（应用化学专业论文）近红外中位氨基酸取代Cy7的合成及生物应用.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 随着生命科学的发展，迫切需要高灵敏度的分析检测方法。生物分子的荧光标记是 继同位素标记后出现的快速方便的生物分子分析手段。二十世纪八十年代中期发展起来 的基于荧光标记的d n a 自动测序技术，已经成为生命科学研究的重要里程碑。但目前 仍需要在荧光分析灵敏度和可靠性上进一步提高。七甲川菁染料作为近红外荧光染料， 由于能有效避开生物样品的自吸收和自发荧光所造成的背景干扰，近来常被用作生物体 内的荧光标记物或制成荧光探针，成为研究热点。 本论文在总结前人工作的基础上，合成了一个兼顾染料的光稳定性和水溶性的七甲 川吲哚菁染料。以这个染料为母体，对其中位氯原子进行取代，合成处中位直链氨基酸 取代的新型近红外菁染料。其在斯托克斯位移这一关键的光谱性能上取得突破，斯托克 斯位移超过1 4 0 i l m ，远远大于普通多甲川瞢染料的2 5 n m 。 设计的母体染料在两端n 原子上引入一个空间位阻的苄基以提高光稳定性。光稳定 性实验发现染料在水溶液中的光氧化速度明显比其他溶剂快。母体染料的合成以甲苯代 替苯作为溶剂，在乙醇与丙酮的混合溶剂中进行二次重结晶，使产率和纯度都好于在水 中重结晶，为后续工作奠定了基础。 将母体染料的中位氯原子用氨基酸试剂亲核取代，衍生合成了两个中位氨基酸取代 的七甲川菁染料。它们具有大的斯托克斯位移，其中在水溶液中的斯托克斯位移大于 1 4 0 n m 。研究了所合成染料的吸收和荧光光谱，测定了吸收和发射性能，考查了溶剂、 粘度、溶液p h 值和样品浓度对其光谱性能的影响。 选择用近红外七甲川菁染料2 b 尝试进行蛋白质标记实验。将染料2 b 转化为琥珀酰 亚胺酯，在常温下用于牛磺酸及牛血清蛋白质的荧光标记。质谱及h p l c 荧光检测分析 结果证实，该染料可用于这类样品的荧光标记，对牛磺酸的标记反应转化率几乎1 0 0 。 牛血清白蛋白的荧光标记结果证实产物具有荧光检测相应值，并染料2 b b s a 衍生物进 行了荧光检测。 关键词：近红外荧光染料；七甲川；斯托克斯位移 一i 一 近红外中位氨基酸取代c y 7 的合成及生物应用初探 s y n m e s i sa n db i 0 1 0 9 i c a la p p l i c a t i o nr e s e a r c ho fw a t e r _ s 0 1 u b i l i t y ， n e a r - i n f r a r e dh e p t a m e t h i n ec y a n i n ef l u o r e s c e n c ed y e sw i m a m i n o p h e n o ls u b s t i t u t i o na tt h ec e n t r a lp o s i t i o n a b s t r a c t w i t l lt h ed e v e l o p m e n to fl i f es d e n c e ，t h e r ei sa 盯。稍n gr e q u j r e m c n tf o rh i 曲s e n s i t i v e d e t e c t i o nt e c h n o l o 百e si na n a l y s i s f 1 u o r e s c e n c el a b e li sac o n v e n i e n tm e t h o d h e p t a m e t h i n e c y a i l i n ed y e se m p l o y e da sn u o r e s c e n c e1 a b e l sa n ds e n s o r so fb i o m 0 1 e c u l e si nv i v oh a v e a t t r a c t e di m m e n s ei n t e r e s tb e c a u s et h e j rs p e c 仃ar e a c ht h e e a r - i n 矗a r e d ( n i r ) r e g i o n ，w h e r ea b i 0 1 0 酉c a l m a t r i xe x h i b i t st h el e a s ta b s o r p t i o na n da u t o f l u o r e s c e n c eb a c k g r o u n d m u c h r e s e a r c hw o r l 【h a sb e e nc a i e do u t an e wh 印t a m e t h i n ei n d o c y a 血ed y ew i t hg o o dp h o t o s t a b i l i t ya n dw a t e r s o l u b i l i t yw a s s y t l t h e s i z e di nt h i st l l e s i s t h e ns o m en e