（光学工程专业论文）光诱导生物超弱发光研究.pdf

_一一一一一竺些卫三齃一一一一一一 abs tract l l l i fe 一 fo rms o mit a k i n do f u lt r a . w e ak l umi ne 那 e nc e ， w h ic hi s ab o utl o 1 04 p ho仍 n s / c 衬st hi s ki nd o f l uzni nes c e nce i s c a l l e d u l tr a 一 weak b i o l umi nes c e n c e ， a s p o nt ane o u s p h e n o m e n ai nn ature . al oto f s c i e nt i sts h a v ework e do ni t s i nce t he d i s c o v e 口o f th i s p h e n o m e n a i nl 9 2 3 . b utti i l n o wi t i s st i i l n o t v e ryc l e ara b o uth o wi t h 叩pens. b e c a u s e o f i t s h i g h l y 一 l i fe r e l at e d cha r a c t e r， u l tr a weakb i o l u m i n e s c e n c e ， asane as y w a y o f d e t e ct i n g ， h asb e en诫d e ly u s e d i n a g r l c u ltu r e ， i a t r o l o gy， b i o lo gy， etc b utthe i nten s i t y i s u l tr a w e a k ， re se arch e s o n th i s ki ndo f b io l umi nes c e n c e d e p e ndt horo u ghi y o n s e n s i t i v e d 以 e c t i n g s y s te m s . my worki n t h i s th e s i s i s m 颐 n l y c o nce m e d o n th e fo l l o w i ngi te m s ， 认 乞 h ave d e s i g n e d and b u i l t a s ens i t i veopti c 1 n d u c e d u 1 t r a . weakb i o l umi nes c e nce d e te c t i n g s y s t e m. i t i s te sted and works v e rywel l . m u l t i c h a n n e l s c ai e r/ 户 lv e ra g e r i s u s e dinthiss y s t em，s oitc an w o r kv ery quic k ly . f or exaj 的 p l ei fw euse 2 0 0 r e c o r d s / sc 叭， 脉 d e t e ct i n g ti 帐 150 川 y 3 而n ut e s . itss m a l l e std e t e c ti n g allil ity is 0 0 2 / 5 m m z . we s u c c e s s fu l l y d e te c te d u l tr a- weakb i o l umi n e s c e n c e fr o ms o y b e an s . and we h ave u s e d t h i s d et e c t i n g s y s t e mtod i s c ri m i n at e d i fferent k i nds o f s o y b e ans . i t p r o v e s tob e v e rys e n s i t i v e . d i ffere nceo fu l tra weak b i o l um i n e s c e ncefrom s o m es o ybe ans ，w h i ch are i n d i ffer e n t l i festag e s ， i s d e t e ct e d . b o ths e c o n d or der e x p 0 n e ntiald ec 即e q ua幼 o n and g u equ a t i o n c anfitthe d a t a v e ryw e l l ， 能ar l y 9 9 % b as e d o n o ure x p e r i m entald ata， we r a i s e dan e we x p l a n a t i o no nth em ech ani s m o f0 p t i ci n d u c e du l tra weak bi o l u 们 n i n e s c e n c e . k eywo r d s : o p t l c l n d u c e d ， u ltr a . w 水b i o lumi n e s c e n c e ， d e t e c t i 雌 第一章绪论 第一章绪 论 1 . 