（固体力学专业论文）无标记生物检测中基因芯片纳米力学行为的多尺度模拟.pdf

上海大学硕士学位论文 摘要 本文利用统计力学、聚合物化学、连续介质力学等建模方法和计算技 术，建立无标记生物检测中基因芯片纳米力学行为多尺度模拟模型，以确 立d n a 分子结构特征、溶液离子浓度等因素与基因芯片纳米力学行为之间 的关系。 在忽略基因芯片d n a 层结构变形的情况下，将d n a 层的某些作用简 化为d n a 种植或杂交引起的当量机械弯矩作用。首先，利用连续介质力学 e u l e r 梁的平截面假定，在当量机械弯矩和热载荷作用下，建立基因芯片纳 米力学行为的连续介质力学层合梁模型。其次，在仅考虑热载的情况下， 以形心轴轴向正应变和中性轴的曲率半径为未知数，推导厚基薄膜多层结 构应力的解析公式。最后，分别采用线性和均匀温度场模拟d n a 杂交时基 因芯片瞬态和稳态的温度分布，解释f r i t z 实验中发现的双金属效应。 在考虑d n a 层结构的变形和d n a 分子极性基团的应变造成的压电效 应的情况下，将d n a 层视为压电材料，认为d n a 的种植或杂交引起基因 芯片的弯曲行为主要是由d n a 层压电效应所致。首先，采用宏观连续介质 力学方法，建立含压电生物层基因芯片的层合梁模型；其次，在纳观尺度 下，将生物高分子毛刷结构视为压电聚合物，利用统计力学方法，采用聚 合电解质溶液理论中的线性p o i s s o n - b o l t z m a n n 方程，建立d n a 分子结构 特征、溶液离子浓度等因素与d n a 层宏观电势之间的关系；最后，结合宏 观与微观模型，建立d n a 分子结构特征等纳观因素与基因芯片纳米级挠度 之间的关系。数值结果表明，d n a 层压电常数的正负可能决定了单链d n a 表面种植时基因芯片的上翘和下弯：d n a 杂交时基因芯片的挠度与目标分 子的片断数基本成正比。 关键词：无标记生物检测、基因芯片、纳米力学、连续介质力学、双金属 效应、p o i s s o n b o l t z m a n n 方程、多尺度模拟 ：海大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h em o d e l i n gm e t h o d sa n dc o m p u t i n gs k i l l si ns t a t i s t i cm e c h a n i c s ， p o l y m e rc h e m i s t r ya n dc o n t i n u u mm e c h a n i c sa r eu s e dt oe s t a b l i s ht h em o d e lo f m u l t i s c a l es i m u l a t i o nf o rn a n o m e c h a n i c a lb e h a v i o ro fg e n ec h i p si nl a b e l - f l e e b i o d e t e c t i o nt oo b t a i nt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h en a n o m e c h a n i c a lb e h a v i o ro f g e n ec h i p sa n df a c t o r ss u c ha sd n a m o l e c u l a rs t r u c t u r ef e a t u r e s ，s o l u t i o ni o n c o n c e n t r a t i o n ，e t c i nt h ec o n d i t i o nt h a tt h es t r u c t u r ed e f o r m a t i o no ft h ed n al a y e ri s n e g l e c t e d ，s o m ee f f e c t so fd n ap r o b eo nt h eg e n ec h i p sa r es i m p l i f i e da s e q u i v a l e n tm e c h a n i c a lm o m e n t f i r s t l y , t h ep l a n ec r o s s s e c t i o na s s u m p t i o no f e u l e rb e a mi nc o n t i n u u m m e c h a n i c si su s e dt oe s t a b l i s ht h el a m i n a t e dc a n t i l e v e r m o d e lo fc o n t i n u u mm e c h a n i c sf o rn a n o m e c h a n i c a lb e h a v i o ro fg e n ec h i p s ； s e c o n d l y , w i t ht h ev a r i a t i o no