（应用化学专业论文）胆红素与生物大分子作用及其氧化还原能力的光谱研究.pdf

摘要 本文采用光谱法研究了胆红素与生物大分子的相互作用以及胆红素的氧化还原能 力。胆红素与血清白蛋白形成复合物，以静态猝灭的方式使蛋白荧光强度降低，使蛋白 质构象发生变化，产生分子茸j 能量转移；铜离子对胆红素和蛋白质的结合有显著影响； 蛋白质能使胆红素荧光发射峰增强，以此为基础建立了测定胆红素的新方法；同时还应 用核磁共振波谱进行了胆红素与蛋白间相互作用的动力学研究。实验分为五部分： 1 研究了胆红素( b i l i r u b i n ) 与牛血清白蛋白( b s a ) 相互作用的荧光猝灭光谱、同步荧 光光谱、三维荧光光谱和紫外可见吸收光谱，探讨了铜离子及胆红素与牛血清白蛋白间 的结合反应，阐明了不同浓度的铜离子对胆红素和蛋白质结合的影响。分别用荧光增敏 和荧光猝灭两种不周方法，求得腆红素与白蛋白的形成常数和结合比。实验表明胆红素 与牛血清白蛋白形成复合物，蛋白质构象发生变化，产生分子间能量转移。有c u 2 + 存在 时，能够形成b s a c u 2 + - b r 三元络合物。 2 。研究了胆红素与人血清白蛋白( h s a ) 相互作用的荧光光谱。利用热力学常数得到 了胆红素与人血清白蛋白间的主要作用力类型，还求得了两者之间的结合距离。实验表 明胆红素与人血清白蛋白形成复合物，两者之间具有较强的作用力，主要凭借范德华力 和氢键作用结合；胆红素丰要以静态猝灭的方式使得人血清白蛋白荧光强度显著降低。 3 次甲基蓝与o h 反应后，使其自身的吸光度降低。胆红素可以清除溶液中的o h ， 从而使溶液吸光度下降的程度降低。据此原理建立了种测定胆红素对o h 清除率的新 方法。测定了胆红素、抗坏血酸、苯甲酸对o h 的清除率，结果表明：三者对羟自由基 均有较好的清除效果；浓度相同时，胆红素对羟自由基的清除效果强于抗坏血酸，弱于 苯甲酸。 4 基于2 ，2 联n 比啶芳杂环羟基化法，采用荧光光谱研究了胆红素与铜离了的相互作 用。探讨了胆红素与铜离予反应生成羟自由基( o h ) ，以及o h 与2 , 2 联吡啶反应的过 程，证实胆红素与铜离子反应确实能产生羟自由基，导致几乎没有荧光的2 ，2 联吡啶发 生芳杂环羟基化，生成强荧光物质。 5 应用l a n g m u i r 吸附等温方程研究溶液中小分子配体与大分子蛋白质之间发生的低 亲和力相互作用。在实验过程中，固定蛋白质浓度，改变胆红素浓度配制一系列胆红素 蛋白质溶液，并测定溶液中胆红素分子的1 h 她偶自旋晶格驰豫速率。应用l a n g m u i r 吸附等温方程推导出胆红素蛋白质络合物的络合常数k 和蛋白质分子对胆红素的结合 中心数目n 。结果表明l 觚g m u i r 吸附等温方程能够很好地解释蛋白与配体间的低亲和力 相互作用。这不仅仅拓宽了l 锄g m u i r 吸附等温方程的应用范围，而且还给小分子一生物大 分子相互作用的动力学研究开辟了一条新途径。 关键词：胆红素：血清白蛋白；芳杂环羟基化；自由基；荧光光度法；核磁共振( n m r ) n a bs t r a c t t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nb i l i r u b i na n db i o m a c r o m o l e c u l e sa n dt h er e d o xc a p a c i t yo f b i l i r u b i nw e r es t u d i e db yf l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y b i l i r u b i na n da l b u m i nc o u l df o r m c o m p o u n d s ，a n dt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fs e r u ma l b u m i nc o u l db eq u e n c h e db yb i l i r u b i n b ys t a t i cq u e n c h i n gs t y l e t h ea l b u m i nc o n f o r m a t i o nw a sc h a n g e da n d i n t e r m o l e c u l a re n e r g y t r a n s f e ro c c u r r e db e t w e e nb ra n da l b u m i n t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r u mo fa l b u m i n - b rw a s c h a n g e da p p a r e n t l y i nt h ep r e s e n c eo fc u 2 + a l b u m i nc o u l do b v i o u s l ye n h a n c et h e f l u o r e s c e n c eo fb r b