1生物超弱发光研究的发展和现状 1 、生物超弱发光w 任 何 有 生 命 的 物 质 都 发 射 一 种 强 度 为1 0 1 0 p h o t o n s / c m . s 的超 弱 光 子 流 ， 其发射光谱覆盖从近红外、可见到紫外的很宽谱区( 2 0 0 -8 0 0 n m ) ， 称之为生物超 弱发光( u l t r a w e a k b i o l u m i n e s c e n c e ) ， 又被称为生物系统超弱光子辐射( u l t r a w e a k p h o t o n e m i s s i o n f r o m b i o l o g i c a l s y s t e m ， 简称b p e ) 。基于生物系统的 超弱光子辐射( b p e ) ，本世纪八十年代初提出一门新兴的学科生物光子学 ( b i o p h o t o n i c s ) 。 2 ,国内外对生物超弱发光研究的概况 生物超弱发光现象最早是由苏 联科学家g u r w i t s c h 于1 9 2 3 年在研究洋葱鳞 茎根尖细胞分裂的机理时发现的。 迅速分裂的细胞产生紫外辐射， 促进邻近另一 洋葱鳞茎根尖的 细胞分裂，当时称这种辐射为 “ 有丝发生”( m i t o g e n i c ) 辐射。 由 于生物超弱发光的强度极低， 在相当长的时间内由 于光电探测器的限制， 生物 超弱发光研究的进展不大。 直到光子计数技术的成熟应用， 才在超弱发光的实验 方面有了 较大进展。1 9 5 5 年意大利c o l l i 等首次利用光电 倍增管检测到小麦、 菜豆、小扁豆和玉米的 黄化幼苗有超弱发光现象， 发光强度随发芽过程而增强， 根的 发光强度是茎和种子的1 0 倍. 7 0 年代以 来， 德国p o p p 为首的 研究小组从 实验和理论两方面对生物超弱发光现象进行了 系统的 研究， 发现植物或动物的 各 种组织、 器官都具有超弱发光现象， 认为这是自 然界普遍存在的生物体固有的一 种功能。t o 我国科研人员在生物超弱发光领域也进行了许多的研究并取得了一定的成 果。 在植物方面，生物超弱光子有可能成为研究植物生理的一种强有力的手段。 1 9 8 8 年， 沈询等131 探测了 绿豆、 大鼠 血液和3 t 3 细胞的 发光， 并指出这些样品的 发 光 都 是 光 诱 导 生 物 发 光。 同 年， 毛 大 璋 等 (+ )又 报 导了a . d ( a c t in o m y c in 功、 e b ( e t h i d i u m b r o m i d e ) , c h i ( c y - c lo h e x i m i d e ) 及n a n 3 对萌 发绿豆的自 发性 超弱发 光强度的影响并提供了d n a分子和/ 或r n a合成代谢对超弱发光有贡献的证据。 1 9 9 5 年， 陆治国等(5 ) 1a 9 m . 了 用 h e - n e 激光照射后的红豆芽的延迟发光。同年， 陈汝民 等6 1 用激光 辐照萌发蚕豆， 观察到在植物的生长、 发育过程中 生物光子数 增加的结果，同时还观察到生物光子的强度与活性氧成正相关的结果。 人体体表的生物光子的差异及变化也反映了 人体内 部的生理状态。 池旭生等 第一章绪论 对人体体表超弱光发射的测盈表明，人体不同部位体表发光的强度是很不一致 的，手指发光最强， 掌心次之， 然后是面颊、前额、小臂、上臂、脚腹等依次减 弱 了， 。 罗金梅报道了 人体体表的生物发光随年龄的 增加而增加， 而且吸烟人的生 物发光普遍高于同龄正常组. 顾樵(e 7 曾 报道利用生物光子鉴别癌症肿瘤和炎症， 鉴别率达1 0 0 % 。 人体的血液也存在超弱发光的现象。 血液是一种重要的体液， 占人体总重量 的 8 %， 血液的超弱发光可以作为一种灵敏、 快速、简易的生物物理指标， 对血 液发出的生物光子进行测最和分析可以揭示疾病的发生或者提供疾病的先兆。 胡 天喜(9 利用不同 病人血清的生物光子的 变化可以 进行肿瘤诊断， 胰腺炎的诊断以 及检测病人对药物的变态反 应等。 马玉琴等( 19 通过对人体血液的 超弱发光测量， 可以 进行 癌症患 者的 早期 诊断. 另 外， 陈 有君等 111 还研究了 血浆 超弱发光中 生 物 大分子 所起的 作用， 进而探讨了 人体血液超弱发光的 机制。(2 ) 互 1 . 2 生物超弱发光的产生机制 12 对于生物界普遍存在的超弱发光现象产生的机制， 目 前为止并没有一个统一 理论。 各国的研究人员从不同的角度提出了 几种可能的理论， 可初步分为物理的 和化学的两大类. 化学方面主要有“ 代谢发光” 机制， 而物理方面则以“ 相千辐 射”机制为主。 