（应用化学专业论文）铕掺杂纳米羟基磷灰石的制备及其表征.pdf

海南人学硕f j 学位论文 摘要 纳米粒子是指尺寸在( 1 l o o 姗) 之问的颗粒材料，其独特的物理化学特性已经引 起了人们的极大研究兴趣。无机纳米粒子在医学上的应用己经成为医学家和材料学家共 同关注的焦点。羟基磷灰石( h y d m x y a p a t i t e ，h a ) 是脊椎动物硬组织的主要无机成分， 具有良好的生物活性和生物相容性。近十几年束对纳米羟基磷厌石的研究非常活跃，热 点在纳米羟基磷狄石作为药物戡体或的研究，而较少涉及利用纳米粒子本身的特性探讨 抗肿瘤效应。此外，关于纳米羟基磷灰石荧光标记的系统报道还较少，因此探索新的纳 米羟基磷灰石荧光材料日益受到重视。本文的目的就是探讨一种可荧光标记的纳米羟基 磷灰石的合成方法，为其在抗肿瘤方面的进一步探索提供实验基础，和技术手段。本论 文利用均相共沉淀法辅助超声和化学共沉淀法分别制备出纳米羟基磷灰石和铕掺杂纳 米羟基磷狄石。并应用傅立叶红外光谱仪、x 射线衍射仪、透射电镜、激光扫描共聚焦 显微系统对其成分、结晶度、形貌、荧光特性等进行了表征。结果显示：纳米羟基磷灰 石颗粒分散均匀，特征峰明显，衍射峰宽化，粒径约1 0 一2 0 n m ；铕掺杂纳米羟基磷灰石 为多分散状态，特征峰明显，衍射峰显示主晶相为羟基磷狄石，粒径在1 0 0 i m l 以内。在 激光扫描共聚焦显微系统下可观察到明亮的红色荧光。由此，本文成功的合成出了纳米 级可荧光标记的羟基磷灰石，结晶度低，表面活性高，可被荧光示踪，为进一步的研究 其抗癌机理，提供了实验条件和技术手段。 关键词：羟基磷灰石铕荧光纳米粒子 钸掺杂纳米羟堆磷灰t i 的制需及j e 表征 a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，t h e r ei sag r o w i n gc o n c e mo nn a n o p a r t i c l e s ( 1 1o o n m ) d u et ot h e i r p h y s i c a la j l dc h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s i n o 唱a n i cn a n op a n i c l e si nt h em e d i c a l 印p l i c a t i o n s h a s b e c o m et h ef i e l db o t hm e d i c a la j l dm a t e r i a ls c i e n t i s tf o c u so n h y d r o x y a p a t i t e ( h a ) i st h e m a i ni n o r g a n i cc o m p o s i t i o no fv e r t e b r a t eh a r dt i s s u ew i t hh i 曲b i o a c t i v i t ya n dg o o d b i o c o n l p a t i b i l i t y d u r i n gt h ep a s tt e ny e a r st h es t u d ya b o u tt h eh y d r o x y 印a t i t en a n o p a n i c l e si s v e r ya c t i v e m a n yp a p e r s w e r ep u b l i s h e da b o u tt h eh y d r o a p a t i t en a n o p a j t i c l e sf o ri t s a p p l i c a t i o na sad r u gc a r r i e r b u tt h e r ew e r e f e wr e p o r t sa b o u tu s i n gi t so w nc h a r a c t e r i s t i ca s a n t i c a n c e rm e d i c i n e a tp r e s e n t ，s e l d o ma u t h o r sp r o v e d t h a th y d r o x y a p a t i t en a n o p 甜i c i e s c o u l db eu s e da sg o o df 1u o r e s c e n tl a b e i n gm a t e r i a l s om o r ea j l dm o r es c i e n t i s t sb e g a nt op a y a t t e n t i o nt oi n v e s t i g a t et h