a s e do ni t , n e wm e t h o d sf o rt h ed e t e c t i o no fb rw e l of o u n d n m rw a s u s e df o r t h ed y n a m i cs t u d yo fi n t e r a c t i o nb e t w e e nb i l i r u b i na n da l b u m i n t h et h e s i si s c o m p o s e do ff i v ep a r t sa sf o l l o w ： 1 t h ei n t e r a c t i o n so fb i l i r u b i n ( b r ) w i t hb o v i n es e r u ma l b u n m ( b s a ) w e r es t u d i e db yt h e m e t h o d so ff l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y , t h r e e - d i m e n s i o n a l f l u o r e s c e n c e s p e c t r o m e t r y , s y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r ya n du l t r a - v i o l e ts p e c t r o s c o p y t h ee f f e c to fv a r i o u s c o n c e n t r a t i o n so fc u 2 + 0 1 1t h eb i n d i n gf o rb i l i r u b i na n db o v i n es e r u ma l b u m i nw a si l l u s t r a t e d t h eb i n d i n gc h a r a c t e r i s t i c so fb ra n db s aw e g om e a s 哪e db yt h ef l u o r e s c e n c es p e c t r a t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tb i l i r u b i na n db s ac o u l df o r mc o m p o u n d i ti n d i c a t e dt h a tt h eb s a c o n f o r m a t i o nw a sc h a n g e da n di n t e r m o l e c u l a re n e r g yt r a n s f e ro c c u r r e db e t w e e nb ra n db s a t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r u mo fb s a - b rw a sc h a n g e da p p a r e n t l yi nt h ep r e s e n c eo fc u z + 2 t h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nb i l i r u b i na n dh u m a ns 0 1 3 1 ma l b u m i n0 - i s a ) h a v eb e e ns t u d i e db y f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y t h em a i nb i n d i n gf o r c eo fb i l i r u b i nt oh s aw a sj u d g e da c c o r d i n g t ot h et h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r s t h eb i n d i n gd i s t a n c eb e t w e e nb i l i r u b i na n dp r o t e i nw a l l a l s oo b t a i n e d t h eo b s e r v e ds p e c t r a lr e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h e r ew o r es t r o n gi n t e r a c t i o n s b e t w e e nb i l i r u b i na n dp r o t e i n ，t h em e c h a n i s mo fq u e n c h i n gb e l o n g e dt os t a t i cq u e n c h i n ga n d t h em a i nb i n d i n gf o r c ew a sv a nd e cw a a l si n t e r a c t i o n sa n dh y d r o g e nb o n d s 3 。