（应用化学专业论文）纳米生物反应器的构筑及其反应动力学的研究.pdf

北京化工大学硕士学位论义 纳米生物反应器的构筑及其反应动力学的研究 摘要 本文以s b a 1 5 为固定化酶载体，利用s b a 1 5 的较大孔径以及和酶 之间的较弱相互作用，构筑了不同几何微环境和化学微环境的纳米结构生 物反应器。从动力学的角度，对反应器的结构设计及其反应行为展开研究。 一、合成不同孔径的s b a 1 5 ，并以其为载体固定猪胰脂肪酶( p p l ) ， 构筑不同孔径的纳米生物反应器，考察纳米结构孔道内酶催化水解反应过 程的内扩散限制效应。发现：在外扩散限制可以忽略的情况下，随s b a 一1 5 孔径的减小，内扩散限制作用越来越明显。当r 1 0 ：9 n m ，内扩散限 制作用可以忽略，反应过程为反应速率控制。 二、分别以三种硅烷偶联剂y 一( 甲基丙烯酰氧基) 丙基三甲氧基硅 烷、癸基三甲氧基硅烷和二异丙基二甲氧基硅烷对s b a 1 5 表面性质进行 进行合成后接枝，通过y - ( 甲基丙烯酰氧基) 丙基( m a ) 、癸基( d e ) * 1 1 二异丙基口d ) 官能团的引入调变纳米生物反应器的表面性质，考察不同 化学微环境对纳米生物反应器动力学行为的影响，并初步探讨脂肪酶催化 水解机理。结果发现，两亲性的i m e s b a 1 5 - p d 的催化能力最强，亲油 性的i m e s b a 一1 5 一d e 次之，而弱亲水性的i m e s b a 一1 5 - m a 的较低。 三、在本实验室前期工作的基础上，对s b a 一1 5 固定化酶进行孔口缩 口构筑仿生纳米生物反应器。动力学研究发现仿生纳米乍物反应器不仅可 北京化工大学硕士学位论文 以有效阻止孔道内的固定化p p l 分子的流失，且未加剧扩散限制，允许 底物和产物分子传质，很好的模拟了酶在细胞中的微环境。 关键词：纳米生物反应器，动力学，s b a 1 5 ，酶，内扩散，表面性质 北京化工大学硕士学位论文 t h ef o r m a t i o na n dt h ek l n e t i c so ft h e n a n o r e a c t o r s a b s t r a c t t h i sd i s s e r t a t i o nf o c u s e so nt h ef o r m a t i o na n dk i n e t i c so fn a n o r e a c t o r s b a s e do nt h es b a 15 m e s o p o r o u sm a t e r i a l sa n dp o r c i n ep a n c r e a t i cl i p a s e ( p p l ) ，u t i l i z i n gt h eh y d r o l y s i sa c t i o no f o l i v eo i la st h em o d e la c t i o n 1 t h ep o r ed i a m e t e ro ft h es b a - 15a sh o s t sf o re n z y m ei m m o b i l i z a t i o n h a ss i g n i f i c a n te f f e c t so nt h ei n t e r n a ld i f f u s i o nu n d e ran e g l i g i b l ee x t e r n a l d i f f u s i o nr e s i s t a n c ec o n d i t i o n t h eg e n e r a lp r o b l e mo fs u b s t r a t et r a n s p o r ti n n a n o m e t e rc o n f i n e m e n t si si n v o l v e d a ts m a l l e rp o r es i z e ( 尺 1 0 9n n l ) 2 s b a 一15h o s t sw e r eg r a f t e dw i t ht h r e ek i n d so ff u n c t i o n a l a l k o x y s i l a n e s ( p d ，m aa n dd e ) a n dt h ed e r i v a t e sw e r ee m p l o y e d a st h eh o s t s o fi m m o b i l i z e d e n z y m e s t h e n a n o r e a c t o r g r a f t e db y p de x h i b i t s a m p h i p h i l i c i t y , h e n c eh i g h e s ta c t i v i t ya n df a c i l ea c c e s s i b i l i t yo f1 - 1 2 0 a n d i i i 北京化工大学硕士学位论文 i n s o l u b l es u b s t r a t et ot h ei m m o b i l