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硕士论文酒精中毒后的血液荧光光谱研究 摘要 本文以新西兰白兔灌注白酒制作成不同程度酒精中毒模型，用多功能光栅光谱仪 检测醉酒白兔血液的荧光光谱，进而从理论上分析和解释了荧光光谱峰产生的机制。 研究了波长为4 0 7 r i m 的非相干单色光激发严重酒精中毒的兔全血、红细胞混悬 液，其荧光光谱的检测结果表明：随着酒精中毒出现昏迷到生物体征逐渐恢复的过程 中，同一浓度的全血、红细胞溶液的荧光强度都发生了规律性的变化。分析认为酒精 中毒引起红细胞的体积增大，并增加了血液的粘度。前者能增加分子间碰撞几率，引 起荧光淬灭；而后者却能增加辐射跃迁的几率，使得荧光增强。在全血和红细胞溶液 中，荧光光谱的变化规律是两者共同作用的结果在同样方法和实验条件下得到了一 般酒精中毒兔全血、红细胞混悬液的荧光光谱，结果表明：从酒精中毒至慢慢恢复的 过程中，同一浓度的全血、红细胞溶液，其荧光强度的变化规律与严重酒精中毒时一 致，只是变化幅度较小。 研究了波长为4 0 7 r i m 的相干激光激发不同浓度的、严重酒精中毒的全血溶液的 荧光光谱，结果表明：酒精中毒后的全血荧光光谱的峰值、强度与溶液浓度间均有较 强的依赖关系，进而利用能量转移理论解释了其产生机制。 本文的研究结果可以为研究酒精中毒情况下生物体征的损伤和血液的破坏程度 以及能否恢复、血液中酒精含量的判定等提供实验和理论依据。 关键词：血液，酒精中毒，荧光光谱，荧光猝灭 硕士论文酒精中毒后的血液荧光光谱研究 a b s t r a c t b a s e do nt h ee x p e r i m e n t a lr e s e a r c ho nt h ea l c o h o l i s mm o d e l so fd i f f e r e n td e g r e e sb y m a k i n gn e wz e a l a n dr a b b i t sd r i n kd i s t i l l e ds p i r i ta n d t h et e s to nt h ef l u o r e s c e n c es p e c t r a o fd r u n kr a b b i t sw i t ht h em u l t i f u n c t i o n a l g r a t i n gs p e c t r ai n s t r u m e n t , t h e a r t i c l e t h e o r e t i c a l l ya n a l y z e sa n de x p l a i n e dt h es y s t e mw h y t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ap e a kc o m e s i n t ob e i n g t h r o u g ht h ee x p e r i m e n t so nt h es e r i o u se x a n i m a t i o na l c o h o l i s mb l o o do f f l u o r e s c e n c e s p e c t r ao f w h o l eb l o o da n de r y t h r o c y t ei n d u c e db y 4 0 7 n mx el a m p ，i ti ss h o w nt h a td u r i n g t h ec o u r s ew h e nr a b b i t sc h a n g ef r o mu n c o m c i o u ss t a t et oc o n s c i o u ss t a t e ，t h ei n t e n s i t yo f a l c o h o l i s mb l o o do ff l u o r e s c e n c es p e c t r ao fw h o l eb l o o da n de r y t h r o c y t eo ft h es a m e c o n c e n t r a t i o nc h a n g e sr e g u l a r l y hi sc o n s i d e r e dt h a tt h ea l c o h o l i s mc a u s e st h ee n l a r g i n go f t h ev o l u