m e t h y l e n eb l u e ( m b ) w i n is t r o n ga b s o r b a n c ea t6 6 2 衄m i g h tr e a c tw i i 。o i - i , a n d p r o d u c t sw i t hn oa b s o r b a n o ew o r em a d e b i l i m b i nm a ye l i m i n a t e 。o hi ns o l u t i o n , s o d e c l i n i n gl e v e lo fa b s o r b a n c ei ns o l u t i o nw a sl o w e r e d b a s e do nt h i sp r i n c i p l e ，an e wm e t h o d w a sp r o p o s e dt od e t e r m i n et h ee l i m i n a t i o na c t i v i t yo fb i l i r u b i nf o rt h eh y d r o x y lr a d i c a l e x p e r i m e n t e dt h es c a v e n g i n ge f f e c to fb i l i r u b i n ，b e n z o i ca c i d , a n dv cf o r o h , a n dt h er e s u l t s h o w e dt h a ta l ls o l u t i o n sh a de v i d e n ts c a v e n g i n ge f f e c tf o r o h a tt h es a m ec o n c e n t r a t i o n ， t h es c a v e n g i n ge f f e c tf o r o hw a sb e n z o i ca c i d b i l i r u b i n v c 4 ，t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nb i l i r u b i na n dc o p p e ri o n sw a gs t u d i e db yf l u o r e 8 0 0 1 1 0 0m e t h o d u s i n g2 , 2 - b i p y r i d y l a sah y d r o x y lr a d i c a lt r a p p e rt h r o u g ht h eh y d r o x y l a t i o no ft h e i i i h e t e r o c y c l i cc o m p o u n d i tw a ss t u d i e di nd e t a i lt h a tt h em e c h a n i s mo fb i l i r u b i nb i n d i n gw i t h c o p p e ri o n s i tw a sf o u n dt h a tb i l i r u b i nw a sa b l et ob i n dt oc o p p e ri o n sa n dp r o d u c e d h y d r o x y l r a d i c a l s u r e l y 2 , 2 b i p y r i d y l ，a n a l m o s tn o n f l u o r e s c e n o e c o m p o u n dw a s t r a n s f o r m e di n t oah i g h l yf l u o r e s c e n c es u b s t a n c eo nt r a p p i n gh y d r o x y lr a d i c a l ，l e a d i n gt oa s t r o n gf l u o r e s c e n c ei n c r e a s e 5 l a n g m u i ri s o t h e r mw a su s e dt od e s c r i b et h ed y n a m i c a le q u i l i b r i u mb e t w e e ns m a l l m o l e c u l ea n dt h ea l b u m i nm o l e c u l e i nt h et h e s i s ，t h es p i n - l a t t i c er e l a x a t i o nr a t e so fb ri nt h e s o l u t i o n sc o n t a i n i n gaf i x e dc o n c e n t r a t i o no fa l b u m