i z e dp p l t h en a n o r e a c t o rg r a f t e db yd e s h o w sh y d r o p h o b i c i t y , w h i c hf a v o r st h ea c c e s s i b i l i t yo fi n s o l u b l es u b s t r a t et o t h ei m m o b i l i z e dp p l a n dl o w e ra c t i v i t y t h en a n o r e a c t o rg r a f t e d b ym a d i s p l a y sw e a kh y d r o p h i l i c i t ya n dl o w e s ta c t i v i t y 3 t h es b a 15 e n t r a p p i n gp p li sg r a f t e db ym af i r s t l ya n dt h e n f o l l o w e db yp o l y m e r i z a t i o no ft h ef r e em a ，t os h r i n kt h ep o r eo p e n i n g s t h e s t u d yo fk i n e t i c sa n da c t i v i t yf o u n dt h a tt h es h r i n k a g em a k e sn om o r es e v e r e l i m i t a t i o no nt h ed i f f u s i o n o f t h es u b s t r a t ea n dp r o d u c tm o l e c u l e s k e yw o r d s ：n a n o r e a c t o r , k i n e t i c s ，s b a 一1 5 ，l i p a s e ，i n t e r n a ld i f f u s i o n ， s u r f a c ep r o p e r t y 北京化工大学硕士学位论文 符号说明 颗粒的比表面积 孔道内的底物浓度 颗粒外表面的底物浓度 底物初始浓度 内扩散有效系数 分子扩散系数 位阻因子 速率常数 本征米氏常数 表观米氏常数 孔道长度 纳米生物反应器的孔径 扩散分子的动力学直径 反应温度 本征最大反应速率 表观最大反应速率 实际有效反应速率 颗粒内无浓度梯度时的反应速率 固定化酶颗粒体积 沿扩散轴的距离 梯勒模数 有效因子 曲节因子 扩散分子直径与孔径之比 孔隙率 g忱日k k l rtvo。力，2。 北京化工大学硕士学位论文 1 1 酶的概述 第一章绪论 酶是生物为提高其生化反应效率而产生的生物催化剂，其化学本质为蛋白质，少 数酶同时含有少量的糖和脂肪。在生物体内，所有的反应均在酶的催化作用下完成， 几乎所有生物的生物现象都与酶的作用紧密联系。 1 1 1 酶结构特点 酶蛋白是由2 0 种氨基酸残基组成的生物大分子【j 】。2 0 种氨基酸结构类似，均为 l 一旺氨基酸，其中仪甘氨酸为非手性氨基酸。氨基酸间通过脱水形成酰胺键，在蛋白 质化学中又称肽键。肽键将氨基酸连接形成长链聚合物称为多肽链，链中的氨基酸称 为残基。酶蛋白可以是单链，也可以是由几条链组成的寡聚体。酶蛋白一般为球状蛋 白。 酶蛋白的一级结构：不同的蛋白质具有不同的氨基酸组成和排列顺序。蛋白质多 肽链中氨基酸残基的组成和排列顺序称为蛋白质的一级结构。许多酶蛋白的一级结构 已经确定，组成酶蛋白的多肽链一般由1 0 0 - 8 0 0 个氨基酸残基构成。 酶蛋白的二级结构：酶的二级结构单位主要是+ 螺旋、b 折叠片、d 一转角和无规 则卷曲四种。酶蛋白在一级结构的基础上进一步盘旋折叠，又以一定规则的氢键形成 0 l 螺旋、p 折叠层、p 转角和自由迎转等二级结构。氢键是维持二级结构稳定的主要 作用力。 酶蛋白的三级结构：这些二级结构单元进一步盘曲折叠，形成球状分子，即三级 结构。稳定酶蛋白的三级结构的主要作用力有氢键、盐键、疏水键、二硫键等，酶蛋 白中每条完整的肽链被称为亚基。 酶蛋白的四级结构：如果酶蛋白有四级结构，则必具有二条或更多条肽链。现有 已知的酶，除少数单体酶外，大多数酶是由多个亚基组成的寡聚体。球状分子表面以 疏水作用力、范德华力、盐键及氢键等非共价键互相联结起来，而成为完整的酶分子。 酶的活性中心：酶的活性中心是指酶蛋白分子中与催化有关的特定区域，它能与 底物结合并发挥催化作用。酶的活性中心一般位于酶分子的表面，具有特定的空间结 构，其中包括底物结合部位和催化部位。活性中心的空间结构是由整个酶蛋白质结构 所决定的，破坏了酶蛋白的整个结构，必然破坏酶的活性中心，从而使酶丧失催化活 性。因此酶蛋白活性中心阻外的其余部分不仅有维持结构的作用，同时还有保护微环 北京化工大学硕士学位论卫 境的作用。酶分子的亲水性强弱，整个分子的电性、电荷分布，以及活性中心周围的 环境都由整个酶蛋白的结构决定，这对于酶的催化特性具有重要意义。酶活性中心的 一些化学基团是酶发挥催化作用所必需的基团，故称为必需基团。