en e wf l u o r e s c e n tn a n op a r r c i c l e s i nt h i sa r t i c l e ，e u - h y d r o x y a p a t i t e w i t hf l u o r e s c e n c ew o u l db eg a i n e d w h i c hw o u l db ed e v e l o p e di na n t i c a n c e rf i e l d i nt h i s p a p e r ， n a n oh y d r o x y a p a t i t ea n dn a n oe u r o p i 啪一h y d r o x y a p a - t i t ew e r ep r e p a r e dt h r o u g h h o m o g e n e o u sc o - p r e c i p i t a t i o n m e t h o dw i t h a u x i l i a 巧 u l t r a s o n i c a t i o na u l dc h e m i c a l p r e c i p i t a t i o n t h ec o m p o n e n t s ， c r y s t a l l i z a t i o nd e g r e e ，m o r p h o l o g y a n dn u o r e s c e n c eo f h y d r o x y a p a t i t ea n de u h y d r o x y a p a t i t ew e r et e s t e db yf t 二i rs p e c t l m m ，x r a yd i f i r a c t i o n ， t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p ea n dl a s e rs c a r u l i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p es y s t e m t h e p a r r t i c l es i z eo fh y d r o x y a p a t i t ew a sa b o u t10 2 0 n ma n de v e n l yd i s p e r s e d t h ec h a r a c t e r i s t i c d i m a c t i o np e a k so fh y d r o x y a p a t i t ew e r en o t i c e t h em a i n c 巧s t a l l i t ) rp h a s e o ft h e e u r o p i u m - h y d r o x y a p a t i t ec o m p o s i t ep a j t i c l e sw a sh y d r o x y a p a t i t eb yx r d ，a n da v e r a g e p a n i c l es i z ei sl e s st h a n10 0 姗t h er e df l u o r e s c e n c ew a so b s e r v e db yt h el a s e rs c a n n i n g c o n f o c a lm i c m s c o p es y s t e m i nt h i sp a p e r ， n a n o e u - h y d r o x y 印a t i t e 、v e r eg a i n e d i t s c r y s t a l l i n ew a sl o w ，a n da p p e a r a n c ea c t i v i t yw a sh i g h i tw o u l d b et r a c k i n gb yf l u o r e s c e n c e i t w o u l db ed e v e i o p e df o ra n t i c a n c e ra c t i v i t yb yi t sn u o r e s c e n c e k e yw o r d s ：h y d r o x y a p a t i t e ；e u r o p i u m ；n u o r e s c e n c e ；n a n op a r t i c l e ； 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。 除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人 承担。 