（无机化学专业论文）dna分子荧光探针的研究.pdf

摘要 脱氧核糖核酸( d n a ) 是生物体重要的遗传物质、遗传信息的携带者和基 因表达的物质基础，它在生物的生长、发育和繁殖等正常生命活动及突变、癌变 等异常生命活动中起着非常重要的作用。d n a 分子的定量分析、特异识别对基 因组学、病毒学、分子生物学等相关学科的发展具有十分重要的意义。定量测定 是研究d n a 的基础，但由于d n a 的内源荧光很弱，直接利用其荧光测定受到 限制。溴化乙锭( e b ) 是应用最早也是应用最广的荧光探针，不仅可用于核酸的定 性定量分析，也可以用于研究核酸杂交动力学特性，但由于溴化乙锭的致癌性， 使它的进一步应用受到很大的挑战，人们开始寻找新的探针。目前人们对这方面 做了很多的工作，而高灵敏的d n a 生物探针的合成与应用，同时避免生物荧光 背景的干扰已成为目前研究的热点。 本人在前人的研究基础上做了一些工作，在d n a 分子探针方面有了一些研 究进展，本论文主要包括以下四部分的内容： 第一部分，以中药小檗碱( b e r b e r i n e ) 作为荧光探针，在0 1 m o f l 醋酸一醋酸钠 缓冲体系中，用荧光光谱、紫外可见吸收光谱和圆二色谱等方法研究了贵金属 离子r u ( m ) 、r h ( ) 、r d ( i i ) 与c t - d n a 的键合相互作用。实验发现，在三种贵 金属离子中，p d ( i i ) 对小檗碱d n a 体系的荧光有较强的猝灭作用，而r u ( m ) 和 r h ( m ) 对该体系产生强烈的荧光敏化作用。分别求出了三种贵金属离子与d n a 的结合常数。三种贵金属离子与d n a 结合能力的强弱顺序依次为：r u ( ) 咖) p d ( i i ) 。探讨了三种贵金属离子与d n a 的作用机理及导致结合力不同 的原因。 第二部分，利用荧光光谱、紫外一可见吸收光谱、圆二色谱、凝胶电泳等方 法系统比较了小檗碱和溴化乙锭与c t d n a 的光谱学作用。在c t - d n a 存在时， 小檗碱和溴化乙锭的荧光强度都有较大的提高( p h = 7 0 1 时，c d n a c a 。- - 9 ， f f o = 6 0 ，c d s c e a = 9 ，f f o = 6 9 5 ) ，p h 的改变对二者荧光光谱的发射峰位与强 度影响不大，紫外一可见吸收光谱随c t - d n a 浓度的增加，表现出减色效应 ( c d n c b 廿= 1o ，a a = 1 2 0 7 8 ，c d n a c 西司5 ，a a = 1 2 1 2 3 ) ，二者都使c t - d n a 的圆二色谱正负峰的吸收强度有所增加( c 蹦 c b 和o ，0 0 0 = 1 2 2 8 ， c d n c e a = 6 0 ，0 0 0 = 1 4 2 6 ) ，凝胶电泳实验中，e b d n a 体系的发光强度高于 b e r b e r i n e - d n a 体系，故采用荧光光谱、紫外一可见吸收光谱、圆二色谱、凝胶 电泳方法系统比较了小檗碱和溴化乙锭与c t d n a 的键合作用。在d n a 的定量 测定中，可用无毒副作用的小檗碱代替有致癌性的溴化乙锭，为安全、不造成环 境污染定量测定核糖核酸提供了新试剂使用基础，也为寻找更合适的d n a 分子 荧光探针提供线索。 第三部分，通过改造溴化乙锭合成了苯甲酰基硫脲化合物，并用红外光谱， 1 h 核磁共振谱，元素分析等方法进行了表征。该化合物有良好的荧光性能。用 光谱学方法研究了该化合物与c t - d n a 的相互作用。在c t - d n a 存在时，化合物 的荧光强度增加；紫外一可见吸收光谱随c t - d n a 浓度的增加，表现出减色效应； c t - d n a 的圆二色谱正峰的吸收强度有所增加，负峰的吸收强度有所减小，故采 用荧光光谱、紫外一可见吸收光谱、圆二色谱等方法研究了物质与c t d n a 的键 合作用。计算出化合物与c t - d n a 的表观结合常数k = 4 4 x 1 0 3 l m o r l 。探讨了化 合物与c t d n a 的键合作用应该是有嵌入和静电作用两种方式，而主要以嵌入作 用为主。 第四部分，合成了o ( 硫杂蒽酮- 2 】- 基) 一氧乙酸，并用元素分析( e l e m e n t a l a n a l y s i s ) 、红外光谱( i r ) 、1 h 核磁共振谱( 1 h n m r ) 和1 3 c 核磁共振谱( 1 3 c n m r ) 等方法对其结构进行了表征。实验发现该化合物有良好的荧光性能。用光谱学方 法研究了该化合物与a t - d n a 的相互作用，结果表明，在p h = 7 3 8 的模拟体液条 件下，当c t - d n a 存在时，该化合物的紫外一可见吸收光谱随c t - d n a 浓度的增加， 表现出减色效应，该化合物使c t - d n a 的圆二色谱正负峰的吸收强度有所降低， 该化合物的荧光强度被c t - d n a 显著猝灭，猝灭常数为1 2 5 x 1 0 4l m o l ，当c t - d n a 的浓度在0 - 1 2 0m g l 范围内变化时，荧光猝灭值与c t d n a 的浓度呈现良好的 线性关系。