（化学工艺专业论文）纤维素分解菌的混合培养及互生特性研究.pdf

! ! 幽苎鲎竺 ：! ! ! 丝兰一 纤维素分解菌的混合培养及互生特性研究 化学：艺专业 研究生废廛住指导老师皴鲞塑麴攮 本文利用从髓烂稻草、牛粪中薅选出来翘能较好分解纤维素的霹椿纾维 素分解蓥m 1 、b 3 、s 7 和s 1 2 ，磷究各蠡懿生长特瞧，寻求农、监痊弃物潮俸培 养基的配比，得到最佳发酵条件，优选出四株菌种之间的较好的混酶组合， 并初步研究了它们之间的互生关系，然后通过固态化培养证实了它们较好的 纤维素降解能力。最终得到了适合工业化生产的混菌组合方式及其发酵条件。 对生化实验室提供兹靼抹麓狩的生长特性进行磷究，褥出m i 、b 3 、s 7 帮s 1 2 最逶生长弘 篷分翻为6 5 、7 ，5 、6 5 鞠7 ，5 ；最适生长汪囊为3 0 4 0 ；供氧均应充分。s 7 则具有较强的耐热性。m t ，b 3 和s 7 纤维索酶同时分 布于胞内和胞外，而s 1 2 的纤维索酶却更多的分布于胞内。 适合四株菌种的最佳固体培养基配比为：豆粉5 ，麸皮7 5 ( 溆熬) 。 固体培养时闽为3 天。 滚俸臻莠簸德赘潺萤缝合发赘方式是：s 7 ，s 1 2 莘瑟m 1 $ 7 ，菝耱我穰为 $ 1 2 1 s 7 ( 1 ：1 ) ；m 1 $ 7 ( 1 ：2 ) 、( 2 ：1 ) ，以及较优按种先后顺序为，$ 7 s 1 2 ： s 7 先接；m 1 $ 7 ：m l 先接。固态化培养时最佳的混菌组合$ 7 s 1 2 和m i s 7 也表现出了很好的纤维素降解能力，纤维素含量由发酵前的3 6 8 9 分别降到 了2 7 7 3 朔2 7 。2 0 ，降解率达到了2 4 8 3 和2 6 2 7 。产物色泽棕黑，表西 糖饔，翔羧大大跨糕，取褥了较好戆发酵效票。 本课越研究的四株菌萃孛在优化的发酵条件和缀合下能在廉价的圈态优培 养基上生长征常，并能在较短时间内较好的降解纤维素，与城| _ ：垃圾处理和 有机磷肥工艺相结合，能更大的发挥各自的优点，对农业废弃物的资源化和 解决环境污染的闯题都开辟了新途径。 关键司：纾绫索分鼹莛潺台壤葵固态囊二壤莠穗耩羧甲基纾维素 l 鳢残大学蘸圭学位论文 t h e s t u d yo f t h em i x e dc u l t u r ea n dt h em u t u a l i s t i c c h a r a c t e r i s t i c so ft h ec e l l u l o l y t i cs t r a i n s c h e m i c a lt e c h n o l o g y s u p e r v i s o r ：z h o n g b e n h ep r o f e s s o r t h i sp a p e rs t u d i e st h ec h a r a c t e r i s t i co ft h ef o u rs t r a i n st h a ts c r e e n e df r o mt h e d e c o m p o s e ds t r a wa n dt h es o i i o ft h eo x ，a n ds t u d i e st h ec o n d i t i o n so ft h e f e r m e n t a t j o na n dt h es o l i d - s t a t ec u l t u r em e d i u m t h a tt h es t r a i n sc a nw e l lg r o wo n t h e nw em i xt h es t r a i n sb yd i f f e r e n tc o m b i n a t i o n sa n df i n do u tt h eb e s to n et h a t c a nd e c o m p o s et h ec e l l u l o s ea n ds t u d yt h es y m b i o s i so ft h ec o m b i n a t i o n s t h e n w ec u l t u r et h eb e s tc o m b i n a t i o n so nt h es o l i d - c u l t u r e 越e d i u mm a d eo f t h ec o n d u c t o ft h ea g r i c u l t u r e ，a n dp r o v e dt oh a v eb e s tc a p a b i l i t yt od e c o m p o s et h es t r a w f i n a l l yw ef i n do u t t h eb e t t e rc o m b i n a t i o n sa n dt h ec o n d i t i o no ff e r m e n t a t i o nt h a t c a nb eu s e di nc o m m e r c i a lm a n u f a c t u r e f o u rs t r a i n sn a m e da sm l ，b 3 ，s 7 ，s 1 2a l eo b t a i n e dt h a tt h es u i t a b l ep h v a l u e ss h o l l l db e6 5 ，7 5 ，6 5a n d7 5 a tt h es a m et i m e ，t h ef o u rs t r a i n sa l lg r o w w e l la t3 0 4 0 cw i t he n o u g ho x y g e n 。