m eo fe r y t h r o c y t e 勰w e l la st h ei n c r e a s eo fv i s c i d i t yt ob l o o d 1 1 硷f o r m e rc a n i n c r e a s et h ep r o b a b i l i t yo ft h ec o l l i s i o n sb e t w e e nt h eb l o o dc e l l s ，a n dt h u sc a u s e st h e f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g ；w h i l et h el a t t e re a e ti n c r e a s et h ep r o b a b i l i t yo ft h ec h a n g eo f r a d i a t i o n , a n dc o n s e q u e n t l yi n c r e a s e st h es p e c t r a b o t ho ft h c mc o n t r i b u t et ot h ec h a n g i n g r u l e so ft h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ai nt h em i x t u r eo fw h o l eb l o o da n de r y t h r o c y t e w i t ht h e s a m em e t h o da n du n d e rt h es 锄ec o n d i t i o n , w eg e tt h eb i b u l o s i t y a l c o h o l i s mb l o o do f f l u o r e s c e n c es p e c t r ao f w h o l eb l o o da n de r y t h r o c y t e i ti sd i s c o v e r e dt h a td u r i n gt h ec o u r s e w h e nr a b b i t sc h a n g ef r o mu n c o n s c i o u ss t a t et oc o n s c i o u ss t a t e , i nt h ew h o l eb l o o da n d e r y t h r o c y t eo ft h es a l n ec o n c e n t r a t i o n , t h ec h a n g i n gr u l e so ft h e i rs p e c t r ai n t e n s i t , a r et h e s a m ea st h eo n e si n 也es e r i o u se x a n i m a t i o na l c o h o l i s m , b u to n l yw i t has m a l lr a n g e t h r o u g ht h ee x p e r i m e n t o nt h es e r i o u se x a n h a a t i o na l c o h o l i s mb l o o do ft h e f l u o r e s c e n c es p e c t r ao fw h o l eb l o o do fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o ni n d a c e db y4 0 7 n ml a s e r i n s t r u c t i o n , i ti sp r e s e n t e dt h a tt h ei n t e n s i t yo f a l c o h o l i s mb l o o do ff l u o r e s c e n c es p e c l r ao f w h o l eb l o o dd e p e n d ss t r o n g l yo nt h ep e a ka n dt h ec o n c e n t r a t i o na n dw i l le a n s et h e r e d - s h i f t e ds p e c t r a lp e a k s f u r t h e r m o