的固定相表面。 1 2 1 2 高聚物涂敷氧化锆固定相 高聚物涂敷z r 0 2 不仅保留了氧化锆高机械强度和酸碱稳定性好的优点，而且 通过涂敷可以降低表面的不均一性，提高固定相对生物样品的活性兼容性。高聚 物涂敷z r 0 2 可根据涂敷高聚物性质的不同用作离子交换、反相色谱及疏水色谱固 定相。所用的高聚物主要有聚丁二烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚苯乙烯一二乙烯基 苯等。1 9 9 7 年，z i r c h r o ms e p a r a t i o n 公司在c a r r 实验室工作的基础上实现了氧化 锆及高聚物改性氧化锆固定相商品化，产品包括正相、反相、强、弱阴离子交换 和阳离子交换等类型。由此可见，氧化锆基质固定相具有一定的市场前景。 ( 1 ) 聚丁二烯( p b d ) 涂敷z r 0 2 第一章绪论 c a 一2 】实验组制备了p b d z r 0 2 固定相并进行了表征，对其色谱动力学、热 力学及应用做了系统的研究，取得了一定的成功。z r 0 2 表面p b d 的涂敷量较低 ( 8 硅胶骨架逐渐被溶解；p h t - z r 0 2 七多c z r 0 2 2 化学性质 z 幻2 具有很高的化学稳定性，除硫酸和氢氟酸外，对酸、碱及碱熔体、玻璃 熔体和熔融金属都具有很好的稳定性，而且还与多数熔融金属不浸润；热导率低、 热稳定性好( 部分稳定z 她) 、高温蠕变小，耐磨性极好；氧化锆表面既具有弱 酸性位也具有弱碱性位，用硫酸进行表面改性可制备酸强度h 。超过1 6 的固体超 强酸m n 。最近王英【4 2 1 等以氧化锆做载体通过负载k n o ，制备出碱强度h 超过 + 2 6 的固体超强碱。z r 0 2 是两性氧化物，又兼具氧化性和还原性。 2 1 2 氧化锆的表面性质 2 121 表面积 近年来，氧化锆作为固定相和催化剂已受到了广泛的关注，作为催化剂载体 必须在使用条件下具有高的、稳定的比表面积，而氧化锆的表面积一般都很祗。 目前许多研究已致力于高比表面积氧化锆的制备和研究。一般认为氧化锆的表面 积取决于烧结温度：随着温度的升高，表面积很快下降，且四方相氧化锆的比例 下降。第二种组分加入可以提高氧化锆的表面积，一般认为是由于加入的第二 第二章基本理论 种组分在一定温度范围内可以阻止相变的发生，从而提高样品的表面积。 2 1 2 2 表面酸碱性 金属氧化物表面常具有酸性、碱性、氧化性和还原性。大多数金属氧化物在 表面主要显示出其中一种性质。氧化锆的特殊性质是其表面同时具有酸性、碱性、 氧化性和还原性，尽管它们的强度均很弱。 y a m a g u c h i 等用c 0 2 和n h 3 - t p d 表征了z r 0 2 的酸碱性，同时表征氧化硅一 氧化铝和氧化镁的酸碱性，结果显示：氧化硅一氧化铝仅吸附c 0 2 而不吸附n h 3 ， 表明氧化硅一氧化铝表面仅有酸性；与此相反，氧化镁仅吸附n h 3 而不吸附c 0 2 表明它的表面仅具有碱性。而作者发现氧化锆同时吸附c 0 2 和n h 3 ，表明其表 面同时具有酸碱两性。 2 1 2 3 表面羟基 氧化锆表面羟基的多样性己经引起许多研究者的兴趣，目前的研究主要集中 于识别氧化锆表面羟基和晶相结构的关系及其与反应性能的关联。红外光谱研究 显示氧化锆表面有三种羟基类型：端羟基( 3 7 7 5 c m 一) 【4 3 】多桥羟基( 3 6 0 0 - - - 3 7 0 0 c m 。1 ) m 1 和双桥羟基( 3 7 4 0c m 1 ) 1 4 5 】。a g r o n 等用红外光谱研究了水在氧化锆表 面的吸附和脱附，将3 6 0 0 3 7 0 0c m j 和3 7 7 5c m 卅的谱峰归属于单斜相氧化锆的 羟基峰，3 7 4 0c m 1 是四方相氧化锆特征的羟基峰。 2 1 3 氧化锆的晶相结构 。 氧化锆属于萤石结构，因为阳离子直径大于阴离子直径，所以可以认为由 z r + 构成面心立方点阵，0 2 占据面心立方点阵所有四个四面体空隙，氧化锆具有 立方、四方和单斜三种晶相。