ft e m p e r a t u r ef i e l dc o n s i d e r e d0 n l y ，t h ea x i a l n o r m a ls t r a i no fc e n t r o i d a la x i sa n dt h er a d i u so fc u r v a t u r eo fn e u t r a la x i sa r e t a k e na sb n k n o w nq u a n t i t i e sa n dt h ea n a l y t i cf o r m u l ao ft h es t r e s sf o ra m u l t i l a y e rs t r u c t u r ec o n s i s t i n go ft h i nf i l m sa n dam i c ks u b s t r a t ei sd e d u c e d ； f i n a l l y , l i n e a ra n du n i f o r mt e m p e r a t u r ef i e l da r er e s p e c t i v e l yu s e dt os i m u l a t e t r a n s i e n t - s t a t ea n d s t e a d y - s t a t et e m p e r a t u r e d i s t r i b u t i o n d u r i n g d n a h y b r i d i z a t i o n w h i c h c a l lw e l l e x p l m nt h e “b i m e t a l l i c e f f e c t i nf r i t z s e x p e r i m e n t w i t ht h es t r u c t u r ed e f o r m a t i o no ft h ed n a l a y e ra n dt h ep i e z o d e c t r i c e f f e c tc a u s e db yt h es t r a i no ft h ep o l a rg r o u po fd n am o l e c u l a rt a k e ni n t o a c c o u n t t h ed n a l a y e ri st a k e na sab n do fp i e z o e l e c t r i cm a t e r i a la n dt h e p i e z o e l e c t r i ce f f e c to ft h ed n al a y e ri st a k e na st h em a i nc a u s eo ft h eb e n d i n g b e h a v i o ro fg e n ec h i p sd u r i n gt h ep r o c e s so fi m m o b i l i z a t i o na n dh y b r i d i z a f i o n o fd n a f i r s t l y , t h em e t h o do fm a c r o s c o p i c a lc o n t i n u u mm e c h a n i c si su s e dt o i i 上海大学硕士学位论文 e s t a b l i s hal a m i n a t e dc a n t i l e v e rm o d e lw i t hap i e z o e l e c t r i cb i o l a y e r s e c o n d l y , i n t h en a n o s c a l ed i m e n s i o n t h eb i o l o g i c a lp o l y m e rb r u s hs t r u c t u r ei st a k e n 嬲a p i e z o e l e c t r i cp o l y m e ra n dt h em e t h o d si ns t a t i s t i cm e c h a n i c sa n dt h el i n e a r i z e d p o i s s o n b o l t z m a n ne q u a t i o ni np o l y m e re l e c t r o l y t et h e o r ya r eu s e dt oe s t a b l i s h t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h em a c r o s c o p i ce l e c t r i cp o t e n t i a lo f t h ed n a l a y e ra n d t h ef a c t o r ss u c ha sn a n o s c o p i c a ld n am o l e c u