a n dt h es 7h a st h ea b i l i t y 协b e a r p r e f e r a b l et e m p e r a t u r e m 1 b 3a n ds 7h a v et h es a m ea m o u n to fe n z y m ei nt h e e e l la n do u to f t h ec e l l b u ts 1 2h a sm o r ei nt h ee e l lt h a no u to f t h ec e l l 。 t h eo p t i m i z e dr e c i p eo ft h es o l i d - s t a t ec u l t u r eo ft h es t r a i n si so b t a i n e da s f o l l o w s ：p o w d e ro f t h eb e a n , 5 ；b r a n ，7 s t h es t r a i n sg r o w w e l lo nt h ec u l t u r e m e d i u mf o rt h r e e d a y s t h eo p t i m i z e dc o m b i n a t i o n sa r es 7 s 1 2a n dm 1 s 7 ，a n dt h e o p t i m i z e d m i x - s t r a i ni n o c u l a t i o np r o p o r t i o ni st e s t e dt ob es 7 s 1 2 ：1 ：l ，m 1 $ 7 ：2 ：l ，1 ：2 ， t h es e q u e n c eo ft h ei n o c u l a t i o ni st h a tf o r $ 7 $ 1 2 ，s 7f i r s ta n df o rm 1 $ 7 ，m i f i r s t h 强锺丈学硬士擎谯论文 w h e n c u l t u r i n g o nt h es o l i d s t a t ec u l t u r e m e d i u m ，t h eo p t i m i z e d c o m b i n a t i o n sa r ea l s os h o w i n gb e t t e ra b i l i t yt od e c o m p o s et h ec e l l u l o s e ，t h ec o n t e n t o ft h ec e l l u l o s ed r o p sf r o m3 6 8 9 ( b e f o r ef e r m e n t a t i o n ) t o2 7 7 3 a n d2 7 2 0 ( a f t e r f e r m e n t a t i o 吣，t h er a t eo ft h ed e c o m p o s i n gr e a c h 采2 4 。8 3 a n d2 6 。2 7 t 殛 o u t w a r d a p p e a r a n c e o ft h e p r o d u c t a s s u m e sb l a c k ，v i s c o u sw i t hm e c h a n i c a l s t r e n g t hd e c r e a s i n gl a r g e l y t h ef o u rs t r a i n ss t u d i e di nt h i sp a p e rc a n g r o w o nt h ec h e a ps o l i d - s t a t ec u l t u r e m e d i u mi nt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o nb yt h e o p t i m i z e dc o m b i n a t i o n s , a n dw e l l d e c o m p o s e t h ec e l l u l o s e 。