i nw e r em e a s u r e da saf u n c t i o no fb r c o n c e n t r a t i o n l a n g m u i ra d s o r p t i o ni s o t h e r mw a sa p p l i e dt oo ft h ed r u ge v a l u a t et h ea s s o c i a t i o nc o n s t a n tk a n dt h en u m b e ro fb i n d i n gs i t e sno ft h eb r - a l b u m i nc o m p l e x t h er e s u l t si n d i c a t et h a t l a n g m u i ri s o t h e r mc a np e r f e c t l ye x p l a i nt h ec a p a c i t yo fl o w - a f f i n i t yb i n d i n go fp r o t e i n sf o r t h el i g a n d s i td o e sn o to n l yw i d e nt h er a n g eo fa p p l i c a t i o n so fl a n g m u i ri s o t h e r mb u ta l s o e s t a b l i s h e san e wa p p r o a c hf o rt h ed y n a m i cs t u d yo ft h es m a l lm o l e c u l e m a c r o m o l e c u l e i n t e r a c t i o n k e yw o r d s ：b i l i r u b i n ；s o r u ma l b u m i n ；h y d r o x y l a t i o no ft h eh e t e r o o y c l i oc o m p o u n d ；h y d r o x y l r a d i c a l ；f l u o r e s c e n c e ；n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ( n 瓜偶) i v 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 论文作者签名：下驴a 日期：7 n 暑年f 月7 口日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允 许采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文：在不以赢利为目的的前 提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 作者签名：1 弘玲 指导教师签名 日期：渺歹如 日期：矽9 岁o 第一章绪论 1 1 胆红素的概述 第一章绪论 胆红素( b i l i r u b i n ，简称b r ) 是动物体内血红蛋白等含铁卟啉化合物分解代谢的产物 和代谢中问体。在哺乳动物体内，b r 是由胆绿素( b i l i v e r d i n ，简称b v ) 在胆绿素还原酶 作用下的还原产物。b r 也是中药人工牛黄的主要成份，具有较高的药用价值，牛黄这 种色素型动物胆结石是人们熟知的名贵药材，色素型结石的主要成份是b r 及其铜箍和 钙盐。b r 在人体内是一种内源性毒素，一方面，由于b r 的亲脂性，容易通过血脑屏 障导致高胆红素症患者的脑损伤；另一方面b r 也是一种内源性抗氧化剂，能起着生理 的断裂抗氧化剂作用，对肝细胞的再生具有积极作用。止常生理条件下，b r 在人体内 主要以与白蛋白或葡萄糖醛酸结合的形式存在；代谢异常时，多余的b r 就会与胆汁中 金属离子及某些生物分子结合、沉积形成胆结石。1 8 6 4 年s t a e d e l e r 首先从胆石中分离 出胆红素至今已1 4 0 余年。近年米，应用现代技术方法诸如x 晶体衍射、核磁共振波 谱、激光拉曼光谱等揭示了胆红素的空间结构及新的理化特性，从而揭示了其可能具有 的生理功能，使人们对胆红素有了更为深刻全面的认识。 1 1 1 胆红素的分子结构 胆红素是一类线性四毗咯衍生物，存在许多异构体，仅胆红素就有a 、p 、丫、6 四 种形式( 见图1 1 ) 。rb e n n e t t 等1 1 1 证明生物体内南血红素分解代谢产生的胆红素为口，并 用x 射线法研究- j b r 晶体，发现胆红素不仅具有化学平面结构，且具有复杂的空间立 体结构及光学活性。由于b r 第l o 位的碳桥是氢饱和的，因而这个碳原子两侧的吡咯环 可以旋转，容易形成分子内氢键。由分子内氢键形成片状的二级结构，再在二级结构的 基础上折迭交错成对称式的三级结构，在空间结构中，能形成互为镜像的对映异构体， 具有典型的光学活性。在生理p h 条件下，胆红素分子之间以次级键相连，形成聚集状的 四级结构。