论文作者签名： 日期：矽矿年厶月0 日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和 汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海南大学。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者签名：咫井 日期：7 j 孑年6 月，口日 导师签名： 日期：刈 j j 户日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论文提交 “c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关权益。回壶逾塞 握銮丘溢丘；旦上生；鱼生生i 旦三生筮查。 论文作者签名：咫么书 日期： u ) 方年6 月，) 日 导师签名 日期：x 研年6 月 海南人学硕l ：学位论文 第一章研究背景与综述 1 1 纳米羟基磷灰石的研究现状 纳米( n a n o m e t e r ，n m ) 是一个长度单位，l n m = 1 0 一m ( 即十亿分之一米) 。1 m 大体上 相当于l o 个氢原子排列的长度或细胞内脱氧核糖核酸( d e o x y 舶o n u c i e i ca c i d ，d n a ) 双螺旋结构的半径，是一个微观世界的概念。 所谓纳米材料，指的是由具有纳米量级( 1 1 0 0 m ) 的晶态或非品态超微粒构成的 固体物质【i 】。如果按维数，纳米材料的基本单元可以以分为以下三类：( 1 ) 零维：指在空 间三维尺度均在纳米尺度，如纳米尺度颗粒、原子团簇等。( 2 ) 一维：指在空间中有二维 尺度处于纳米尺度，如纳米理、纳米棒、纳米管等。( 3 ) 二维：指在空间中有一维处于纳 米尺度，如超薄膜、超品格等。因为这些单元往往具有量子性质，散零维和一维的基木 单元又有量子点、量子线之称。纳米材料具有以下特点： ( 1 ) 原子畴( 品粒或相) 尺习 小于1 0 0 眦l ：( 2 ) 很大比例的原子处于品界环境，有大量的界面和自由表面；( 3 ) 各纳米 单位之间存在相互作用。 纳米材料之所以能引起如此广泛的兴趣，正是因为它的结构特点导致的一系列特殊 效应。纳米粒子处在原子簇和宏观物体交界的过渡区域。从通常的关于微观和宏观的观 点看，这样的系统既非典型的微观系统亦非典型的宏观系统，是一种典型的介观系统。 由于处于这一特定尺寸范围内的物质粒子的粒径小、比表面积大，故处于其表面的分子 或原子的比例远大于同组成的普通粒子，所以具有一系列新异的常见大块样品材料中所 忽略或是根本不具有的物理化学性质，如表面效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应 以及小尺寸效应等1 2 一 。由此导致了纳米粒了的光、磁、电、热、力以及化学活性等性 质与本体物质有显著差异。 1 1 1 纳米羟基磷灰石的结构与特性 磷灰石是具有相同结构的无机磷酸钙大家族的总称，羟基磷灰石( h y d r o x y a p a t i t e ， h a ) 是一种典型结构的代表。它是脊椎动物骨和牙齿的主要无机成分，在人骨中约占 7 2 ，齿骨中则高达9 7 ，是微溶于水的弱碱性磷酸钙盐。羟基磷灰石生物陶瓷具有良 好的生物相容性和化学稳定性，能与骨形成牢固的化学结合。大量的生物相容性试验证 明【5 圳，羟基磷狄石无毒、无刺激、不致过敏反应、不致突变、不致溶血、不破坏生物 组织，是一种很优良的生物材料。 羟基磷厌石1 1 0 j 的理论组成为c a l o ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 ，c 胛为1 6 7 。h a 晶体为六方晶系， 属l 6 p c 对称型和p 6 3 m 空间群，其结构为六角柱体，与c 轴垂直面是一个六边形，a ， b 轴央角为1 2 0 。，晶胞常数a _ b = o 9 4 3 m ，c = o 6 8 8 m i l ，z = 2 。单位晶胞含有1 0 个c a 2 + 、 6 个p 0 4 弘和2 个o h 。图卜l 是羟基磷狄石的晶胞结构。从图中可以看到，o h 。位于晶 胞的四个角上，1 0 个c a 2 + 分别占据两种位置，4 个c a 2 + 占据c a ( i ) 位置，即z = o 和z = l 2 铕掺杂纳米羟堆磷灰“的制备及j e 表征 位置各两个，该位置处于6 个o 组成的c a - o 八面体的中心。6 个c a 2 + 处于c a ( i i ) 位置， 即z = 1 4 和z = 3 4 位置各三个，位置处于三个o 组成的三配位体中心。从图中还可以看 出，6 个p 0 4 3 。