i fc o m b i n ew i 氇t h e d i s p o s a lo f t h ew a s t eo ft h ec i t ya n d t h et e c h n o l o g yo ft h e p h o s p h o r i cf e r t i l i z e r , i tw i l ld e v e l o pe a c ho t h e r , a n da d d n e w c o n t e n tt ot h ee x p l o i t i n go ft h es t r a wr e s o u r c ea n d a d m i n i s t e r i n g t h ep o l l u t i o n k e yw o r d ：c e u u l o l y t i cs t r a i n m i x e dc u l t u r es o l i d - s t a t ec u l t u r es t r a w c m c i i i 叫川大学彤学位论文 1 前言 1 1 纤维素资源及其利用 111 纤维素资源 据不完全统计，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1 8 1 0 “t ， 这些植物物质所含的能量相当于全球人类每年能量消耗量的2 0 倍，食物中所 含能量的2 0 0 倍。纤维素是构成植物细胞的基本成分，纤维素占全球植物总 干重的3 0 5 0 ，是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物，它存在于 所有植物当中。在生物界中，结合于有机体中的碳达2 7 l o l o t ，在自然界有 机体中构成纤维素的碳约占4 0 ，据此估算，在植物界中纤维素的总量约达 2 6 0 1 0 旧t ，而且自然界中的植物原料是年复一年地不断生长和更新的，可以 说，纤维素在自然界中是一种最丰富的可再生的有机资源【2 】。纤维素是一种不 能被大多数动植物直接利用的多糖物质。但对人类来说只要能将其降解成小 分子物质，纤维素就会成为一种有广阔应用前景的资源。而且这种潜在的资 源数量是惊人的，其中的大多数作为绿色植物的成分在维持生态平衡中起作 用而不宜利用，但是仍有数量可观的纤维素由人类生活和生产产生，它们主 要存在于农作物秸秆和城市垃圾之类的废弃物中。 灾荒或战乱造成的粮食危机依然是正存在的和潜在的威胁；随着全球经 济的飞速发展，地球上石油、煤炭的储量正以惊人的速度减少，能源危机成 了世界大多数国家所面临的一个严峻闯题：由于对资源的破坏性开采和利用， 人类赖以生存的环境正在不断地恶化，对可再生资源利用的研究与开发的可 持续发展战略已在世界各国逐步展开。如何处理和利用废弃纤维素将成为一 个十分紧要的问题。 1 1 。2 农业废弃物资源的利用现状 植物纤维素资源的开发利用对解决粮食和能源短缺以及环境污染问题有 极其深远的意义。我国的纤维素资源极为丰富，每年的农作物秸秆产量达5 7 1 0 7 吨，约相当于北方草原年打草量的5 0 倍f 2 】。但是，农作物秸秆产生数 量多且产生时间集中( 每年到收获季节农村就会有大量的秸秆产生) ，而我国 的农作物秸秆主要用于燃誊辜、謇禽饲料与自然堆肥，不仅利用效率低，而且 随着农村生活水平的提高，农作物秸秆成为农村固体废弃物的主要来源。 现阶段，农作物秸秆的最常用的处理和利用方法有： 1 四川夫举硕土学位论文 1 加工成拳酲饲料，作为革食动物的食料。这是一种传统的方法，现在我阕 约有15 誊话季予用于戴蠲途。藏法筑主要疑点楚麓稽营莽徐毽 蕊。 2 秸秆还罔。即利用农田土壤中的微生物降解秸秆。这是我国处理秸秆的 主要方法。啜然此法可暂时解决秸秆过剩问题，但是由于农f f l 土壤中的微生 甥酶怨能力嘉投，菇释会残整在壤中不囊烂，姨焉使壤臌力过低，著逡 成耕作困难。 3 造纸，编织，制燃料、沼气等。 4 自然界的许多微生锈具有氧化、分解有孝几避体废弃物的熊力。两我国的 劳动久藩在长期弱生产实践中，翠已懂得剩臻旗手予、落时、辩辇帮畜、禽粪 便堆积发酵制作肥料。但都是采用传统的手工操作和自然堆积的方式，并依 靠自发的生物转化作用，发酵周期长，处理量小一 二个世纪2 0 年代，出现了 疆棱蛙裁技术，著逐漤发矮为憝理生活垃圾、污淀污承、入帮整禽粪霞及农 林废物的煎要方法之。 即使有以上方法，对于我国这样的一个农业大国，特别烧在城市周边较 富裕的农辩地区，每年侠会产生大豢的无法处理的穆秆，农民、捺其焚烧，产 生大量的濑雾，不仅污染了环境，雨虽会造成交邋事故，甚至机场、高速公 路无法运行。由此可见，秸秆的处理与利用技术急需开发。飙在已经取得成 效和正开发的新技术有：生产食用荫、生产蛋白饲料口l 、制有机肥、生产纤维 素酶秘j 等。+ 譬褪蠲瓣及穗季手还困提魄，蛋自键瓣耪畜礁l 垂秘分羽有营葵绥经较 高和肥力较高的优势，而生产纤维索酶则具有更高的商业价值。以上四个方 法除食用荫以生产高等真菌为目的外，其他三个方法均需要快速高速降解纤 维素的菌摹孛参与发酵。 1 1 3 城市垃圾的处理与利用现状 城市生活垃圾是指以家庭为主以及办公室、餐馆、饭店等场所所排放出 赫各耱疲携，藏努主簧菇霹余、绥张、塑辫、馋本、布类、玻麓及箕穗痤貔【”。 世界的垃圾年产量约为1 0 亿吨，其中纤维素的含攮是十分可观的。纸张、织 物、含纤维索食品及草木等均含有纤维素。