该化合物对c t - d n a 的检出限为1 6 3m g j l 。据此，o - ( 硫杂蒽酮一 2 】- 基) 一氧乙酸是一种可用于测定c t - d n a 浓度的新试剂。o - ( 硫杂蒽酮一 2 】- 基) 一氧乙 酸与c t - d n a 的作用主要有嵌入作用和静电吸引两种方式。 关键词：荧光探针，光谱学方法，c t d n a ，溴化乙锭，小檗碱，硫杂葸酮， 金属离子 a b s t r a c t d n a i st h eg e r mp l a s mo f t h eo r g a n i s m ，o w n e ro f h e r e d i t a r yi n f o r m a t i o na n dt h e m a t e r i a le l e m e n t so fg e n ee x p r e s s i o n , a n dd n ap l a y sav a r yi m p o r t a n tp a r ti nt h e n a t u r a lb e i n gm o v e m e n t ( b i o l o g yg r o w t h , d e v e l o p m e n ta n dr e p r o d u c e ) a n da b n o r m i t y b e i n gm o v e m e n t ( c a n c e r o u sb r e a k a n d0 2 t n c a o u $ m o v e m e n t ) t h eq u a n t i t a t i v e a n a l y s i s ，d i f f e r e n t i a li d e n t i f i c a t i o no f d n ap l a y sag o o dp a r ti nt h eg e n o m y , v i r u sa n d m o l e c u l eb i o l o g y 1 1 璩q u a n t i t a t i v ea n a l y s i si st h eb a s e m e n tt os e a r c hd n a 。b u t b e c a u s et h ei n n e rf l u o r e s c e n c eo fd n ai sv e r yw e a k , s ot h ed e t e r m i n a t i o no fd n a c o m e si nf o rr e s t r i c tu s i n gf l u o r e s c e n c eo fd n a d i r e c t l y e t h i d i u mb r o m i d e ( e b ) i s t h ep i o n e e rf l u o r e s c e n c ep r o b e , i tn o to n l yc 锄b ea p l l i e di nt h eq u a n t i t a t i v ea n d q u a l i t a t i v ea n a l y s i so f n u c l c i ca c i d , b u ta l s oc a n b eu s e di nt h ed y n a m i c sc h a r a c t e r i s t i c s t u d yo fn u c l c i ca c i d b u te bi sac a r c i n o g e n , w h i c hl i m i ti t sa p p l i c a t i o n , s op e o p l e b e g i nt os e a r c hn e wf l u o r e s c e n c ep r o b eo fd n a n o w , p e o p l e h a v ed o n el o t so f w o r k , t h es y n t h e s i sa n du t i l i z a t i o no fm o r es e n s i t i v ep r o b e w h i c ha tt h es a m et i m e 啪 a v o i db a c k g r o u n dd i s t u r b a n c eo f b i o l o g yf l u o r e s c e n c e , i st h es e a r c h i n gh o t p o t s o m ew o r ko nt h eb a s e m e n to fp i o n e e r sw o r ka n ds o m ee v o l v e m e n to nt h e d n af l u o r e s c e n c ep r o b ea r er e p o r t e di nt h i sp a p e r t h i st h e s i sc o n s i s t so ff o u r s e c t i o n sa sf o l l o w s ： f i r s t , f l u o r