l a rs t r u c t u r a lf e a t u r e s ，s o l u t i o ni o n c o n c e n t r a t i o n ，e t c f i n a l l y , b o t hm a c r o s c o p i ca n dn a n o s c o p i cm o d e l sa r e c o m b i n e dt oe s t a b l i s ht h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h en a n o m e c h a n i c a ld e f l e c t i o no f g e n ec h i p sa n dt h ef a c t o r ss u c ha sn a n o s c o p i c a ld n am o l e c u l a rs t r u c t u r a l f e a t u r e s ，s o l u t i o ni o nc o n c e n t r a t i o n , e t c n u m e r i c a lr e s u l t ss h o wt h a tt h es i g no f t h ep i e z o e l e c t r i cc o n s t a n to ft h ed n al a y e rm a yr e s u l ti nt h eu p w a r do r d o w n w a r db e n d i n go f t h ec h i p sd u r i n gt h ei m m o b i l i z a t i o no ff i n g l e - s t r a n dd n a ( s s d n a ) o nc h i ps u r f a c e ，a n dt h ec h i pd e f l e c t i o ni sp r o p o r t i o n a lt ot h ef r a g m e n t n u m b e ro f t h et a r g e tm o l e c u l a rd u r i n gt h ed n a h y b r i d i z a t i o n k e y w o r d s ：l a b e l - f r e eb i o d e t e c t i o n ，g e n ec h i p ，n a n o m e c h a n i c s ，c o n t i n u u m m e c h a n i c s ，b i m e t a l l i ce f f e c t ，p o i s s o n b o l t z m a n ne q u a t i o n , m u l t i s c a l es i m u l a t i o n i l l 原创性声明 本人声明：所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作。 除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已发 表或撰写过的研究成果。参与同一工作的其他同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名： 掣生胁型却 本论文使用授权说明 本人完全了解上海大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留论文及送交论文复印件，允许论文被查阅和借阅；学 校可以公布论文的全部或部分内容。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名： 导师签名：三丝丝塑日期： 3 - 0 06 5 n ：海大学硕士学位论文 1 1 课题来源 第一章绪论 本课题来受到上海市重点学科建设项目和上海高校优秀青年教师后备人选 科研项目的资助，项目编号：y 0 1 0 3 和0 4 y q h b 0 8 8 。 1 2 课题研究的背景、目的和意义 生物芯片的飞速发展引起世界各国的广泛关注和重视，毫无疑问，生物芯 片产业有着广阔的市场前景。2 0 世纪9 0 年代，被誉为与阿波罗登月计划及曼 哈顿原子弹计划相媲美的人类基因组计划正式启动，并以此引发了人类生物科 技的革命，融合了分子生物学、材料科学、信息科学、计算机、微电子、物理 学等多个学科的d n a 芯片技术由此应运而生马文丽，2 0 0 2 。在基因组研究、 临床诊断、新药筛选等生命科学的各个领域都发挥了令人瞩目的作用。美国财 富杂志曾写道：“2 0 世纪科技史上有两件事值得大书特书：一是微电子芯片， 它改变了我们的经济和文化生活；另一个就是d n a 芯片，它将给生命科学的 研究方式带来重大改变，开辟了一个生命信息和应用的新纪元。” 1 2 1 生物芯片的技术、应用及分类 生物芯片技术是指在固 相支持物上原位合成寡核苷 酸或者直接将大量生物探针 以显微打印的方式有序地固 化于支持物表面f 马文丽， 2 0 0 2 1 ，如玻片、硅片、聚丙 烯酰胺凝胶、尼龙膜等( 图 1 1 ) 。