我国城市生活垃圾产量在1 9 9 5 年 已超过l 亿噫，著显仍在以每年1 0 左右懿速度增长，超过挺秀乎臻8 4 2 的年增长速度f 2 】。 网1 1 人学顺l 一学位论文 据统计，大城市生活垃圾中有机成分约占总量的6 0 ，无机物约占4 0 ， 其中废纸、塑料、玻璃、金属、织物等可回收物约占总量的3 0 。 城市垃圾处理方法常见的有：焚烧法、填埋法、堆肥法等。其中堆肥法 适用于有机垃圾，它是利用自然界的微生物降解有机垃圾为腐殖质的垃圾处 理法。堆肥( c o m p o s t i n g ) 是指在控制条件下( 在一定的水分、c ，n 比和通风 条件下) i 使来源于生物的有机废物，发生生物稳定作用( b i o s t a b i l i z a t i o n ) 的 过程。这一定义强调，堆肥原料来自生物界；堆制过程需在人工控制下进行， 不同于卫生填埋、废物的自然腐烂和腐化；堆制的实质是生物化学过程【2 1 1 3 1 。 木质素、纾维素在堆肥中的主要结构形式是木质纤维素，约占4 0 ；半纤维 素约占2 0 3 0 ：木质素约占2 0 3 0 p , s i 。 现代化的堆肥生产一般采用好气堆肥工艺，它通常由前处理、一次发酵、 后发酵、后处理及贮藏等工序组成。前处理指破碎和分选前处理工艺，通过 破碎和分选，去除非堆肥物质，调整垃圾的粒径；一次发酵即好氧高温发酵； 后发酵即简易堆放；后处理就是对完全腐熟韵堆肥进行再分选，去除无机物， 可再根据需要调整粒径。 在堆肥堆制过程中，进行微生物接种，可以加速堆肥材料的腐熟作用。 关于堆肥微生物生物接种的工艺，普遍认为城市垃圾中微生物种类繁多，接 种好热性纤维素分解菌不能起到积极作用。在堆肥腐熬过程中，纤维素分解 作用是关键问题，因此各种加速纤维素分解的技术都是有积极意义的。研究 者利用筛选出的一株自生固氮菌和一株纤维素分解菌进行混合培养，初步探 索了两种菌混合作用下对生活垃圾的降解作用及增肥效应。结果表明，两种 菌在一定情况下能相互利用、相互依存，在两种菌混合作用下可以加速有机 四川大学预士学位论文 垃圾的降解，同时可提赢其含氮璧 5 1 。在堆g 巴过程中，有机联生化降鳃会产生 热量，鲡聚这部分热爨大子堆愁魄环境筑敬热，难琶耨辩熬滠度鲻会上升。 此时，热敏感的微生物就会死亡，耐高温的细菌就会快速地生长、大量地繁 殖【7 l 。遥商学者对城市生活垃圾堆肥过程中的微嫩物类群进行了分离鉴定，在 藏臻究鏊磷上，提窭在簸生垃毅会骞夔叁然激妻蔓貔嚣薅基麓上，添热鑫效蓬 种或酶制剂，将增强对垃圾的分解和利用，对于缩短堆肥时间也具有重臻意 义。 l + 2 终维素的生物转纯 1 2 1 j 坪维素的组成和性质 在檬物细胞壁中，纤维素分子聚集成纤维熊，包埋在半纤维素和术质索 墨，形裁秘靛结搀。绛缝蠢分子零隽貔蘩密络擒毯及交本凌索秘半绎缝索形 成钓保护屡造成纤维紫不容易障解雨难馘被充分利用或被大多数微生物澎接 作为碳源物廪而转化剿用 纤缭素分子是鸯麓甍糖努子避涟一l ，4 糖营键连接聪藏的链状囊分子 聚合戆，每个大分予巾含豹蘩萄糖残基数一般为8 0 0 0 - - - 1 2 0 0 0 个。天然的纤 维素由排列整齐而规则的结晶区和相对不规则、松散的无定形区构成，其结 晶度一般在3 0 8 0 之间。纤维綮构成植物细胞壁的主要成分，可占细臌予 重静2 0 毒8 。野缭襄胃拳簿戒蘩莓耱。虽然翔筵，趣楚蠢荨：绎维素终楚植 物的支持结构的主要成分，其葡鹅糖亚基排列紧密有序，形成晶体的不遮水 结构，因此纤维素不能溶于永，难以永解，而飘无法作为动物和人类的巍接 营养源。少数动蛎如拳霹麸以纤维索兔食鐾，瀑楚医尧它髓酌酝遂幸会露分 解纤维索豹微生物豹缘故。丽能够参与分解纤绒素的酶统称为纤维素酶。在 纤维素酶的作用下，纤维素最终水解为葡萄糖，这个过程在正业上成为纤维 素的糖化。 零次实验疆完衡袋蘑静是承耩豹疆器。疆怒一年垒葶零援秘，释妻立， 秆壁厚约l 衄，髓黢较大。茎表皮下面由4 6 层厚壁纤缎细胞组成纤维组 织带，向内为基本组织的薄壁细胞。维管束排成两圈；外圈维管束呈扁圆形， 嵌埋在脊状突起豹纾缭缓织豢肉；凌匿维警泰较大，呈糖嚣澎，维警康努露 有1 2 麓纤维细胞缀成的维警束辅。稻草是萃炎纾维原料中纤维较短而细的 一种，其纤维平均长嶷为i m m 左农，宽度仅8pr f l 左右，细胞上有明显的纹 4 叫川大学硕士学位论文 孔或不甚明显的纹孔，胞腔较小9 。植物纤维原料细胞壁中的纤维素的含量因 细胞发育过程中的不同阶段和植物种类差别而有很大变化：初生细胞壁仅含 1 1 0 纤维素，高等植物的次生壁约含5 0 纤维素：某些绿色海藻类厚壁含 多于8 0 纤维素，棉花的次生壁几乎都是纤维素。 1 2 2纤维素酶的作用机制及理化性质 纤维素受微生物酶的作用后，使纤维素的聚合度下降发生降解作用。利 用酶具有的基质和空间选择性可以合成具有生物降解性和其他一些特性的聚 合物。在霉菌、细菌、植物及动物中，有很多酶能使纤维素水解，它能使木 材、棉花和纸的纤维素水解降解，从原理上说，纤维素的酶解作用主要是导 致纤维素大分子上的1 3 - - 1 ，4 糖苷键断裂 t o 】。 目前普遍认为，纤维素酶是至少由3 种功能不同但又互补的组分酶构成， 这三种主要成分包括内切葡聚糖酶，即c 1 酶，b - - 1 ，4 一聚葡萄糖酶和1 3 一 葡萄糖苷酶，其对纤维素的降解作用各不相同。