四配位体分别位于z _ l 4 ( 0 2 5 ) 和z - 3 4 ( 0 7 5 ) 的平面上，这些p 0 4 3 。四面体 的网络使得h a 结构具有较好的稳定性【1 1 ，12 1 。 图1 1 羟基磷灰石的晶胞结构 f i g 1 一lc 呵s t a ls t r u c t u r eo fh y d r o x y a p a t i t e h a 的表面性能取决于其结构1 1 3 i4 。，h a 表面主要存在2 个吸附位置：( 1 ) 当o h 一位 于晶体侧表面时，在水溶液中，这个表面的o h 。位置至少在某一瞬间空缺，由于两个 c “i i ) 离子带正电荷，形成了一个吸附位置，称为c 位置，这个位置能吸附p 0 4 3 、大分 子上的磷酸根基团或羧基基团。( 2 ) 当c “i ) 位于平行于单晶横截面的表面时，由于c a ( i ) 与6 个带负电荷的o 原子相连，c a ( i i ) 与3 个带负电荷的0 原子相连，当h a 在水溶 液中，表面的c “i ) 位置至少在某一瞬间空缺，连着六个o 原子的c a ( i ) 位置就形成了 一个较强的吸附位置，称为p 位置，p 位置能吸附s r 3 + ，k + 等阳离子以及蛋白质分子上 显j 下电性的基团。而在c “i i ) 位置则形成一个较弱的吸附位置。( 3 ) p 0 4 3 位于晶体的表 面时，h 2 0 通过氢键与p 0 4 3 。离子结合生物活性材料。h a 的表面水化层通过氢键与水相 有很好的相容性，所以h a 在水中的表面能较低，能长时间保持细小的分散状态。影响 h a 表面电荷的定势离子是它的构晶离子及其与水的反应产物h + 、o h 、c 矛+ 、p 0 4 孓等， 其它的无机物、表面活性剂和聚合物也能影响其界面电荷，但这种二次影响主要是通过 定势离子来决定的。当阳离子决定表面电荷时，提高其浓度会使电位升高。因此c a 2 + 浓度上升，可使h a 表面电位提高，带正电荷；p 0 4 3 。浓度上升可使表面电位下降，带负 电荷。h a 的晶体结构和表面性质决定了它的c a 2 + 、p 0 4 弘和0 h 易于被其它种类的离子 所取代，替代导致晶格常数、晶形和溶解性的改变，而晶胞的六方对称性却无大的变化。 羟基磷灰石理论密度较大，为3 1 5 6 c m 3 ，折射率为1 6 4 1 6 5 ，莫氏硬度为5 ， 海南人学硕i ：学位论义 微溶于水，易溶于酸而难溶于碱，羟基磷狄石的溶解特性受诸多因素影响，主要包括： 羟基磷灰石和水的重量百分比，羟基磷灰石的比表面，溶液的p h 值以及羟基磷灰石的 晶粒缺陷和杂质含量。从晶体角度看，h a 的溶解为非定位溶解，即溶解同时发生于晶 粒表面和品核。离子交换能力强，c a 2 + 很容易被c d 2 + 、h 9 2 十等有害会属离子和s p 、b a 2 + 、 p b 2 + 等贵金属置换，p 0 4 3 。位置易被s i 0 4 2 ，c 0 3 2 。等置换。o h 也常被f 。、cl 。、i 。、o 玉等 置换，并且置换速度非常快【i5 1 6 j 。 纳米h a 的表面特性源于它本身的表面结构i l 。由于纳米微粒粒径减小，比表面积 增大，表面原子数增多及表面原子配位不饱和性导致大量的悬键和不饱和键等，这就使 得纳米微粒具有高的表面活性。h a 表面水化层通过氢键与水有很好的相容性，如图1 2 所示，第一层水的吸附热为9 6 u m o l ，吸附两层水后吸附热为4 6 m o l 【1 8 j ，与水的汽 化热相等。因此两层以外的吸附水分子与溶液中水分子的结合等同于它与内层吸附水分 子的结合。所以h a 在水中的表面能较低，能长时间保持细小的分散状态。但是，当 h a 晶体颗粒尺寸很小时，由于其巨大的比表面积使它极易团聚。在h a 制备中，可以 通过超声波以及加入表面活性剂的办法使之稳定。 m h 苫一苫一毒一苫一l】第二层 m l ：呈，：伊董二1 一曼二专一 三二： r h 叹h气hq o 、hk i 第一层 黉熬懑一表面 生物材料中的磷灰石，尤其是羟基磷灰石纳米材料以其良好的生物相容性和骨传导 能力因而在硬组织的替代和填充方面得到了广泛的应用。在药物载体和蛋白质分离方面 也有羟基磷狄石的应用研究报道。李玉宝教授1 1 9 。2 3 】将纳米磷灰石与聚酞胺高分子制成生 物活性仿生纳米人工骨，具有更优越的性能。将内植物表面涂上一层h a ，可以具有良 好的组织相容性1 2 驯。h a o k i 利用羟基磷灰石超微粉体作为药物盐酸阿霉素、丝裂霉素c 的载体使得其对癌细胞的抵制作用得到明显提高。利用纳米羟基磷灰石与胶原纤维复合 制备了胶原复合材料【2 5 2 ”，组成模仿了天然骨基质中无机和有机成分，其纳米级的微结 构也类似于天然骨基质，引起国际社会的广泛关注。 1 1 2 纳米羟基磷灰石的合成现状 铕掺杂纳米羟桀磷灰石的制备及j e 表征 纳米粒子的制备主要通过以下两种基本途径：一是“自上而下”的方法，即借助机 械力将块状材料超细粉化；二是“自下而上的方法，即通过各种物理和化学的方法使 生成的各个分散状态的分子、原子逐渐生长成设计需要的纳米粒子。