对于单体酶而言， 一个分子中只有一个活性部位；含辅基的酶，辅基分子常常结合在这一区域，参与构 成活性部位的一部分。 酶构象的柔顺性：酶构象的柔顺性是指酶在溶液中具有较为柔顺的结构，能以多 种构象状态存在，在底物诱导下，构象改变为适宜于结合底物的状态。酶在结晶状态 时具有较大的刚性，但是有一些酶在晶状时也表现缓慢的催化活性。 1 1 2 酶催化特性 由于酶在常温常压的温和条件下具有高效的催化作用，并具有很高的专一性，许 多难以进行的有机化学反应在酶催化下都能顺利进行，且可以避免或减少副反应，因 而酶在工农业生产实践中蕴藏着巨大的潜力。世界范围内，每年食品、去垢剂、精细 化工和诊断瑙酶钧销售额达七亿美元，以骛为催化荆的新工业过程数量和酶的市场需 求量将持续增加。 作为生物催化剂的酶，它具有与一般无机物或低分子有机催化剂的共性：降低反 应的活化能，加快反应速率，不改变反应的方向和化学平衡关系，反应结束时本身不 消耗。但除此之外，酶作为生物催化剂还具有以下特性f 2 l ：( 1 ) 有较高的催化效率；( 2 ) 很强的催化专一性：3 ) 具有温和的反应条件；( 4 ) 酶催但是可调控的：如亨瘁割裁调节、 共价修饰调节、反馈调节、酶原激活及激素控制等。 1 1 3 酶催化反应机制 酶催化反应的机制有两种学说【3 l ，最早提出的是锁钥学说，在此基础上发展了诱 导学说。 ( 1 ) 锁钥学说：酶发生催化作用首先必须与底物接近，酶与底物形状互补，然后 通过两者间相互作用，形成各种非共价键或共价键，组成酶与底物的复合物。酶和底 物问的严格互补关系被比喻为锁与钥匙的关系，称为锁钥学说( 见图1 1 ) 。但是还有 些问题是这些学说所不能解释的：如果酶的活性中心是“锁与钥匙学说”中的锁，那 么，这种结构不可能既适合于可逆反应的底物，又适合于可逆反应的产物。而且，也 不能解释酶的专一性中的所有现象。 ( 2 ) 诱导学说：现代科学研究发现酶与底物结合时，伴随着酶分子构象的改变， 使酶分子中起催化作用的氨基酸残基处于适当的位置，同样底物分子的构象也发生相 2 北京化工大学硕士学位论文 应的变化。因此，k o s l l l a n d 提出酶分子与底物分子结合时是一个动态的诱导楔合过程， 各自构象的改变有利于酶与底物的结合，有利于酶发生催化作用，这种学说被称为诱 导学说f 见图1 2 ) 。事实上通过旋光测定，了解到许多酶在它们的催化循环中确有构象 的变化，特别是x 射线衍射分析发现未结合底物的自由羧肽酶与结合了甘氨酰酪氨酸 底物的羧肽酶，在构象上有很大的区别；溶菌酶的x 射线衍射分析了也得到类似的结 果，这些都是支持“诱导学说”假说的有力证明。 图1 1 酶与底物的“锁与钥匙关系” 学说示意图 f j g u r e1 一ls c h e m a t i ci 1 1 u s e s i f a t i o no f k e y l o c k h y p o 血e s i s 1 1 4 脂肪酶概述 图1 2 酶与底物的“诱导楔合” 假说示意图 f i g u r el - 2s c h e m a t i ci l l u s e s t r a t i o no f h y p o t h e s i s i n d u c e d w e d g eh y p o m e s i s 酶的种类很多，根据酶催化的反应类型，1 9 6 1 年国际生物化学联合会酶学委员会 将酶分为六大类：氧化还原酶( o x i d o r e d u c t a s e ，e c1 _ x x x ) ，转移酶( 恤n s f b m s e ，e c2 x x x ) ， 水解酶( h y d r o l 嬲e ，e c3 x x x ) ，裂合酶( 1 y a s e ，e c4 x x x ) ，异构酶( i s o m e r a s e ，e c5 x x x ) 和连接酶( 1 i g a s e ，e c6 x x x ) 。 在众多的酶中，氧化还原酶、水解酶在光学活性药物合成中的应用尤其突出。脂 肪酶是水解酶，在生物催化反应中，有3 0 以上的研究涉及到脂肪酶【4 ”，这类酶在 手性技术中正发挥着越来越重要的作用。由于酶催化反应的高效性、高立体选择性及 温和的反应条件使得酶催化拆分法可用于某些用一般方法难以拆分的手性化合物。以 脂肪酶为手性拆分催化荆，具有价格低廉、不需辅酶、拆分反应操作简便、拆分效率 和立体选择性高等特点，已成功地用于光学活性药物及其合成子的制备。所以在本论 文的研究中，首先选择了脂肪酶作为纳米生物反应器的研究对象。 1 1 4 1 脂肪酶结构特点 大多数脂肪酶是单体酶，它们通常由条肽链组成，一般不需要辅因子。尽管各 汐 c 一 ，拶 北京化工大学硕士学位论文 种不同来源的脂肪酶在结构上有不同特点，但基本结构及活性中心结构是相似的【8 l 。 