r e , t h ea r t i c l ee x p l a i n st h e o r e t i c a l l yt h es y s t e mw h yi t h a p p e n sa c c o r d i n gt o t h et h e o r yo f e n e r g yt r a n s f e r t h er e s e a r c hc o n s e q u e n c e sm a yo f f e rat h e o r e t i c a la n de x p e r i m e n t a lr e f e r e n c et o j u d g eh o ws e r i o u s l yt h ec r e a t u r ei s 蝎u r e da n dt h eb l o o di sd e s t r o y e dw h e ns u f f e r i n g a l c o h o f i s m b e s i d e s i tc a na l s oh e l pt od e c i d et h ec o n t e n to f a l c o h o li nb l o o da n dw h e t h e r t h e yc a nr 吐n r l lt on o r m a l k e yw o r d s ：b l o o d , a l c o h o l i s m , f l u o r e s c e n c es p e c t r a , f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本 学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或 公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使 用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均已在论文 中作了明确的说明。 研究生签名：苤互：童2 。6 年5 月日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或 上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送交并 授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对于保密 论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：叠丛錾2 0 0 6 年5 月日 硕士论文 酒精中毒后的血液荧光光谱研究 1 血液光谱学的研究现状 1 1 荧光光谱分析技术 荧光( f l u o r e s c e n c e ) 通常是指分子吸收电磁波后，从其最低激发态重新发射紫外 光或可见光的现象。把所发射的荧光中不同波长分别加以测量的技术称为荧光光谱分 析法。 荧光光谱分析法自建立以来，就受到了人们的广泛重视。荧光光谱分析作为一种 高灵敏度的测试方法，在生物化学、医学、工业和化学研究中的应用【l ，2 川与日俱增。 目前荧光分析法已经成为有机分析化学、光子生物医学等领域的重要研究手段【4 】。 荧光光谱分析的特点 ( 1 ) 灵敏度高 荧光光谱分析的最大特点是灵敏度高。与常用的分光光度法比较，荧光是从入射 光的垂直方向检测，即在黑背景下检测荧光的发射，而分光光度法是在入射光的同方 向检测，即在亮背景下检测暗线。因此一般荧光分析的灵敏度要比分光光度法高2 q 个数量级。例如，对容易致癌的3 、仁苯并芘的测定，采用分光光度法，可检测到 1 0 西数量级；但采用荧光法可以达到1 0 母数量级。 ( 2 ) 选择性强 荧光光谱包括激发光谱和发射光谱。所以荧光法既能依据特征发射，又可按照特 征吸收，亦即可依激发光谱来鉴定物质。假如某几种物质的发射光谱相似，可从激发 光谱差异来区分它们。例如3 、仁苯并芘与苯并( k ) 荧蒽，二者的发射峰很相近， 只差2 6 n m ，且峰的数目相等，但可用扫描激发光谱的办法，将其区分。若其吸收谱 相同，则可用发射谱将其区别。例如酪氨酸和色氨酸，它们的吸收峰虽相近，但在紫 外光照射下，酷氨酸的发射峰为3 0 3 r i m ，色氨酸的发射峰为3 4 8 n m ，可利用发射峰将 其分开。因此，与只能得到待测物质的特征吸收光谱的分光光度法相比，在鉴定物质 时，荧光法选择性更强。 ( 3 ) 样品用量少及方法简便 由于灵敏度高，所以可减少样品用量。特别在使用微量池时，只需1 0 山样品。 用荧光法测定蛋白质中色氨酸的含量时，只用4 0 肛g 的样品即可。另外荧光分析方法 简便，快速。 ( 4 ) 能提供较多的物理参数 荧光分析法可提供包括激发光谱、发射光谱及荧光强度、量子产率、荧光寿命、 荧光偏振等许多物理参数。这些参数反映了分子的各种特性，且通过它们可以得 到被研究分子的更多信息，这也是分光光度法不能相比的地方。然而用荧光分析法得 l 一 硕士论文 酒精中毒后的血液荧光光谱研究 到的常常是分子的局部信息，而不像x 光、衍射法那样能同时得到一个分子结构的 全部信息。 分子荧光光谱分析( m f s 分析) ，是利用某些物质被紫外光或可见光照射后所产生 的，且能够反映出该物质特性的荧光，并对其进行定性和定量的分析，是当前普遍使 用并有发展前途的一种光谱分析技术【4 】。荧光光谱分析在血液光谱、肿瘤诊断、皮肤 等生物组织中的应用于研究报道较多，近年来又取得了许多新的发展。生物组织荧光 分析的应用范围很广，包括生物物理学、生理学、生物化学、分子生物学、药理学、 免疫学、细胞学、遗传学等方面的检测和研究，如氨基酸、蛋白质、核酸、维生素、 酶、药物、毒物、d n a 等都采用这一技术。因此近几十年来一直是生物医学领域的 研究热点。 1 2 荧光光谱的基本理论 1 2 1 荧光光谱及其特征 任何发荧光的分子都具有两个特征光谱，荧光激发光谱( e x c i t a t i o ns p e c t r u m ) 和 荧光发射光谱( e x c i t a t i o ns p e c t n a n ) 。它们是荧光分析法进行定性和定量分析的基本 参数和依据。 1 2 1 1 荧光激发光谱 固定合适的发射波长与狭缝宽度，改变激发光的波长，测量荧光强度的变化。以 激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，即可得到荧光物质的激发光谱。激发 光谱是不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。激发光谱的形状 与测量时选择的发射波长无关，但其相对强度则与所选择的发射波长有关。发射波长 固定在其峰位时，所得激发光谱强度最大。荧光测定中，通常把激发光谱中最大的峰 值波长激发样品，这样可避免较短波长的激发光光子能量较大，而使样品产生光分解。 1 2 1 2 荧光发射光谱 与激发光谱密切相关的是荧光光谱。保持激发光的波长和强度不变，然后扫描发 射波长，以荧光强度对照着荧光波长画成的曲线称为该物质的荧光光谱。即荧光光谱 是指某一激发波长引起物质发射不同波长荧光的相对强度。荧光光谱的形状与激发波 长的选择无关( 个别化合物例外) 。但当激发波长选在远离激发峰处，荧光强度低。 1 2 1 3 斯托克斯位移 激发峰位与荧光峰位间的波长差是一个表示分子发光特性的物理常数，称为斯托 克斯位移( s t o k e ss h i f t ) 它表示分子回到基态前，在激发态寿命期间能量的消耗。 此位移常用1 1 式表示，单位是厘米1 ( c m 1 ) 11 斯托克斯位移= 1 0 7 牛一) ( 1 1 ) 2 硕士论文酒精中毒后的血液荧光光谱研究 式中：丸和五。分别是校正后的最大激发波长和最大荧光波长，单位是纳米 1 2 1 4 荧光光谱特征 ( 1 ) 荧光波长一般比激发光波长长 通常不论采用何种波长的光进行激发，荧光光谱的峰值位置不会发生变化的。但 是荧光光谱的强度与激发光波长有关【5 】。因为采用不同的波长的光波进行激发时，可 将分子激发到它的几个不同电子激发态，但是分子具有很高的内转换和振动弛豫，不 管起初激发到哪个电子态，或其中的哪个振动能级及转动能级，它们总要通过内转换 释放多余能量，迅速地驰豫到第一激发态的最低振转能级。荧光发射都是从第一电子 激发态的最低振转能级对电子基态的跃迁，从而导致发光的能量总比吸收的能量低。 因此，光谱线就产生了斯托克斯位移，这也说明在分子荧光中很难出现共振荧光。 ( 2 ) 荧光吸收光谱与发射光谱呈镜像对称 当激发光只能将分子激发到第一激发态的各振动能级时，吸收光谱的结构反映第 一激发态的各振动能级的情况。当分子由该激发态向电子基态的各振动能级跃迁发射 荧光时，荧光光谱结构反映它基态的各振动能级跃迁概率。因此，镜像主要来源于基 态中各振动能级的分布与第一激发态的各振动能级分布相类似和相互跃迁的几率也 相近。 多原子分子特别是生物大分子具有很复杂的能级结构，能级的数目随分子中原子 数目的增加变得非常多，所以生物大分子的荧光光谱不再有线系的外观，因而这种镜 像关系也难以看到。 