自订者难以得到微米 级以下的粒子，粒子形状不规则，而且容易混入杂质并发生剧烈的氧化反应。而后者代 表了当今超微粒子化技术的发展趋势，其最大的优点在于容易制备微米级以下高纯、可 控的纳米粒子。 纳米粒子的制备方法有很多，可以根据是否发生化学反应，分为物理法和化学法， 而更科学的分类方法是根据反应物及介质的相态，分为气相法、液相法和固相法1 2 剐( 表 1 】) 。 表1 1 纳米粒子的制备方法 1 a b l e1 1m e t h o d so fr e p a r i n gn a n op a t i c l e s 由于羟基磷灰石在高温时容易脱羟基，所以羟基磷灰石纳米粒子多采用液相合成 法。在液相法的诸多制备工艺中，用于合成羟基磷灰石纳米粒子的主要方法有溶胶凝 胶法、微乳液法、共沉淀法、水热反应法、自订驱体水解法、酸碱反应法等。在溶胶凝 胶法中，可采用钙的柠檬酸盐或乙酸钙与磷酸反应，获得溶胶，溶胶在一定条件下老化 为凝胶，再经过进一步处理，获得纳米级h a 。 d e p t u l a 将溶胶凝胶工艺与水的萃取相结合，先将乙酸钙与磷酸按一定的钙磷比相 混合，然后将混合溶液倒入2 乙己醇和s p a n 8 0 中形成乳液，通过不断注入脱水的2 一 乙己醇循环处理，可将溶液中的水分萃取出来，胶体固化。高温处理后获得h a 粉体1 2 圳。 海南人学顾l ：学位论文 用溶胶凝胶法合成纳米材料的缺点是反应时间长，过程不易控制，难以获得批量的材 料，产物的形貌难以控制。微乳液法办可以获得均匀的羟基磷灰石纳米粒子。新加坡国 立大学l i m 教授i j o j 将c a c l 2 与烈h 4 ) 2 h p 0 4 分别制成微乳液，油相为环己醇，表面活性 剂为n p 5 + n p 9 ，将两种微乳液混合后放置一定的时间，将沉淀物用乙醇洗涤，可以制 备出粒径为2 0 4 0 n m 的h a 粉体。任卫利用a o t 异辛崩水体系形成球形水核，利用 c a ( h 2 p 0 4 ) 2 h 2 0 水溶液和c “o h ) 2 饱和水溶液作反应试剂，用反相微乳液法制备了羟 基磷灰石纳米粒子p 。由于微乳液的球形反应介质，有可能获取球形的羟基磷狄石纳米 晶体，但反应有诸多限制，合成过程中引入的油相难以彻底分离排除，水核中的纳米粒 子在破乳、分离过程中会有严重的团聚。所得羟基磷狄石作为生物医用需要进一步处理。 共沉淀法适于许多纳米材料的合成1 32 ，3 3 j ，是一种简单有效的方法，共沉淀法合成羟基磷 狄石采用c 刑0 3 ) 2 4 h 2 0 和州h 4 ) 2 h p 0 4 在p h 值一定的条件下，在常温下或水热条件 下进行反应，可获得纳米级h a 晶体1 3 引。其不足之处是杂质离子的分离较为困难，工艺 要求严格，否则会有粒子的二次长大。水热反应法办用于羟基磷灰石的制备【3 5 3 9 1 ，通常 采用c 删0 3 ) 2 4 h 2 0 和h 3 p 0 4 进行反应，然后对沉淀物在一定的压力和温度下进行水 热处理。水热法制备羟基磷灰石所得产物数量有限，反应周期较长。水解法合成羟基磷 灰石通过c a 洲0 3 ) 2 4 h 2 0 在6 0 7 0 和p h 为8 0 左右的条件下制备h a ，q t c p 在近 似的条件下也可水解制备出h a 粉木。前驱体水解法常与水热法结合使用，可以获得结 晶相对较好的纳米粉体，缺点是如果水解不完全则产物的分离困难。酸碱反应法采用 h 3 p 0 4 和c a ( o h ) 2 进行酸碱中和反应，其优点是可以获得品质纯净的磷灰石纳米粒子， 过程容易控制。不足之处是氢氧化钙属于难溶化合物，制备过程浓度低，所得羟基磷灰 石溶胶浓度过低，实际应用时需有进一步的浓缩处理。本论文使用多种合成方法制备纳 米磷灰石，着重研究化学共沉淀法。 掺杂离子、外加剂及有机物对h a 微晶形态的影响在近年来开始见诸报道。n a n c o l l 2 l s 的研究h o j 表明，c l 。的存在能改变h a 的结晶形态，使其容易形成平面状的h a 微晶。此 外，w a l t e re b r o 、v n 的研究认为m 9 2 + ，p 2 0 7 2 和c 2 0 4 2 的存在也能影响h a 的晶体形 态。 1 2 稀土元素与荧光标记的研究技术 随着现在生命科学、临床医学等新兴科学的发展，分析化学所面临的挑战越来越大， 生物大分子分析、药物分析、生物活性物质分析等大量新课题不断涌现，许多生物分子 由于本身可供分析的性质较弱，要获得高灵敏度的检测，常常借助外来的标记物获得可 测量的信号来分析。 目前，应用于生物体标记的荧光材料主要包括量子点、具有光学活性的金属纳米粒 子、复合型纳米粒子、稀土掺杂无机纳米发光材料等，它们种类丰富、光谱品质高，合 成方法灵活多样，目前己经在通讯、激光、显示等方面取得了可喜成绩。 