四级结构的形成和状态与溶剂系统有关，在不同的溶剂系统中，其聚集态是 不相同的。b r 分子内的5 及15 位次甲基碳桥的双键处可以有顺反异构，因此b ri x 可以 形成z z ，z - e ，e z 和e e4 种构型。由于每种构型的立体结构不同，形成分子内氢键的 程度不同，从而也导致了这些异构体在某些性质如水溶性( 脂溶性) 、配位能力等方面的 差异。 湖北大学硕士学位论文 o o i x i 图1 1 胆红素的分子结构 f i g u r e l - 1t h e m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fb i l i r u b i n 1 1 2 胆红素的溶解性 h 胆红素。在p h f 氐于7 o 的水溶液中几乎不溶解，这主要是由于未解离的羧基形成完 全的分子内氢键饱和了对水的亲和力。在非极性的有机介质中溶解度很小，通常低于1 g m o ll 一，其溶解度随溶剂的极性增加而增加，芳香族溶剂比脂肪族溶剂的溶解性好， 不对称结构能促进溶解。因而二氯甲烷、氯仿、吡咯、吡啶等是胆红素的良好溶剂。 1 1 3 胆红素的不稳定性 b r 。在溶液中不稳定，易被氧化为胆绿素或氧化降解为无色产物。在碱性p h 条件 下，即使在暗处，只要有痕量的分子氧存在，就可使水溶液中的胆红素凶自氧化而分解 为胆绿素及二吡咯化合物，还可发生歧化反应，生成胆红素的其他异构体【2 1 。b r 在氯仿 中每天转化约1 ，在碱溶液中每天转化约4 0 【3 】。光、痕量的过渡金属离子及其他金属 离子都可促进胆红素n 的氧化反应。光照条件下，水溶液中的胆红素。可分解为胆绿 素n 等光解产物，且能异构为多种几何异构体 4 1 。在氯仿溶液中，胆红素d 光解为各 种单吡咯和二吡咯化合物及胆绿素。新生儿的高胆红素血症及黄疸采用光线疗法就是基 于胆红素的光解作用。 2 第一章绪论 ，1 1 4 胆红素的荧光活性 b r 在水溶液和有机溶剂中的荧光效率极低，难以进行直接荧光测定。在寻求简便 而有效的b r 荧光分析过程中发现，b r 碱溶液经适当处理能产生强的特征荧光，其2 e x = 4 6 4n l l l ，2 e m = 5 2 4n n l 。这一激发峰与发射峰位置不受碱浓度、光照、热处理等因素影 响【5 1 。但b r 的荧光强度因处理条件不同会产生显著的差异。水浴加热恒温1 2 0m i n ，b r 荧光强度基本达到最大，继续恒温有衰减趋势。某些金属离子也会对b r 的荧光强度产 生影响，具有代表性的是z n 2 + 和c u 2 + 。z n 2 + 对b r 有明显的荧光增强作用，而c u 2 + 则对b r 荧光有猝火作用。 b r 碱溶液的荧光活性物质应来自b r 分子本身，而不是b r 的氧化还原产物或其降解 物。另外从b r 碱溶液中分离出的墨绿色固体，其颜色与胆绿素柏近，与通常的b r ( 橙红) 有较大差异，但与b ri x 具有相同的分了量( 5 8 4 ) 、相同的u v 和取光谱性质、相同的质 谱裂解行为。因此它不是胆绿素，而可能是分子内氢键和溶剂化程度适中的z - e 或e - z 异构体。由于b v 也有相似的荧光性质，比较b v 和b r 的荧光性质和分子结构，推断出发 射荧光的基团可能是单个的吡咯环或两对共轭吡咯环，而不是整个分子的共轭体系。 1 1 5 胆红素的紫外可见光谱研究 用紫外可见光谱对b r 进行研究表明，溶剂不同，其特征吸收峰的位置不同。以n a o h 溶液为溶剂时，b r 吸收光谱会随温度与n a o h 浓度的变化而变化，吸收峰位置及强度均 有变化，这种变化反映了b r 的不稳定性。升高温度，提高n a o h 浓度和离子强度等，会 使b r 稳定性更差，而低温、避光、通氮气等均会增强其稳定性。b r 在n a o h 溶液中因其 分子内氢键被破坏而异构化，然后可能进一步被氧化成b v 及胆紫素。 1 1 6 胆红素的n m r 谱研究 用b r 的h - n m r 谱可研究b r 在溶液中的结构性质，包括构型、氢键形成、异构化、 聚集状态等。详细的数据分析可参考有关综述文献【6 1 。 1 2 胆红素与金属离子的作用 b r 分子中有多个配位原子和配位基团，在不同的溶剂体系中，b r 对金属离子的配 位位置不同，它们可以形成1 ：l 、1 ：2 、2 ：1 或非化学计量配合物。其结构有平面型，有立 3 湖北大学硕士学位论文 体型，这与配比及金属离子的性质有关。金属离予与b r 配位后，会影响b r 的稳定性， 促使b r 氧化为b v ，破坏b r 的分子内氢键，引起b r 光谱的变化。由于b r 分子中含有多 个配何基团和配位原子，容易形成分子内和分予间氢键，容易发生异构化作用，因此， b r 与金属离子的作用非常复杂，有关b r 与金属离子作用的研究报道也较多，主要涉及 的过渡金属有：z n 【7 8 9 ，1 0 2 2 ，2 3 i ，c u l 9 1 0 ，1 1 1 4 1 5 ，1 6 ，1 8 1 9 2 0 2 1 i ，n i l 9 - 2 1 ，f e 【1 甜7 1 ，h g 1 7 1 ，a g 9 , 1 7 1 ， m n 【1 引，c 0 1 9 , 1 2 1 l 1 8 , 1 9 1 ，以及c d l l 7 , 1 9 , 2 4 1 。 