1 2 2 荧光光谱的检测 由于荧光的频率低于入射光的频率，因此测量到的荧光频率与入射光的频率不 同为避免来自激发光的干扰，通常检测荧光光谱是与入射光垂直方向进行探测。当 然，在某些荧光光谱仪中并不采用9 0 。角 另外，由于荧光具有一定的寿命，且其寿命比吸收的时间过程( 1 0 - 1 5 s ) 要长， 因此，一些用观测不到吸收的变化过程( 如荧光团及其环境的变化) ，恰好可以用荧 光来观测在吸收的时间过程( 1 0 - 1 5 s ) 中，荧光团及其环境基本上是静止不变的。 而在很多反应中，溶剂的重新排列和分子运动过程发生的时间与激发态的寿命是同一 量级的。 1 2 _ 3 荧光光谱的主要参量 荧光分析能给出的信息与测量方式有关，可根据实验目的来选择。常用的基本参 数有： 1 2 3 1 荧光强度与荧光量子产额 荧光强度是荧光分析的最基本参量，指在一定仪器条件下，所测得的荧光强弱。 3 硕士论文酒精中毒后的血液荧光光谱研究 它和光源强弱( 功率) 、激发与发射波长及单色器的缝宽，样品及其浓度，探控测器 的灵敏度等有关。因此实际测得的荧光强度只是一个相对量，作图时，可用任意单位 表示。一般都用测得强度和标准样品在相同测量条件下，测得的强度之比来表示。 荧光量子产额( f l u o r e s c e n c eq u a n u n ny i e l d ) 也称荧光效率或量子效率，它表示物 质发射荧光的本领，指发射光子数与吸收光子数的比值，是荧光测定的基本参数之一。 在大分子构象的研究中尤为重要。若用妒代表荧光量子产额，则有： 口：蕉堑蓥鲞塑坌墼：蕉壁鲞三塑 尹2 1 蟊疆乏磊聂再夏矿2 面五反了丽 ( 1 2 ) 式中：p 值与物质本身性质和溶剂有关，对于发强荧光的分子，比如荧光素，其量 子产率在某些情况下将接近于1 ，而无明显荧光的化学物质其伊值则接近于零；同一 物质的p 还和激发波长有关，比如奎宁o 1 m o l l 硫酸溶液2 5 3 2 下，以3 1 3 r i m 光激发 时的妒值为l ，而以3 4 5 n m 光激发时矿值为o 9 8 。此外，9 值还与温度有关，一般温 度高时，d p 值下降，这种现象称为温度淬灭( t e m p e r a t u r eq u e n c h i n g ) 。 根据l a m b e r t - b e e r 定律，吸收前后的光强( 光予数) 为l 与，则： 1 = 0 1 0 一耐 ( 1 3 ) 式中：8 为摩尔消光系数；c 为样品浓度；，为光程；s o l 称为光密度。 被吸收光子数l 为 l = 厶一i ( 1 - 1 0 。耐) ( 1 4 ) 所以，荧光强度f ( 用光子数表示) 应为 f = 比( 1 - 1 0 “) ( 1 5 ) 荧光量子产额与荧光强度是两个不同的概念，妒指发光效率，单位是一个百分数， 而f 则是发光物质所发射的光子数。 当浓度小时，l o 一耐* 1 - 2 3 耐，由上式可得 f = 2 3 q i o a ：l ( 1 6 ) 上式表示f 与c 成正比但在浓度逐渐增大时，增长减慢，最后达到饱和值。 实际上，由于存在浓度淬灭现象，当浓度达到某一值再继续增大时，荧光强度反而降 低。因此用荧光强度测某物质浓度时，必须利用f 与c 成正比的浓度范围。 1 2 3 2 峰位和谱带宽度 峰位指激发峰或发射峰的波长，常用符号a 。表示。谱带宽度通常用“半宽”表 示。即峰的强度值一半时，其横坐标上的波长宽度。表示谱带宽度的方法还有多种， 4 硕士论文酒精中毒后的血液荧光光谱研究 如用光谱的有效面积除以峰值高度等。 1 2 3 3 荧光寿命 荧光寿命( f i f et i m e ) 又叫荧光的期间，即处于激发态的时间。它也是荧光特性 中的一个重要参量。它不仅在荧光动力学的计算中很重要，而且还能提供其它许多信 息，如二聚体与激发络合物的形成，能量转移和分子内基团与基团距离的测定以及分 子的旋转扩散等。 荧光寿命的定义有很多种，最简单的定义是：当发光过程符合指数衰减规律时， 去掉激发光后，分子荧光强度降到激发时最大荧光强度的i e 所需要的时间，用f 表 示。分子从吸收光能到发射荧光之间有一定的时间间隔。同种分子这一时间不完全相 同，即一定时间内，将有一定百分数的激发分子发射光子这与放射性核素的衰变规 律相同。设初始荧光强度为l ，则经过t 时间后的荧光强度j 为 一t i = i o e ” ( 1 7 ) 即经过f 时间后，荧光强度降低为原来的z 。f 值可用专门仪器测定，不同物质的f 值 不同，如人血清白蛋白( 水溶液) 为4 5 n s ，色氨酸( 水溶液) 为2 6 n s 等。 