a 专l 基酸 图l 一3 氨基酸的结构 f i g u r el oc o n 五g i l f a t i o no f 锄i n o i d 不变部分 可变部分 组成脂肪酶的2 0 种基本氨基酸分别是甘氨酸( g 1 y c i n e ) 、丙氨酸( a l a i l i n e ) 、缬 氨酸( 、，a l i n e ) 、亮氨酸( l e u c i n e ) 、异亮氨酸( i l e u c i n e ) 、脯氨酸( p 南l i n e ) 、甲硫氨 酸( m e t h i o n i n e ) 、半胱氨酸( c y s t e i n e ) 、苯丙氨酸( p 1 1 e n y l a l a l l i n e ) 、酪氨酸( t 扣o s i n e ) 、 色氨酸( t r y t o p h a l l ) 、精氨酸( a 唱i n i n e ) 、赖氨酸 ( l y s i n e ) 、组氨酸( h s t i d i n c ) 、 天冬氨酸( a s 口a n a t e ) 、谷氨酸( g l u t 啪a t e ) 、丝氨酸( s e r i n e ) 、苏氨酸( n 嘴o n i n e ) 、 天冬酰胺( a s p a r a g i n e ) 、谷酰胺( g l u t 锄i n e ) ，除甘氨酸和脯氨酸外，其他均具有 一样的结构通式( 图1 3 ) 。 1 14 2 脂肪酶界面活化原理 脂肪酶的特点是在不溶性的疏水底物反应中活性比较高，这一特点对发生在含不 溶性底物和水相界面上的反应机理具有至关重要的作用。脂肪酶被它的非极性底物活 化，这一现象称作脂肪酶的界面活化p 。1 q 。 脂肪酶的界面活化现象是1 9 3 6 年由h o l 、v e r d a 等最早观察到的，接着在1 9 4 5 年 s c h o n h e y d e r 和v o i q v a r t z 也发现了这一现象。多年来人们一直在讨论关于界面活化的基 本结构背景。d e s n u e l l e 等推测脂肪酶分子吸附在界面阱后发生了构象变化。 b r o c k e r h o f f 和j a i l s e n 则提出了所谓的底物理论，这一理论强调了油一水界面上底物的状 态和浓度的重要作用。1 9 9 0 年，两种脂肪酶的三维结构被首次描述，确认了早期理论 的合理性，从而解释了脂肪酶的界面活化现象。如人胰脂肪酶( h p l ) 的表面有一个 螺旋结构，也就是通常所说的盖子覆盖了酶的活性中心，使得活性中心无法暴露于溶 剂中，而这个螺旋结构只有在油水界面才会发生构象变化。后来脂肪酶结构的进一步 研究发现，除了个别的几种脂肪酶，其他所有为人知的脂肪酶都有一个螺旋结构的多 肽区域覆盖在酶分子的活性中心。这个区域被称为“盖子”( “l i d ”) 。盖子上有一个色 氨酸残基的侧链插入活性部位，此盖了足双亲性的，内表面由于存在色氨酸而体现为 疏水性，能和活性中心周围的疏水性残基相互作用，盖子暴露在外的部分则是亲水性 北京化工大学硕士学位论文 的，通过氢键与外面的一些水分子发生作用。只有当脂肪酶接触到水油界面时，这个 短的螺旋片断( 盖子) 才会折回，此盖子向后翻卷进入一个亲水性的沟，暴露出酶 的活性中心和盖子的疏水性表面，产生了一个大的疏水性区域，这时的酶处于活化状 态，对底物进行催化反应。当缺少这样的界面时，酶的活性部位被盖子保护起来，阻 止了底物同酶催化活性中心的接触。因此对于脂肪酶的水解反应，水一油界面的形成是 关键。g r o c h u l s k i 等发现c r u g o s a 脂肪酶在低的离子强度的溶剂中，酶分子的空间构象 以开放的形式存在。脂肪酶对水溶性的底物表现出比较低的酶活力，因为这时盖子盖 住了他们的活性中心。当水不溶性底物与脂肪酶分子接触时，酶分子发生了构象变化， 在这种作用的诱导下，盖子不再覆盖在活性中心处，脂肪酶呈现一种半敞开的结构 ( “o p e ns t m c t i l r e ”) ，从而使得底物更易接近催化中心，发生界面活化作用，酶活性提 高。 但自从发现假单胞菌脂肪酶( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 虽然有螺旋结构的盖子， 却不会发生界面活化，人们意识到界面活化远比想象的复杂。此外，葡萄状球菌脂肪 酶( s t 印h y l o c o c c u sh y i c u s ) 也只对一部份不溶性底物活化。目前，关于界面活化机 理还在进一步研究中。 图1 - 4 脂肪酶的界面活化示意图 f 逛；l l ml 一4o p e na n dc l o s e dc o n f o 】1 i l 鲥0 n so f t l l e 】i p a s e 4 3 脂肪酶的应用 脂肪酶原指甘油酯水解酶，以其来源广、催化功能多以及催化底物广泛( 酯、酸、 醇、酸酐、酰胺等都可以成为它的底物) 的优势使其成为生物技术及有机合成方面应用 北京化工大学硕士学位论文 最广泛的一类酶，广泛应用于油脂、食品、香料、化妆晶、医药、农药等有机合成领 域中。 ( 1 1 水解反应【1 7 】 水解反应是指脂肪酶催化脂肪或水解为其组分脂肪酸和甘油或醇。利用脂肪酶 水解油腊的能力可获得重要的轻化工原料脂肪酸和甘油。用于这种目的的脂肪酶包括 来自c a n d i d an l g o s a ，p s e u d o m o 玎a s hu o r e s c en 和蓖麻种子( c a s t o r b e a n ) 等的脂肪酶。水 解的底物包括各种植物油如大豆油、蓖麻油、橄榄油等和动物油如牛脂、羊脂和鱼油 及其酯类。如由蓖麻油( c a s t o ro i l ) 水解生产蓖麻酸，由于脱水、内酯化等副反应它不能 用传统的蒸气裂解方法由蓖麻油生产，但用来自蓖麻种子的脂肪酶水解蓖麻油，则可 避免这些弊端，该工艺已实现商业化生产。