传统方法中，当荧光标 图1 1 生物芯片技术 记的靶分子与芯片上的探针 上海大学硕士学位论文 分子结合后，通过激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机( c c d ) 对荧光信号的 强度进行检测，从而判断样品中靶分子的数量和样品的遗传信息。这个新兴技 术的研究开发及其产业化，将对疾病诊断、药物筛选、农作物优育和优选、环 境检测和防治、食品卫生监督乃至司法鉴定等技术发展起到巨大的推动作用 【m a r ks c h 饥a ，2 0 0 2 】。 生物芯片根据芯片上的探针不同，可分为蛋白芯片和基因芯片f 梁国栋， 2 0 0 lj 。如果芯片上种植的是肽或蛋白，则称为肽芯片或蛋白芯片；如果芯片上 种植的分子是寡核苷酸探针或靶d n a ，则称为基因芯片( g e l l ec h i p ) 或d n a 芯 片。基因芯片有寡核苷酸芯片和e d n a 芯片，包括两种模式：一是将靶d n a 固定于支持物上，适合于大量不同靶d n a 的分析；二是将大量探针分子固定 于支持物上，适合于对同一靶d n a 进行不同探针序列的分析。 基因芯片是最早出现的一种生物芯片，被美国科学促进会列为1 9 9 8 年度自 然科学领域十大进展之一，可见其科学史上的意义。本文主要研究对象就是这 一类型的生物芯片。 1 2 2d n a 概述 d n a 的基本单位核苷酸由一个糖分子、一个磷酸分子和一个含氮碱基 构成( 图1 2 ) 。碱基是编码信息的成分，有四种不同的形式：腺嘌呤、胞嘧啶、 鸟嘌呤和胸腺嘧啶。这四种碱基分别简称为a 、c 、g 、t ，是遗传字母表中的 四种字母。核苷酸串在一起形成难以置信的d n a 长链，如果把一个细胞中的 d n a 连起来不弄断，长度可达2 米，而其宽度仅有5 0 万亿分之一厘米。细胞 图1 2d n a 基本单位 上海大学硕士学位论文 内的生物分子由两条链组成，这两条链相互盘绕形成一个螺旋状的梯子，这就 是非常著名的双螺旋结构( 图1 3 ) 。梯子的两个边是由糖和磷酸分子构成长链， “横档”片断是一对一对的碱基，碱基分别连在两条链上。d n a 一个显著的特 征是碱基配对的方式：a 只与t 配对连接，c 只与g 配对连接，这些配对称为 “碱基对”。碱基沿着生物链的线性排列次序就是生物的序列。 1 2 3 基因芯片的关键技术 基因芯片技术包含四个关键技术【马文丽， 2 0 0 2 ：芯片方阵的构建、样品的制备、杂交或 反应、杂交图谱的检测及读出。基因芯片的技 术核心是芯片的制备及反应信号的检测。 ( 1 ) 芯片制备技术 目前制备芯片的方法基本上可分为两大类 【马文丽，2 0 0 2 】：一类是原位合成( ms 油 图1 3d n a 双螺旋结构 s y n t h e s i s ) ：一类是合成后交联( p o s t s y n t h e s i s a t t a c h m c n 0 。原位合成是目前制造高密度寡核苷酸芯片最为成功的方法。在制 备基因芯片时要考虑阵列的密度、再生性、操作的简便性、成本的高低等几方 面的因素。 具体而言，比较典型的d n a 芯片制备方法有四种 梁国栋，2 0 0 1 ：第一种 方法是a f f y m e t r i x 公司开发的光引导原位合成法，其关键是高空间分辨率的模 板定位技术和高合成生成率的d n a 化学合成技术，该方法是微加工技术中光 刻工艺与光化学合成法相结合的产物。第二种方法是i n e y t ep h a r m a c e u t i c a l 公司 采用的化学喷射法，该方法是将合成好的核苷酸探针定点喷射到芯片上并加以 固定化来制作d n a 芯片。第三种方法是斯坦福大学研制的接触式点涂法。在 d n a 芯片制备中通过高速精密机械手的精确移动让移液头与玻璃芯片接触，而 将d n a 探针涂敷在芯片上。第四种方法是通过使用四支分别装有a ，t ，g ， c 核苷的压电喷头在芯片上并行地合成出d n a 探针。目前很多公司采用合成点 样法来制备芯片。 r 海大学硕士学位论文 ( 2 ) 探针制备技术 为了提高监测灵敏度，人们的努力放在信号放大以及模板扩增两个方面， 其中应用经过特殊处理的探针方法可以提高灵敏度的方法有三种马文丽， 2 0 0 2 。一是分支探针，这种方法的原理是，设计具有庞大分支结构的分支核苷 酸探针，分支末端以酶标记，这样，经过分支核苷酸与酶的双重放大作用而将 标本杂交时极弱的信号转换为较强的化学信号；二是分子信标( m o l e c u l a r b e a c o n ，m b ) ，一种设计巧妙的荧光标记的核酸探针，未杂交状态下为发夹结构， 在发夹的两端分别连接荧光素分子和猝灭分子，利用荧光共振能量转移原理 ( f r e t ) ：三是肽核酸( p e p t i d en u c l e i ca c i d s ，p n a ) ，以中性酰胺键为骨架， 不带电荷，为d n a 类似物，与d n a 的亲和性高、酶解稳定性好，因此，该类 探针多用于诊断和检测。 ( 3 ) 杂交反应及过程控制技术 目前杂交是提高芯片在实际应用中的准确性的关键步骤之一。杂交条件的 构建要根据芯片的实际情况进行最优化。 杂交反应是一个复杂的过程，受很多因素的影响，而杂交反应的质量和效 率直接关系到检测结果的准确性。这些影响因素包括【赵颖，杨宝珍，2 0 0 2 】 ( a ) 寡核苷酸探针密度的影响。低覆盖率使杂交信号减弱，而过高的覆盖率 会造成相邻探针之间的杂交干扰。 ( b ) 支持介质与杂交序列间的间隔序列长度的影响。当间隔序列长度提高到 1 5 个寡核苷酸时杂交信号显著增强。若选择合适长度的间隔序列，可 使杂交信号增强1 5 0 倍。 ( c ) 杂交序列长度的影响。在杂交反应中经常发生碱基错配现象，区分正常 配对的互补复合物与单个或2 个碱基的错配形成的复合物，主要依赖于 形成的复合物的稳定性不同，而杂交序列的长度是影响复合物稳定性的 一个重要因素，一般说来，短的杂交序列更容易区分碱基的错配，但复 合物的稳定性要差一些；而长杂交序列形成的复合物稳定，而区分碱基 错配能力要差一些。研究表明，1 2 、1 5 、2 0 个碱基产生的杂交信号强 度接近，但1 5 个碱基的杂交序列区分错配碱基效果最好。 4 上海人学硕士学位论文 ( d ) g c 含量的影响。g c 含量不同的序列其复合物的稳定性也不同。 ( e ) 探针浓度的影响。以凝胶为支持介质的芯片，提高了寡核苷酸的浓度， 在胶内进行的杂交更象在液相中进行的杂交反应，这些因素提高了对错 配碱基的分辨率，同时也提高了芯片检测的灵敏度。 ( d 核酸二级结构的影响。在使用凝胶作为支持介质时，单链核酸越长，则 样品进入凝胶单元的时间越长，也就越容易形成链内二级结构从而影响 其与芯片上探针的杂交，因而样品制备过程中，对核酸的片段化处理， 不仅可提高杂交信号的强度，还可提高杂交速度。 ( 4 ) 杂交图谱的信号检测 杂交图谱的信号检测是生物芯片的关键技术之一，目前关于生物芯片的大 量专利和研究集中在这方面。该技术为基因芯片信号的分析与解读提供了直观 基础。 1 2 4 课题研究的目的和意义 生物信息的数据分析是基因芯片技术中很重要的方面。芯片杂交图谱的多 态性处理与存储都由专门设计的软件来完成。一个完整的生物芯片配套软件应 包括生物芯片扫描仪的硬件控制软件、生物芯片的图像处理团建、数据提取或 统计分析软件，芯片表达基因的国际互联网上检索和表达基因数据库分析和积 累。从国际上生物芯片专利的按领域分布来看，6 2 的专利集中在数据分析领 域，可见如何对生物芯片带来的海量数据进行解读、分析是生物芯片研究领域 的焦点和重点。 本文拟建立无标记生物检测中基因芯片纳米力学行为的多尺度模拟模型， 目的在于通过宏观力学信息来提取纳观生物信息，确立纳观d n a 分子结构特 征、盐溶液离子浓度与基因芯片连续介质力学挠度之间的关系。本文的选题具 有较强的工程背景，同时可以推动生物芯片的理论研究，丰富和发展生物力学、 纳米力学的相关理论。 r 海大学硕士学位论文 1 3 国内外研究概况 1 3 1 国内外有关实验研究 基因芯片技术中生物信息提取大多采用荧光标记法，即根据各杂交点的荧 光信号强弱用扫描同焦显微镜读出生物信息。它的优点是重复性好，但是缺点 是成本高、灵敏度相对较低。因此，质谱法、化学发光和光导纤维、二极管方 阵检测、乳胶凝集反应、直接电荷变化检测、悬臂梁光学挠度差技术等新的芯 片检测替代方法正处于研究和试验阶段 b u s t a m a n t ee ta i ，2 0 0 3 ；c h u a n ge ta 1 ， 2 0 0 0 ；h e l de ta 1 ，2 0 0 3 ；r u e d ae ta 1 ，2 0 0 4 ；s t e f le ta 1 ，2 0 0 4 ；x ue ta 1 ，2 0 0 4 】。 目前，各国科学家j 下在探索一种基于微悬臂梁光学挠度差技术的无标记生 物检测技术，其工作原理是利用生物分子发生生物化学反应引起悬臂梁的挠度 提取生物信息，从而可用于检测碱基错配、癌细胞抗原和抗体蛋白识别等。由 于采用a f m 直接读出芯片挠度，而且检测分子无需标记。所以这项技术灵敏 度高、成本低、速度快。早期 b e r g e r , 1 9 9 7 ；f r i t z 1 9 9 8 ；b a i l e r , 2 0 0 0 1 该技术是采 用a f m 、光学镊子、磁头实验等直接观察外力作用下分子的力学响应，与此同 时，一些科学家发现，小分子的吸收会引起与之连接的固体表面或悬臂梁的弯 曲，如m o u l i n 和b a i l e r 都发现蛋白质的不确定吸收引起悬臂梁的弯曲m o u l i ne t a 1 ，2 0 0 0 ；b a l l e re ta 1 ，2 0 0 0 。 2 0 0 0 年i b m 研究中心苏黎士实验室f r i t z 等在s c i e n c e 上发表工作，首先 将单链d n a 的5 - 或3 端部经过硫化处理固定在硅梁的金层表面作为基因芯 片的生物探针，然后利用a f m 观察电解液中d n a 杂交引起的基因芯片挠度 【f r i t ze ta 1 ，2 0 0 0 。