wd e r i v a t i v ed y e sw e r eo b t a i n e db ya n 印p a r e n ts n r l r e a c t i o na tt l l ec e n t r a lc h l o r i n ea t o m0 ft h ep a r e n td y e ag r c a ti m p r o v e m e n ti nd y e s s t o k e s s h i f t ( 丘o m2 0 n mt oo v e r1 4 0 n m ) i st h em o s ti m p o n a n ti n n o v a t i o nt ot h en i rh e p t a m e t h i n e c y a n i n ed y e s t w ob e n z y lg m u p sw e r ei n t r o d u c e dt ot h e 研ona t o m sa tt h e3 h - i n d 0 咖g so f t h en e w h e p t 锄e t l l i n ec y a i l i n ed y er c s p e c t i v e l y t h en e wp a r e n td y ew a sf o u n db e t t e rp h o t o s t a b i l i ty w h i c hi n d i c a t e st h a tn - e m y lg r o u pc a 工li m p r o v e p h o t o s t a b i l j t yf o ri t sr i g i da 1 1 db u l ks t m c t u r e i na d d i t i o n a l ，i ti sf o u n dt h a td y e si nw a t e rs o l u t i o n sa r ee a s i e rt op h o t o b l e a c ht h a ni na l c o h o l s o l u t i o n s ar e a s o n a b l em e c h a n i s mw a sp r o p o s e dt oe x p l a i t h ep h e n o m e n o n t h er e a c t i o n c o n d i t i o n0 ft h ep a r e n td y ew a si m p r o v e db yr e p l a c i n gb e n z e n eb yt o l u e n ea st h es o l v e n t t h e p a r e n td y ew a sp u r i f i e db yr e c r y s t a l i i n gi nt h em i x e ds 0 1 v e n to fe t h a n o la n da c e t o n ee a s i l yf o r d e r i v a t i v er e a c t i o n s t w od e r i v a t i v ed y e sf r o mt h ep a f e n td y e sw e r eo b t a i n e db yn u c l e o p h i l i cs u b s t i t u t i o n r e a c t i o ni nw h i c ht w op r i m a r ya m i n o p h e n o lw e r ee m p l o y e da st h e u c l e o p h i l i cr c a g e n t s o m e p a r t i c u l a rs p e c t r a lp r o p e r t i e sw e r ef o u n di nt h en e wd y e s t h e yw e r ef o u n dt oe x h i b i tal a 鸦e s t o k e ss h i f t t h e 血f l u e n c e so nt h es p e c t r a lp r o p e n i e sw a si n v e s t i g a t e di nd i f f e r e n ts o l v e n t s ， v i s c o s i t y ，p hm e d i aa n dd y ec o n c e n t r a t i o n t h ea b s o i p t i o na 1 1 de m i s s i o ns p e c t r ao ft h es y n t h e s i z e ds q u a r a i n ed y e sw e r ei n v e s t i g a t e d i n n u e n c e so fs o l v e n t ，p ha n dd y ec o n c e n t r a t i o nw e