除墨组分中加入2 0 0 u 的p s e u d o m o n a s 脂肪 酶可使油脂水解，纸的白度从5 6 提高到5 8 。 ( 2 ) 合成反应 目前，关于脂肪酶的催化合成反应方面的应用的注意力主要集中在不对称合成和 酯交换。 不对称合成是绿色化学的重要组成部分i l 引。目前，用于拆分外消旋化合物的酶多 数是水解酶，而且绝大多数为脂肪酶。手性化合物在人们生活中具有重要作用，目前 绝大多数化学合成药物都是以外消旋混合物形式生产销售。实际上，其药物作用包括 酶的抑制、膜的传递、受体结合等，均和药物的立体构型有关。此外，只含单一对映 体的各类手性物质势必极大地减少其对环境的污染，这也是环保方面所提出的重要课 题。因此，光学活性化合物的制备已成为众人注目的焦点，世界各国许多著名大学和 研究机构纷纷致力于该领域的研究。与传统的化学方法相比，酶催化拆分外消旋化合 物具有反应条件温和、节省能源、专一性强、副反应少、产品纯度高、反应步骤简单、 不需手性源、产品成本低等优点。与微生物法相比，酶法反应时间短、条件易控制、 产品纯度高。随着非水介质酶学的发展，为解决外消旋化合物的拆分，特别是外消旋 醇的拆分这一难题带来了希望。o l i v e r 等用假丝酵母脂肪酶( c 蛐d i d aa n t a r c t i c a ) 手性合 成了( s ) _ d a p o x e t i n e ，产率近1 0 0 。 利用1 ，3 一定向脂肪酶催化油脂进行定向酯交换的特性，有实际意义的应用是利用 廉价油脂经过改性而生产珍贵油脂，目前在油脂工业上研究最多也最有研究价值的类 可可脂和生物柴油的生产。近年来，随着石油资源的逐渐枯竭和公众环保意识的增强， 可再生的绿色环保型燃料一生物柴油，受到了许多国家的重视。生物柴油，即动植物 油脂与低碳醇进行醋交换反应所生成的脂肪酸低碳醇醋，具有良好的燃料特性、含硫 量低，可替代矿物柴油作为内燃机的燃料。生物柴油主要是在催化剂作用下通过醋交 换反应来制备。反应使用的催化剂可以是酸、碱或酶。相较酸碱催化剂，酶法合成生 物柴油具有反应条件温和、醇用量小、后处理简单、无污染物排放等优点，而且原料 6 北京化工大学硕士学位论文 油中的自由脂肪酸能完全转化成甲醋。尤其是采用固定化酶，反应结束后酶易回收， 可多次循环利用，大大降低了生产成本，显示出良好的应用前景。n o u 硎d i n i 等用溶 胶一凝胶固定化假单胞菌脂肪酶( p s e u d o n l o i a sc e p a c i a ) 将大豆油改性为生物柴油，1 小时 可得6 7 的产率。 1 1 5 酶制剂中存在的问题 酶的催化优点大大促进了人们对酶技术的研究和开发，使酶在各个领域中的应用 越来越广。但是，由于酶是生物体根据自身需要面产生的，它们在实际应用中还有很 大限制。其原因有【1 9 】：( 1 ) 由于有些酶的提取纯化繁琐，所以它们的价格十分昂贵； ( 2 ) 反应后的酶无法回收再利用，只能采取分批法生产手段，不能实现连续化操作， 且由于产物中酶的残留，造成提纯工艺复杂，降低了产品的性能；( 3 ) 大量的氧化还 原酶、转氨酶等需要等计量反应物的辅因子存在才能表现催化活性，从而限制了它们 在许多有机合成反应中的应用；( 4 ) 酶通常在水溶液中实施其催化活性，对于大多数 有机化学反应来说，使用的溶剂是非水溶性的有机溶剂；( 5 ) 酶对环境极敏感，易变 性与失活。体现在 a 在催化反应过程中，游离酶是水溶性的催化剂，容易发生微生物的降解或聚集 而失活； b 酶的稳定性一般较差，极端的p h 值、较高的温度和高盐浓度的反应体系都可 能使酶钝化，失去部分甚至大部分催化活性，有些酶即使在较合适的条件下 使用，也会很快失去活性； c 酶的化学本质是蛋白质，因而具有蛋白质的所有性质。其中容易变性的性质， 使得酶在应用时，常因变性而活力下降，甚至完全失去活力，即失活。酶的 变性多数为不可逆。引起变性的原因有物理因素及化学因素。物理因素包括 热、紫外线、x 射线、声波等；化学因素包括酸、碱、表面活性剂、重金属 盐等化学药品的影响。因而产生了诸如热变性、酸碱变性、氧化变性等，引 起酶的构象改变，而降低或失去活性。 所以丑前尽管已发现了上千种酶，但真正在工业生产上能够得到实际应用的不足 1 0 0 种。 怎样才能获得理想的生物催化剂? 如果能设计一种方法，将酶束缚于特殊的相， 使它与整体相( 或整体液体) 分隔开，但仍能进行底物和效应物( 激活剂或抑制剂) 的分子交换。这种固定化的酶可以像一般化学反应的固定化催化剂一样，既具有酶的 催化物性，又具有一般化学催化剂能回收、反复使用等优点，并且生产工艺可以连续 化、自动化。2 0 世纪5 0 年代发展起来的固定化技术j f 是基于这一目的发展起来的。 北京化工大学硕士学位论文 1 2 固定化酶概述 酶作为一种生物催化剂，一经发现就被人们广泛应用于在酿造、食品、医药等领 域。由于酶可以在常温、常压等温和条件下高效地催化反应，一些难以进行的化学反 应在酶的催化下能顺利地完成。酶的开发利用在2 0 世纪初得到了巨大的发展，但由于 酶的稳定性低，使用后难以回收，在实际应用中也就带来了很多问题，从而限制了酶 制剂产品的使用和开发。