随后系列试验表n w ue ta 1 ，2 0 0 1 a ；m c k e n d e r ye ta 1 ，2 0 0 2 ； h a g a ne ta i ，2 0 0 3 ，芯片自由端的挠度值大约在0 8 0 n m 。芯片的弯曲与缓冲 溶液的离子浓度、探测d n a 分子的种植密度和链长以及目标分子的浓度等多 种因素有关。f r i t z 认为这种纳米运动是由于d n a 分子杂交引起的表面应力差 造成的 f r i t ze ta 1 ，2 0 0 0 1 ，美国加州大学伯克利分校的w u 等和其橡树林实验室 的合作者认为生物化学反应过程中构型熵的变化是值得考虑因素 w ue ta i ， 2 0 0 1a 1 ，m c k e n d r y 认为主要是由于位阻抗效应( s t e r i c h i n d r a n c e e f f e c t s ) 引起 6 上海大学硕士学位论文 i 拘 m c k e n d r y e t a l 2 0 0 2 ，以上结论都是基于实验现象的一种定性推测。 1 3 2 相关定量研究 目前也已有少量工作开始致力于利用微观或宏观物理规律，建立数学模型， 定量研究基因芯片纳米力学行为的起源。如v a i n m b 借助线性p o i s s o n - b o l t z m a n n 方程讨论了静电表面效应对d n a 分子杂交效率的影响，但未涉及原子尺度的 表面效应与细观尺度的基因芯片纳观挠度之间的关系 v a i n r u b 就a 1 ，2 0 0 2 ； m c k e n d r y 认为探针表面覆盖度与目标分子浓度的关系服从l a n g m u i r 等温吸附 模型，而芯片挠度差与探针表面覆盖度成正比【m c k d r ye ta 1 ，2 0 0 2 ；美国加 州大学伯克利分校的h a g a n 考虑了构型熵、静电排斥、渗透、弯曲变形对自由 能的贡献，利用各种经验势研究了种植的单链d n a 和杂交后双链d n a 引起的 各种纳米机械力，认为碱基对其中的氢键引起的水合力是引起芯片挠度的主要 原因，而不是构型熵 h a g a ne ta 1 ，2 0 0 2 ，但仅将基因芯片视为单层硅梁模型， 未考虑实验中温度变化对芯片挠度的影响，而且有关长链分子的经验势能否用 于实验中的短链分子还有待于进一步的论证或修正，由于问题的复杂性，缺乏 统一的理论框架；美国加州大学伯克利分校的y u em i n 等人已将该技术平面化， 制成了面积1 5 1 5 r a m 2 含9 0 ( 6 x 1 5 ) 个悬臂梁的芯片，并指出可以将梁的数目增 加到1 0 0 0 个，同时利用b a r n e s 发表于n a t u r e 上的双层梁模型 b a r n e s ，1 9 9 4 ， 研究了温差对基因芯片变形的影响 y u ee ta 1 ，2 0 0 4o 总之，有关无标记生物检 测中基因芯片纳米力学行为的定量研究还非常少见，而且主要都是在单一尺度 下假设造成芯片弯曲的原因是某一种因素引起的，这与实验观察有一定差别， 而且未能解释实验中的所有现象，如单链d n a 在不同的实验条件下种植时会 引起芯片的上翘或下弯。可见，国外的大部分工作是采用实验方法定量研究基 因芯片的纳米级弯曲行为，或是在实验基础上提出一些简单模型。 国内对于基因芯片技术中生物信息提取的研究也刚刚起步。中国科学技术 大学的伍小平院士正在进行用于癌症诊断的新悬臂梁生物芯片及检测技术基础 研究；中国科学院理论物理研究所所长欧阳钟灿院士 l i u e ta 1 ，2 0 0 3 ；z h o ue ta 1 ， 2 0 0 2 借助液晶薄膜的m e y e r 模型，认为芯片的曲率与芯片表面探针层电势差成 上海大学硕士学位论文 正比，从而建立了纳观d n a 分子结构特征与芯片连续介质力学挠度之间的关 系，但仅将芯片硅层视为非线性矩形薄膜模型，未考虑芯片金层( 附着层) 和 钛层( 固定层) 对变形的贡献。 1 3 3课题研究的困难分析和设想 基因芯片技术从机理上急需解决生物分子的种植和结合过程中芯片纳米力 学行为与探测分子和目标分子的纳观特征、溶液离子浓度、温度变化等之间的 定量关系。然而对于该生物结构的建模和模拟，涉及生物、物理、化学、力学 等多学科交叉，跨越不同的空间尺度，给问题的解决带来很大的挑战和困难。 显然，研究弯曲行为的起源，仅凭实验方法是无法胜任的，因为实验中的 许多不确定因素会影响分析结果。因此利用统计力学、聚合物化学、连续介质 力学等纳观、细观、宏观建模方法和计算技术，不失为一种有力手段。利用这 些跨尺度的耦合方法，既能从原子论角度理解d n a 杂交过程中的动力路径 【h a g a ne ta 1 ，2 0 0 3 和微观结构与杂交力之间的关系 h a g a ne ta 1 ，2 0 0 2 ，还能得 到许多在实验中无法获得的微观细节。 同时，为了将探测d n a 分子固定在s i 或者s i n x 梁上，在d n a 探针层与 s i 梁之间，还有多层纳米级金属薄层，可见，从研究微悬臂梁纳米运动的相对 尺度上看，将芯片视为单层薄膜或梁模型显得过于粗糙，有必要将其视为一种 层合结构。