r ed i s c u s s e d t h e n h s c a r b o x y ls q u a r a i e w a s p r e p a r e d f r o mt h ee s t c r i f i c a t i o no f n _ h y d r o x y s u c c i n i m i d ew i t hc a r b o x y is q u a r a i n e ，a n dt h en h s c a r b o x y ls q u a r a i n ew a su s e dt o c o n j u g a t ew i l hb e n z y l a m i n ea n db s ai n a p h 9 5b i c a r b o n a t eb u f f e r ，r e s p e c t i v e l y t h e c o r q u g a t e sw e r es e p a r a t e da n dd e t e c t e db ye s i m sa n dh p l c ，a n dt h er e s u l ti n d i c a t e dt h a t t h ed y ec o u l dc o u p l ec o v a l e n t l yt ob i o m a s sc o n t a i n i n g 行e en h 2 f o u p 近红外中位氮基酸取代c ) ，7 的合成及生物应用 k e yw o r d s ：n e a r _ i n l h r e dn u o r e s c e n td y e s ；h e p t a m e t h j n ec y a n i n ed y e s ；s t o k e ss h i f t s ； 大连理工大学硕士学位论文 引言 上世纪七八十年代，随着限制性内切酶，聚合酶链反应，d n a 固相合成等技术的 相继发现发明，生命科学全面进入了分子生物学时代，并带动了许多新的相关领域的迅 速发展。而九十年代出现的生物芯片技术，被认为是人类有史以来继计算机之后的第二 次技术革命，从根本上改变了生物学和医学的面貌以及人类生命的质量。生物芯片技术 对于生命科学以及与生命科学的相关领域产生了深远的影晌。最为世人瞩目的人类基因 组计划提前完成，人类向了解自己的生命奥秘这一目标迈进了一大步。但是，由于基因 的主要功能是通过其表达产物蛋白质来实现的，人类要揭示整个生命活动的规律， 就必须研究基因的产物蛋白质。蛋白质具有自身独有的活动规律，随着生命活动的 进程表现出极其动态的紧密协调的变化，蛋白质在合成之后具有相对独立的修饰、转运 和相互间作用能力，同时还具有对外界因素发生反应的能力。因此，只有从蛋白质组学 的角度对所有蛋白质的总和进行研究，即开展蛋白质组学研究，才能更加贴近对生命现 象和本质的掌握，生命活动的本质和活动规律才能找到答案。正是因为这样，国际科学 界预言，在2 1 世纪，生命科学的热点将从基因组学转向蛋白质组学，使后者成为新的 前沿。 生物芯片技术、蛋白质组学的迅速发展很大程度上依赖于与之相关的检测手段的发 展，其中生物标记技术的发展起着重要的作用。 生物标记技术的同位素法、化学荧光法、化学发光法和酶标法等，其中最常见的为 前两种。传统的同位素标记法具有放射性危害，存储寿命短，后处理困难和不易实现计 算机化及实时检测等缺点，而荧光标记法具有良好的灵敏度、操作简便、安全和检测迅 速等优点，为生物分析中主要采用的方法。 荧光标记对所使用的荧光染料有一些特殊的要求，如荧光发射波长尽可能靠近红外 区以减少散射和消除背景荧光干扰，荧光发射强度要尽可能的高，标记后荧光猝灭尽可 能的减少。因此开发具有低背景噪音、良好的光稳定性、高的光量子产率的荧光标记试 剂，将会有利于促进生物技术迅速发展。 近红外中位氨基酸取代c y 7 的合成及生物应用初探 1 文献综述 1 1 概述 菁染料是一类比较特殊的染料，它不能用于织物的染色，因为它不能牢固的粘附于 织物上，并且在光照下不稳定。长期以来，瞢染料主要应用于感光材料中的卤化银凝胶 的增感剂。随着人们对其性质的深入了解，以及其它相关科学技术的发展，人们开始利 用它的摩尔吸光系数高、吸收及发射光谱范围可调、合成简单等特性，将其应用于红外 激光染料、光盘存储材料、非线性光学材料【1 3 i 和生物大分子荧光标记。 其中，菁染料在生物大分子标记中的应用发展极为迅速。大量文章和专利报道了它 作为生物荧光探针染料在科研、商业以及临床方面的应用。目前研究比较活跃的标记菁 染料主要有两大类，一类是t 0 ( m j a z o l eo r a i l g e ) ，y 0 ( o x a z o l ey e l l o w ) 系列及其二聚体染 料，另一类是多甲川系列菁染料。t o ，y o 系列染料采用的是非共价键标记方式，是以 染料分子与核酸之间的正负电荷的亲和力作用相互结合在一起，以嵌入方式得到复合 物。近红外菁染料由于带有活性基团，所以能与核酸中的活性基进行反应，从而以化学 键的方式将染料与核酸键合在一起，得到标记物分子。以这种共价键结合得到的标记物 分子比嵌入方法所得的复合物要稳定得多。