e s c e n c e , a b s o r p t i o na n dc j i r c i d a rd i c h r o i s ms p e c t r ah a v eb e e nu s e di n t h ei n t e r a c t i o n so fm t h e n i n m ( h i ) ，r h o d i u m ( 1 1 1 ) a n dp a l l a d i u m ( i i ) i o n sw i t hd n a w i t hb e r b e r i n ea sap r o b e t h er e s u l t sa 阳a sf o l l o w s ：r u t h e n i u m ( i 1 1 ) a n dr h o d i u m ( i i i ) i o n ss h o wd i f f e r e n te f f e c t sf r o mt h a to ft h ep a l l a d i u m ( i i ) i o no nt h ef l u o r e s c e n c e s p e c t r ac h a r a c t e r i s t i c so f b e r b e r i n e - d n as y s t e m q u e n c h i n gf l u o r e s c e n c ei ss e e nw i t h p a l l a d i u m ( i i ) i o na d d i t i o n , w h e r e a si n c r e a s i n g f l u o r a s e n c ei so b s e r v e df o r r u t h e n i u m ( m ) a n dr h o d i u m ( i i i ) i o n s t h ea d d i t i o no fr u t h e n i u m ( 1 l i ) ，r h o d i u m ( i i ) a n dp a l l a d i u m ( i i ) i o n se a u s 懿t h ei n c r e a s i n ga b s o r p t i o no ft h ed n as o l u t i o n t h e a d d i t i o no fr u t h e n i u m ( 1 1 1 ) ，r h o d i u m ( i l i ) a n dp a l l a d i u m ( i i ) i o n st ot h ed n as o l u t i o n a l s oc a u s e st h ec i f c u l a rd i c h r o i s ms p e c t r at oc h a n g e t h ea b o v er e s u l t ss u g g e s tt h a t d i f f e r e n tm e t a li o t ae x h i b i td i f f e r e n ta f f i n i t yw h e nb i n d i n gt od n a ，w h i c hc o u l d c o r r e l a t ew e l lw i t ht h ei o n s c h a r g e ，s t r u c t u r ea n dt h ea b i l i t yt oc o o r d i n a t e t h e r ei sa c o m p a r i s o n b e t w e e np t ( i v ) a n dp d ( i i ) i o n so nt h ef l u o r e s c e n c eo f t h eb e r b e r i n c - d n a i v s y s t e m s e c o n d , t h es p e c t r o s c o p yi n t e r a c t i o n sb e t w e e nb e r b e r i n ea n dd n a ，e t h i d i u m b r o m i d e ( e b ) a n dd n ah a v eb e e ns t u d i e db yu v - a b s o r p t i o n , f l u o r e s c e n c e , c i r c u l a r d i c h r o i s ms p e c t r o s c o p ya n da g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sm e t h o d s 。