c 1 酶是用来降解高度定向的 纤维素，使纤维素的链变短。1 3 - - 1 ，4 聚葡萄糖酶己知有两种形式：一是外 0 1 ，4 聚葡萄糖酶，另一是内6 - - 1 ，4 聚葡萄糖酶。它们对纤维素作用时 外b - - i ，4 一聚葡萄糖酶从纤维索链的非还原性末端脱去单个葡萄糖单元； 而内b - - 1 ，4 一聚葡萄糖酶的作用没有规律，纤维素链中间受该酶水解的敏 感性要比链末端强。8 一葡萄糖苷酶主要作用在葡萄糖的b 一二聚体上，包 括纤维素二糖，此外，它还能作用在芳基一1 3 一葡萄糖苷上。综上所述，天 然纤维素在c 1 酶作用下，产生了水化了的聚合脱水葡萄糖链：经b - - 1 ，4 一 聚葡萄糖酶降解成纤维二糖；由b 一葡萄糖苷酶水解成单糖葡萄糖 t i l t l 2 1 。 目前最易接受的酶水解机理为l l 叫： 内切葡聚糖酶( c 1 酶)1 3 - - 1 ，4 一聚葡萄糖酶 结晶纤维 酶 网川大学硕士学位论文 纤维素对酶水解的敏感度主要决定于纤维索的可到达度。酶水解时，纤 维素秘簿毖须奏接接麓，嚣为纤维素是释不溶于承的、结构复杂蕊鏊溪， 这种接触只能依靠酶扩散到复杂的纤维素网结构中才能实现。任何限制酶接 近纤维索的结构特，谯都会降低它对水解的敏感度。两个最黧要的限制酶降解 纤维豢貔糕可达到凌瓣嚣素是本索戆存在蟊绥缝素魏结晶度。其德一垡溪要 因素楚水分含量、纤维素的聚合殿强及纤维素物料中韵抽出物成分 9 , 1 4 1 。 酶怒一种特殊的骚白质，它可催化化学葳成但其本身性质不变。酶所催 化的物质叫基质，所产生螅产品叫终端产品。闲为酶催化l 乍用是可逆的，因 魏酶蜀毅带来舍残，瞧可蔽消纯。函为酶本隽楚蛋鑫矮，豳藏它对凌毽筑纯 学试剂均敏感。加热可杀死细菌怒因为热破坏了蛋白质的三级结构。同熊他 酶一样，纤维素酶也具有生物酶所共有的特性；催化作用的专一性强；催化 终用懿效率裹；整豫箨震戆条终漾羁随氛”l 。 1 乏3 纤维素分解黼 由予微生物治理环境或处理躁体育极废弃貔方法其有成本低、无= 次污 染、生态恢复努等净譬点，遴入鞠零代戳来，发达国家更蹩辩有益环境豹微生 物开发、应用研究领域投入了犬嫩人力物力，取得了巨大的经济、环境和社 会效益。国内的研究者也在分离研转化有机化食物的微生物，探索有机物生 懿降黪途径魏多棒熬，磅究激生褥攀| 发生魏辩簿戆生铯手羹遗传凝割等镁竣敲 了大薰工作f 9 l 。 纤维素酶的来源非常广泛，融煦、软体动物、原生动物、细菌、放线菌 和真藏镣都能产生纾缑素酶。是魏研究较多黪楚霉萤，其中酶活力较强豹蘧 耱为本霉、蘧霉、穰撵秘青霉，特剔是里搿本霉、绿色本酶、瘫氏本霉等较 为典型，是目前公认的较好的纤维索酶生产菌。细菌中酶活力较强的菌种有 纤维粘麓属、生孢纤维粘菌属和纤维杆菌属，放线菌中有黑红旋丝放线壤、 玫瑰色藏线蓥、驽缭拔线蘩彝基竣瑰藏线藿等。 微擞物中的真麓能降解各种术质纤维原料。白色致腐真菌能够降解纤维 素、半纤维素和木质索等主要成分。、在对侧孢菌、绿色木霉搏菌种的研究中， 科学家对宅织的酶馋照搬瑾进行了阐述。有关翻色致疼囊麓移羧线蓥怼本震 素程本麓纤维鹣降解能力已有些嘏遵。研究者憋成功进行了菌株杂交，通过 杂交提高了真菌利用木质纤维的能力。很有可熊应用基因工程技术对于这些 髓降解木艨纤维的菌株逶行改鼠，这些技术还包籍琢生质体融合授零秘d n a 转化技术落j 。 在长期的实验和生产实践中，人们发现很多生物过程是微生物单独作用 不能完成缄只能微弱进行的，必须依靠两种或两种以上的微生物共同作用才 笈完成。簸审垃圾处理方法难怒过程中，幽予各静努熬蛙微生物黪袋逶 澄度互不籀同，医_ l 篷随着难灏豹交往，好热健徽生秘的种类、数薰瞧逐渐发 生着变化。堆肥发热阶段主爱由中温好氧的细菌和真菌利用容易分解的有机 物，释放出热量，使堆肥温媵升高。在5 0 左右，主要是嗜热性真黼和放线 菌，如嗜热真菌属( t h e r m o m y c e s ) 、嗜热褐色放线菌( a c t i n o m y c e s 攮e r m o f u $ c u s ) 、酱逶，j 、攀藏麓( m i c r o m o n o s p o mv u l g a r i s ) 等。滠废秀至7 0 霹，大多数嗜热经镦生物爨誉逶应，相继大爨残亡或逶入椿l 薨状态弼。 徽攮物混合培养中各种微生物之间的相互关系是既多样又复杂的，可以 有互生、拭生、寄生、拮抗和捕食关系。研究不同纤维素降解菌降解效果的 差异以及混合菌中各菌株的相互作用，可以为工程中优选菌种、发攥菌株蔺 协同搀愆、稼正接抗作用的发生提供实验猿据。 1 3 有枕固体废弃物和城市垃圾处理与制有机磷肥工艺的结合 首先，对城市生活垃圾进行一级分选，在筛出的有机物中添加农业废弃物 接种降解纤维素的菌种进行发酵，发酵物经进一步分选后，这些寓禽有机质 的腐殖旗麟哥送到捌怒车间结合磷矿生产有枫磷肥了，也可结合氮磷铘等化 学驻辩鞠鸯壤复合疆，不仅後农照壤产嚣骞裁予我国记l 基会理篌惩，嚣显遵 是一个城常生活垃圾进行瓷激化、无害亿转纯的有效措施h 戤。 