在立方结构中，每个锆离子与八个等距离的氧离子 配位，形成z r - 0 8 形式，但是z r - o 的距离不同，其中四个z r - o 距离为2 0 6 5 a ， 构成扁平的四面体，另外四个z r - o 距离为2 4 6 3 a ，形成细长的四面体，且相对 于前者旋转9 0 度。单斜相与立方相和四方相在结构和配位上皆不相同，z r - o 呈 z r - 0 7 配位，其中四个氧离子构成平面正方形，对应于正常z r - o s 配位的半， 另外三个氧离子构成几乎平行于前正方形的三角型。因此，在纯氧化锆四方相到 单斜相的转变过程中。z r o o 配位必然经历一个z r - o s 到z r - 0 7 的转变，而且氧离 子必须发生位移。三种晶形的晶格常数和密度如下表2 1 第二章基本理论 表2 1 氧化锆三种晶形的晶格常数和密度 里曼! ! ! ：! 鱼! ! 型! 望! ! 竺曼翌巳! ! 塑! ! 竺! i 堕旦! 圣盟：! ! 生! l 壁盟坐! 型! 望! 巳垦垒! 皇! 晶型晶格常数n m 密度g c m 3 kbc 弘 单斜 0 5 1 4 5 4 o 5 2 0 7 50 5 3 1 0 79 9 0 1 4 ，5 6 5 四方0 5 0 9 4o 5 2 6 9 26 10 立方0 5 0 6 5 6 2 7 2 2 液相色谱的基本理论 2 2 1 液相色谱的分离原理及功能原理图 液相色谱中所使用的流动相为液体。固定相主要有两类：一类为具有活性的 多孔性吸附剂，另一类为涂在载体表面的高沸点的有机化合物液膜。当组分由流 动相带入柱中时，就会被吸附剂吸附，流动相以一定的流速冲洗柱子，被吸附的 组分就会被解吸附下来。随着流动相不断流动，组分在柱中吸附剂表面就会发生 反复多次的吸附，解吸附过程。如果多组分的样品进入色谱柱中，由于吸附剂对 组分有不同的吸附力，经一段时间，各组分在柱中运动速度就不同。吸附力弱的 组分容易被解吸附下来，最先离开柱子。各组分彼此达到分离。如图2 1 所示： 2 2 2 定性分析 定性分析就是要确定样品的一些未知组分是什么物质，在液相色谱中保留值 定性的方法主要是直接与己知标准物对照的方法。色谱分析中的定性主要是依据 第二章基本理论 保留值，即和己知的标准物的保留值进行对比。已知标准物与待测物的保留值完 全相同时，则未知峰可能与此已知的标准物是同一物质，特别是在改变色谱柱或 洗脱液的组成时，未标准物的保留值与已知标准物的保留值也能完全相同，则可 以基本上认定未知峰与标准物是同一物质。 由于即使保留值完全相同的两个峰，也可能是不同的物质，因此在最终准确 确定色谱图中某个峰是什么物质时，还需要一些辅助技术。通常应用联机性。通 称“四大谱”的质谱法，红外光谱法，紫外光谱法和核磁共振波谱法对于有机化 合物具有很强的定性能力，特别适用于单一成分的定性，因此，将色谱分析与这 些仪器联用，就能发挥各自方法的长处，很好的解决组成复杂的混合物的定性分 析问题。 2 2 3 定量分析 在色谱h p l c 定量分析中常用的定量方法有标准曲线法、内标法。按测量参 数又可将上述两种定量方法分为峰面积法和峰高法。这些定量方法又各有优缺点 和使用范围，在什么情况下，选用哪种定量方法，这是一个十分重要的，必须正 确决定的问题。如果定量方法选择的不合适，所得出的定量结果，也必然有较大 误差。 在色谱定量分析中，选择峰高法还是选择峰面积法，主要决定在检测器的线 性范围内，峰高和峰面积测定的准确性和重复性。在分离度较好，色谱峰形较好， 峰面积可以准确测量时，以峰面积法定量为好。特别是在气相色谱使用程序升温 和液相色谱使用多元梯度洗脱时，最好使用峰面积法定量。由于我们的实验是使 用液相色谱的多元梯度洗脱法，所以在定量分析时，选择峰面积法。 标准曲线法也称外标法或直接比较法，这是在色谱定量分析中，特别是 h p l c 定量分析中比较常用的方法，是一种简便、快速的绝对定量方法。与分光 光度分析中的标准曲线法相似：首先用预测组分的标准样品绘制标准工作曲线， 此标准工作曲线应是通过圆点的直线。若标准工作曲线不通过圆点说明测定方法 存在系统误差。