这些染料的结构中需要有一个能与生物分子 中的巯基或氨基反应的活性基团。一般这些基团为活化的羧基，大多形成琥珀酰亚氨酯 ( n h s e s t c r ) 和邻苯二甲酰亚氨酯，或者为异硫氰基( r r c ) 。 多甲川菁染料的吸收和发射光谱区位于5 5 0 1 2 0 0 n m 处( 近红外荧光 锄 6 0 0 n m ) ， 处于近红外区。相对于常规荧光( e m 氯仿 己烷。荧光物质与溶剂或其他溶质分子之间发生氢键有两种情况：一是在激 发之前，即荧光物质处在基态时与溶剂或其他溶质分子形成的氢键；二是在激发之后， 即荧光物质处在激发态时与溶剂或其他溶质分子形成的氢键。显然，第一种情况下产生 的氢键将对物质的吸收光谱和荧光光谱都产生影响，而后一种情况只对物质的荧光光谱 产生作用。溶剂的氢键供体或受体能力及溶剂的极性，都将影响到荧光物质的实际光谱 移动。 ( 4 ) p h 值的影响 未解离的( 弱酸或弱碱) 分子和它们的离子常呈现出不同的荧光性质。若分子中的 酸性和碱性基团属于生色团的部分，或直接连在生色团上，那么溶液的p h 值的改变， 会引起绝大多数含有这些基团的化合物的基态和激发态的酸碱性或解离形态的变化，因 此有着不同的荧光光谱。 此外，溶液的浓度对荧光强度也有影响，在较低范围内，荧光强度随浓度的增大而 增大，达到一定值后，增加浓度，荧光强度反而降低了，直至荧光完全猝灭( 大约浓度 为1 l ) 。溶液中的表面活性剂，溶剂性质等因素，也对荧光有着不同程度的影响。 综上所述，荧光与有机物质的分子结构及环境因素存在着非常复杂的关系，有很多 现象和规律要进一步的探讨。 1 2 3 荧光染料的介绍 ( 1 ) 香豆素型高分子荧光染料 r 图1 2 香豆索染料荧光团的结构 f i g 1 2s t m c t u r e so fc o u m a ri n 丑u r o p h o r e s 以香豆素为母体的荧光染料，如果染料中含有一n h 2 、一c 0 0 h 等基团，在一定条 件下也可与被标记物发生反应，而含有h g 基团的荧光染料可选择性与蛋白质的一s h 发 生反应。用聚合物上连有大量荧光团的高分子荧光染料进行标记，其灵敏性大大提高， 它在量子产率、s t o k e s 位移、光稳定性、分子均匀性、与蛋白质配对的产率等方面都适 合生物标识。香豆素染料母体的结构如图1 2 所示 柏】： f 2 ) 菁染料 一5 一 近红外中位氨基酸取代c y 7 的合成及生物应用初探 菁染料通常由两个杂环体系及中间的次甲川链组成，其核心结构如图1 3 所示【矧： r ， c h = = c h ) n c 图1 3 菁染料的核心结构 f i g 1 3c o r es n l i c t u r eo fc ) r a n i n e s r ， 其中x 可以为o 、s 、s e 或者n r 、c r ，y 、y p 为一r 3 = r 4 一，m 、p 为0 或1 ， r 为1 6 个碳原子的烷基，可为链状或者环状。甲为a 、b r 、i 等负离子，菁染料在其 分子结构中含有较大的共轭平面和季铵盐阳离子，因此与d n a 有很大的亲和力，并且 结合后荧光大大增强，是近年来倍受亲睐的生物大分子标记荧光染料，菁染料的另外一 个优点是波长可调范围特别大，可以进入近红外区，能有效避开生物体系自发荧光，提 高探针的灵敏性。 但是菁染料也存在一个显著的缺点那就是光稳定性差，很容易分解，其应用受到一 定的制约。 ( 3 ) 萘酰亚胺荧光染料 3 3 】 r s 0 3 l 图1 4 萘酰亚胺类染料的母体结构 f i g 1 _ 4s t 兀l c t l l f e so fn a p h t h a i i m i d en u o r o p h o r e s 1 ，8 一萘二甲酰亚胺( 图1 4 所示) 是一类良好的荧光发色体，其4 位一n h 2 等供 电基团的衍生物大都具有强烈的荧光帆含酰肼和乙烯砜活性基团的萘酰亚胺染料，在 适合的p h 值和温度下，对微生物着色有专一选择性，由于其无毒，可用于细胞内染色 吼但是其波长较短，可调范围较小。 ( 4 ) 咕吨类荧光团f 6 】 大连理工大学硕士学位论文 咕吨类染料的结构如图1 5 所示，其中r l 、r 2 、r 3 、r 4 、r 5 单独分别为氢原子、烷 基、芳香环、烷氧基、羟基、卤素原子、氰基、羧基、异氰基等，至少其中有一个是连 接官能团，最好是能有一个是羧基官能团。 图1 5 咕吨类荧光团 f i 吕1 5s u c m r o fx 如i h 柚en u o r o p h o r e s r 6 、r 7 、r 粤、r 9 、r l o 、r 1 1 最好是卤素原予，1 1 0 个碳院子的烷基，硫取代烷基 等等。当x 和y 为氨基或取代氨基时此化合物代表罗丹明染料( r h o d a m i n ) ，当y 为 氧原子，而x 为烷氧基或者羟基此化合物代表荧光素染料。它们都是非常重要的荧光染 料，荧光量子产率高，在荧光探针方面应用很广泛。但是它们的缺点也很明显：s t o k e s 位移较小，对环境因素如p h 值的依赖性很强，与生物大分子结合后荧光淬灭很严重， 达到6 0 9 0 。