1 , “ 代谢发光” 机制 “ 代谢发光”机制以 光生物化学为基础， 把生物超弱发光与有机体内的代 谢过程联系起来， 认为这种发光主要来源于氧化还原等代谢反应， 如脂肪酸氧化、 酚和醛的氧化、 h 2 0 2 的酶解、花生四烯酸的氧化、儿茶酚胺和单宁的过氧化、酿 的氧化裂解、氨基酸的氧化等. 其中脂类自由基在超弱发光中的作用尤为重要， 因为在生物膜的磷脂中含有许多不饱和脂肪酸， 它们在一定条件下可以 按照自由 基锁链反应机制进行氧化反应。 锁链反应的特点是自由 基在与其它分子反应后并 不消失， 而是转化为另一种自由基， 因此， 脂类锁链氧化的过程包括在一自由基 引导下，引发产生一脂自由基， 然后此自由基反应继续发展，并产生分支， 从而 产生更多的脂自由基。 不饱和脂肪酸的氧化作用产生了过氧化自由基， 过氧化自 由 基复合时能形成处于激发态的过氧化物， 其退激时即可产生超弱发光。 反应的 一般过程如下 阁 : 1 )引发反应 r h - - . r ( r 为脂自由基) 第一常绪论 2 )链的延续 r + o z - 4 r o o ( r o o . 为过氧化自由 基) 3 )链的扩展 r o o . 十 天 万斗r o o h+ r p zt、 . 尸 分 1万.to.es矛 4 )复合反应形成激发态 r+r r + r 口口. r oo +r oo, 为处于激发态的过氧化物) 5 )介质中无活化剂时， 激发态产物自 身发光， 这些产物为醛、酮、酸等 p - +p+h v 6 )介质中 有活化剂如麦角脂醇、 芳香氨基酸、 蛋白 质等时 ， 则发生能童转移， 使活化剂激发， 它们在跃迁至基态时发出 光子， 但通常其发射波长都移向长波方 向。添加各种活化剂可以提高反应时的发光强度。 尸 十 a分尸 + a * 斗尸十 a + h v ( a 为活化济 7 ) 性基团， 介质中存在抗氧化剂或抑制剂时则能使活化剂不被氧化，而转化为低活 从而中止链式氧化。 r r o口 r 万 r oo h) 冲 “ 为 抗 氧 化 剂 -+ .了孟 十 a 十 、1、1、111 1 + qa人 0 0 “ 代谢发光” 机制的实验依据来自 多方面，小鼠 肝脏微粒体的化学发光与 脂类过氧化的研究1u 表明， 脂肪酸的最大发光值或总发光值都与脂肪酸氧化酶呈 线性关系; 药物提取物对超弱发光和脂肪酸氧化酶有相似的抑制作用; 脂肪酸氧 化酶抑制剂c o . m n , h 扩 和e d t a ( 乙 二胺四乙 酸)等同样也抑制超弱发光. 呼 吸代谢抑制剂n a 对萌发绿豆超弱发光的抑制实验1n 表明，萌发绿豆至少 7 2 % 的超弱发光与呼吸作用等氧化过程相关联， 证明脂肪酸氧化是超弱发光的主要来 源之一。 “ 代谢发光”机制包括了活性氧生成与控制两个方面，能较好地解释自 由基引起超弱发光的可能性。一些自由基复合反应时释放的能it高达 4 8 0 k j / m o l 足以 产生大约 2 3 0 n m 的紫外光子( 该波长近似于有丝分裂辐射光子的波 长) ， 同时， 由于活体内的氧化反应速率受抑制剂的控制， 如生育酚、 过氧化物酶、 过氧化物歧化酶、维生素a . c 和k 等都能清除活性自由基r ，因此，生物在代 谢过程中生产的大t自由 基不可能使起弱发光强度太高。 但是当生物体内的天然 阻氧化剂和氧化脂类之间的平衡被打破后， 将导致发光强度瞬时剧增 ( 即“ 闪光 现象”) 。 第一章绪论 上述 “ 代谢发光” 机制不能完全解释生物系统的超弱发光，如细胞有丝分 裂时产生的超弱发光，其波长在 1 9 0 - 3 2 5 n m 的紫外波段，与代谢发光的光谱范 围 有所不同。因 此，分裂发光与 代谢发光可能有不同的 来源和机制. p o p p等人 提出了d n a 光子存贮假说和分化模型1s . 16 1 ， 有实 验为这种观点提供了 依据+ 1 。 一 般来说， 细胞的代谢发光与分裂发光是同时或相继进行的， 光谱从紫外到红外呈 准连续谱。 2 , “ 相干辐射”机制 以 德国生物物理学家 p o p p为 代表的小组从超弱发光的物理机制出 发， 研究 了生物超弱发光的光谱、 光相干性、 光子计数统计和光照诱导延迟发光的衰减动 力学以 及生物超弱发光与生物体的生理和病理过程的相关性和对生物体温度的 依赖关系， 提出如下假说: 一部分自 发的和光诱导的生物超弱发光的光子 ( 叫性 物光子” ，简称 p e ) ，起源于生物系统内一个高度相千的电磁场，这种相干电磁 场很可能 是活组织内 通讯联络的基础。 这就是生 物光子的“ 相千辐射” 机制( 18 1 ( 又 称 “ 相干理论”)。 在把生 物光子 和激光的 特性作了比 较后， 顾 樵认为幻 生物系 统和 激光 器都是 非线性的非平衡的开放系统， 都具有产生相干辐射的激活物质、 泵浦源和谐振腔。 由 光或代谢过程激发的 d n a分子的碱基所形成的激发体具有良 好的激光物质特 性，在生物系统中维持生物分子处于稳定非平衡态的能源是新陈代谢中的生化 能; 生物细胞相当于一个小小的球状谐振腔， 球状腔内具有很高的光场， 可以引 发各种非线性效应，产生相干辐射。 生物光子常表现出非线性特征， 反映了一个系统内部各个组成单元之间的相 互作用和偶联关系。 