标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。 标准曲线法的优点：是绘制好标准曲线后工作就很简单了，计算时可直接从 标准工作曲线上读出含量，这对大量样品分析十分合适。特别是标准工作曲线绘 制以后可以使用一段时间，在此段时间内可经常用一标准样品对标准工作曲线进 行单点校正，以确定该标准工作曲线是否还可使用。标准曲线法的缺点：是每次 样品分析的色谱条件( 检测器的响应性能，柱温度，流动相流速及组成，进样量， 柱效等) 很难完全相同，因此容易出现较大误差。另外，标准工作曲线绘制时， 第二章基本理论 一般使用预测组分的标准样品( 或已知准确含量的样品) ，因此对样品前处理过 程中预测组分的变化无法进行补偿。 内标法是选择适宜的物质作为预测组分的参比物，定量加到样品中去，依据 预测组分和参比物在检测器上的响应值( 峰面积或峰高) 之比和参比物加入的量 进行定量分析的方法。它克服了标准曲线法中，每次样品分析时色谱条件很难完 全相同而引起的定量误差。把参比物加到样品中去，使预测组分和参比物在同一 色谱条件下进行分析，可使定量的准确度提高，特别是内标法测定的预测组分和 参比物质在同一检测条件下响应值之比与进样量多少无关，这样就可以消除标准 曲线定量法中由于进样量不准确产生的误差。 内标法的关键是选择合适的内标物。内标物应是原样品中不存在的纯物质， 该物质的性质应尽可能与预测组分相似，不与被测样品起化学反应，同时要能完 全溶于被测样品中。内标物的峰应尽可能接近预测组分的峰，或位于几个预测组 分的峰的中间，但必须与样品中的峰不重叠，即完全分开。内标法的优点是：进 样量的变化，色谱条件的微小变化对内标法定量结果的影响不大，特别是在样品 前处理前加入内标物，然后再进行前处理时，可部分补偿预测组分在样品前处 理时的损失。若要获得很高精度的结果时，可加入数种内标物，以提高定量分析 的精度。内标法缺点：选择合适的内标物很困难，内标物的称量要准确，操作较 麻烦。 2 2 4 评定高效液相色谱的基本参数 高效液相色谱法和气相色谱法在各种溶质的分离原理、溶质在固定相保留规 律、溶质在色谱中的峰型扩散方面有许多相似之处，在气相色谱中应用的表达色 谱分离过程的基本关系式，绝大多数也适用于高效液相色谱法。 2 241 保留值的基本关系式 保留值的基本关系式：t r = t r + t o v r 5v m + v s k p = v m ( 1 + k ) 公式( 2 1 ) 公式( 2 - 2 ) k - - k p 胪t r t o 公式( 2 3 ) t r 为保留时间，t r 。为调整保留时间，v r 为保留体积，v m 为柱温、柱子平均压 力下，色谱柱中流动相的体积，v 。为色谱柱中固定相的体积，k 。为分配系数，k 为溶质在色谱柱中分离后的容量因子，1 3 为相比率，是色谱柱中流动相与固定相 的体积比。 0 2 ，1 = t r 。2 ) t r 公式( 2 4 ) 0 【2 ，l 为分离因子，表示在相同色谱操作条件下，两个相邻组分的调整保留时 第二章基本理论 间之比，表征了色谱柱分离的选择性。 2 2 4 2 色谱柱效的基本关系式 色谱柱长为l ，虚拟的塔板间距离为h ，色谱柱的理论塔板数为n ，则三者 的关系为： n = l h 公式( 2 - 5 ) 理论板数n = 1 6 ( t r m 2 = 5 5 4 ( t r w i n ) 2 公式( 2 - 6 ) w 为峰宽或称基线宽度，表示由色谱顶峰与色谱峰两侧拐点处作切线与峰 底基线相交两点间的距离：w 为半峰宽，表示通过色谱峰峰高的中间点作平行 于峰底的直线，此直线与峰两侧相交点之间的距离。 当固定相确定以后，要使一对组分的分离达到某一个r 值，柱子必须具有最 低限度的理论塔板数，即最低柱效；增加柱长可以改进分离，但是柱长增加( 同 时压力增大) ，分析时间也随之增加，峰宽也随保留时间延长而增加。 。 2 2 4 3 相邻组分分离度的基本关系式 分离度是既能反映柱效率又能反映选择性的指标，称总分离效能指标，分离 度又叫分辨率。