1 9 1 6 年n e l s o n 和g r i f n 【2 0 】发现了酶的固定化现象后，科学家 就开始了固定化酶的研究工作。1 9 6 9 年i z 】j 日本一家制药公司第一次将固定化的酞化氨 基酸水解酶用来从混合氨基酸中生产l 氨基酸，开辟了固定化酶工业化应用的新纪 元。 1 - 2 l 固定化酶概念 固定化酶最初是将水溶性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍生 物，所以曾叫过“水不溶酶”( w a t e r i n s o 】u b l ee n z y m p ) 和“固相酶”( s o l i d p h a s e e n z y m e ) 。 但是后来发现，也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤 膜一边，而反应产物可以透过膜逸出，在这种情况下，酶本身仍处于溶解状态，只不 过被固定在一个有限的空间内不能自由流动。因此，用水不溶酶或固相酶的名称就不 恰当了。在1 9 7 1 年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”( j n u n o b i l i z e d e n z y m e ) 的名称。它是通过物理或化学的方法使溶液酶转变为在一定的空间内其运动 受到完全约束、或受到局部约束的一种不溶于水，但仍能进行其特有的催化反应、并 可回收及重复使用的酶。它能以固相状态作用于底物进行催化反应。 1 2 2 固定化酶的优点 固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，具有以下优点副： ( 1 ) 在催化反应以后很容易从反应系统中分离出来，不仅固定化酶可以反复使用， 使酶的使用效率得到提高，使用成本降低，尤其适合于使用贵重酶 ( 2 ) 固定化酶极易与反应体系分离，可获得不被酶污染的、纯度较高的产物，简化 了提纯工艺，提高了产量和产品质量。 ( 3 ) 在大多数情况下，酶在固定化后稳定性得到较大提高，可较长期地使用或贮藏。 ( 4 ) 固定化酶有一定的形状和一定的机械强度，可以搅拌或装柱的方式作用于底物 溶液，使反应过程能够管道化、连续化和自动化。 ( 5 ) 酶的催化反应过程更易控制。如使用填充式反应器时，一旦底物不与酶接触， 北京化工大学硕士学位论文 即可使酶反应终止。 ( 6 ) 比可溶酶更适于多酶体系的使用，不仅可利用多酶体系中的协同效应使酶催化 反应速度大大提高，而且还可以控制反应按定顺序进行。 ( 7 ) 辅酶固定化和辅酶再生技术，使固定化酶和能量再生技术或氧化还原体系合并 使用，从而扩大其应用范围。 因此固定化酶在生产中的应用蜀渐增多，为酶催化的应用开辟了新的途径。固定 化酶在医药和食品等工业部门有着很大的实用价值。如用固定化氨基酸酰化酶生产 l 一氨基酸、固定化青霉素酰胺酶水解青霉素g 生产6 一氨基青霉烷酸、固定化葡萄糖异 构酶生产高果糖浆、固定化糖化酶生产葡萄糖等。 固定化酶的研究不仅具有重要的实际意义，而且还具有理论意义。酶促反应机理 的研究，是阐明生物体内各种复杂代谢过程及其调控的基础。研究固定化酶有助于了 解细胞的结构与功能。细胞内与呼吸链、蛋白质合成、主动运输及神经传导等重要物 理功能有关的酶都是天然的固定化酶，它们或者是在凝胶的环境中、或者是吸附在界 面上，或者是在线粒体一类的细胞器上发生作用。而至今为止的绝大多数的研究，都 是将酶从天然支持物( 如膜) 上分离下来，使它处于一种与天然细胞内不完全相同的状 态下进行的，所以不易得到完全符合于机体的认识。理想的方法是将酶结合到细胞中 的凝胶物质或天然酶等固相载体上，再来研究细胞的多酶体系，固定化酶为之提供了 一种良好的模型。 基于阱上原因，固定化酶技术的研究颇受关注，其应用也日益广泛。 1 2 3 酶固定化方法和常用载体 酶的催化反应取决于酶本身蛋白质分子所特有的高级结构和活性中心。酶的活性 中心是由一定的氨基酸残基所构成的。酶的固定化状态下发挥催化作用时，既需要保 证其高级结构，又要使括性中心的氨基酸残基不发生变化。因此，在制各固定化酶时， ( 1 ) 应避免活性中心的氨基酸残基参与固定化反应。( 2 ) 同时还应避免那些可能导致酶蛋 白高级结构破坏的条件，如高温、强酸、强碱、有机溶剂等处理，由于酶蛋白的高级 结构是凭借疏水键、氢键、盐键等较弱的键维持的，所以固定化时应采取尽可能温和 的条件。迄今为止，寻找合适的方法和载体是固定化酶研究的重要组成部分。 1 2 3 1 酶固定化方法 研究和应用的酶固定化方法一般可归纳为吸附法，共价结合法，交联法和包埋法 网大类陟26 1 。 吸附法是将酶分子吸附在水不溶性的载体上而使酶固定的方法。吸附的机理包括 北京化工大学硕士学位论文 有范德华力、离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。吸附酶分子的稳定性依赖于上 述多种相互作用在固定化条件下的加和强度以及在操作条件下保持的长久。一方面。， 吸附法具有操作简单、固定化条件温和，酶分子的空间结构不发生明显的变化，酶分 子活力不易丧失以及操作可逆性等优点；另一方面，吸附法制得的固定化酶的稳定性 受浴液p h 值、缓冲溶液类型、离子强度、温度、底物浓度影响较大，酶分子易脱落， 影响了吸附法的实用价值。 