实验表明 19 ) ， 黄瓜幼苗发射的光子在通过不同厚度的大豆薄 层时， 其消光系数比利用分光仪分出的同等强度和波长的人工光的消光系数至少 低一个量级，说明p e 具有部分相干性在p e与水蚤的数量关系实验中，p e的强 度一开始随水蚤数目的增加而增加，水蚤数目 超过2 0以后，发光强度随数目的 变化出现极大与极小值， 这些极大和极小值有规律地出现在当水蚤间的平均距离 为虫体尺寸的整数比时。这说明比色杯中的水蚤之间存在相互作用，p e的强度 与水蚤数目 呈非线性关系，这一现象能较好地用长程相千作用加以 解释. 由 于生物光子的强度极弱， 通常检测光相干性的方法如干涉不再适用， 而需 要采用光子统计的方法。 用该方法对黄瓜幼苗、 绿豆芽和大豆根瘤菌类菌体所发 光子的统计结果表明1e 1 ， 它们的发光接近泊松分布， 而纯粹属于随 机事件的 鲁米 诺的化学发光则偏离泊松分布很远， 这至少说明生物系统的发光不完全是纯化学 激发造成的偶然事件， 它们发射的光子彼此间存在着一定的位相关系。 但服从泊 松分布只是相千场的一个必要条件， 而非充分必要条件。 当模很大时， 多模混沌 第一章绪论 场的光子计数统计也趋向泊松分布。 利用经典、 时间演化算符和光子计数都可以得出这样的结论: 如果一个各态 遍历场的驰豫是按照一个双曲线衰减的话， 那么该场就是一个充分相干场。 对光 诱导 生 物系统的 延迟发 光研究 表明 侧， 延迟发 光不 遵循指 数衰减规律， 而十 分接 近于双曲线衰减规律。 这充分说明了生物系统内各个激发态分子之间是相互偶联 的， 它们很可能通过在生物系统内 存在的电磁场相互联系， 这正是相千场的重要 特征。 综上所述， “ 代谢发光”机制和 “ 相干辐射” 机制都只能解释部分超弱发光 现象， 刘颂豪等研究者2 q 利用it子化学和辐射与物质相互作用的时间it子理论研 究了生物光子的全同粒子模型， 对 “ 代谢发光” 机制和 “ 相干辐射” 机制的统一 性进行了有益的探讨. 但是生命是一个极其复杂的运动形式， 每种生物都具有高 度有序和复杂的结构， 虽然生物超弱发光只是生物众多物理特性中的一个， 但是 它与生物的有序性及许多重要特性及过程相关联， 包含着大量的生物学信息， 产 生机制非常复杂，目 前人们对它的认识还具有一定的局限性， 仍需要在理论和实 验方面进行深入研究。 3 、 生物超弱发光与普通生物发光的区别 虽然生物超弱发光的产生机制还没有被阐明， 但可以肯定它不是通常的生物 发光。因为生物发光是由酶催化的氧化作用引起的， 某些细菌、真菌、昆虫、 鱼 类等可以 产生生 物发光， 但这种现象在高等动、 植物中并不普遍. 而生物超弱发 光则是一种普遍现象， 且生物等级越高， 发光强度越大。 另外生物发光的强度比 超弱发光高几个数t级. 由 此可见生物超弱发光与生物发光并不是一码事， 相反 生物发光倒有可能是由 超弱发光触发的一个过程。门 4 、自 发 超弱发光和诱导 超弱发光 日 生物超弱发光通常包括两大部分: 一种为自 发的生物化学发光， 和生物体的 氧化代谢有关;另一种为外因诱导的发光， 取决于光、电离辐射、 超声、化学药 物等外界因素的作用。 生物的细胞、 组织和体液中， 普遍存在着自 发和诱发的超 弱发光。 生物超弱发光可被光照处理诱导， 这种光诱导的超弱发光比自 发超弱发 光强得多， 且呈指数衰减， 但对于不同的生物系统衰减速率不同。 刘颂豪等研究 人员以萌发的水权、 绿豆为材料进行的实验证实了光诱导超弱发光及其指数衰减 现象的存在。 电 离辐射对活细胞超弱发光的 影响实验叫表明， 在电 离辐射作用下的细胞的 第一章绪论 发射光谱与自 发发光相比 未发生改 变， 取决于拨基化合物r = 口 . 和单线态分子氧 勺 2 ， 它 们的 发 射峰 值分 别 位于6 36 . 4 nln 和 4 40 nm 附 近， 这 暗 示 辐射 诱 导 的 发光机制与自 发发光一样。 辐射诱导发光还涉及到电子转移和能量传递过程， 因 为活细胞受电离辐射作用后，发光强度明显增加，而且和照射剂t有关.因此， 可通过对辐射诱导生物发光的测t研究生物的自 发发光现象。 互 1 . 3研究生物 超弱发光的 意义 11 8 0年代末以 来，随着光电 子探测技术的 快速发展， 生物超弱发光研究越来 越受到重视， 并发展成为t子生物学发展前沿中的一个非常活跃的领域。 近年来， 随 着分子生物学的迅猛发展， 生命科学研究取得了 一系列的重大突破， 但仍有许 多基本问 题还末得到阐明，如细胞分裂、细胞分化、细胞识别以及 d na 复制、 蛋白质合成的机制还不十分清楚。 生物超弱发光是伴随生命过程的一种特性， 细 胞内或细胞间的信息传递有可能是由生物超弱发光介导的。 所以有理由相信， 生 物超弱发光的研究对于生物学中许多基本问题的解决具有重要意义. 对生物超弱发光的研究工作不仅有重要的科学价值，还有重大的应用价值。 例如: ( 1 ) 、对人体及血液的超弱发光研究与 疾病诊断 人体不同部位体表超弱发光有很大差异， 光照对体表超弱发光也有影响， 且 同样的光照在不同部位引起发光强度增加程度不同，避光后的衰减速度也不一 样。 体表超弱发光的强度随体表温度的升高而增强. 