表示两个相邻色谱峰的分离程度，以两个组分保留值之差与它平 均峰宽值之比。 r = 2 ( t m 2 一t r , i ) ) w 1 + w 2 = 2 ( t r ( 2 ) - t r ( 1 ) ) w l + w 2公式( 2 - 7 ) 通常用r = i 5 作为相邻两组分已完全分离的标志，如图2 2 所示： 0 0 0 第二章基本理论 2 3 高效液相色谱法建立的步骤 了解样品的有关情况 首先应对样品有足够的了解，并明确分析目的( 同一样品，不同的测试要求， 其方法也可能不一致) 。样品的重要性质包括：所含化合物的数目；化学结构( 官 能团) ；分子量；p k a 值；u v 光谱图；被测组分在样品中的浓度范围；样品的溶 解度、沸点及其稳定性；可能存在的干扰物质及样品的复杂程度等。 l 、分析大分子、小分子还是生物分子 一般常规的h p l c 分析分子量2 0 0 0 以下，大分子一般采用凝胶色谱、生物 大分子采用不能变性的色谱体系。 2 、样品是混合物、天然物质还是基本是单一物质。 如果是天然物质，一般分离完全采用梯度体系。如果是混合物，则分析混合 物中是否有结构类似的异构体。 3 、测定是主成分、还是少量成分或痕量成分。 主含量的测定一般比较容易，但少量成分的测定要考虑分离完全的问题，痕 量成分则要考虑检测器的类型，采用何种提取方法和检测的灵敏度等。 4 、分离化合物是极性、弱极性、非极性还是离子化合物、两性化合物。 非极性化合物以正相体系较多，如果溶于反相体系的溶剂，可采用反相体系。 弱极性、极性化合物采用反相较为方便，可在流动相中添加改性剂，调节合适的 p h 值。离子化合物可以采用反相通过调节p h 值或者添加离子对试剂，也可采 用离子交换。两性化合物中水溶性差的可采用反相，但在反相出峰快的则考虑离 子交换，也可考虑衍生后测定。对于极性的糖类物质，可用 用聚合物的糖柱。大分子的极性化合物、离子化合物，往往采用特定的色谱柱， 多为聚合物柱子。 5 、样品的溶解度、沸点 样品在不同溶剂中的溶解度，对色谱条件的选择非常重要，测定其溶解的性 能，则可以判断其化合物可能的类型。非极性样品不溶于水，但溶于有机溶剂。 如果只能溶于非极性溶剂，一般建议做正相。溶于极性溶剂，以反相为上策。极 性和离子化合物一般都溶于水，但在不同p h 值下区别可能很大。极性化合物在 水和极性溶剂中都有一定的溶解度。从溶解度可以判断出采用何种体系为佳。易 挥发性的低沸点的物质在蒸发光检测器( e l s d ) 中难以检测。 6 、样品的稳定性 如果样品存在水解、光解、醇解、氧化、分解则测定时需注意。对光敏感物 第二章基本理论 质，用棕色瓶，避光保存，不宣存放，随配随做。易水解的物质、要选择合适的 溶解溶剂。有些样品可能存在醇解，流动相不能用甲醇，而要用乙腈。易氧化的 物质( 如p a p 的测定) ，溶解时可考虑加抗氧剂，调节p h 值。胺类化合物，产 品不稳定的化合物，分析越快越好。 7 、化合物的化学结构( 官能团) 常见的基本结构是苯环、杂环、多环芳烃。基团有c o o h 、o h 、n i t 2 、s 0 3 h 、 c 1 ( b r ) 、c h o 、c o 、c h 3 、c 2 h 5 、n = n h 、s o 、s 0 2 、o 等。亲水性的基团在 反相中出峰时间前移，疏水性的基团出峰后移。从存在的结构可以判断出其在溶 剂中的溶解度。 8 、化合物的p k 值 知道p k 值，有助于方法的建立，尤其流动相p h 的选择。p k 的差异是官能 团造成的。 9 、u v 光谱图 知道其吸收波长的曲线有助于检测，如果有d a d 则关系不大。多组分的样 品，宜多选几个波长。同一样品在不同的流动相及p h 最大波长可能不一致。 有双键共轭的结构紫外吸收较大，单键的则在低紫外区有一定的吸收 总之，充分了解了被分离样品的性质，将可能提供一个参考的分析条件，缩 短分析时间和分析难度。 2 3 2 流动相的选择 l 、流动相的性质要求 一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于 得到纯品和低毒性等特征。 