1 2 1 金属离子对b r 性质的影响 1 9 6 2 年，c a m 川得出在1 ：1 的氯仿甲醇溶液中b r 与z n 2 + 形成配合物的结论，并比较 了加入z n 2 + 前后溶液颜色和吸收光谱的变化。加入z n 2 + 后，b r 的最大吸收峰由4 5 2i 吼红 移至u 4 7 6n m ，进一步加入浓盐酸，最大吸收峰又移回至4 5 2n l l l 。在氯仿溶液中，b r 的 锌盐能较快被1 2 氧化，而游离b r 被氧化较慢。 1 9 6 4 年f o g 8 】发现在b r 的碱性溶液中加入醋酸锌，b r 能较快被氧化为b v ，并形成 近似平面型的b v 配合物，而加入e d t a 则可对b r 溶液起到稳定作用。 1 9 7 1 年，v e l a p o l d i 2 1 认为过渡金属z n 2 + 、c u 2 + 、c 0 2 + 、f e 2 + 等在氯仿乙醇中与b r 形 成稳定的配合物，v e l a p o l d i 记录了由于配合物的形成而引起的吸收光谱谱带移动情况。 发现配合物形成的相对速率与金属卟啉相似，过渡金属与b r 形成平面正方形配合物， 并可使b r 迅速氧化。 1 2 2 胆红素与金属离子的结合位点 v a nn o r m a n 把b r 与金属离子的相互作用分为三类1 9 1 ：第一，z n 2 + 、c r 2 + 、n i 2 + 以吡 咯的氨原子为配位点来形成配合物，这将使b r 的吸收峰红移；第二，a 9 2 + 、c 0 2 + 通过丙 酸侧链来配位，使b r 吸收峰蓝移；第三，由于氧化还原反应的发生，c u 2 + 与b r 的相互 作用不可逆。 s i m e r 等指出v 觚n o r m a n 的分类也有一定的局限性，又进一步研究了d m s o 和 水溶剂体系中b r 与c u 2 + 、z n 2 + 、c d 2 + 的配位情况，发现在两种介质中z n 2 + 、c d 2 + 不直接 与b r 反应，d m s o 中存在c o o - 、r o - 、o h - 等基团时，则可形成2 ：1 的配合物：而对于 c u 2 + ，在两种介质中都能使b r 很快氧化，在d m s o 中得到的是b v ，在水介质中得到的 是b v c u 2 + 配合物。 4 笫一章绪论 1 2 t 胆红素与金属离子作用的应用 1 2 3 1 在分析化学方面的应用 郑玉霞掣2 3 j 研究了在p h l o 的氨氯化铵溶液中铜对b r 的催化氧化作用及其氧化产 物b v 与铜形成络合物的性质，并根据c u ”b v 络合物在3 4 0n l n 波长处的最大吸收，用于 b r 的间接光度测定。王聚礼等【2 4 1 利用亚硫酸钠作稳定剂以减缓b r 的氧化，研究了 n i 2 + b r 在微碱性介质中的单扫描极谱行为和电极反应机理。郑文杰等利用z n 2 + 对b r 的荧光增强作用建立了常温下游离b r 的荧光分析方法，并应用于中成药中b r 的测定。 1 2 3 2 关于胆结石的研究 胆结石分为4 种：固醇型结石( f l 色) ，胆红素型等色素型结石( 棕黑色) ，胆红素胆固 醇结合型结石( 黄黑色) 以及无机物型结石( 如钙化磷酸盐) 。胆结石中成分复杂，所含的 主要金属离子有c a 2 + 、c u 2 十、f e 2 十，它们与b r 相互作用，形成配合物。目前已知道色素 型结石的主要成份是b r 及其铜盐和钙盐。b r 的钙盐是棕色结石的主要成份，而b r 的铜 盐在外观上与黑色色素型结石相似，且黑色结石中所含金属元素中铜含量往往仅次于 钙，因j 比b r - c u 2 + 与黑色结石的形成密切相关。 惠建斌等【2 6 1 用非线性科学的观点进行研究发现，金属离子、胆酸分子等因素可能与 胆结石中环状结构的形成也有关系。王爱勤等【2 7 1 采用不同的溶剂对溶解前后的胆色素类 结石进行了超微结构的观测和红外光谱观测，认为b r 和金属离子，尤其是钙和其他二 价金属离子，形成了胆色素盐或配位络合物，并与糖蛋白等螫合成了大分子复合物，这 是胆色素类结石难溶的主要原因。 1 2 3 3 关于牛黄药理性能的研究及新药开发 动物胆汁、胆结石是重要的中药材资源，其中牛黄等色素型动物胆结石是人们熟知 的名贵药材，具有神奇药理活性，在中医学中得到广泛的应用。据统计，目前已有2 0 0 多种中成药含有牛黄或人工牛黄。b r 钙盐具有镇静、解热、降压、促进红血球新生等 作用，对乙型脑炎病毒和w 5 6 癌细胞有抑制作用。最近对于天然牛黄基本成分的研究发 现，天然牛黄中含有微量的过渡金属离子，这使人们推想，天然牛黄的药理活性可能同 b r 与微量金属配合物密切相关，因此关于b r 金属配合物的研究是一项关系到胆汁药材 资源开发应用和药理活性研究的基础性工作。 5 湖北大学硕士学位论文 1 3 胆红素的氧化性和抗氧化性 胆红素在人体内是一种内源性毒素，也是一种内源性抗氧化剂。一方面由于胆红素 的亲脂性，易使高胆红素症患者导致脑损伤；另一方而b r 能起着生理的断裂氧化链的 抗氧化作用，对肝细胞的再生具有促进作用。