有人根据自己的测量结果指 出，青壮年发光强，少年、 老年发光弱。由此认为人体生命活动越强， 发光也越 强。另外一些测量结果表明年龄越大， 体表发光越强. 他们认为体表超弱发光的 主要来源是脂质过氧化过程， 年龄越大， 体内脂质过氧化过程越强， 发光也越强。 在体表超弱发光的研究中，由于对发光机制理解不一样，实验结果也很不一致， 甚至互相矛盾。 人体血液也存在着超弱发光现象。 血液是一种重要的体液， 临床上通过化验 血液的理化指标以协助诊断疾病。 近年来， 血液的超弱发光作为一种灵敏、 快速、 简易的生物物理指标， 越来越受到重视， 并广泛开展了在医学和生物学诸领域的 应用研究. p o pp等 (l 9 8 1 ) 发现癌细胞与正常细胞的超弱发光有明显差别: 马玉 琴等 ( 1 9 90) 的 实 验 研究表明， 血 液的 超 弱发光强 度与供 血者的 年龄、 性别有关， 癌症患者血液的超弱发光强度明显高于对照组， 尤以肝、 卵巢癌症患者显著。 这 一结果惫味着血液的超弱发光测t， 有可能用于癌症的早期诊断. 同一份血液样 第一章绪论 品如果同时分别测量全血及血清部分的发光， 几乎无一例外地血清的超弱发光都 高于全血的发光水平。 这是因为血红蛋白是光子碎灭剂 ， 当从全血中除去有形成 分后， 血清的发光强度会明 显增加。 对于生物大分子在血浆超弱发光中的作用， 己有研究证实， 血浆超滤后其大分子浓缩部分的自发发光以及碱诱导发光强度都 增加， 而膜透过部分的自 发发光和碱诱导发光强度则降低。用 1 0 % z n s o ; 沉淀 蛋白 质后的血浆制液， 其发光强度下降。 这说明生物大分子， 尤其是蛋白质在血 浆超弱发光中起着重要作用。 借助血液的超弱发光强度变化， 可以揭示疾病的发生或提供先兆， 但它绝不 是专一性指标。 尤其是在早期诊断癌症方面尚 须大量工作， 而目 前的研究仍处于 摸索阶段。 况且， 各个实验室的报道结果也不完全一致， 但是正常人和癌症患者 在血液发光上存在差别，这一点是共同的认识。 ( 2 ) 、 植物的 超 弱发光 及其在农 业上的 应 用研究 植物的超弱发光现象亦普遍存在。 植物超弱发光与生物氧化、 细胞分裂、 光 合作用等代谢或生理过程相关。 脂类通过脂氧合酶作用而进行的氧化过程可能在 植物超弱发光中 起重要作用。 己 有不少研究证实， 活性氧是产生超弱发光的动力， 细胞或组织在无氧条件下是不能产生或较少产生超弱发光的。 当植物处于各种逆 境条件下， 细胞或组织中的活性氧产生增多， 而清除能力下降， 导致植物超弱发 光增强。 由于植物超弱发光的变化比各种生理生化指标的变化要快得多， 因而可 以 根据农作物在各种逆境条件下超弱发光强度的变化，迅速判断出各品种的抗 性，植物超弱发光对环境污染程度极为敏感，因此也可应用于环境科学。 利用各种适宜的材料， 如萌发种子、培养细胞、 动物组织等， 研究生物超弱 发光的基本特性和规律， 构成了 跨学科基础理论研究的新领域。 生物超弱发光作 为生命过程中一个极其灵敏的生物物理指标在医学、 农业、 及环境科学上的应用 已 初见端倪， 但生物超弱发光研究中还有许多重要问题没有解决， 其生物学机制 仍需要进一步探索， 脂质过氧化作用、 自 由 基以 及生物体内的代谢反应与生 物超 弱发光的关系还需要深入研究。 从童子光学的角度看， 超弱发光的光子统计应该 包含大量的生物学信息， 如何通过超弱发光的光子统计测量获得有价值的生物学 信息是一个重要的理论和实际问题。 研制超高灵敏度的光电 探测系统， 进行生物超弱发光的衰减动力学及不同部 位强度分布的研究， 并从细胞和分子水平进行显微光子计数探测等， 将有助于生 物超弱发光生物学机制的阐明。 第一章 绪论 1 . 4 探测生物超弱发光的主要手段 12 1 由千生物超弱发光的强度极其微弱， 所以必须使用背景噪声极低和探测灵敏 度极高的光电 探测仪器才能 进行有效的 探测。 1 9 2 3 年c u r w i t s c h ( ) 在“ 洋葱实 验” 中 发 现了 超 弱 发 光， 但由 于当 时 条 件限 制， 该发 现 未 被承 认， 直 到1 9 5 4 年c o l l i 1z) 研究小组才用光电 倍增管首次证明了 生 物体确实具有弱光子辐射的 本领， 之后许 多国家的科学家也用不同型号的探测仪器对生物系统的超弱发光进行了全面研 究。 虽然用于生物超弱发光的探测仪器种类很多， 但按照仪器的结构和性能可以 归为两大类: 一类是以光电倍增管为主的单光子计数探测系统， 可提供生物超弱 发光总强度的时域信息; 另一类是以微通道板像增强器为主的超弱发光图像探测 系统， 具有二维光子计数成像功能， 可同时获得有机体超弱发光强度的时间和空 间信息。 1 、光子计数探测系统 图1 . 1 是同 步单光子计数探测系统结构简图a ) 。 生物样品放在样品 池中， 小 盒放在暗室里，彩色滤光片用来选择性地让生物发射的某些光通过，斩波器( 遮 光片) 用来分隔由光电倍增管本底噪声引起的暗计数率和由信号引起的真实计数 率，以 便实现噪声自 动扣除， 这样可大大提高测a系统的信噪比 和灵敏度.