w h e nd n a e x i s t s ， t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f b e r b e r i n ea n de bb o t l lh a v eag r e a ti n c r e a s e ( p h = 7 0 1 ， c d n a c b 盯；= 9 ，f ，f d = 6 0 ，c d s a c e b - - 9 ，f f o = 6 9 5 ) ，b u tt h ec h a n g eo f p hv a l u eh a s n o tg r e a te f f e c to nt h ew a v e l e n g t ha n di n t e n s i t yo ft h ef l u o r e s c e n c es p e c t r a t h e a b s o r b a n c eo fu vs p e c t r ap r e s e n tah y p o c h r o m i ce f f e c tw h e nd n ac o n c e n t r a t i o n i n c r e a s i n g ( c d n a c 附= 1 0 ，舭= 1 2 0 7 8 ，c d n a c 西= o 5 ，舭= 1 2 1 2 3 ) t h ec d s p e c l mo fd n ah a sag r e a tc h a n g eb o t hi nn e g a t i v ea n dp o s i t i v es p e c t r a ( c d n a c b f 6 0 ，0 0 0 = 1 2 2 8 ，c d s a c 功= 6 0 ，阶1 4 2 6 ) ，i nt h ea g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，t h el u m i n e s c e n c ei n t e n s i t yo f e b - d n as y s t e mi sm o r es e n s i t i v et h a n b e r b e r i n e - d n as y s t e m , s ow ei m p l o r et h eu v - a b s o r p t i o n , f l u o r e s c e n c e , c i r c u l a r d i c h r o i s ms p e c t r o s c o p ya n da g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i sm e q h o d st os t u d yt h e i n t e r a c t i o no fe ba n db e r b e r i n eo nd n a i nt h eq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no fd n a , w ec o u l di m p l o r et h eb e r b e r i n er a t h e rt h a nt h ee b ，w h i c ho f f e ru sa ni m p o r t a n tb a s e o f n e w r e a g e n ti nt h eq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no f d n a w h i c ha l s oa f f o r du sc l u et o s e a r c hm o r es e n s i t i v ep r o b eo f d n a t h i r d , a l la c e t y l t h i o u r e ac o m p o u n dw a ss y n t h e s i z e db yr e b u i l d i n ge b ，t h e s t r u c t u r eo f t h ec o m p o u n dw a sc h a r a c t e r i z e db yi r , 1 hn m r s p e c t r u ma n de l e m e n t a l a n a l y s i s t h et h i o u r e ah a sg o o df l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p ym e t h o d sh a db e e nu s e di n t h ei n t e r a c t i o n so ft h i o u r e aw i mc t d n a w h e nd n ae x i s t s t h ef l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yi n c r e a s e d t h eu l t r a v i o l e ta b s o r p t i o ni n t e n s i t yo ft h i o u r e ap r a s e n ta h y p o c h r o m i ce f f e c tw h e nd n ac o n c e n t r a t i o ni n c r e a s i n g t h ep o s i t i