胆红素作为有机小分子能与蛋白质等生物 大分子相互作用；在金属离- 了影响下，能产生自由基使生物大分子损伤：同时胆红素又 有清除自由基的能力。 1 3 1 胆红素抗自由基及清除自由基作用 多年来胆红素一直被视为一种无用的代谢产物，其临床意义仅在于作为诊断黄疸的 标志物，血中浓度异常增高时对机体特别是新生儿有毒性。但近年研究发现，胆红素在 对人体无损害的前提下( 文献报道人体每天产生和分泌约2 5 0m g 的胆红素而无损害) ，具 有较强的抗氧化作用【2 8 】，且作用强于v c 、v e ，在体内是一种很有效的抗氧化剂，具有 很多方而的细胞保护作用2 9 3 们。 胆红素对生物体内多种活性氧及活性氮均具有拮抗作用 3 1 , 3 2 1 ，从而与一系列由氧化 应激介导的疾病有关。保证机体正常的代谢需要维持自由基产生与清除的平衡，代谢异 常时，平衡被破坏，有害自由基在体内大量聚集，当超过机体的防御能力时，会导致氧 化应激。随着氧化应激水平的升高，机体的细胞、组织和器官会造成不同程度的损伤。 为了降低氧化应激的水平，一方面利用机体内部的抗氧化系统，另一方面可以人为地加 入抗氧化剂。 对胆红素抑制低密度脂蛋白的氧化修饰进行实验研究，发现胆红素具有抑制低密度 脂蛋白的氧化修饰作用3 3 1 。胆红素作为一种内源性抗氧化剂，能直接清除氧自由基，可 通过降低机体内过氧化水平、抵抗氧化应激减缓对血管内皮的损伤、抑制血栓和泡沫细 胞的生成，防止和降低动脉硬化的发生，属于非酶类抗自由基系统。 胆红素是新生儿防御各种氧化物质损害的血浆自由基清除剂之一胆红素经血红素 加氧酶作用后转变为胆绿素，再经还原酶的作用，转变为间接胆红素，在此还原过程中 可提供二个氢原子，起到抗氧化作用。新生儿非酶类抗自由基系统比成人强，弥补了新 生儿酶类抗自由基之不足。这可能是新生儿黄疸的生理意义。美国有一项医学人群调查 发现血清胆红素水平随种族、性别、和吸烟状况而有变化，男性高于女性，吸烟者胆红 素水平降低；另外，有恶性肿瘤病( 除外皮肤恶性肿瘤) 病史的人群和没有恶性肿瘤病病 6 第一章绪论 史的人群相比，其胆红素水平较低，特别是有结直肠癌病史胆红素下降尤为突出。统计 f 表明血清胆红素每增加1m gd l ，伴随有结直肠癌患病率的明显下降。 值得注意的是，胆红素的抗氧化作用在体内受到一系列因素的影响，在一定条件下， 其作用可能向相反的方面转化。文献【3 4 】还提到胆红素结合氧自由基变成稳定性胆红素 自由基，并有释放氧自由基的作用，导致脂质过氧化。 南此可见，胆红素作为内源性抗氧化剂其作用虽值得充分重视，但体内一种物质是 “废”是“宝”，是有益抑或有害，都是相对的、有条件的和可转化的，我们的认识不 可绝对化。这是我们在考虑胆红素抗氧化作用的临床意义时必须特别注意的。 1 3 2 胆红素的病理作用 长期以来，胆红素对神经系统的毒性作用研究较为深入。近年研究发现胆红素不仅 具有生理功能，而且对心脏、肾脏及大脑有一定的毒性影响。 1 3 2 i 胆红素脑病 高胆红素血症( 简称高胆) 是新生儿的常见病症。高间接胆红素血症p 5 3 6 3 7 1 ，在新生 儿时期容易引起胆红素脑病，因为间接胆红素是一种脂溶性分子，具有亲脂性，对于富 含脑磷脂的脑细胞有亲和力，易于通过血脑屏障进入脑神经细胞，尤其是神经核细胞被 间接胆红素浸润后即发生胆红素脑病。对胆红素的神经毒性研究显示，线粒体是胆红素 毒性的最初作用部位，组织学上可见神经细胞肿胀、固缩、崩解及被吞噬，神经胶质增 生，临床上出现急性症状，并留有神经系统功能不全后遗症。近年来对胆红素脑病的发 病机理进行了深入的研究，通过动物实验发现：单纯高胆对健康动物不会引起核黄疸， 只有在病理情况下如低氧血症、高渗状态、高热、感染、早产、血脑屏障受损等情况下， 不仅游离胆红素可通过血脑屏障，而且与白蛋白相连的胆红素也可通过血脑屏障进入脑 组织引起胆红素脑病。 1 3 2 2 对心肌细胞的损害以及对肾功能、免疫功能的影响 有学者观裂3 8 1 到黄疸程度晕的新生儿，如血胆红素水平达4 0 9 - a ：3 5t t m o ll d 时，其心 肌酶谱显著升高，心电图显示s t t 改变，并且随着黄疸加重而加重；随黄疸程度减轻， 心肌酶谱、心电图的改变也减轻，其中又以肌酸磷酸激酶、乳酸脱氧酶最敏感1 3 引。 7 湖北大学硕士学位论文 生理性黄疸对新生儿肾小管功能无明显影响，高胆对新生儿。肾小管功能的损害与血 胆红素浓度密切相关，严重高胆对肾小管功能影响较大。高胆所致的肾损害病理学上称 胆汁性肾病或胆红素肾病。中度以上高胆可对新生儿肾脏滤过功能造成损害，但这种影 响是可逆的【3 9 1 。 高胆对新生儿红细胞的免疫功能有一定影响，且与胆红索浓度相关，高胆患儿红细 胞c 3 b r r ( c 3 b 受体花环率) 明显降低，红细胞i c r r ( 免疫复合物花环率) 明显升高，能引 起继发性红细胞免疫功能下降删。 1 3 2 3 胆红素致d n a 损伤 a s a d 等4 1 1 研究发现，胆红素在金属离子影响下，能够产生自由基，通过电泳等实 验，发现其能使d n a 裂解。 1 4 胆红素和蛋白质的相互作用 1 4 1 蛋白质的概述 蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构和功能物质，它参与 了几乎所有的生命活动过程。