由 光 电 倍增管输出的脉冲经三级快脉冲放大器放大， 用恒比定时甄别器将小于单光子 脉冲的噪声小脉冲过滤掉， 再送入计算机进行数据分析和记录。 用光电 倍增管进 行光电 探测的方法主要有:1 )测量输出光电 流的d c 方法;2 )测f输出光电 流 中交流成份的a c 法; 3 )单光子计数( s p c ) 法; 4 )同步单光子计数( s s p c ) 法. 在 弱光下，它们的 信噪比 性能排列为:d c a c s p c s s p c。在弱光测a中常用的 是后两种方法。 图1 . 1同步单光子计数探测系统结构简图 第一章绪论 2 .超弱发光图象探测系统 图1 . 2 是超弱发光图 象探测系统结构简图w . 该系统由 样品 盒池、 变焦物镜、 微通道板像增强器、 中继镜、 背向照明致冷c c d 探测系统、 监控器、 计算机及打 印机等部分组成。 光电探测系统是以微通道板像增强器为核心的超高灵敏度成像 系统。 生物样品经变焦物镜成象在微通道板像增强器的光阴极上， 光阴极的光敏 波长在 3 5 0 - 8 5 0 n 。 范围内， 透过输入窗口 到光阴极上的光子由 于光电效应转换 成电子图象， 电子透镜将电子图象祸合到微通道板上， 在微通道板的各微通道内， 电 子经过加速并不断和通道壁撞击， 每个入射电 子便会产生 1 0 ， 一1 0 。 个次级电 子， 并保持图象的空间分布信息， 从微通道板出射的电子撞击荧光屏， 重新激发 出 光子图象， 再经中继镜投射到致冷c c d 的成像平面上， 数据经控制器采集到计 算机里， 配合信号图象增益修正和背景噪声扣除等技术， 由 计算机对图象进行显 示并结合图象处理技术提高测量系统的成象质童。 该类仪器常见的有用微通道板像增强器组成的 光子计数成像系统 ( m i c ， 英 国) ，由 三极微通道板像增强器作为光子计数成像探测器和四象限位置敏感器组 成的光子计数图象采集系统( p 工 a s ，日本) ，多阳极微通道阵列式 ( m a m a ) 光子计 数成像系统 ( 美国 ) ，利用高速数字自 处理器( d s p ) 实时探测光子坐标的光子计 数成像系统 ( 法国 ) 等。 这些测量系统的共同点是都采用像增强器作光电转换和 放大。光子坐标的探测方法分别采用了c c d 、四象限位置敏感器、多阳极阵列和 专用数字信号处理器等. 图1 . 2超弱发光图象探测系统结构简图 第一章绪论 参考文献: 1 李韶山 ， 朱延彬， 刘颂衰， 激光生 物学 报，1 9 9 8 年9 月， 7 ( 3 ) : 2 2 3 - 2 2 5 . 2 朱延彬，王孝力， 光电子 激光，1 9 9 ， 年4 月， 8 ( 2 ) : 6 7 - 7 1 . 3 沈 询 等， 生 物系 统 超 弱 发 光的 探 测: 绿 豆， 大鼠 血 液 和3 t 3 细 胞的 发 光 j 生 物 物 理 学报，1 9 8 8 , 4 ( 2 ) :9 8 - 1 0 3 . 4 毛大 璋， 沈询， 张月 敬等， 代谢 抑制 剂对 萌发 绿豆超弱发 光的 影响 j ) ， 生 物物理学 报， 1 9 8 8 , 4 ( 2 ) : 1 1 6 - 1 2 0 . 5 陆治国 等， 激 光杂志，1 9 9 5 , 1 6 ( 5 ) : 2 0 7 - 2 0 8 . 6 陈汝民 等， 应 用激光，1 9 9 5 , 1 5 ( 5 ) : 1 9 3 - 1 9 6 . 7 池旭生等， 生 物物理学 报， 1 9 9 4 , 1 0 ( 1 ) :1 6 5 - 1 6 8 . 8 顾樵， i子电 子学，1 9 8 8 , 5 ( 2 ) : 9 7 - 1 0 8 . 9 胡 天喜， 生 物化学与生 物物理进展，1 9 8 8 , 1 5 ( 1 ) :1 8 - 2 2 . . i 0 马 玉 琴等，生 物物 理学报，1 9 9 0 , 6 ( 2 ) :1 5 9 - 1 6 3 . 川 陈有 君， 生 物物理 学报，1 9 9 3 , 9 ( 4 ) : 6 7 3 - 6 7 6 . 1 2 1 王 维 江， 韩 俊 英， 广东 工 业 大 学 学 报， 2 0 0 0 , 1 7 ( 1 ) : 4 9 - 5 4 . 1 3 1 胡 天 喜， 陈 祀， 陈克明 等， 发 光分 析与医学， 上 海: 华东 师范大学出 版 社，1 9 9 0 , 4 8 . 1 4 w r ig h t j r , r u m b a u g h r c , c o lb y h d , e t a l. t h e r d la t io n s h ip b e t w e e n c h e m i lu m i n e s c e n c e a n d l i p i d p e r o x i d a t i o n i n r a t h e p a t i c m i c r o s o m e s j . a r c h i v e s o f b i o c h e m i s t ry a n d b i o p h y s i c s , 1 9 7 9 , 2 : 3 4 4 - 3 5 1 . 