v es p e c t r ao fc d s p l e c 觚 o fc t d n ah a da ni n e r e a s e m e n t ，a n dt h e n e g a t i v es p ( 娥l a h a sa d e c r e a s e m e n t s ow ei m p l o r et h ef l u o r e s c e n c e ，u v - a b s o r p t i o na n dc i r c u l a rd i c h r o i s m s p e c t r o s c o p ym e t h o d st os t u d yt h ei n t e r a c t i o no ft h i o u r e aa n dd n a t h ea p p a r e n t i n t e r g r e a t ec o n s t a n tc a l c u l a t e di s4 4 x 1 0 5l m 0 1 t h ei n t e r a c t i o nm o d eb e t w e e n t h i o u r e aa n dc t d n aw e r ei n s e t m e n ta n ds t a t i c ，a n dt h ei n s e t m e n ti st h em o s t l y i n t e t s c t i o nm o d e f o r t h , t h et h i a x a n t h o n - 2 y l - o x y a c e t a t ew a ss y n t h e s i z e d , a n dt h es t r u c t u r e w a sc h a r a c t e r i z e db ye l e m e n t a la n a l y s i s ，i r , 1 hn m r , a n d ”cn m rs p e c t r u m w e f o u n df r o mt h e e x p e r i m e n tt h a tt h i a x a n t h o n - 2 y l - o x y a c e t a t eh a dv e r y h i g h f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y m e t h o d sh a db e e n u s e di nt h ei n t e r a c t i o n so f t h i a x a n t h o n - 2 y l o x y a c e t a t ew i t hc t - d n a n 埭u l t r a v i o l e ta b s o r p t i o ni n t e n s i t yo f t h i a x a n t h o n 一2 - y l - o x y a c e t a t ed e c r e a s e da st h ec o n c e n t r a t i o no fc t - d n ai n c r e a s e da t p h 2 7 3 8 t h e r ew e r es o m ed e b a s e di n t e n s i t yb o t hi nt h en e g a t i v ea n dp o s i t i v es p e c t r a o fc ds p e 沲啪o fc t d n aw h e nt h i a x a n t h o n - 2 y l - o x y a c e t a t ei n t e r a c t e dw i t h e t - d n a ，a n dq u e n c h i n g e f f e c to c c u r r e di nt h ef l u o r e s c e n c e s p e c t r u m o f t h i a x a n t h o n - 2 一y l - o x y a c e t a t e 豇”q u e n c h i n gc o n s t a n ti s 1 2 5 x 1 0 4l t 0 0 1 w h e nt h e c o n c e n t r a t i o no fc t - d n ac h a n g e df r o mo 1 2 0m g l t h ec o n n e c t i o nb e t w e e nt h e q u e n c h i n gd a t aa n dt h ec o n c e n t r a t i o no f c t - d n as h o w sa f a v o r a b l el i n e a rr e l a t i o n s h i p t h ed e t e c t i o nl i m i tw a s1 6 3m 班，8 0t h ec o m p o u n di san e wr e a g e n tf o rt h e m e a s u r e m e