另外，尽管纳米金属薄层的厚度仅为微米硅层的百分之几，但实验 已发现，由于不同层材料热学性质的不同，注入的样品溶液与缓冲溶液的温差 和d n a 杂交瞬间氢键结合的放热效应会造成梁的弯曲，即所谓的双金属效应。 因此，有必要建立模拟芯片纳米力学行为更为精确的层合结构模型，而宏观连 续介质力学方法或结合微观方法的多尺度模拟技术现已广泛用于纳米碳管力学 研究中，这给我们提供良好的借鉴。 综上，本文拟利用统计力学方法，采用聚合物电解质溶液理论中的线性 p o i s s o n - b o l t z m a r m 方程，建立纳观d n a 分子结构特征、溶液浓度等因素与d n a 层宏观电势之间关系，并采用宏观连续介质力学方法，建立含压电生物层基因 芯片的层合梁模型，以确立宏观电势与基因芯片纳米级挠度的关系，从而解决 上海大学硕士学位论文 基因芯片纳米力学行为与探测分子和目标分子的纳观特征、溶液离子浓度、温 度变化等之间的定量关系。 1 4 论文的主要研究内容 本论文主要内容一共分为四大部分。 第一章绪论。主要介绍了生物芯片的技术、应用、分类和课题研究的目的 意义，阐述了国内外研究的现状，分析了课题研究的困难并预计相应的对策， 概述本文的结构与主要内容。 第二章无标记生物检测中基因芯片宏观连续介质力学模型。本章不考虑基 因芯片d n a 层结构的变形，将d n a 层作用简化为d n a 种植或杂交引起的当 量机械弯矩作用。首先，利用连续介质力学e u l e r 梁的平截面假设，在当量机 械弯矩和热场载荷作用下，建立基因芯片纳米力学行为的连续介质力学层合梁 模型，给出了应力、应变和挠度预测公式。其次，在不考当量机械弯矩作用， 而仅考虑温度场变化的情况下，以形心轴轴向正应变和中性轴的曲率半径为未 知数，推导了应力的解析公式，并对该公式解析作一阶近似和零阶近似；在零 阶近似的情况下，模型退化为s t o n e y 公式，并在五层梁和两层梁的情况下，与 h e u s h 的层合模型进行比较。最后，分别采用线性和均匀温度场模拟基因芯片 在d n a 杂交过程中的瞬态和稳态温度分布，解释f r i t z 实验中发现的d n a 分 子杂交时基因芯片的双金属效应。 第三章无标记生物检测中基因芯片纳米力学行为的多尺度模拟模型。本章 考虑d n a 层结构的变形，将d n a 层视为压电生物材料，认为d n a 种植和杂 交引起基因芯片的弯曲行为主要由d n a 层的压电效应所致。首先利用统计力 学方法，采用聚合电解质溶液理论中的p o i s s o n b o l t z m a n n 方程，建立纳观d n a 分子结构特征、溶液离子浓度等因素等与d n a 层宏观电势之问的关系；其次 采用宏观连续介质力学方法，建立含压电生物层的基因芯片层合梁模型，确定 d n a 层宏观电势与基因芯片纳米级挠度之间的关系；最后在d n a 种植情况下， 采用本文模型与实验数据进行拟合，解释单链d n a 在芯片表面种植时可能导 致芯片上翘或下弯的原因；同时，在d n a 杂交情况下，将本文的修正预测模 9 上海人学硕士学位论文 型得到的理论预测值与实验观测值进行比较，数据吻合良好。 第四章总结全文，并且提出了几个有待进一步研究的问题。 0 上海大学硕士学位论文 2 1 引言 第二章无标记生物检测中基因芯片 宏观连续介质力学模型 本章忽略基因芯片d n a 层结构的变形，将d n a 层的某些作用简化为d n a 种 植或杂交引起的当量机械弯矩作用。首先，利用连续介质力学e u l e r 梁的平截面 假设，在当量机械弯矩和热载荷作用下，建立基因芯片纳米力学行为的连续介质 力学层合梁模型，给出了应力、应变和挠度预测公式。其次，在不考虑当量机械 弯矩作用，而仅考虑温度场变化的情况下，以形心轴轴向正应变和中性轴的曲率 半径为未知数，推导应力的解析公式，并对该解析公式作一阶近似和零阶近似： 在零阶近似情况下，模型退化为s t o n e y 公式，并在五层梁和两层梁的情况下，与 h e u s h 的层合模型 h e u s h ，2 0 0 2 进行比较，以验证本文提出的预测厚基薄膜多层 结构应力公式的合理性。最后，分别采用线性和均匀温度场模拟在d n a 杂交过 程中瞬态和稳态温度分布，解释f r i t z 实验中发现的d n a 分子杂交时基因芯片的双 金属效应 f r i t ze ta 1 ，2 0 0 0 。 图2 1d n a 杂交引起基因芯片弯曲图2 2 基冈芯片的几何示意图和梁弯曲图 上海大学硕士学位论文 2 2 数学描述 假设基因芯片的长度为，宽度为b ，金层、钛层两个金属薄层材料的厚度、 弹性模量和热膨胀系数分别为岛，巨，q ( 卢l ，2 ) ；硅层的厚度、弹性模量和热膨胀 系数为h s ，e ，。如图2 2 和图2 3 所示，沿梁的轴向方向建立工轴，沿梁的纵 向对称面与横向对称面分别建立y 轴和：轴，即y 轴和z 轴为悬臂梁横截面的 形心主轴。 2 2 1 应力应变关系 0 中性轴 任意层 图2 3 层合梁应力应变关系求解示意图 轴o 假定中性轴的位置如图2 3 所示。令中性轴离形心轴x 的距离为，中性轴 处的曲率半径为p ，则距离形心轴x 距离为，处的轴向正应变为 占：( p + a + y = ) d 丁# - p d o ( 2 - 1 ) o d 8 而形心轴x 处的轴向正应变为 。