1 2 4 荧光与物质结构的关系 荧光现象只在一些具有某些结构特征的物质体系才会产生。 1 2 4 i 电子跃迁类型 事实说明，荧光很难由波长低于2 5 0 h m 的紫外辐射的吸收引起，因为此种辐射 的能量足以使激发态分子发生预离或离解。波长为2 0 0 n t o 的辐射相当于大约 1 4 0 k c a l m o l 1 ，这一能量可使大多数分子中的某些键断裂。因此，由o 一。跃迁所产 生的荧光很少看到。实验证明，矿叫【跃迁发射荧光要比兀一n 跃迁发射荧光更常见。 这是由矿呱跃迁属于电子自旋允许的跃迁，具有较大的s ，它一般比属于禁阻跃迁 的兀一n 跃迁的占大1 0 0 1 0 0 0 倍；其次，矿帽跃迁的寿命约1 0 屯l 矿，比矿n 跃迁的寿命1 0 屯lo 7 要短，因此在与各种失活过程竞争，冗啊跃迁更有利；此外， 在矿叫c 跃迁过程中，因s l 与t l 能级差较大，通过系问窜跃至三重态的速率常数也 较小，这有利于荧光的发射。 1 2 4 2 共轭效应 含有低能的矿叫r 跃迂能级的芳香族化合物的荧光最常见且最强。大多数未取代 芳香烃类在溶液中发荧光，随着环的数目和稠合程度的增加，荧光峰红移、量子效率 增大。含大的共轭体系或脂环羰基结构的脂肪族化合物也可能发光，但数目比芳香化 合物要少得多。 绝大多数荧光团含有芳香环或杂环。细胞色素的血红素辅基、卟啉、类胡萝i - 素、 黑色素等等都是共轭体系 5 l 硕士论文酒精中毒后的血液荧光光谱研究 _ _ _ _ i 。- _ _ _ - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - - _ _ _ - _ - 。_ _ - - _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ - 。_ _ _ _ 。_ _ _ _ 。_ _ _ _ _ 。_ _ _ 。_ _ _ _ - 。_ _ 。_ _ _ 。- _ _ 。_ _ _ _ _ 。- 。_ _ _ _ _ _ 。- _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ - 。o _ _ - - _ _ _ _ 。_ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ 一 1 2 4 3 取代基作用 如苯环上有取代时可使最大吸收波长发生位移并使荧光峰也发生相应的改变，此 外，也影响荧光效率。芳环上有羧基、羰基或亚硝基等吸电子取代基时常常会妨碍荧 光的发生。而给电子取代基- o h 、- n h 2 、c n 、o c h 3 会使荧光强度增加。 1 2 4 4 平面刚性结构效应 有刚性结构的分子容易发荧光。平面构型或分子刚性增加，荧光增强。这是因为 刚性和共平面性增加，可使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，即使外转移 能量损失减少，从而有利于荧光的发射。此外，当荧光物质被吸附在固体表面上时， 常常也使荧光增强。 1 2 5 影响荧光光谱峰值位置x m a x 的因素1 6 1 荧光分析的主要特点是灵敏度高，但因此也容易受到各种因素的干扰，如样品的 浓度、温度、p h 值以及样品中杂质等。为了得到可靠的结果，实验设计和操作中需 要考虑设法减少这些因素的影响。 1 2 5 1 环境极性 环境( 如溶剂) 的极性是一个对k 。影响的因素。同一种荧光团在不同极性的环 境中，其k 。有所区别。一般来说，激发态的极性比基态要强，因此被激发的荧光团 将趋向于与极性溶剂相互作用，使溶剂分子的电子分布会发生变化，偶极子重新取向， 而这又会反过来影响荧光团的基态和激发态能级，减少激发态的能量，引起发射谱的 红移。 1 2 5 2 溶液的p h 值 如果荧光团为弱酸或弱碱，则溶液p h 值的改变常对k 。有影响。这是因为弱酸 和弱碱分子和其离子在电子结构上有所不同，因而荧光k 。也会发生变化。溶液粘度 增加也可能使k 。产生蓝移。 1 3 5 3 能量转移川 分子之间的能量转移有几种形式： ( 1 ) 当一个激发分子与另一基态分子发生碰撞时，前者可将能量转移给后者， 口q 碰撞能量转移，通常将会引起荧光的猝灭，即碰撞猝灭。 双分子的作用过程的基本条件是两个分子的紧密接近，即“碰撞，对于基态分子 的动力学碰撞，要求两分子相互接触，而对于处在激发态的分子而言，不一定需要两 个作用分子的直接接触，它们之间便可能发生光学碰撞作用。光学碰撞的有效截面要 比动力学碰撞的有效截面大得多。