即使这样，由于尚未找到合适的替代品，它们仍然是生物医学上应用最 广泛的荧光团。 ( 5 ) b o d 口y 类染料【7 ，8 】 图1 6 b o d i p y 荧光团 f i g 1 6s 叽c f u r e so fb o d i p yn u o r o p h o r e s b o d i p y 类染料( 如图1 6 所示) 由于其开发较晚，现在应用不是很广泛，但是由 于其荧光量子产率高，其荧光范围随取代基的不同变化很大，并且其荧光不受环境p h 值的影响，它的性能受到普遍公认。 1 2 4 生物应用近红外荧光染料 近红外荧光技术应用的瓶颈是具有良好的荧光性能和稳定性的荧光团太少。传统的 近红外中位氨基酸取代c y 7 的合成及生物应用初探 具有高荧光量子产率的染料的光谱大都在紫外可见区，如荧光素的k b 是4 9 0 姗，k 。是 5 2 0 i l m ，见表1 1 。目前存在的近红外荧光染料只有多甲川菁染料和酞菁染料 ( p h t h a l o c y a i l i n e ，n a p h t h a l o c y a i l i l l e ) 两大类f 9 1 。 表1 1 常见的荧光标示剂 t a b 1 1c o m m o nn u o r e s c e n tp r o b e s 多甲川菁染料是近红外染料的主体，它作为荧光探针与现有的其它荧光标记试剂如 罗丹明、荧光素等相比更具优越性。最近分子探针公司开发的各种系列荧光染料中菁染 料居多，从这一趋势可以看出，菁染料系列将在将来荧光染料领域中以优异的性能替代 部分其它染料，在荧光标记分析中起重要作用【1 0 】。 在近红外菁染料家族中，吲哚绿( i c g 或瓜1 2 5 ) 是唯一一个已经被美国f d a 比 准可以临床使用的菁染料。获准应用于心脏、肝脏功能的诊断和视网膜病的血管造影术 等医疗技术中。i c g 的吸收波长为7 8 0n m ，发射波长为8 3 0n m 。它和其它游离的与其 类似的菁染料都能很快从血液中排泄掉。这类染料在近红外影像技术中作为荧光对比剂 ( 丑u o r e s c e n tc o n t r a s ta g e n t ) 可以应用于血液分析。但i c g 更进一步的应用受限于它没有 可以用于共价偶合的反应性基团，例如羧基等。另外，它的水溶性还不够好，与血清有 相当大的结合能力，导致荧光的线性规律差。而且在水溶液中稳定性也不好。为克服i c g 的这些问题，很多结构改进的新型近红外七甲川瞢染料被设计和开发。如下图1 7 【1 2 】。 0 3 8 唠。书8 。3 l h 。c j c v s ，e ，e m ：e 。9 ，e ，。n m 豇沁扮洲 ( 亡h 2 ) 4 s 0 3 。 ( 亡h 2 ) 4 s 0 3 。 i t c c e ，e m = 7 4 7 ，7 8 3n m 大连理工大学硕士学位论文 i c g e x ，e m = 7 7 s 8 3 1n m c y p a t e ，e x ，e m = 7 9 5 ，8 3 0n m 取b 枷d ( 亡h 2 ) 4 s 0 3 。 ( c h 2 ) 4 s 0 3 s 0 3 k 0 3 n l r 8 2 0 。e x ，e m = 7 9 0 ，8 2 0n m n i r 2 ，e x ，e m = 6 6 2 6 8 4n ml r d y e 7 8 ，e 州e m = 7 6 8 ，7 9 6n m 图1 7 最近常被应用得近红外菁染料结构 f 追1 7e x 蛐p l e so fr e c e n t l yu s e dn i rn u o r o c h 姗e s 近红外荧光染料虽然具有能避开生物基质的背景干扰的独特优势，但是相对于可见 区染料其缺点也很明显。l 、长波长染料光谱易变宽，从而检测特异性变差。2 、荧光量 子产率一般都很低，因为长波长染料的激发态更容易发生超快的无辐射衰减。3 、一般 来说，波长越长，染料的光稳定性越差。4 、波长变长，染料的化学稳定性也变得更差。 5 、共轭程度增大造成疏水性增加，从而导致染料更易自聚 1 3 】。这些问题制约着近红外 染料的生物应用。 1 2 5 荧光标识方法的种类 按荧光标识试剂与被测组分的结合方式可将荧光标识技术分为两大类：共价键合荧 光标识和非共价键台荧光标识 1 事1 6 1 。 ( 1 ) 非共价键合荧光标识( n o n c o v a l e n tf 1 u o r e s c e n tk b e l i n g ) 非共价键合荧光标识通常是指荧光标识剂与被标识分子通过物理作用方式相结合 的标识方法，如核酸探针与d n a 的嵌入作用，某些蛋白质探针与蛋白质分子的择形镶 嵌等。可用于在双链d n a 片断的电泳显色和毛细管电泳点阵基因排布技术( c a p i l l a r y g 近红外中位氨基酸取代c y 7 的合成及生物应用初探 a r r a ye l e c t r o p h o t e s i sg e n o t y p i n g ) ，将d n a 嵌入染料直接与d n a 片断复合。