一l p + a ) d o 一p 钿一五万一 由( 2 1 ) 式和( 2 - 2 ) 式，得 2 ( 2 2 ) l 海大学硕士学位论文 v s s 0 。二- p 于是，距离形心轴y 处的正应变为 ( 2 3 ) 占=上+(2-4) p 而热弹性材料的应力应变关系为 程昌钧，1 9 9 5 f = 要+ 以r( 2 5 ) e 、7 若梁的应力小于材料的比例极限，则梁的应力分布为 o s ：墅 e 民一e psat(2-6a) 口 q ：墨兰+ e i 一巨q r ( f _ 1 ，2 ) ( 2 - 6 b ) 其中，盯，q 分别为硅层和各金属薄层的应力；e ，e i 分别为硅层和各金属薄层 的弹性模量；，q 分别为硅层和各金属薄层的热膨胀系数；a t 为热场温度变 化。 可见，模型中应力和应变分布仅取决于两个未知量占。和p 。 2 2 2 层合粱的平衡条件 若层合梁轴力为0 ，则 ；。q d a i + e , c rd a , = o 若d n a 生物化学作用引起的等价弯矩记为m q ，则 二k 哪d a i + l ? 刚眠= m q 其中，a i ，a ；分别为金属薄层和硅层的横截面积。 ( 2 - 7 ) ( 2 - 8 ) 卜海大学硕士学位论文 2 2 3 模型的提出 椅( 2 6 ) 瓦代八( 2 7 ) 式，j 以得剑 军e ( e c 吉蝎m 蝉卜+ 啦c 吉蝎m 啦r 卜= 。 根据静矩的定义，上式可化为 军( 吉巨s + 巨啊6 一巨d ，6 e 砌 + 吉e 疋+ e 玩6 岛一巨吼6 e 助= 。 ( 2 - 9 ) 其中，h t i ， 6 f ，h t ， 眈分别表示金属薄层与硅层的上下表面坐标；s i , 只分别表 示金属薄层与硅层的静矩。将( 1 6 ) 式代入( 1 - 8 ) 式，得 莩啦c 砉蝎m 中，y d a ，+ l ( ec 寺吲一刁删，圳 根据惯性矩和静矩的定义，上式可化为 犯吼删舻配6 e 必砌j 陋 + i 1e s is + e s s s 6 0 - - e r b y 虹匆= m q 口 删r 其中，分别表示金属薄层与硅层的惯性矩。于是，f 1 3 ( 2 9 ) 式和( 2 1 0 ) 式可 得 占0 ：翌! 篁! 竺：竺壁竺也竺型陋1 6 一7 _ 一t z 。1 ， 6 【；聃+ 聃j 其中， 1m 9 + m 7 p e 1 4 ( 2 - 1 2 1 r 海大学硕士学位论文 叫弘叫一鞘 ( 2 - 1 3 ) m t = 电即i y 龃匆岖as y 一( 至兰：壁竺：兰：篁竺廷兰兰：型 e h i + eg h s 由于芯片的挠厦w 一舣在儿十个纲米，向芯片的长度卜一股在几目个微米，显然， w ， l 。于是由材料力学知识【单祖辉，1 9 9 9 ，在本文的坐标下，有 去= 害d x c 2 彤， 口 所以，若考虑d n a 种植或杂交引起的当量机械弯矩和热场作用，则基因芯片 层合梁模型为 w 一：一m _ q + m r ( 2 - 1 6 ) e i “0 ) = 0 ( 2 1 7 a ) w ，( o ) = 0 ( 2 - 1 7 b ) 因此，( 2 - 1 6 ) ，( 2 - 1 7 a ) ，( 2 1 7 b ) 构成了在d n a 种植或杂交引起的当量机械 弯矩和热载荷作用下，模拟基因芯片纳米力学行为以挠度为未知量的连续介质 力学模型。 2 3 应力分布的近似公式 2 3 1n 层粱的近似公式 暂不考虑d n a 种植或杂交引起的当量机械弯矩作用的情况，即取m q = 0 ， 并且设薄层的层数为n 层。对于硅层和金属薄层，静矩和惯性矩的表达式分别 上海大学硕士学位论文 为 沪学巩一瑚卜詈+ 茎”尹h i ( 2 - l s a ) l 啦( 半) 2 + 警，l 啦- - + h 善”争2 + 等( 2 m ) f k 三p 簟岛_ 昙z + 芸 ，+ 等，+ 日曩s 。一目口，c 脚j 。：，。， + 警”酗i o 也as 龃d y = o 吉e 际毪l + 小剀 + 互i h + ；i - l _ + 批嘲6 e 必砌 + 吉e 陋竽n 铡+ 巨( 竽坎卜聊r i y a t d y = 。 f 2 2 0 ) 假设温度变化沿芯片厚度是均匀的，即a t 与y 无关，从而，晶和一1 的表达式 p 铲睦竺娑塑掣) 一1 再f 甭 世 1 p r 莩竽蝴，掣 啊陋吃i h 删，竽) 眇胁小吃 ( 爿+ 翻 ( 2 2 2 ) 由于金属薄层的厚度远小于硅层厚度，即h 兰九，所以，公式( 2 2 1 ) 和( 2 - 2 2 ) 的 一阶近似为 6 0 = 口j a t + 日 肛， 口。) t e s h ， 1 6 f 2 - 2 3 ) e 海大学硕士学位论文 土：竖竺竺：竺： p e s 缱 2 3 2 两层粱的退化 对于两层梁的情况，( 2 2 3 ) 式和( 2 2 4 ) 式变为 铲a t 。a t4 。掣 f 2 - 2 4 ) r 2 2 5 ) 土：6 e l l t ( a i , i - - a , 一) a t ( 2 - 2 6 ) p e s 醚 ，e 。分别为薄膜层的热膨胀系数和弹性模量。代( 2 2 5 ) 式和1 (