无论是动力学还是光学碰撞都会影响双分子反应的 速率常数。 动态猝灭过程是与自发的发射过程相竞争从而缩短激发态分子寿命的过程。动态 6 1 m l m + y ( 发生荧光) h 【l m 】 1 m + q b m + q ( 猝灭过程)m 肘】【q 】 式中：觑和砬为相应的反应速率常数；厶为吸收的速率或活化分子生成的速率。 显然，荧光猝灭程度取决于七l 和赶的相对大小及猝灭剂的浓度。 碰撞猝灭还与溶液的粘度有关。在粘度大的溶液中，猝灭作用较小此外，碰撞 猝灭将随温度升高而增加。 ( 2 ) 激发分子将其激发能以辐射形式释放，本身回到基态，另一分子则吸收此 辐射光子处于激发，该过程叫重吸收。假如另一分子与激发分子是同一种，则此过程 叫自吸收。由于这一过程是一个分子释放光子，另一个分子再吸收，所以此过程又叫 一种辐射能量转移。此时可能引起荧光猝灭，也可能有新的荧光产生如图1 1 所示， 供体( 荧光团) s 受激发射的光子被受体( 荧光团) a 重吸收，彳又发射荧光光子。 ( 3 ) 当两个分子具有相同的激发能量变化( 或受体比供体激发能级稍低一些) ， 且达到一定的距离时，通过两个分子在空间 产生的电磁相互作用，供体分子s 可将其激s ， 发能转移给受体分子4 ，这就是非辐射共振 能量转移。这种能量转移方式相当于两个偶 联的电偶极子的振动，当两个电偶极子的振 动频率相同时，相互间就发生共振作用，从 而转移了能量，所以又叫共振能量转移1 4 】， 振能量转移的分子跃迁也可用图1 1 表示，s 。 供体与受体间激发能级有一小的电子能量差 a e 。这种能量转移的特点是过程中不包含光 子的发射与再吸收，所以有别于重吸收，此 时两分子很靠近但又不碰撞，所以有别于碰 撞转移。 图l l荧光团能量转移跃迁示意图 实箭头线表示吸收。虚箭头线表示辐射 共振能量移需要有三个条件：一是能量供体与能量受体分子间的距离要在 5 1 0 r i m 之间；二是供体的荧光光谱必须与受体的吸收光谱要有重叠，重叠愈大转移 效率愈高，通常不同分子间的光谱重叠比相同分子间的重叠( 假若有重叠的话) 要更 7 叫甓；rii 引 硕士论文酒精中毒后的血液荧光光谱研究 大一些；三是供体必须是必荧光的分子( 荧光团) ，并且在没有受体存在时，供体的 荧光量子效率愈高，则能量转移效率也愈大。 共振能量转移可以在分子内进行也可以在分子间进行。5 n m 是一般生物大分子的 直径大小，也是生物膜厚度( 即脂双层) 的大小，所以在生物大分子和膜上可进行能 量转移。共振能量转移可以在不同分子间进行，也可以在相同分子间进行。浓度淬灭 与浓度去偏振现象都可以作为在相同分子间进行能量转移的证明。杂质猝灭，特别是 敏化荧光可以作为不同分子间进行能量转移的证明。 如果两种荧光团的荧光频率接近，则当两种基团足够接近时，用一种荧光团吸收 光能激发使之处于激发态后，处于激发态的这种荧光团可能将激发能转移到另一种荧 光团，使第二荧光团进入激发态，产生第二种荧光团特有的荧光。 显然，由无论是碰撞能量转移、重吸收能量转移还是共振能量转移引起的荧光猝 灭或产生新的荧光，都可能对五。造成影响。 1 2 6 影响荧光强度的因素 由式( 1 6 ) 可知，凡是会影响荧光量子产额矿的环境因素也必然会影响荧光强度 f 。 1 2 6 1 温度的影响 溶液温度对荧光的影响是很大的。温度降低会增加，因为降低了碰撞与非辐射 失活的概率。如荧光素的乙醇溶液在o 以下每降低1 0 ，荧光产率增加3 ，当温 度降至8 0 时，荧光量子产率为1 0 0 。 1 2 6 2 环境极性的影响 或f 会随着环境极性的减小而增加。一种可能的机制是：在非极性的溶剂中系 间交连的速率会减少。 1 2 6 3 光照的影响 荧光团吸收光能，可能造成某键断裂，这现象称为光化分解( p h o t o d i s s o c i a t i o n ) ， 光化分解会造成荧光逐渐减弱尤其是对于稀溶液来说，光化分解现象较为严重。 1 2 6 4 样品浓度的影响 由式( 1 6 ) 可知，在样品浓度较低时，与荧光团的浓度成正比。但到了一定 浓度以后，就不再存在这种正比关系，如式( 1 5 ) 所示 当荧光团的浓度过大时，由1 2 5 3 节讨论的分子间的能量转移更易发生，当然 也易发生猝灭现象。这样就使出射荧光强度反而低于浓度较小时的荧光强度。 另外，浓度过高还可能形成样品分子的二聚体或多聚体，因而降低荧光强度。 还有当溶液较浓时，均匀分布在样品池中的荧光团吸收强烈，越进入溶液内部， 荧光团被激发的机会越少，因为大量的激发光在到达池中间之前就被吸收了这样， 8 硕士论文 酒精中毒后的血液荧光光谱研究 从垂直于激发光入射方向中检测到的荧光就很微弱了 1 2 6 5 溶液粘度的影响 荧光强度一般随介质粘度的升高而增强。