1 5 n a g l w p o p p f a . p h y s i c a l ( e l e c tr o m a g n e t i c ) m o d e l o f d i ff e r e n t i a t i o n 1 . b a s i c c o n s i d e r a t i o n j . c y t o b i o s , 1 9 8 3 , 3 7 :4 5 - 6 2 . 1 6 p o p p f a . b i o p h o t o n e m i s s i o n j . e x p e r i e n t i a , 1 9 8 8 , 4 4 ( 7 ) : 5 4 3 - 5 4 4 . 1 7 马 玉 琴， 于明 珠， 张月 敬等. 电离 辐射对活细 胞超弱发光的 影响 j 。 生 物物 理学 报， 1 9 8 8 , 4 ( 3 ) :2 1 5 - 2 2 0 . 1 8 1 沈沏， 生命科学中的 物理问 题讲 座 j ， 物理，1 9 9 5 , 2 4 ( 3 ) : 1 6 6 - 1 7 1 . 1 9 1 p o p p f a , g u q , l i k h . b i o p h o t o n e m i s s i o n : e x p e r i m e n t a l b a c k g r o u n d and t h e o r e t i c a l a p p r o a c h e s ( j . m o d e rn p h y s i c s l e tt e r s b , 1 9 9 4 , 8 ( 2 1 被放大的光电子群集中到光电 倍增管的阴极， 成为达到一定强度的电流输出。 倍增管输出的 信号电 流经光子计数器的前置放大器进一步放大， 进入光子计数 器，从而形成光子计数，得到生物光信息。 目 前，对生物超弱发光的研究更加广泛，研究涉及医学、农业科学、食品 科学、 环境科学 等许多 领域， 研究 工作在很大 程度上取决 于 探测仪 器的 进展w 为了更好的对生物超弱发光现象进行深入的研究， 我们利用现有的先进探测器件 设计建造了一套光诱导生物超弱发光探测分析仪。由于生物超弱发光的 特殊性， 在进行仪器设计的时候遵循了以下几条原则: ( 1 )采用光诱导生物发光的方式来增强生物超弱发光的强度。 ( 2 )最大限 度的将生物超弱光收集到探测器的 信号接收端. ( 3 )信号光收集系统采用暗箱设计， 避免一切干扰光。 ( 4 )选用高性能的器件， 如: 光电 倍增管、 多通道光子计数器、 信号线等。 ( 5 )对系统进行电磁屏蔽，提高信号的性噪比。 对 于 生 物 超 弱 发 光的 检 测 必 须 使 用光电 倍 增 管. 从 结 构 和方 法 来 看， 现代 发 展起来的应用光电倍增管的检测方法主要有四种:( 1 ) 测量输出光电流的d c 法; ( 2 ) 测量输出电流中交流成分的a c 法;( 3 ) 单光子计数( s p c ) 法;( 4 ) 同步的单光 子计数( s s d c ) 法。根据 i n a b a 的理论分析，a c 法较d c 法信噪比高三倍，s p c 法 在弱信号下又比a c法优越，而s s d c 法比s p c 法更灵敏。因此，s s d c 法是迄今 为止最灵敏的 检测方法2 ) 。 图2 . 1 为 我们研制的高灵敏度同 步化单光子计数光诱 导生物超弱发光探测分析仪的结构简图。 该系统最小可探测的光子流强度可达到 0 .0 2 个光子/ s . m m 2 . 第二章 光诱导生物超弱发光探测系统的结构及特性 外 雌集 母 a m k r jr i j - * n ; 育珍镜 舍暮制冷片 屏蔽 箱 it x ta 件-h礴11 49 目 14 暗箱 图2 . 1 光诱导生物超弱发光探测分析仪结构简图 本章的以下部分将分别对光诱导生物超弱发光探测系统各组成部分的设 计思想、器件特性等进行介绍. 互 2 . 1 光 源 系统所选用的诱导光源为日 本滨淞( h a m a m a t s u ) 公司生产的超静闪光佩灯 ( s u p e r - q u i e t x e n o n f l a s h l a m p s ) 及其配套电 源( 图2 . 2 ) 。 这种闪 光氛灯具有 从紫外经可见，到近红外的连续光谱( 图2 . 3 ) ;光输出非常稳定( 图2 . 5 ) ，使用 寿命长; 结构紧凑， 相对于连续低灯来说热辐射很小， 是一种理想的“ 白 光” 诱 导光源。 具 体 的 技 术 参 数 如 下: (3 1 名 称: 超 静闪 光 氨灯( s u p e r - q u i e t x e n o n f l a s h l a m p ) 型号:e 6 6 0 4 电弧尺寸:3 . 0 m m 闪光灯外形:平面型 封装材料: 硼硅酸盐玻璃( b o r o s i l i c a t e g l a s s ) 光谱范围:2 4 0 - 2 0 0 0 n m 电源电压:7 0 0 - 1 0 0 0 v ( d c ) 触发电压:5 - 7 k v 第二章光诱导生物超弱发光探测系统的结构及特性 最大平均功率:6 0 w 每个闪 光脉冲的 平均能童:2 j / f l a s h( 图2 . 