n to fc t - d n a t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h i a x a n t h o n - 2 y l - o x y a c e t a t ea n d e t - d n aw e r ei n s e t m e n ta n ds t a t i c k e y w o r d s ：f l u o r e s e e n e ep r o b e ，s p e c t r o s c o p ym e t h o d s ，c t - d n a ，e t h i d i u mb r o m i d e ( e b ) ，b e r b e r i n e ，t h i a x a n t h o n , m e t a li o l l 5 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标示和致谢的地方 外，论文中不包括其他人已发表的或撰写的研究成果，也不包含未获 得西北师范大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示了谢意。 签名： 日期：尘娣叁群 关于论文使用授权的说明 本人完全了解西北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留送交论文复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公 布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存 论文。( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：聱爱基导师签名：季：室：度日期：童丝：步 硕士研究生毕业论文 d n a 分子荧光探针的研究 第一章绪论 1 1 引言 众所周知，脱氧核糖核酸( d n a ) 是生物体重要的遗传物质、遗传信息的 携带者和基因表达的物质基础，与生命息息相关，它在生物的生长、发育和繁殖 等正常生命活动及突变、癌变等异常生命活动中起着非常重要的作用。d n a 分 子的定量分析、特异识别对基因组学、病毒学、分子生物学等相关学科的发展具 有十分重要的意义【l 】。d n a 的定量测定是研究d n a 的基础，发展灵敏度较高的 检测方法很重要。测定d n a 的方法很多，其中以分子光谱法居多，目前常用的 有紫外可见分光光度法、荧光光度法以及共振瑞利散射法等。荧光光谱法具有 选择性好和灵敏度高的优点，但由于核酸的内源荧光很弱，因而不能利用荧光技 术直接测定核酸的结构和性质，所以采用荧光法研究和测定核酸时，必须引入荧 光探针。利用核酸对小分子荧光探针的荧光变化来研究小分子探针和d n a 的相 互作用或进行核酸的定量分析，方法比较简单，应用较广。同时，许多分子能与 d n a 发生相互作用，研究小分子与d n a 的作用机理，一方面可作为生物探针建 立测定d n a 高灵敏的分析方法，另一方面可以作为靶向分子研究其与d n a 作用 的模式和机理及生物活性之间的关系，而且对于从分子水平上了解抗癌药物作用 机理以及以d n a 为靶标的药物分子设计有一定的意义，而研究小分子与d n a 的 作用机理常常采用荧光探针法，江崇球等【2 】采用溴化乙锭为荧光探针研究了多 粘菌素b 与d n a 的作用方式，胡皆汉和宋增福等 3 】曾用荧光探针( 以溴化乙锭为 荧光探针) 方法研究过药物的防癌抗癌效用。所以，近年来，人们对核酸探针很 感兴趣，该方法可以避免以前人们常用的放射性标记，溴化乙锭是应用最早也是 应用最广的荧光探针，不仅可用于核酸的定性定量分析【4 】，也可以用于研究核 酸杂交动力学特性，但由于溴化乙锭的致癌性，使它的进一步应用受到很大的挑 战，人们开始寻找新的探针【5 】。目前人们对这方面做了很多的工作，而高灵敏 的d n a 生物探针的合成与应用【6 】，同时避免生物荧光背景的干扰已成为目前研 究的热点。 另外，近年来，离子探针方法及其应用也越来越受到人们的重视，正逐步发 展成为一种常规的测试手段，广泛应用于生物学、医学、化学等学科。特别是在 生物大分子结构与功能研究中，有着广阔的应用前景。 因此就本论文研究的重点，本章主要在d n a 分子的组成与结构特点、荧 西北师范大学化学化工学院专业：无机化学 导师：宋玉民 硕士研究生毕业论文 d n a 分子荧光探针的研究 光产生的理论基础、d n a 分子荧光探针的类型、d n a 分子与探针分子或离子 的作用方式及研究方法等方面进行综述。 1 2d n a 的组成与结构特点 自e m i e s h e x 从脓细胞和鲑鱼精子中提取出人类历史上第一个核酸制品一 核素( n u c l e i n ) ，r a l t m a n n 提取出不含蛋白质的同类物质，并首次使用了“核酸” 这一名称以来，人类对于核酸的研究取得了一系列令人瞩目的成就【7 】。1 9 2 8 一1 9 “年期间g r i f f i t h 、d a w s o n 8 和q s w a l da v e r y 9 1 等证明了d n a 是遗传物 质的基础，第一次向人们展示了d n a 的生理功能。