选好填料( 固定相) 后，强溶剂使溶质在填料表面的吸附减少，相应的容量 因子k 降低；而较弱的溶剂使溶质在填料表面吸附增加，相应的容量因子k 升高。 因此，k 值是流动相组成的函数。塔板数n 一般与流动相的粘度成反比。所以选 择流动相时应考虑以下几个方面： ( 1 ) 流动相应不改变填料的任何性质：低交联度的离子交换树脂和排阻色谱 填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动 相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。 ( 2 ) 纯度：色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在 柱上积累时。 ( 3 ) 必须与检测器匹配：使用u v 检测器时，所用流动相在检测波长下应没有 吸收或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的 第二章基本理论 溶剂作流动相，以提高灵敏度。 ( 4 ) 粘度要低( 应 2 e p ) - 高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效， 还会使柱压降增加，使分离时间延长。最好选择沸点在1 0 0 0 c 以下的流动相。 ( 5 ) 对样品的溶解度要适宜：如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影 响了纯化分离，且会使柱子恶化。 ( 6 ) 样品易于回收：应选用挥发性溶剂。 2 、流动相的选择 在化学键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力直接与它的极性相关。在正相色谱 中，溶剂的强度随极性的增强而增加：在反相色谱中，溶剂的强度随极性的增强 而减弱。 正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。 反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性 调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的 保留值和分离选择性有显著影响。一般情况下甲醇水系统已能满足多数样品 的分离要求，且流动相粘度小、价格低，是反相色谱最常用的流动相。但s n y d e r 则推荐采用乙腈一水系统做初始实验，因为与甲醇相比，乙腈的溶剂强度较高且 粘度较小，并可满足在紫外18 5 - 2 0 5 n m 处检测的要求，因此，综合来看乙腈水 系统要优于甲醇水系统。 在分离含极性差别较大的多组分样品时，为了使各组分均有合适的k 值并分 离良好，也需采用梯度洗脱技术。 2 3 3 固定相的选择 l 、色谱固定相的评价 根据s c h o m b u r g 、u n g e r 和t r u d i n g e r 等人对高效液相色谱固定相的研究，确 定性能良好的色谱固定相应具备如下的性质： ( 1 ) 化学稳定性：在很低或者很高的p h 值的流动相中长期保持化学稳定性 而不溶解 ( 2 ) 机械强度：在高压下不破碎，具有较高的强度 ( 3 ) 粒子具有很窄的粒径分布和很高的表面积 ( 4 ) 粒子的空隙直径要与要分离的物质的分子直径相匹配且有很好的连通性 ( 5 ) 固定相能够抵抗化学降解和热降解作用 2 、固定相保留机理的研究 ( 1 ) 线形溶剂化能相关( l s e r s ) 是一种简单的并且准确度很高的用来评价待 测物与流动相、固定相之间的相互作用的方法。l s e r s 方法最早是在二十世纪七 第二章基本理论 十年代中期由k a m l e t 和t a f t 共同发展起来的，这种方法将待测物与流动相之间 的相互作用分为三种类型：空腔的形成分散、偶极性极性能力以及氢键作用。 这种方法将待测化合物的保留与溶剂化参数有机结合起来，能够更好地理解固定 相的保留机理，并且对化合物的保留有良好的预示能力。 ( 2 ) 定量结构保留相关( q s r r ) 是色谱学基础理论的重要组成部分，它是用 来表征固定相的性质和预示化合物在固定相上保留的重要方法。从根本上说，在 q s r r 研究中所使用的方法来源于结构和性质之间的关系，所不同的是在q s r r 研究中更强调了色谱参数在结构和性质之间的关系，这种关系属于所谓的超热力 学模型。具体做法是以化合物的各种结构参数为自变量，以化合物的保留数据作 为因变量，通过数理统计的方法建立一个结构描述参数与容量因子间的定量关 系。匹配参数的分析，对研究固定相的保留机理和预示化合物的保留都是非常重 要的。 。表2 2 高效液相色谱固定相 t a b l e 2 - 2t h es t a t i o n a r yp h a s eo fh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 注：h 斗好+ + 一般+ 差 分离中等极性和极性较强的化合物可选择极性键合相。氰基键合相对双键异 构体或含双键数不等的环状化合物的分离有较好的选择性。氨基键合相具有较强 的氢键结合能力，对某些多官能团化合物如甾体、强心甙等有较好的分离能力； 氨基键合相上的氨基能与糖类分子中的羟基产生选择性相互作用，故被广泛用于 糖类的分析，但它不能用于分离羰基化合物，如甾酮、还原糖等，因为它们之间 会发生反应生成s c h i f f 碱。二醇基键合相适用于分离有机酸、甾体和蛋白质。 分离非极性和极性较弱的化合物可选择非极性键合相。利用特殊的反相色谱 技术，例如反相离子抑制技术和反相离子对色谱法等，非极性键合相也可用于分 离离予型或可离子化的化合物。o d s ( o c t a d e c y ls i l a n e ) 是应用最为广泛的非极性 键合相，它对各种类型的化合物都有很强的适应能力。短链烷基键合相能用于极 第二章基本理论 性化合物的分离，而苯基键合相适用于分离芳香化合物。 另外，美国药典对色谱法规定较严，它规定了柱的长度，填料的种类和粒度， 填料分类也较详细，这样使色谱图易于重现，而中国药典仅规定填料种类，未规 定柱的长度和粒度，这使检验人员难于重现实验，在某些情况下还浪费时间和试 剂。 2 3 4 样品的测定 1 、流动相比例调整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度， 因此每次检新品种时几乎都须调整流动相( 按经验，主峰一般应调至保留时间为 “1 5 分钟为宜) 。所以第一次检验时少配流动相，以免浪费。弱电解质的流动相 其重现性更不容易达到，注意充分平衡柱。 2 、样品配制：溶剂的选择：容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可 能释放到样品液中造成污染，而且还会吸收某些药物，引起分析误差。某些药物 特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要 时应将玻璃容器进行硅烷化处理。 3 、记录时间：第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各 进一针，并尽量收集较长时间的图谱( 如3 0 分钟以上) ，以便确定样品中被分析 组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来， 确定是否会影响主峰的测定。 4 、进样量：药品标准中常标明注入1 0 p 1 ，而目前多数h p l c 系统采用定量 环( 1 0 p , 1 、2 0 p 1 和5 0 - t 1 ) ，因此应注意进样量是否一致。 5 、计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、 有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检验时应注意。 6 、仪器的使用： ( 1 ) 流动相滤过后，注意观