4 ) 最大闪光频率:3 0 h z 光输出稳定性: f i t t e r t y p . 2 0 0 n s， 最大输出波动3 % 闪光寿命( 最短) :2 x 1 了次 a x z . r . . zd i a 1 + a . ， 一 6 , c -.i么or c 6 0 9 6 尸 心， 、 伊吧 ， 之， st 二 p%.13, c o o1 iy q丁 , . ox e七 .! 欲毖: 护 l a a n pi -. -. t . r i e 8 6 d ae c s袭夏 图2 . 2 闪光侃灯及配套电源 名称:闪光低灯电源( x e n o n f l a s h l a m p p o w e r s u p p l y ) 型号:c 6 0 9 6 高效稳定高压电 源输出: 3 0 0 - 1 0 0 0 v ( d c ) 可调， 建议在7 0 0 至1 0 0 0 v 范围内 使用 内置触发振荡器:闪光频率1 0 - 1 0 0 h z ，可调 外触发输入信号:5 v t t l 信号( 方波) 高压电源输出可由 外部电压控制:高压可调范围3 0 0 到1 0 0 0 v d c : 相应的控制电 压范围3 . 6 到1 0 . 6 v d c 电源外尺寸:1 0 8 ( w ) x 1 7 4 ( h ) x 4 9 ( 0 ) m m 重量:5 0 0 克 输入电压:2 4 v d c 士5 % s p e c t r a l d is t r i b u t io n f l a s h p u l s a wa v e f o r ms 图2 . 3 e 6 6 0 4闪光灯光诺分布 图2 . 4 e 6 6 0 4 闪 光脉冲波形 第 二 章 光 诱 导 生 物 超 弱 发 光 探 测 系 统 的 m 翅塑邀 t i t f l u c t u a t i o n o f f l a s h o u t p u t 图2 . 5 e 6 6 0 4 闪光灯输出稳定性 2 . 2 弱光收集系统 由于生物超弱发光的特性超弱， 在系统设计的时候采用了暗箱设计， 以 避免外界杂散光的干扰。系统的外形 犹如几个相互套在一起的圆柱形套 筒，各个套筒之间紧密配合，使内部 形成一个暗腔. 各部件均经过“ 发黑” 处理，有效的吸收了 杂散光， 使其干 扰降到最低。弱光收集系统的光路见 图2 . 6 。由 诱导光源产生的激发光经 准直透镜准直，然后经过会聚透镜聚 焦在样品上。生物样品由于受到诱导 光的激发而发射出微弱的生物光， 发 光范围为2 : 立体角。 羔 x w, r 图2 . 6 弱光收集系统的光路图 生物信号光经椭球镜在接近 2 二 立 体角的范围内反射式收集，并且会聚到快门上。由快门通光孔出射的信号光经 过凸透镜的会聚， 在光电 倍增管的光阴极上成像为(b 6 m m 的光点， 从而使倍增管 得到输入信号。 1 .弱光收集系统组成 ( 1 ) 活动样品架 如何设计一个可以活动的样品架， 使其即方便操作， 又最大限度的减少对诱 导生物弱光的遮挡，是设计中的一个重点.由于实验中涉及到的样品种类很多， 第二幸 光诱 导 生物 超弱 发光探测系统的结 构及 特性 2 . 4 信号采集、处理系统 光电倍增管阳极输出的信号通过数据线输入到信号采集、处理系统中。生 物弱光探测系统的信号 采集、处理系统包括: 前置放大器、多通道计数/ 平均器 和计算机等几部分. 1 、前里放大器1. 1 计数器前方为s r s ( s t a n f o r d r e s e a r c h s y s t e m s ) 公司生产的s r 4 4 5 型， 3 0 0 m h z 直流放大器。 s r 4 4 5 型直流放大器上升时间短， 噪声低， 直流性好， 是快响光电倍增管理 想的输出放大器.此前置放大器有四组相互独立的宽带直流放大通道，每组通 道可以 单独使用， 也可以 相互组合使用。 s r 4 4 5 能 够提供5 , 2 5 和1 2 5 三种放大 倍数: 组合使用的通道个数放大倍数最大输入电压 1 5 2 0 0 mv 2 2 54 0 mv 3 1 2 58 mv s r 4 4 5 型直流放大器性能参数: i n p u t s o u t p u t s v o l t a g e g a i n b a n d w i d t h r i s e / f a l l t i m e p r o p a g a t i o n t i m e r e c o v e r y t i m e o p e r a t i n g r a n g e o v e r s h o o t n o i s e 5 0 o h m i m p e d a n c e , d c c o u p l e d , b n c c o n n e c t o r s ( c h a n n e l 1 s e l e c t a b l e 5 0 o r 5 0 0 o h m ) . d c c o u p l e