铕掺杂纳米羟甚磷次的制餐及j 表征 ( 1 ) 半导体量子点 半导体量子点( q u a n t u md o t ，q d ) 多指基于i i 族( 如c d s e 、z n s ) 、i i i v 族( 如 g a a s 、i n p ) 及族( 如p b s 、p b s e ) 三个系列的纳米晶体材料【4 2 j 。由于量子受限， 量子点的带隙随着晶粒尺寸变化，呈现量子尺寸效应( q u a n t u ms i z ee 仃e c t ) 1 4 引，最直接 的表现为光化学性质随着品粒尺寸的变化而变化。因此，改变量子点的组成和尺寸，可 以获得波长从蓝色一直到近红外区( 大于7 0 0 m ) 的荧光。例如，c d s 和z n s e 量子点 可以发射从蓝色到近紫外的荧光【4 4 l ；不同尺寸的c d s e 量子点的发射光谱可以覆盖整个 可见光区域；i n p 和i n a s 量子点可在远红外和近红外发射荧光【4 孓4 。 半导体量子点可以吸收宽波长范围的光，发射波长范围却非常窄。用特定波段的光 源激发时，不易出现信号交叠现象【4 8 1 。经过适当的表面化学修饰后，可以按照意愿使量 子点与某生物分子特异性结合。根据需要标记的生物分子的不同，可对半导体量子点表 面进行不同的化学处理。量子点表面可以与多种分子结合，获得多种功能基团，使分析 更加灵活。 量子点用于生物医学标记的一个缺点是，目前对量子点在生物环境使用的安全性还 缺乏了解。许多用于制备量子点材料的物质有很强的毒性，如c d 2 + 可能从c d s e 或 c d s e 亿n s 量子点中缓慢释放出来f 4 9 】，产生不良影响。虽然量子点可以附加保护性的包 覆层，但目f j 对包覆层长时间的稳定性及对生物环境的综合影响了解还不多。此外，量 子点始终处在发射态或者非发射态，两种态之间的转换是随机的，这种“闪烁”现象在 单个量子点的荧光发射中特别明显，这一特性在一定程度上影h 向了其在单分子检测中的 应用【5 0 1 。 ( 2 ) 具有光学活性的金属纳米粒子 金属纳米粒子标记物主要是贵金属金、银的纳米粒子。金或银的纳米粒子作标记物 具有制备简单，化学性质稳定，可和多种生物分子( 抗体、激素、蛋白质) 结合易于标 记的特点。几乎所有的大分子物质都可被会物理吸附标汜，标记后活性基本不发生改变。 不同直径的纳米金可以用于多重标记，在检测中样本用量极小，且免疫纳米金比较稳定， 可长期保存，不需底物反应，检测速度较快纳米金对人体无害，实验结果可以长期保存。 另外，金属纳米粒子的光学特性还可以显著提高一些光学检测方法的灵敏度1 5 卜 j 。 如会纳米粒子增强的表面激元共振( s p r ) ，通过会粒子标记后的增强作用，灵敏度比未 增强的提高1 0 0 0 倍，对d n a 测定灵敏度可达1 0 p m o l l ，可望使s p r 成为一种灵敏的 d n a 测定技术【5 。用银纳米粒子增强的罗月明6 g 的拉曼散射光谱，信号增强因子达到 1 0 1 4 1 0 b 数量级，灵敏度达到单个罗月明6 g 分子的测定，超过荧光检测i ：去1 5 2 j 。这种基 于拉曼散射增强的方法己用于核酸的分析和免疫分析【5 4 5 5 j 。 海南人学顾f ：学位论文 ( 3 ) 复合型纳米粒子 复合型纳米粒子一般通过高分子材料包裹荧光分子或乳液中形成荧光纳米球。如包 裹着若干个染料分子的荧光纳米球，包含着稀土螫合物的纳米粒子【5 引。包裹作用一方面 能使更多的发光分子连接在生物分子上起到信号放大作用，另一方面可克服外界环境对 发光试剂的影响如淬灭作用等，增加发光试剂的稳定性。乳液的保护作用在于隔丌各个 发色基团，防止坏状共扼结构产生一叠加导致峰变宽，发生红移。 复合型纳米粒子的内核材料主要有染料、过渡金属络合离子及稀土配合物等，前两 种主要有异硫氰酸荧光素( f i t c ) 、罗月明b 衍生物、c y 3 t m 等【”，染料在应用中通 常存在以下问题：光谱带宽、荧光寿命短、光漂白及对细胞存在毒害。所以，在用它们 作为标记物时通常制成核壳型纳米粒子。由于核壳型纳米粒子的核壳结构特点，使其物 理化学特性将比一些普通纳米材料更优越【5 引，主要表现在：降低了纳米颗粒对生物机 体的毒性，提高了纳米颗粒的生物亲和性：纳米颗粒的稳定性得到显著提高：生物体 内各种酶以及预防系统都有可能影响纳米颗粒作用的发挥。通过采用外壳材料的包被避 免了外界环境因素对功能化核材料的影响如光漂白、氧化、生物降解等，使纳米颗粒的 各种物理化学性质的稳定性得到显著提高，有利于发挥其应有的功能。检测灵敏度增 强：纳米颗粒的尺寸效应导致的比表面积增大，可以在核壳纳米颗粒表面修饰更多的生 物分子，使核壳纳米颗粒应用于生物医学检测时，灵敏度明显提高。 ( 4 ) 稀土掺杂无机纳米发光材料 上转换发光材料 上转换发光材料( u p 。