共价结合法是将酶分子的非必需基团经共价键与聚合物载体结合的方法。此法或 是将载体上有关的基团活化，然后与酶上的有关基团发生偶联反应；或是在载体上接 个双功能试剂，然后将酶偶联上去。共价结合法是至今为止研究最为深入的固定化方 法。此法的优点是酶与载体的结合较为牢固，酶不易脱落，用于大量生产及工业化较 为理想。但因反应条件较为苛亥0 ，可能会由于酶分子活性中心的官能团参与反应而使 酶分子活力降低或丧失，活力回收较低，一般在百分之三十左右。 交联法是使用双功能或多功能的试剂，使酶分子之间进行分子问交联形成交联网 架结构而得到固定化酶的方法。除了酶分子之间的交联外，还存在一定程度的分子内 交联。利用交联法制备的固定化酶可形成凝胶、膜等各种模式。但由于酶蛋白的功能 团，如氨基、酚基、巯基和咪唑基参与此反应，所以酶的活性中心构造可能受到影响， 而使酶显著的失活。而且所需酶量大，形成的酶的凝胶缺少刚性，难以在柱式反应器 中使用。 包埋法是将酶包埋在高聚物内，这样的结构可以防止蛋白质渗出于周围培养基 中，但是底物仍能渗入这格子与酶相接触。这样，酶分子本身不参加水不溶性格子的 形成，仅仅是被包围起来，因而在原理上而言，酶分子本身不发生物理化学变化，活 力丧失很小，所以适合于固定各种类型的酶。但也有局限性，只有小分子的底物和产 物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶是不合适的，高聚物网 格或半透性膜对小分子物质扩散的阻力导致固定化酶的动力学行为改变，活力降低。 而且，由于凝胶类物质两格空隙太小不一，也可能会使酶分子从高分子两格中溶去， 造成酶分子的流失，从而使得固定化酶的活力降低。 1 2 3 2 常用载体 从载体的组成来看，固定化酶所使用的载体可以分为高分子载体、无机载体和复 合载体口7 圳i 。 高分子载体可分为天然高分子载体材料和合成高分子载体材料。天然高分予材料 如结构性蛋白( 角质、胶原蛋白) 、球状蛋白以及碳水化合物出于原料比较易得，都 比较适合担当酶的载体材料。此类材料最大的特点是无毒性。传质性能好。近年研究 比较热门的栽体是壳聚糖和海藻酸等。合成高分子材料由于其化学、物理性能都有很 o 北京化工大学硕士学位论文 大改变性，从理论上来讲，可以担当任何一种酶的固定化载体，而且它们对微生物的 腐蚀有很强的抵抗力。另外，与天然高分子材料相比，合成高分子凝胶载体还具有强 度较大的优点。c h i o u 等研究了以壳聚糖载体固定化假丝酵母玫瑰酶的情况。研究结 果表明：采用碳化二亚酰胺活化后的壳聚糖微球固定化玫瑰酶具有很高的酶负载量， 同时也保持了单体酶很高的活性。 无机载体具有一些有机材料不具备的优点，如稳定性好、机械强度高、对微生物 无毒性、不易被微生物所分解、耐酸碱、成本低、寿命长等。常见的载体有玻璃、硅 凝胶、铝、斑脱土等。目前，无机载体加以修饰使之与酶和细胞结合的技术取得了重 大突破。在这方面，美国的u o p 公司以氧化铝为载体，德国的m i l e s 公司以二氧化硅为 载体植被固定化酶都取得了显著的成效。武汉大学的研究人员采用多孔二氧化硅珠固 定木瓜蛋白酶和脂酰基酶，在高温下酶的活力和稳定性有显著提高。固定化的脂酰基 酶在8 0 c 保温1 h 其酶活达到最高值，可比初始活力高约1 2 0 。近年来，随着介孔分 子筛制各技术的日臻成熟，人们正在尝试用其担当固定化酶的载体。与其他材料相比， 介孔分子筛规则的孔道、大的比表面据、极强的吸附性能、稳定的结构等特点，使其 具有担当固定化酶得天独厚的优势。 复合载体材料是以有机材料和无机材料复合组成的新载体材料，如磁性高分子微 球，它是一种内部含有磁性金属或金属氧化物的超细粉末从而具有磁响应性的高分子 微球，磁性高分子微球可以通过共聚、表面改性等化学方法在微球表面引入多种反应 性功能基团，也可以通过共价键来结合酶、细胞、抗体等生物活性物质，在外加磁场 的作用下，进行快速运动或分离，因而在生物工程、生物医学及细胞学等领域有着广 阔的应用前景。 1 2 4 固定化酶研究现状及发晨趋势 经过四十多年的研究和发展，酶固定化技术取得了长足的进步。它不仅在理研究 ( 如阐明酶作用机理) 上发挥独特作用，在实际应用尚也显示出强大威力。用这种技 术不仅能稳定酶、改变酶的专一性、提高酶活力，从而改善酶的种种特性，使之更符 合人类的要求，而且还能创造适应特殊要求的新酶。在酶的固定化方面，先后开发了 多种固定化方法和性能多样的载体材料。精巧设计的固定化生物催化剂反应器可实现 生产工艺的自动化操作，从而大大降低成本。固定化酶在食品、医药、化工和生物传 感器制造上都有成功的应用实例。然而，真正投入工业化应用的固定化酶却不多，原 因是多方面的。 ( 1 ) 某种固定化方法的成本核算将直接影响到实用。固定化成本包括酶、载体及 试剂的费用、制备的工艺费用及固定化效率等。在工业化生产中，酶的固定化效率低、 稳定性差、连续操作需要的设备比较复杂，无形中会增加固定化的成本，从而限制了 北京化工大学硕士学位论文 固定化酶的工业化发展。 ( 2 ) 生物催化剂不同于常规催化剂的最显著的特点之一就是其三维构象对微环境 的敏感性及其柔顺性。