由于嵌入 只需简单地将染料与d n a 样品混合，而得到稳定的多位点标记的产物，这是共价键台 标记法难以比拟的。但这类标识一般只能用于定性检测或粗略定量，常用于核酸与蛋白 质等大分子的检测，免疫荧光分析等，较少用于小分子的分析。 ( 2 ) 共价键合荧光标识( c 0 v a l e n tf l u o r e s c e n tl a b e l i i l g ) 共价键合荧光标识是指荧光标识试剂与被标识分子通过共价化学键的方式相结合 的标识方法。标识反应的发生是因为荧光标识试剂和被标识的生物物质中含有彼此可共 价反应的活性基团，常见的反应活性基团有一n h 2 、一o h 、一s h 、一c o o h 和一n c s 等。活性基团也可在无活性基团分子中引入，如在核苷酸核寡聚核苷酸的合成中引入氨 基等。根据所含的反应基团及基团所在的位置的不同，可有多种荧光标记反应方式。该 法具有很高的反应专一性，可重复，易于定量检测，特别适合于小分子如氨基酸、小分 子肽的分析，也可用于大分子检测。 1 3 近红外荧光试剂c y 系列 1 3 1 近红外区检测生物样品的优势 由于很多生物分子本身不发光，或发光不足，因此对这些重要分子的荧光分析就必 须引入有荧光的物质，即荧光探针。有机荧光染料是最为常用的荧光探针之一。研究开 发具有良好的光稳定性且荧光量子产率高的荧光染料是发展荧光分析技术的关键和核 心。 我们知道，在生物样品分析中，需分析的目标分子往往不具有荧光( 这也是荧光标 示技术存在的原因) ，而生物样品中的另一些成分在一定光谱范围却有较强的吸收和荧 光发射。如图1 8 所示，血红蛋白和组织色素等的吸收和荧光光谱分布在几乎整个紫外 可见区，而脂类和水在中红外区有强的吸收。只有近红外区7 0 0 9 0 0 n m 是个空白区【蝎1 。“。 血红蛋白，组织色素脂类，水 幽1 8 生物样品在近红外区表现出最弱的背景吸收和自发荧光。 f 唔l _ 8i nc h en i r “w i n d o w ”，c h ea b s o r p i i o na n da u c o n u o r e s c e n c eo fa l lb i o m e i e c u l e sr e a c hm i n i m a 在紫外可见区进行荧光检测所存在的问题体现在下面几个方面：一、生物样品在这 个区间的吸收使光进入生物组织内部变得困难。二、紫外可见光在组织内的散射光干扰 - 1 0 大连理工大学硕士学位论文 更强，因为散射光强度与波长的四次方成反比，波长越短，散射越强。同样造成紫外可 见光进入生物体内的深度不够。三、生物样品中某些成分的自发荧光形成很强的背景干 扰，使荧光检测效率大大降低。目前使用广泛的有机荧光染料的工作区间大都处在紫外 可见区i 捌，如表1 1 。它们用于生物体内荧光检测时所存在的这些问题正逐渐引起人们 的重视。 讹v 日舯口t k d 驰n 幽n t 跗岫瑚o r v 峪l o 口扑i a 喇阳d i y f l 枷s l m m 鲥l 删v 口撕s 盯隋b 4 t 怕她旭o f ah 4 托蚶m i c 啪删w 神e x 刚r 聃u e 却b t 岫阻。蝴悄5 廿i i m 脚d 墉旧协f d 卅啪r t 舷d 懈b 删。咖n 目陋f 雉b ：蚴b i u 哟m 4 6 n ，t ，邬5 - 5 r 神) ：口r e 。r i ，时5 2 5 _ 鞴5 n 州鞫o _ e 5 0 删；m d 州r 7 2 s 寸碍俐7 9 0 啦0nm jt 怕m 帅值同e 口唧i 由d 时。h 自t * 疆t w 5 嘞5 b d b2 m w 七一t oc o m p er 瑚岫白rd 惭咐5 he m l s 如n t l b r w “d 州h w i d t h d 镯m e 幢拍r t 啉剁p u mu 啷w e m 副j 岫d 一h g f i 坩m 5 n c e 加5 啪e h b 删r m 圳峨口b nf 甜o h e n 4 t i 。n i 怕w h k6 9 m 蚧i m e 时t a m 时毫s h 舯nm 黼 r m w 5 m a t t 日1 0 c 吐l d ”b 口丑i 岫h 曲r t g 她帅对j j n t e g i i m ( 锄a 喇h 删e r f 日m w w w c 晴i 。p i o n 瑚mc u m e n t0 p i n i o n n m j ib i 口l o # y 2 舶矗瑚2 6 4 图1 9 小鼠内脏组织经不同波长滤光器滤光后的自发荧光影像对照图 f 培1 9w a v e l e n g t h d e p e n d e n t 叫t o n u o r e s c e n c eo fv i t a lo r g a n sa n db o d i l yn u i d s 相反，近红外区荧光检测表现出的独特优势，基本可以克服上述问题。在对小鼠的 光照对比实验中，发现在相同条件下小鼠体内近红外光( 6 7 0 n m ) 的光子数是绿光( 5 3 0 n m ) 的四倍。理论计算显示近红外光渗透进入组织的深度能达到7 。1 4 厘米。最为重要的是 荧光背景几乎被完全消除，荧光效率大大提高。