c o n v e n i n gp h o s p h o r sm a t e r i a l ，u p m ) 是一类在长波长激发 下发射短波长光的材料【59 1 。此类材料在防伪标记、激光探测和立体显示上的用途已经广 为人知。最近几年来，科学家们【6 0 j 又发现上转换发光材料有不易发生光漂白和发光强度 高等优点，用在生物标记中可以大大提高检测灵敏度和线性范围。上转换发光材料作为 新型生物标记物的优点在于1 6 i j ：a 高度的敏感性，独有的上转换发光现象确保了上转换 发光材料在检测过程中不存在来自于外界的背景光干扰。b 高度的灵活性，上转换发光 材料标记物的发光特性以及可自由组合的多样化特征光谱( 吸收光谱和发射光谱) ，使其 可适用于多重定量分析。c 高度的稳定性，上转换发光材料的发光现象是产生于结构内 部的纯粹物理过程，且以能量较低的红外光作为激发光，避免了来自被检测样品腐蚀以 及自身衰变导致的发光碎灭。d 高度的安全性，上转换发光材料为惰性合成材料，在其 受激发光的过程中，对检测者、被检测样品、环境均无任何危害。但因上转换发光材料 有易于沉降和团聚等特点，影响了它在生物标一记中的应用。 无机稀土荧光纳米粒子 无机稀土荧光纳米粒子吸收能力强，转换率高，可发射从紫外到红外的光谱，在可 见光区域，有很强的发射能力，且物理化学性质稳定，非常有利于它们作为发光标记物 钸掺杂纳米羟幕磷灰钉的制备及】e 表征 用于生物分析。此外，无机稀土荧光纳米粒子具有较大的s t o k e s 位移，发射光谱和激发 光谱不会相互重叠，而普通荧光物质的s t o k e s 位移较小，因此激发光谱和发射光潜通常 有部分重叠，相互干扰严重：无机稀土荧光纳米粒子的荧光寿命比普通物质的荧光寿命高 几个数量级，这样在检测时采用适当的延缓时间，可非常显著地降低来自散射光、样品 和试剂的本底荧光强度的干扰。g i a u m e 【6 2j 等合成了粒径在4 0n m 左右的y v 0 4 ：e u ”纳米 粒子，并对其进行了s i 0 2 包裹和氨基修饰，初步探讨了其用于生物标记的潜能。目前， 无机稀土荧光纳米粒子用于标记物的研究方面还很少，原因之一是现在制备的发光材料 粒径比较大，且粒度分布范围较宽，形状不规则，不能满足理想标一记物对纳米粒子粒 度大小和均匀性的要求，因此我们需要在其制备方面进行更为细致的研究，以求得到符 合理想标记物的纳米粒子。 1 3 论文研究的意义和目的 羟基磷灰石足人体与动物骨骼的主要无机成分，是f d a ( 美国食品和药物管理局) 认可的一类生物医用材料。近十几年来对纳米羟基磷灰石的研究非常活跃，突出在纳米 羟基磷狄石药物载体方面，较少涉及利用纳米粒子本身的特性探讨抗肿瘤效应。本文旨 在为探讨纳米羟基磷狄石粒子本身的抗肿瘤特性做实验基础。实验拟用稀土元素标记 羟基磷灰石，以达到荧光示踪的目的。以此来了解纳米羟基磷次石对癌症细胞的作用靶 点，进出细胞的途径和方式等。目前关于稀土元素掺杂h a 的研究已有相关报道： a d o a t 【6 3 ，6 4 】在3 7 的条件下通过化学沉淀法制备了铕掺杂羟基磷灰石微粒，并用激光 扫描共聚焦显微系统观察到带有荧光的粒子可进入胰腺癌细胞内。该方法合成的为低结 晶度的铕掺杂羟基磷灰石微粒，适于生物学研究，但其粒径大于纳米级别，限制了细胞 学机理的深入探讨。r t e m a n e 【6 5 j 于9 5 0 制备铕掺杂羟基磷灰石，其特点是：结晶良好、 表面缺陷少，但同时合成过程中晶粒长大，导致粒径明显变大，影响生物学效应的发挥。 鉴于此，本文的目的就是探讨一种纳米羟基磷灰石的荧光标示技术方法。通过选择稀土 元素掺杂，最终获得具有发光特性的纳米羟基磷灰石，用于抗肿瘤效应的机理研究。为 无机抗肿瘤药物的丌发奠定实验基础，提供技术手段。 海南人学硕i ：学位论文 参考文献 【l 】蔡元霸，梁玉仓纳米材料的概述、制备及其结构表征结构化学2 0 0 l ，2 0 ( 6 ) ： 4 2 5 4 3 8 【2 】王中林纳米材料和纳米技术化学通讯，2 0 0 1 ，6 ：l 3 【3 】尹邦跃纳米时代现实与梦想北京：中国轻工业出版社，2 0 0 l ，7 1 2 【4 】张立德，牟季美纳米材料和纳米结构，北京：科学出版社，2 0 0 1 ， 1 1 2 1 6 0 【5 】l a s c h k em w jw i t tk ，p o h l e m a n nt e ta 1 i n j e c t a b l en a n o c 叫s t a l l i n eh y d r o x y a p a t i t ep a s t e f o rb o n es u b s t i t u t i o n ：hv i v oa n a l y s i so fb i o c o m p a t i b i l i t ya n dv a