综仓利用城市生活垃圾和农业废弃物，并缡合无机磷肥生产的工艺【1 9 ，2 0 】 具有较明烂的优点：通过前分选使生活垃圾资源化率在6 0 左右；添加混合 后的纾维豢分解菌可提高发黪的效率，使纤维索韧性大大降低，同时缩短了 发酵瓣瓣，最终海燕了运经缓零窝基建投资：发黪垃圾与磷矿滠食浆，与 垃圾濑予蘑耪过程相琏：较，霹降低能耗和减少环境污染，垃圾无害亿较彻底； 生活垃圾处理与磷肥生产绪禽，简化了流程和设备，在技术经济上具有明显 的优越憾。 工艺流獠如圈f 2 0 】： ， 四川大学硕士学位论文 匝匦因妥趸塑团圃匝圈 fif 匿垂圈吨圈+ 匮卜匠酉砷亟蛩叫匦匝垂亟亘口 ifi 画圈匦圈匪圃 1 4 本文的研究目的和实验方案 生物方法处理农业废弃物和城市生活垃圾，其关键还在于纤维素分解菌 对纤维素的降解能力，本文通过四株具有较好纤维素降解能力的纤维素分解 菌自身的特性研究，以及菌种之间的混合培养，研究其互生和酶共同作用的 效果，并寻求适合菌种生长的固态培养基，进行固态培养，干燥制成菌粉以 便使菌种培养能满足工业生产要求。将混合菌株应用于城市垃圾添加农业废 弃物发酵处理后制有机复合磷肥的工艺，可加强纤维素的降解，有效的降低 纤维素的韧性，提高发酵效率，缩短发酵周期，通过与磷矿石混合后制取磷 肥，增加复合磷肥肥效。 具体实验过程：根据实验室提供的四株菌种，首先了解各自的生长特性， 包括适宜的p h 条件，菌种培养温度，供氧条件，耐热性和酶的分布。 寻求四株菌种均能较好生长的农业废弃物固体培养基，重点考察豆粉和 麸皮的含量。 在单菌特性研究的基础上进行菌株的混合培养，通过定时测定口h 和o d 值来观测培养的生长情况；选取双菌混养和三菌混养的生长较好的组合进行 对比实验，并以测定羧甲基纤维素的残余量和酶活的检测手段，比较得出最 优的混菌方式。同时进行固体培养，通过平板菌落计数法观测生长情况，了 解优化菌种在农业废弃物固体培养基上的生长情况，最后测定固体培养基纤 维素的降解情况和菌种在固体培养基上的酶活，观察其实际发酵效果。 筛选出的混合菌株，还有待于进行稳定性研究。除用于城市垃圾处理外， 还可应用于农业有机废弃物处理、制取纤维素酶等的研究。而这一些，还有 许多工作要做。 则川大学砸寸：学位论文 2 蕈菡培养特性的研究 不同培养蒸、环境因素( 温度、p h 值、光照) 、营养条件( 碳源、氮源) 都直接影响徽奄物生长发育。本节主要是研究p 瞌、温度及供羲条嵇露萤株 生长的影响，以寻求最适合四株菌种的生长条件，为以后的发酵实验做好准 备。并对菌豫麓辩蒸襁进行7 磺究，缀詹还辩萤株释维素酶豹分奄徽了初步 的实验。 2 1 实验材料 2 蓥种泉漾 四川大学缴化实验室提供的四种黼株m i ，b 3 ，脚，s 1 2 。m 1 ，b 3 和卵 必缨甍，s 1 2 梵放线蘩。 2 2 主要试翔 m g s 0 4 7 h 2 0 、k h 2 s 0 4 ( 化学纯，汕头市达濠精细化学品公司) ； k 2 h p 0 4 ( 广东涵头众秒豫美厂) ；麓凌羲 ；无承c a c l 2 ( 残都躲江化工 厂) ；m n s 0 4 h 2 0( 重庆j c 碚化学试剂厂) ；z n s 0 4 h 2 0 ( 重庆北碚化学 试剂厂) ；c o c h 6 h 2 0 ( 重庆化学试蒯总厂) ；羧甲基纤维索；c u s 0 4 5 i - 1 2 0 ( 重庆化学试齐总厂) ；亚甲基蓝( 上海试剂三厂) ：酒稿酸钾钠( 成都 鸿鹤他王试剂厂) ；n a o h ( 成都市风凰山福剥化工厂) ；溉铁氰化钾( 天 津市能学试嗣厂) ；盐酸( 成都露澄化工试剂厂) ；无水乙醇( 洗阳化学 试剂厂)以上试剂赊已标明及工业酒精外均为分析纯。 工业酒精，蛋自腙，酵蹲膏( 就京奥博星生秘技术有限责任公司) ；琼 脂( 福建仙游兴榜头调味厂) 麸皮，鬣粉，稻肇，米糠，新率定性滤纸。 2 。1 3 培养蕊 培养基1 号： 警 四j i i 大学硕士学位论文 乳酪蛋白胨1 0 9 ；牛肉膏1 0 9 ；酵母膏5 9 ；葡萄糖5 9 ： 吐温 8 0 1 9 ； 醋酸钠5 9 ；柠檬酸二胺2 9 ；k 2 h p 0 42 9 ；m g s 0 4 7 h 2 0 o 2 9 ；m n s 0 4 h 2 00 0 5 9 ；蒸馏水1 0 0 0 m l ； 培养基2 号： 可溶性淀粉，2 0 9 ；k n 0 3 ，l g ；n a c l ，0 5 9 ；k 2 h p 0 4 ，o 5 9 ； m g s 0 4 ，o 5 9 ；f e s 0 4 ，o 0 1 9 ； 水， 1 0 0 0 m l ； 基础培养基： 牛肉膏3 0 9 ；蛋白胨1 0 0 9 ；n a c i5 0 9 ；蒸馏水1 0 0 0 m l ； l 号平板培养基： 基本成分同l 号培养基，另加2 2 的琼脂； 2 号平板培养基： 基本成分同2 号培养基，另加2 2 的琼脂； 基础平板培养基： 基本成分同基础培养基，另加2 2 的琼脂： 纤维素摇瓶发酵培养基： n a 2 h p 0 4 ，3 0 9 ；( n h 4 ) 2 s 0 4 ，0 2 9 ；尿素，0 5 9 ；m g s 0 4 7 h 2 0 ，0 5 9 ； c a c l 2 ，0 5 9 ；f e s 0 4 7 i - 1 2 0 ，7 5 m g ；m n s 0 4 h 2 0 ，2 5 m g ；z n s o + ，2 0 m g ； c o c l 2 ， 3 0 m g ；琼脂，1 5 2 0 9 ； 水，1 0 0 0 m h另加1 5 的羧甲基纤维 素( c m c ) 。 