蛋白质分子量大、结构复杂且种类繁多。 蛋白质分子的功能往往是由其结构所决定的，在生命科学研究中，人们需要了解各 种蛋白质的组成、结构与功能的关系，蛋白质的存在形态，以及与小分子、金属离子的 相互作用等。因此，探索蛋白质的构象、组成、结构，研究药物、毒物、染料、表面活 性剂、金属离子等小分子与蛋白质的相互作用机理和作用过程。不仅对研究生物大分子 和小分子相互作用的配位本质、促进生命科学的发展有着重要的意义，而且对改进和发 展蛋白质的分析方法有促进作用。这一领域己成为从事生命科学、化学、药代动力学和 临床医学科研者共同关注的课题。 血清白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质，是生物体内具有重要生理功能的大分子4 2 1 。 它可以同许多内源性和外源性物质结合，起着重要的储存和运输作用。并且，血液中血 清白蛋白浓度长期以来一直是检验健康和疾病的指标。与其它蛋白质相比，血清白蛋白 具有分子量小、水溶性好、稳定性高、易提纯制备等优点，因此，在临床药物研究中一 直作为模型蛋白，也是研究高分子蛋白理化性质、结构与功能、临床应用以及变异方面 的理想蛋白质。 8 第一章绪论 血液中有许多内源物质可与血清白蛋白结合，如胆红素、脂肪酸、维生素、激素、 r 电解质等。蛋白质除了与内源性物质作用外，还可以同许多外源性分子如药物、染料、 表而活性剂、离子、配合物等结合。这些物质与蛋白质结合生成超分子复合物之后，体 系的光谱、电化学等性质发生改变，从而提供蛋白质浓度或者结构方面的信息。了解小 分子与蛋白质相互作用中，结合的紧密程度、结合位置、结合位点数、作用力类型以及 药物对蛋白质二级结构的影响等问题，也有助于理解药物对蛋白质生理功能的影响。 1 4 2 蛋白质与胆红素相互作用的研究现状 胆红素与血浆白蛋白结合成复合体，可以限制胆红素自由渗透各种生物膜而不致于 对组织细胞产生毒性作用。同时，这种复合体也增大了胆红素在血浆中的溶解度而便于 运输，防j 卜胆红素在体内积累导致黄疸病。所以研究蛋白质与胆红素的相互作用，对于 预防和治疗黄疸症等疾病有重要的指导意义。对于这一课题，人们曾用荧光、拉曼、红 外光谱、旋光色散谱等现代于段做了大量的研究工作并得到许多重要的结果。但至今对 于蛋白质分子与胆红素分子之间存在的结合场尚无一致的结论 4 3 , 4 4 , 4 5 , 4 6 l 。 杨培慧等1 4 7 1 的实验结果表明，蛋白质分子和胆红素小分子之间的相互作用不仅是某 一种力的单独作用，而是多种力的协同作用的结果。当两者受静电引力相互吸引时，b r 分子中两个二吡咯发色团展开，其羧基与蛋白质上的碱性氨基酸残基结合，使b r 分子 发生弯曲导致光谱改变，并随浓度的不同使光谱强度发生不同变化。 1 4 3 小分子与蛋白质相互作用的研究方法 小分子与蛋白质间非共价键的作用，包括静电作用、氢键、范德华力等。虽然非共 价相互作用很弱( 一般小于l ok jt o o l 一，比通常的共价键键能小1 2 个数量级) ，作用范围 为0 3 0 5l 皿，但这些分子间弱相互作用力可在一定条件下起加合、协同作用，形成有 一定方向性和选择性的强作用力。这种强作用力是分子识别与组装的基础，对其本质的 研究，有助于理解在生命科学、医学、药学领域中涉及到的分子之间的相互作用以及相 互识别过程。现在普遍认为有机小分子是与蛋白质上的碱性氨基酸残基相结合的，这些 碱性氨基酸包括赖氨酸、组氨酸、精氨酸和n 端氨基。这些碱性氨基酸残基中，精氨酸 和赖氨酸起着重要作用。有机小分子与蛋白质的结合方式是多种多样的。蛋白质上的主 要结合位点可以结合多个有机小分子，一个有机小分子可以结合在另一个已被结合的有 机小分子上，一个有机小分子还可以同时结合在两个蛋白质分子上。 9 湖北大学硕士学位论文 目前，研究小分予物质与蛋白质相互作用的手段主要包括光谱法，如紫外可见、荧 光、红外光谱、圆二色谱等，还有平衡透析法、电化学法、毛细管电泳、高效液柏色谱、 核磁共振、质谱等。光谱法由于分析方法简单、容易操作和灵敏度高等优点是小分- 了物 质，与蛋白质相互作用研究的主要方法。 1 4 3 1 紫外可见吸收光谱法 紫外可见吸收光谱是研究小分子与生物大分子相互作用的一种最方便、最常用的 技术。当蛋白质的构型发生变化时，蛋白质生色基团所处的微环境发生变化，其吸收光 谱随之发生变化，吸收峰将发生红移或蓝移。利用溶剂微扰光谱可以探测蛋白质分子中 生色基团的暴露程度。根据峰形和峰位的变化可判定小分予是否与蛋白质发生作用，并 可得到作用方式、热力学参数等信息，还可以进一步研究实验条件对热力学参数的影响， 还可利用紫外可见吸收光度法计算小分予与蛋白质作用的结合常数和结合位点数【4 8 4 9 1 。 由于紫外可见光谱所反映的信息量有限，必要时可以结合其它的光谱学方法。 1 4 3 2 荧光光谱法 荧光光谱法是研究生物大分子与小分子、离子相互作用的重要手段 5 0 , 5 1 】。荧光光谱 法具有灵敏度高、选择性强、用样量少、操作简便等优点。蛋白质在紫外线照射下会发 出紫外线荧光，借此可进行荧光测定。蛋白质的内源荧光主要来源于色氨酸( t r p ) 、酪氨 酸( t y r ) 、苯丙氨酸( p h e