图1 9 即为一组小鼠内脏组织经不同波 长滤光器滤光后的自发荧光影像对照图【2 8 j 。可以看到在可见光区存在明显的荧光背景， 而近红外区则几乎没有。 1 3 2 荧光试剂c y 系列的结构与光谱特点 近红外荧光试剂c y 系列属于多甲川链系列菁染料，目前常见的c y 系列菁染料结 构通式如图1 1 0 所示。 一1 1 近红外中位氨基酸取代c y 7 的合成及生物应用初探 图1 1 0c y 系列菁染料结构通式 f i g 1 1 0c o m m o ns t m c t 【l r eo fc yc y a i ed y e s c v 系列菁染料是由两端的吲哚环通过共轭甲川链连接在一起的。n 值代表共轭甲川 链上所含碳碳双键的数目，n 值越大，则共轭甲川链越长。当n _ 1 时，甲川链中含有三 个碳原子，称为三甲川菁染料；n = 2 时，为五甲川菁染料；n = 3 时，为七甲川菁染料， 依此类推。通过n 及r l ，r 2 ，r 3 ，r 4 的改变即可形成各种对称与不对称的荧光分析试 剂。 c y 系列著染料分子是一个大的，c 共轭体系( 染料的第一结构特征) ，光照以后分 子中的电子能量增加，由基态跃迁至单线激发态 铡，当电子由单线激发态回落至基态时， 会以光的形式释放能量，因此，该类化合物具有荧光。不同的菁染料具有不同的光谱吸 收位置，共轭体系越大，分子的最大吸收波长越长，如吲哚三甲川菁染料最大吸收波长 在5 0 0 6 0 0 m 之间，而五甲川菁染料则在6 0 0 7 0 0 l l n l 之间，因此，c y 系列菁染料可 通过改变其共轭骨架中的甲川链的长短来调节分子的最大吸收波长，很容易合成得到近 红外c y 系列菁染料。一般甲川链上每增加一个双键可使染料分子的最大吸收波长红移 1 0 0 n m 。同时，每增加一个乙烯基，振动强度也会增加一个值，摩尔消光系数约增加 5 0 ，0 0 0 9 0 ，0 0 0 。另外，随着甲川链的增加，谱带宽度会逐渐减小。 染料的第二特征( 杂环上引入的取代基) 也会使吸收峰的位置发生变化，c y 5 5 的 最大吸收波长与最大发射波长与c y 5 相比均发生红移，分别为6 7 3 n m 和6 9 2 衄。一般 说来【3 “，氮杂环上有供电子基时，染料的最大吸收波长相对较长，如苯环上没有取代的 哼i 哚五甲川菁染料在乙醇中的最大吸收峰在6 4 0 n m 附近，但当5 ，5 位上的氢被氨基取 代时，则波长红移5 0 i l m ；而环上硝基的引入往往使染料的荧光淬灭；但氮原子上取代 基的改变对波长影响较小。 1 3 3 荧光试剂c y 系列的稳定性 作为一个大的共轭体系，c y 系列菁染料伴随着共轭链的增长，分子中电子激发能 降低，吸收波长更长，但同时分子的光稳定性也随之降低，单甲川菁染料和三甲川菁染 料在2 0 下可保存四年之久，七甲川菁染料在常温下存放几个月就会发生分解，而十一 甲川菁染料在o 存放几个月，就有部分发生蜕变。 活性氧如单线态氧、超氧化物、过氧化物等氧化活性物质被认为是荧光团产生光降 解而褪色的主要原因。c y 系列菁染料的光漂白是由于单线态氧对多亚甲基链的攻击， 2 一 大连理工大学硕士学位论文 发生光氧化反应。根据具体光氧化反应过程不同，可分为自敏光氧化反应和敏化光氧化 反应。所谓自敏光氧化反应，是指在光的照射下，由染料自敏化作用产生的活性态氧破 坏染料。研究结果表明，主要是染料的三重态参与了褪色反应过程，由染料的三线态敏 化所产生的单线态氧化染梅从而导致了染料的永久性褪色。而对另些菁染料自身不 能敏化产生活性态氧，在缺少合适的敏化剂的条件下，由于低的量子效率，反应进行的 较为缓慢，而在有敏化剂的条件下，反应得到大大加速【2 0 1 2 ”。 瞢染料的光氧化反应具有如下特征 2 2 】： ( 1 ) 在溶液中的光氧化反应符合一级反应动力学过程； 但) 菁染料中甲川链结构相同时，杂环母核上取代杂原子增大，稳定性降低，即吲 哚 嗯唑 噻唑 硒唑； ( 3 ) 当杂环母核结构相同时，甲川链越长，光稳定性越差； ( 4 ) 自敏氧化初始过程中，既存在单线态氧过程，又存在超氧负离子过程，单线态 氧起主要作用： ( 5 ) 光氧化反应主要发生在与杂环母核相连的次甲基碳链上，氧化产物为醛、酮和 少量的羟酸： 为提高这类菁染料光稳定性能，通常采用以下三种方法】： ( 1 ) 在甲川链上引入不饱和的环体结构，使分子部分刚性化，或在分子外部共价引 入或掺杂环糊精等，增加光氧化时的空间位阻，提高其光稳定性能； ( 2 ) 在分子中引入强吸电子基团，如一n 0 2 、一c n 等，降低分子的h o m o 轨道能 量，增强其抗氧化性能； ( 3 ) 将花菁染料与单线态氧淬灭剂配合使用，这种淬灭剂可以是金属鳌合物、胺类、 氮杂环类、酚类和有机磷化合物等多种物质【矧。 由于第一种方法常常引起染料溶解度的下降，第二种方法易引起染料的吸收光谱的 蓝移，因此第三种方法最为常用，效果也最明显。 在甲川链上引入如图1 1 1 所示的不饱和环，使链被相对固定，分子部分刚性化，可 提高染料的稳定性，不过随着染料结构的复杂化，在染料上引入活性基团也将变得困难 起来。如需要加入活性基团琥珀酰亚胺酯，而在合成时这种活性基团不稳定，所以反应 产率比较低且难于分离。 