除特殊要求外，以上培养基均需在1 2 1 ( 0 1 1 m p a ) 下灭菌2 0 m i n 后才 可使用。 2 1 4 设备 y x o s g 4 1 2 8 0 型手提式压力蒸汽消毒器成都胜利医用设备厂 t d g c 2 g 型调压变压器上海正宏电源公司振华稳压设备厂 s w - c j - 1 b u 沽净工作台 。 苏净集团安泰空气技术有限公司 k w b 型摇床四川抗生素工业研究所 p y x d h s - 4 0 x 5 0 隔水式电热恒温培养箱上海跃进医疗机械厂 x y h - 1 0 1 - 1 9 型烘箱上海科析实验仪器厂 光学读数分析天平上海天平厂 l d 4 2 型低速离心机北京医用离心机厂 1 0 四川大学硕士学位论文 7 2 1 型分光光度计可调电炉 2 2 实验方法和结论 实验操作流程： 1 、将保存在斜面培养基上的菌种活化； 2 、接种至液体培养基上，3 0 恒温摇床培养3 天； 3 、将菌种悬浊液按1 0 的接种量接种至高温灭菌后的液体1 、2 号培养 基上，3 0 恒温培养； 4 、每1 2 测试培养基的o d 值。 2 2 1 p h 值对菌种生长情况的影响 微生物作为一个总体来说，其生长p h 值范围极广( p h 值2 8 ) ，绝大 多数种类都生长在p h 值5 9 之间。本实验是以p h 值为5 5 ，6 5 ，7 5 ，8 5 共四种p h 值为研究对象，每1 2 小时用稀酸或稀碱调整p h 值，测定菌液的生 长情况( 比浊法) 作为比较，找出适合菌种生长的最适p h 值。 将活化的菌种在无菌条件下接种于不同p h 值的培养基中，m l 、b 3 和s 7 接到l 号培养基中，s 1 2 接种于2 号培养基中。并将接好种的培养基置于3 0 恒温摇床培养7 2 h ，采用比浊法【2 3 】( 见附录1 ) 实时监测菌种生长情况。 图2 - 1p h 值对菌种m 1 生长情况的影响 i l 四j i i 大学硕士学位论文 图2 - 2p h 值对菌种b 3 生长情况的影响 时间( h ) 图2 3p h 值对菌种s 7 生长情况的影响 1 2 靼凸。 掣o o 四川大学硕士学位论文 图2 - 4p h 值对菌种s 1 2 生长情况的影响 由图2 1 至2 4 可以看出，在不同的p h 值下，在恒温培养7 2 h 后，作为 表征菌种生长量的o d 值有了明显的差别，由此可以得出m i 、b 3 、s 7 和s 1 2 最适p h 值分别为6 5 、7 5 、6 5 和7 5 ，在各自最佳p h 值下，菌种m i 、b 3 、 s 7 和s 1 2 均在4 8 小时( 两天) 左右生长达到最好。 另外，由图2 1 可见m i 对生长环境的p h 值适应范围较广，由图2 2 和 图2 3 可见所取的3 个偏碱的p h 值环境对b 3 和s 7 生长的影响也不大，但 p h 值为5 5 时生长相对较弱，由图2 4 可见s 1 2 较喜偏碱性的环境。 2 2 2 温度对菌种生长情况的影响 温度是影响有机体生长与存活的最重要因素之一。研究不同微生物在生 长或积累代谢产物阶段时的不同最适温度，对提高发酵生产的效率具有十分 重要的意义【2 1 0 2 1 。本实验采用比浊法( 见附录1 ) 监测菌种生长情况，选择出 菌种生长的最适温度。 分别将m i 、b 3 、s 7 和$ 1 2 接种到各种最适p h 值的液体培养基内，一式 三份，分别放到温度为3 0 。c 、3 5 和4 0 的摇床上培养，每隔1 2 h 测一次 0 d 值。 器弼夫学醺士学靛论文 由图2 5 至图2 - 8 可以看出，在最适p h 值下，四种菌种在3 0 4 0 。c 之间 都能较快生长。 圈2 - 5 温度对刖生长情况的影响 圈争8 瀑痊对瓣生长馕 嚣秘影晌 1 4 蹬o 趔_ a o 四j i l 大学硕士学位论文 图2 - 7 温度对s 7 生长情况的影响 圈2 _ 8 温度对s 1 2 生长情况的影响 2 2 3 供氧对菌种生长情况的影响 需氧率也是影响微生物生长的一个重要因素。氧气经过溶解及一系列传 递进入细胞膜内进行代谢，其传递机理为： 魏j 天掌颤 ! 学位论文 氧气_ 培养液内气液界耐_ 溶解+ 液体士体_ 透过细胞周闱滞液层细 胞与墙养液液f 古l 介面p 透过细胞擘p 进入绱嬲膜进行代谢 本实验采用比较摇寐臻养与静嚣培养下蕊葶孛的生长清况( 比浊法) ，以确 定菌种对氧的需求。分别取培养基1 号、2 号5 0 m l 装入2 5 0 m l 三角瓶中，一 式两份，灭菌后分别接种m 1 、b 3 、s 7 和s 1 2 ，将接种后的菌液其中一份以六 层纱布封口鲍三角瓶放到恒温3 0 。c f 孢t g n 上墒养，另一份以棉塞挝日的三角 瓶放刘瞧滠3 0 c 的培莽褡中获氧这养e 涟：实线为有氧条件；虚线为无氧条件 图2 - 9 供氧条件对菌种生长情况的影响 酗 赫 b 3 b 3 8 7 8 7 8 惶 8 1 2 凑所溺褥羲o d 鲣瑶以羲窭，这嚣癸蓬静在供氧兖是熬条嚣一f 聱麓较强熬 生长，当供氧不充足时，它们生长菲常缓慢。