s c u l a d z a t i o n 【j 】j o 啪a lo f b i o m e d i c a im a t e r i a l sr - e s e a u r c hp a r r tb ：a p p l i e db i o m a t e r i a l s ，2 0 0 7 ，( i np r e s s ) 【6 】r o u a h im ，c h a m p i o ne ，g a l l e to ，e ta 1 p h y s i c o - c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dp r o t e i n a d s o 叩t i o np o t e n t i a lo fh y d r o x y a p a t i t ep a i r c i c l e s ：i n n u e n c eo ni nv i t r ob i o c o m p a t i b i l i t yo f c e m m i c sa r e rs i n t e r i n g j 】c o l l o i d sa n ds u r f a c e sb ：b i o i n t e r f a c e s ，2 0 0 6 ，4 7 ( 1 ) ：1 0 1 9 【7 】c h u n gr j ，h s i e hm f h u a n gcw ，e ta 1 a n t i m i c r o b i a le 腩c ta n dh u m a ng i n g i v a l b i o c o m p a t i b i l i t y o fh y d m x y 印a t i t es o l - g e lc o a t i n g s j j o u m a lo fb i o m e d i c a lm a t e r i a l s r e s e a l c hp a r tb ：a p p l i e db i o m a t e r i a l s ，2 0 0 5 ，7 6 b ( 1 ) ：1 6 9 1 7 8 【8 】江捍平，王大平，阮建明，等纳米羟基磷灰石人工骨的生物相容性研究 j 】中国现 代医学杂志，2 0 0 5 ，1 5 ( 1 0 ) ：1 4 7 7 1 4 8 0 【9 】刘月辉，文三立，肖尊文复合活性羟基磷灰石陶瓷的研制及其生物相容性研究 j 】 中国生物医学工程学报，2 0 0 0 ，1 9 ( 1 ) ：5 3 5 9 【1 0 】曲远方功能陶瓷及应用【m 】北京：化学工业出版社，2 0 0 3 【1 1 】任卫，曹献英，冯凌云，等纳米羟基磷灰石合成及表面改性的途径和方法 j 硅 酸盐通报，2 0 0 2 ，2 l ( 1 ) ：3 8 4 3 【1 2 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复合材料的制备和界面研究四 川大学学报( 自然科学版) ，2 0 0 2 ，3 9 ( 3 ) ：4 7 9 4 8 3 【2 l 】魏世成，李玉宝郑谦等注射型纳米羟基磷灰石聚酞胺生物活性骨修复材料的研 究生物医学工程学杂志，2 0 0 3 ，2 0 ( 4 ) ：5 9 0 5 9 3 【2 2 孟纯阳，安洪，蒋电明等新型纳米骨重建和修复材料轻基磷灰石聚酞胺体内植入 的生物相容性及安全性中国临床康复，2 0 0 4 ，8 ( 2 9 ) ：6 6 3 0 6 6 3 4 2 3 】孟纯阳，安洪，蒋电明等网孔纳米羟基磷灰石聚酞胺人工骨修复兔挠骨缺损中 华创伤杂志，2 0 0 5 ，2 1 ( 3 ) ：1 8 7 1 9 1 【2 4 p e t e rb ，z a m b e l l ip yg u i c h e u xj ，e ta l 。t h ee 脏c to fb i s p h o s p h o n a t e sa n dt i t a n i 岫 p a r r t i c l e so no s t e o b l a s t s ：a ni nv i t r os t u d y jb o n ej o i n ts u 略br ，2 0 0 5 ，8 7 ( 8 ) ：115 7 116 3 2 5 】冯庆玲，崔福斋，张伟纳米羟基磷狄石胶原骨修复材料中国医学科学院学报， 2 0 0 2 ，2 4 ( 2 ) ：1 2 4 1 2 8 2 6 】r 猢e l ts ，s c h u l z ee ，w i t tm ，e ta l 。c o l l a g e nr e m o d e l l i n ga r o u n dh y d r o x y a p a t i t e i m p l a m si nt i s s u e so r g a n s ，2