1 9 5 3 年，两个年轻的科学 家w a t s o n 和c r i c k 发现了生命的奥秘，他们根据d n a 的x 射线衍射数据提出 了d n a 的双螺旋结构模型，从分子水平上阐述了生命遗传信息，迈过了d n a 的半保留复制机理，为现代分子生物学的发展奠定了基础，从此生物学进入了 分子生物学的新时代。 1 9 7 5 年b e r g 建立了d n a 体外重组技术基因工程，使核酸的研究取得 了突飞猛进的发展，并逐步开始转向实际应用。所有这些划时代的发现，无不 改变着人类的生活，成为人类探索生命奥秘，创造巨大财富的有力武器。同时， 有关生命遗传物质d n a 的研究也就成为分子生物学和生物化学的重要课题。 2 0 0 1 年2 月1 2 日，美、英、日、法、德和中国科学家宣布共同绘制完成了人 类基因组序列图。这是继发现d n a 结构之后生命科学领域的又一里程碑，标 志着人类基因组时代的正式来临。 d n a 是由大量脱氧核苷酸组成的、极长的大分子，其中戊糖和磷酸基起结 构作用，而碱基则携带遗传信息。d n a 含有四种碱基，其中两种为嘌岭碱，即 腺嘌岭( a ) 和鸟嘌呤( g ) ，两种嘧啶碱是胸腺嘧啶( t ) 和胞嘧啶( c ) 。 州y m o 胞嘧啶胸腺嘧啶 鸟嘌呤 腺嘌岭 1 9 5 0 年，c h a n g a f f 发现，在所有物种的d n a 中，碱基的摩尔比有一定的 关系，即g - - c ，a = t 。这是d n a 双螺旋模型的一个重要实验基础。 西北师范大学化学化工学院专业：无机化学 导师：宋玉民 2 、。 硕士研究生毕业论文d n a 分子荧光探针的研究 d n a 存在a 型、b 型、z 型三种空间构型。b - - d n a 的二级结构是由两条 反向平行的脱氧多核苷酸链通过他们碱基问的氢键结合在一起，并围绕同一个 中心轴盘旋，构成双螺旋结构。两条链都是右手螺旋，方向相反，其两条链之 间的螺旋呈现两种凹形，其中一条沟区较浅而另一条较深分别称之为小沟、大 沟。四种疏水性的碱基位于螺旋的内侧，带负电荷的、亲水性的磷酸基与脱氧 核糖单位处于外侧。碱基的平面与螺旋轴近乎垂直，糖的平面与碱基平面几乎 成直角。双螺旋结构中双链碱基间的氢键配对并不是随意进行的，而是限定在 g 与c ，a 与t 之间。双螺旋的直径为2 0 a ，碱基之间的堆积距离，即相邻碱 基在螺旋轴向的间距为3 4 a ，旋转夹角为3 6 0 。因此，螺旋结构在各链上每隔 1 0 个碱基重复一次，即螺距为3 4 a 。 d n a 的双螺旋结构相当稳定，维持此结构的力主要有三种：一是互补碱 基对之间的氢键；二是碱基堆积力，由芳香族碱基上的j r 电子之间的相互作用 产生，是比较主要的力；第三种力来自磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子之 间的静电作用力。 d n a 一级结构上的一个小片段d n a 的双螺旋结构 以上叙述的是b - - d n a 的二级结构，溶液中及细胞内天然状态的d n a 一 般都是b 型的。a - - d n a 是在相对湿度为7 5 时制成的d n a 钠盐纤维，也为 螺旋结构。和b - - d n a 不同之处是，碱基不与纵轴相互垂直而呈2 0 0 夹角，所 以螺距及每匝螺旋的碱基数发生了变化，a - - d n a 的螺距为2 8a ，每匝碱基数 为1 1 个。d n a r n a 杂交分子也采取a 型结构。当纤维中的水分减少时，出现 c - - d n a ，其碱基倾角为6 0 ，螺距为3 1 a ，每匝碱基数为9 3 个。另外，人们 西北师范大学化学化工学院专业；无机化学 导师：宋玉民 硕士研究生毕业论文 d n a 分子荧光探针的研究 发现细胞中也有左手螺旋的d n a 结构，称为z - - d n a 。z - - d n a 与b - - d n a 在结构上差异很大。 1 3 荧光产生的理论基础 1 3 1 荧光的产生 当紫外光或可见光照射到某些物质上的时候，这些物质就会发射出波长和 强度各不相同的光线，而当紫外光或可见光停止照射时，这种光线也随之很快 地消失，这种光线称为荧光。 分子中具有一系列不同的能级，各能级之间相差不大，电子处于不同的能 级中，当光照射到分子上，电子就自某一能级转移至能量较高的其他另一能级 中，它吸收了相当于这两个能级之差的能量，电子就被激发从低能级跃迁到高 能级。含有处于较高能级电子的分子为激发态分子，不稳定。在光线照射下， - d , 部分的分子吸收了能量，跃迁至较高能级而成为激发分子。在光线照射下 吸收能量而跃迁至较高能级的激发分子并不久安于位，在很短的时间内( 约1 旷 秒) ，他们首先因撞击而以热的形式损失掉一部分能量，从所处的激发能级下降 至第一电子激发态的最低振动能级，然后再由这一能级下降至基态的任何振动 能级。在后一过程中，激发分子以光的形式放出它们所吸收的能量，所发出的 光称为荧光。因发生荧光时所发出的能量比入射光所吸收的能量略小些，所以 荧光的波长比入射光的波长稍微长些。在荧光分析中，常采用汞弧灯为灯源， 以在近紫外光区及可见光区的射线为激发光，所发生的荧光多在可见光区。电 子通过辐射跃迁和非辐射跃迁失去能量返回基态，荧光就是处在激发态的分子 和原子返回基态过程中伴随着放射出来的一种光能。