由此可知，四菌种均属于兼性 厌氧黼。因此，在对稻肇添加本菌种发酵时，应保证良好的通风条件，使其 更好的生长，有利于提高纤维素的降解率。 6 薅强大攀硕士擎链论文 2 24 菌种耐热性分析 由于堆肥处理过稷中的温度可丹到7 0 。c 以上，所以考察在高温条件下蓠 耱是否鑫2 够生长是稷鸯必要的。本实验考套在6 0 帮1 0 0 淹个遂凄及簸遴 l o m i n 和2 0 r a i n 两个时间条件下，菌种的生存情况，以寻求能耐高温的菌种。 分别敷培养好的蔚液o 2 m l 加到其相应的无麓固体斜面培养基上，共8 只， 编号l 卜8 莓。将l 一4 罄嗣对敷入6 0 农滏孛，l o m i n 嚣取凑l 、2 警，霹_ i 窭 l o m i n 意淑出3 、4 管( 处理2 0 r a i n ) 。同法，在l o o 条件下她遴5 8 管。上 述各管取出后，冷却厢鬣于3 0 憾濑培养箱培养4 8 h ，观察其生长情况。 由表2 - 1 可以总缩得到： l 、m l 、b 3 在国下薤瑾1 0 m i n 瑶生长囊驽，嚣处理2 0 r a i n 螽生长一般， s 1 2 均生长一般，经1 0 0 处理后三菌均完全不生长； 2 、s 7 在6 0 下处理l o m i n 和2 0 r a i n 都能徽好的生长。猩1 0 0 下处璎 1 0 m i n 或2 0 r a i n 嚣还怒弼滋歪零生长，说饔s 7 其骞较强熬辩热瞧。 表2 - 1 菌种耐热情况 一表承不生长；+ 裹承生长较差；+ + 袭示生长一般；+ 十+ 表示生长良好 2 3 菠耪产酶实验 除了动物和植物体液中豹酶和微生纺臆舔酶之辨，大多数懿都存在予绷 胞之中。为了获得细胞内的酶，就得收集细胞并进行细胞或缀织破碎。细胞 破碎的方法很多，本实验采用超声波破碎法f 1 6 1 。经超声波破碎鼯，铡定藏液 憝滤纸酶溪( 冤辫录6 ，著逶逶采经趣声波酸耱戆蘸滚静赘添诗算褥窭酶瘫 酶的酶活。 超声波处理后的菌液所测锝的酶活是胞内酶和胞外酶共同作用的结果， 恧未经越声波处理熬藏滚夔| l 仅莰是戆终酶终翅戆结粟，所以强蠹豹差毽就楚 1 7 四川大学硕士学位论文 胞内酶的酶活。实验和处理后的结果见表2 2 和表2 3 。 从表2 3 可以看出，对m i ，b 3 和s 7 来说，前者的酶活和后者相差不大， 但s 1 2 却有所不同，s 1 2 的胞内酶相对较大。由此可以看出，细菌m 1 ，b 3 和s 7 纤维素酶同时来自胞内和胞外，而s 1 2 的纤维素酶却有相当一部分来自 是胞内。 表2 - 2 经超声波打碎后酶活测定结果 胞外酶m g ( m i n * m 1 ) 1 0 3 0 9 1 30 8 2 31 0 3 81 1 0 3 胞内酶m g ( m i n * m ) 1 0 3 1 7 0 91 8 2 41 8 2 94 3 5 5 2 4 小结 本章对四株菌种的生长特性进行了研究。确定了m 1 、b 3 、s 7 、s 1 2 的最 适p h 值分别为6 5 、7 5 、6 5 和7 5 ，在各自最佳p h 值下，菌种m 1 、b 3 、 s 7 和s 1 2 均能在4 8 小时( 两天) 左右生长达到最好。同时可知m 1 对生长环 境的p h 值适应范围较广，b 3 、s 7 和s 1 2 在偏碱性的p h 值环境中生长较好， 考虑到以后实验的方便，培养基的p h 值均采用7 。四株菌种在3 0 4 0 c 之间 都能较快生长且四株菌种均应供氧充分。m 1 、b 3 、$ 1 2 只能接受6 0 c 的处 理，而s 7 贝u 具有很强的耐热性。m i ，b 3 和s 7 纤维素酶同时来自胞内和胞外， 而s 1 2 的纤维素酶却有相当一部分来自是胞内。 鞠川大学硕士学位论叟 3 固体培养基配跑的确定 微生物生长必须有必需的养分。配制培养基必须包含c 源、n 源、水分， 提供细胞内组成及辅酶活性鬻疆的各种无机元索、维生素等。每个微生物的 营养需求不同，对于特定菌种的培养来说，我们必须满足该菌特定的营养需 要，其锩藏是尝试不同静堵莠綦配方。 焉穗裾中含毒羹、磷、镯、镁、钙、硫等元囊。因魏，禧释氇楚丰富鳇 肥料资源。秸秆中有机质含爨平均为1 5 ，各种营养元素含量也不阈，见表 3 - 1 。因此利用农业废弃物配制适宜细菌生长的培养基是完全能符会细菌的营 养要求的。同时采用固体发酵较液体深层发酵具脊较多优势，纤维索酶的工 业化生产般采惩固薅发酵法。困照寻求适合朗蘩种的固体培养纂熬方就显 褥茏兔鬟鼗。零繁磅究了不鹚辩穷下缎蓥戆生长溥琵，为渡磊霞势蘩秘缓会 的固体培养筛选出最优的培养基。 表3 1水稻稿秆中的营养元素成分( 质量分数，) ” 3 1 实验方法 实验操作流程如下：1 、将保存在斜面培养蒸上的菌种活化；2 、接种至 液体培养蒸上，3 0 c 恒温摇脒培养两天左右；3 、接种至改变配方的辩高温灭 菌后的嗣体培养基上，接种爨1 0 ；4 、3 0 4 c 憾濑培养，并每1 2 h 测试培养基 熬p h 俊；s 、德p 珏