譬心 h h r 2 “毛必 蚓1 1 1 可引入到甲川链中的不饱和环状结构基团 f i g 1 1 lu n s a t u r a l e du n i i sw h i c hc a nb ei n t r o 血c e d 【om e t h y l c h a i n 一1 3 近红外中位氨基酸取代c y 7 的合成及生物应用初探 1 3 4 荧光试剂c y 系列的溶解性 生物大分子的标记一般都是在水溶液中进行的，荧光染料的水溶性对荧光标识性能 有较大的影响，这就要求标记染料要有较好的水溶性。为了增加染料的水溶性，在菁染 料结构中大都接上水溶性基团，如磺酸基、羧基、羟基等，这些基团的引入，不仅增加 染料的溶解性、减少染料在溶液中的聚集，而且可改变与底物结合后的光谱性能。 本实验室发现磺酸基的引入不仅增加了染料的水溶性，而且提高了其稳定性，当用 羧基代替磺酸基时，水溶性有所下降。w a g g o n e r ，p a 幻n a y 等【2 3 ，2 5 1 合成了一系列水溶性 荧光染料，其中w a g g o n e r 【2 6 】等研制的n 羧戊基5 磺酸基3 h 哼i 哚菁染料c y 3 、c y 5 具 有较好的水溶性及荧光性能，分子中所含的羧基可与生物基质中的游离氨基共价结合， 作为新一代的商品化荧光探针应用于d n a 、蛋白质和寡核苷酸的检测分析中。 1 。3 5 荧光试剂c y 系列作为荧光标记试剂的优点 由于菁染料结构、光谱特征与性质的特殊性，使其作为荧光试剂与现有的其它荧光 标记试剂如罗丹明、荧光素等相比更具优越性( 2 7 1 第一，这类染料类型众多，广泛分布 在光谱3 5 0 砌到几乎1 2 0 0 n m 的区域中，具有很大的可比性及选择性。它们与生物分子 键合后的活性衍生物能用于同时测试多种物质，多色或多参数分析对于简化操作，降低 成本极为有利，且可提高在一个复杂的混合体系中不同被标示成分的测定速率；第二， 大多数菁染料及其衍生物的吸收强度高，摩尔消光系数大( e = 1 5 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 ) ，且荧 光较强；第三，这类染料具有相对的光稳定性，不会在荧光显微镜下迅速淬灭；第四， 这类染料可作为简单有效的偶合试剂；第五，染料类型多样，通过结构的改变可使试剂 具有不同的水溶性，而且所带电荷也可改变，不会干扰分子与被测物的键合，并减少不 必要的连接；第六，与生物基质结合后会有强烈的荧光增强效应；第七，这类染料的分 子量相对较小( 约1 0 0 0 ) ，不会对被标记分子的连接与功能产生位阻效应。 1 4 七甲川菁染料的结构与生物应用 1 4 1 七甲川蔷染料的基本机构 甲川花菁染料中间为多次亚甲基桥，两端为噻唑、嗯唑、苯并噻唑和苯并啄唑等杂 环，中间或两端可修饰上多种基团，以获得不同的特性和用途。作为一个大的共轭体系， 甲川花菁染料伴随着共轭链的增长，分子中电子激发能降低，吸收波长更长，但同时分 子的光稳定性也随之降低，因而亚甲基桥不宜过长。近红外甲川染料中，常见的有五甲 川花菁染料和七甲川花菁染料【7 。七甲川花菁染料常见结构如图1 1 2 所示。 唧砂 大连理工大学硕士学位论文 凡晦懈屯u 屯 图1 1 2 七甲川菁染料的常见结构 f i g 1 1 2u s u a ls t n l c t u f e so f h e p t a m e t h 血c y a i l i n en u o r e s c e n c ed y e s 1 4 2 七甲川菁染料在物理结合荧光标示中的应用 ( 1 ) 蛋白质检测 郑洪等【1 3 】使用不带活性基团的近红外菁染料结合血清总蛋白，染料结构如图1 1 3 。 染料在c t a b 阳离子表面活性剂中形成现场二聚体后荧光淬灭，随着蛋白质的加入，染 料二聚体破坏会使荧光恢复。在一定范围荧光恢复强度与蛋白质的加入量成正比，实现 蛋白质的定量检测。他们以2 0 m m o l 几，p h = 4 0 的h a c n a a c 体系为最佳缓冲介质，近 红外花菁染料浓度为6 0 1 0 击m o l l 时，得到体系对蛋白质的检出限为5 0ug ，l ，检测 的线性范围为1 0 0 1 9 0 0 “虮。 。0 3 8 钾s 0 3 lu 图1 1 1 3 水溶性近红外七甲川菁染料 f i 9 1 1 3aw a t e r - s o l u b k e a f - 抽丘a r e dh e p 【a m e l h i l l ec y a i ed y e 该组最近又利用这个染料与蛋白质作用后在9 0 4 n m 处出现新的吸收峰来定量检测蛋 白i “。这种检测方法对b s a ，h a s 和c i g g 的检测范围分别是2 0 0 2 0 0 0 、1 0 0 2 4 0 0 和2 0 0 3 0 0 0 n g m l ，对b s a 的检测限达到2 o n g m l ，文献强调这种方法非常简便。 一般地，激光诱导荧光检测( u f ) 蛋白质，是将荧光染料与蛋白质预先共价结合。 但是共价结合的问题是衍生反应费时耗力，而且要严格控制p h 值，反应后还必须除去 未反应的染料。在蛋白质的激光诱