当然也能通过分子内的作 用过程使激发态分子去活化。被光照射激发的是分子，发出的是分子荧光，为 光致发光。 如激发分子在下降至第一激发态的最低振动能级后，并不直接由此降落到 基态的任何振动能级，而转入亚稳的三重线级，在这里逗留的时间较长( 有时 长达1 秒以上) ，然后再由这里降落到基态的任何振动能级。从三重线级降落到 基态所发出的光称为磷光。因激发分子在三重线级所逗留的时间稍长些，所以 有时候在入射光光源关闭之后，还可以看到磷光的存在，至于荧光则因激发分 子在很短暂的时间内便下降到基态，所以在入射光光源关闭之后立即消失。 荧光的产生过程见图1 。一般来说，荧光试剂分子处于基态，吸收光后， 试剂分子处于电子激发态，基态和激发态都有单重态和三重态两类，多重态用 西北师范大学化学化工学院 专业：无机化学导师：宋玉民4 硕士研究生毕业论文d n a 分子荧光探针的研究 2 s + l 表示，s 为电子自旋量子数的代数和，其数值为0 或1 。s = 0 时，分子内 轨道中的所有电子自旋配对，自旋方向相反，此时分子处于单重态( 又称单线 态) ，大多数有机物分子的基态时处于单重态，分子吸收光能后，电子跃迁到高 能级，电子自旋方向不变，此时分子处于激发单重态。s o ，s 1 ，s 2 ，表 示分子的基态和第一，第二，激发单重态，能量由低到高。如果处于基态 单重态的有机物分子的电子在跃迁过程伴随有电子自旋方向的变化，在激发态 分子轨道就有两个自旋不配对的电子，此时s = 1 ，表明分子处于激发态的三重 态，用t 表示，t l ，t 2 分别表示三重态的第一，第二激发态。分子中的电子从 基态( 单重态) s o 跃迁至激发态单重态s l ，s 2 ，比较容易发生，进行很快( 约 l 酽s ) ，而从基态单重态到激发态单重态不易发生。高能量的单重态激发态分子 ( 如s 2 ) 可以与其他同类分子或溶剂分子碰撞通过内转换( 无辐射跃迁) 回到 激发态的最低能级，这一过程为1 0 q 2 s ，处于激发态最低能级的分子寿命一般为 l o 。4 s 一1 0 s s ，它们会放出光子返回基态，这时产生的光就是荧光，即最低激发 态单线态( s 1 ) 分子回到基态( s o ) 会产生荧光。从s l 到t l 能量转化是体系 间跨越( i s c ) 。从t i 回到s o 有两种过程，一个是体系间跨越，无能量释放；另 一个是放出光子，即磷光，在1 0 4 s 一1 0 s 间完成。 图1分子内的光物理过程 a 1 ，a 2 吸收 f 荧光 p 磷光；i c 内转化； i 8 c 体系间窜跃；y r 振动松弛 根据物质吸收激发光后发射荧光的时间，把荧光分为瞬时( p r o m p t ) 荧光 和滞后( d e l a y ) 荧光。分析上普遍应用的是瞬时荧光，滞后荧光应用相当少。 如入射光的频率太低，不足以使分子中电子跃迁到电子激发态，但仍能被 该分子所吸收，而把电子激发至基态中其他较高的振动能级。因为没有发生电 子的跃迁，所以被激发的电子将在很短促的时问内( 约为1 0 - t 2 s ) 返回原来能级， 西北师范大学化学化工学院 专业：无机化学导师：宋玉民 5 硕士研究生毕业论文 d n a 分子荧光探针的研究 而在各种不同方向发出和激发光同样波长的光。所发出的光称为瑞利散射光。 除瑞利散射光外还有一种散射光，称为拉曼光。当分子吸收了光，它们的 电子被激发至基态中的其它较高的振动能级后，在很短促的时间内( 约为1 o - ”s ) 返回到比原来稍高或稍低的能级，所发出的能量略异于所吸收的能量，因此， 所发生的散射光的波长也略异于激发光的波长，这种散射光称为拉曼光。 1 3 2 荧光激发光谱和发射光谱 激发光谱是使激发光的波长连续变化时，表示某一波长荧光强度变化的曲 线。测定激发光谱时，把荧光物质试液置于荧光光度计光路中，固定荧光发射 波长( 通常是荧光强度最大波长) 和狭缝宽度扫描，得到荧光激发波长和相应 荧光强度的关系曲线，即荧光激发光谱，用 。表示，它与测量仪器构件，如 单色器、检测器的性能有关。 如果使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所发生的荧光通过单 色器而照射于探测器上，移动单色器至各种不同波长并由单色器测出荧光强度， 然后以荧光强度对照着荧光波长所绘成的曲线称为该荧光物质的荧光发射光谱 ( 简称荧光光谱) 。荧光光谱表示在该物质所发生的荧光中各种不同波长组分的 比较强度。荧光强度最强的波长为最大荧光发射波长，用 。表示。荧光光谱 可用于鉴别某一荧光物质。同样，由于测量仪器及其构件的性能差别，往往会 导致同一物质在不同仪器上的x 。不同，但形状基本相同。 根据荧光产生的原理，物质吸收具有特定波长能量的光后被激发，荧光光 谱应该与它的吸收光谱形状一样。因为荧光的发生是由第一电子激发态的最低 振动能及开始的，而和荧光物质分子被激发至哪一个能级无关，因此，荧光光 谱的形状和激发光的波长无关。其次，吸收光谱中第一吸收带的形成是由于该 物质分子由基态被激发至第一电子激发态中各个不同能级，所以吸收光谱的第 一吸收带的形状决定于第一电子激发态中能级的分布情况。基态中能级的分布 和第一电子激发态中能级的分布的情况是相类似的，因此，荧光光谱的形状和