酶与底物接触进行催化反应的同时常需伴随其三维构象的改 变，因此其三维构象的柔顺性是影响其催化效率的重要因素之一，些固定化方法如 物理吸附法，对酶的三维构象柔顺性等无明显不良影响，因而可获得较高的固定化酶 活性，但由于酶三维构象的变换自由度与游离( 溶液) 酶相似，酶的稳定性难尽人意， 加之较弱的主客体相互作用，固定化酶很难具有理想的操作稳定性。其它一些固定化 方法如共价偶联等，由于酶的三维构象及其柔顺性受到限制，常伴随酶活性的大量丧 失。加之固定化载体有可能会触及到酶的活性敏感区，导致酶活的下降。因此，如何 获得具有理想的三维构象柔顺性的固定化酶体系一直是生物催化剂多相化研究中难 以解决的科学问题之。 ( 3 ) 随着固定化技术的发展，酶固定化过程不得不面对的另一科学问题是如何避 免酶微环境的改变，使酶更加稳定。这也是固定化细胞技术后来居上的原因之一。 由于存在这些不足，使固定化酶的大规模、大范围的应用受到了限制。目前，人们从 多方面改进固定化载体和固定化条件，以降低成本，使有更多的固定化酶得到工业规 模的应用。 酶固定化技术的核心问题是载体材料的制各与选择。用于酶固定化的载体，要求 一定的化学稳定性，能抵抗微生物及酸碱等作用，制备的固定化酶具有高的催化活性 和良好的稳定性。无机材料用于固定化酶的载体，负载的酶通过焙烧等简单处理就可 以除去，载体材料可以重复使用，因而可以在很大程度上降低了固定化酶的成本，同 时，也避免了使用过的固定化酶的闲置问题。a 1 2 0 3 ，s i 0 2 ，t i 0 2 等无机物已被用于固 定化p a ，甚至澎润土固定化青霉素酞化酶曾经用于工业化6 - a p a 的生产，但这些无机 载体制备的固定化酶，始终没有获得高的催化活性。造成活性偏低的主要原因是上述 的普通无机物在绝大多数情况下是微孔材料，在酶的固定化过程中，体积较大的酶分 子不能进入载体的孔内，因而载体结合的酶量少，固定化酶活性低。 酶的催化反应取决于酶本身蛋白质分子所特有的高级结构和活性中心。酶的活性 中心是由一定的氨基酸残基所构成的。酶在固定化状态下发挥催化作用时，既要保证 其高级结构的完整性，又要使活性中心的氨基酸残基不发生变化。因此，在制备固定 化酶时，应避免活性中心的氨基酸残基参与固定化反应。同时还要避免可能导致酶蛋 白高级结构破坏的固定化操作，如高温、强酸、强碱、有机溶剂的处理等。由于酶蛋 白的高级结构是依赖于疏水键、氢键、盐键等较弱的键维持的，所以固定化时应采取 尽可能温和的条件。迄今为止，寻找性能优良、价格便宜的载体和合适的固定化方法 仍是固定化酶研究的重要组成部分。优良的酶固定化载体应具备以。f 性能；( 1 ) 较好的 机械强度；( 2 ) 耐受化学物质或微生物的侵蚀：( 3 ) 具有合适的反应基团，或容易用物理或 北京化工大学硕士学位论文 化学方法进行衍生；( 4 ) 适当的亲水性和疏水性；( 5 ) 多孔性载体或网格松散的凝胶；( 6 ) 使 用后的载体最好能通过简单、经济的方法再生。 1 9 9 2 年，美国m o b i l 的科学家报道合成m 4 l s 【3 2 】系列硅基( s i l i c a b a s c d ) 介孔分子 筛，揭开了分子筛科学的新纪元。近年来，随着合成技术的不断创新，一系列介孔材 料及其金属杂原子衍生物不断见诸报道。介孑l 材料由于具有较大的比表面积和孔体 积，孔径均一且纳米尺寸可调，强吸附性能，表面易官能团化等特点，从而使介孔分 子筛孔道中生物大分子酶蛋白的组装，成为目前国际上介孔材料研究的热点之一。 近十年，研究者们通过调变介孔材料的颗粒形貌、孔道结构和或表面性质，改善 固定化酶的稳定性、活性以及固定化行为，并取得了一定的进展f 3 3 5 ”。如赵东元等1 3 8 用棒状的s b a - 1 5 为载体固定化溶解酵素( 1 y s o z y m e ，l y z ) ，最大的平衡吸附量可达 到5 0 0m g 。a c k e 珊a 1 1 等【37 】对介孔硅材料进行h o o c 和- n h 2 改性后，利用氢键作用 固定化酶，得到了2 0 0 的相对活性和较高的稳定性。目前酶在介孔材料孔道内的固定 化方法主要是共价结合法和物理吸附法，前种方法得到的固定化酶具有比较高的稳定 性，但是酶活相对较低，而后者则具有高的酶活回收率，但酶易流失且操作稳定性较 筹。 1 3 纳米结构生物反应器 利用介孔材料( 如s b a 一1 5 ) 较大的比表面积和纳米孔径以及酶与载体之间较弱的 相互作用，可以实现酶分子在其孔内表面的固定化，由于固定化载体较窄的孔径分布 和孔道结构的规整性，每一个纳米孔道都可看作是一个纳米生物反应器。( 如图1 5 所 示) 。 图1 5 纳米生物反应器的结构示意图 f i g u r e1 - 5s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no f n a n o r e a c t l ) s 在纳米生物反应器内，底物可与酶分子的活性部位接触发生催化反应，且底物和 北京化工大学硕士学位论文 产物可在反应器孔道内相对自由的传质。同时，这种纳米生物反应器还具有以下几点 优势： ( 1 ) 介孔材料主体的孔径大小可调，即酶分子所处的几何微环境可以调变，可实 现纳米限域空间对底物分子的“阱”效应； ( 2 ) 介孔材料主体的内j l 表