因为介质粘度增加，减少了分子碰撞， 从而减少了能量损失。 1 2 6 6 溶解氧的影响 溶解氧的存在往往可使溶液的荧光强度降低，这可能是由于荧光物质的光化学诱 导氧化所致。然而，更常见的是发生淬灭现象，这是由于氧分子的顺磁性，这种顺磁 性能促进激发分子发生系间窜跃变成三重态。其它顺磁性物质也会导致荧光淬灭现象 的发生。 1 2 6 7 膜电位的影响 有些能和膜结合的荧光团的荧光强度会随着膜电位的改变而改变，这种变化有的 是由于带电的荧光团随膜电位变化而在膜内外重新分布，有的是由于荧光团的荧光光 谱在电场下发生改变。据此现象可以用来监测膜电位的变化。 还有一些其他的干扰因素可能影响荧光强度，例如光散射就可能影响荧光强度。 区分散射光和荧光发射的依据，是散射光波长与激发光波长相同或相近，离荧光峰较 远。另外，表面吸咐也会对稀溶液的荧光测定造成影响。 1 3 血液光谱学的研究现状 由于血液在生物体内是无所不在的，因而在研究光与生物组织相互作用机理时， 不可避免地要涉及到光与血细胞的相互作用问题。虽然关于血液的流变学和生物化学 等性质的研究己很多，但从物理学或光学的角度出发进行研究的报道并不多见。 光谱学方法是研究光与血液相互作用过程的有效方法之一，当光照射到血液，会 发生散射、吸收和发射等现象。通过检测和分析血液的散射光谱、吸收光谱和发射光 谱，能够获得一些反映血液状态和内部物质构成的情况信息嘲，以及光子与血液相互 作用过程的有关信息。 血液的吸收光谱表示血液对于光的吸收随波长的变化情况，吸收曲线上各峰值的 位置和相对强度能够反映血液中生物分子的部分能级结构t 9 1 ；血液的荧光光谱则可以 部分地反映血液分子吸收光子能量以后所发生的能量转移情况。分析研究这些谱线的 结构，有助于进一步理解激光与血流的相互作用机理。 1 3 1 正常血液的光谱学研究现状 1 3 1 1 血液的散射光谱研究 9 硕士论文 酒精中毒后的血液荧光光谱研究 血液是一种强散射介质。当一束光作用于血液时会发生散射现象，如r a y l e i g h 散 射、m i e 散射或t y n d a l l 散射和r a m a n 散射，其中r a y l e i g h 散射、m i e 散射或t y n a a l l 散射属弹性散射，散射光与入射光的频率相同；r r m f l n 散射是非弹性碰撞，散射光的 频率相对入射光的频率有位移【l o l 。关于血液或血细胞的散射特性，国内外研究已比较 多0 t t 2 1 3 】，这方面的理论相对比较成 熟。所以根据血细胞的散射特性理论 制成的血细胞计数器 1 4 , 1 s 】己成功用于 临床。 在血细胞的共振散射光谱研究方 面，蒋治良等人1 1 6 1 利用u - 3 4 0 0 型紫 外一可见光分光光度计获得了人的血 液、红细胞、白细胞和血清的共振散 射光谱，如图1 2 所示。由图可知全 血和红细胞均在3 1 0 h m 、4 7 0 n t o 、 5 6 0 h m 、6 0 0 n m 处产生了四个共振散 射峰。自细胞和血清均在3 1 0 h m 、 4 7 0 r i m 处产生了二个共振散射峰；但 2 5 0 4 5 0 6 5 0 l , n m 图1 2 各种血液成分的共振散射光谱 缸全血稀释4 0 0 倍；b 红细胞稀5 0 0 倍 c 启细胞稀释5 0 0 倍；d 血清稀释1 0 0 倍 共振散射峰强度较弱。全血的共振散射谱图是由红细胞、自细胞、血清的共振散射光 谱图组合而成，i r s 值跟颗粒的大小和数量有关。其中4 7 0 n m 处的共振峰主要是红细 胞的贡献。而白细胞的贡献相对较小；5 6 0 h m 和6 0 0 r i m 处的共振峰可以认为是红细 胞的特征峰。血清对图1 2 各峰的贡献较小。 1 3 1 2 血液的吸收光谱研究 在生物组织中，主要吸收光的生色团是水分子以及如蛋白质和色素的大分子。在 红外波段的吸收主要是由水分子引起的，而蛋白质和色素的主要吸收光谱在紫外和可 见光范围。 国内外的研究均表明全血的吸收光谱曲线与红细胞的吸收光谱曲线分布情况基 本上一致陈祖林等人的实验( 1 9 9 4 ) 唧表明，在波长为2 4 0 一8 0 0 n m 范围内，全血 与红细胞均在波长为3 4 2 n m ，4 1 6 n m ，5 4 0 r i m 和5 7 8 n m 处附近存在吸收峰，在波长为 4 1 6 r i m 附近的吸收最强，如图1 3 所示。只是红细胞在波长为2 7 8 n m 处未见吸收峰( 如 图1 3 中( 2 ) ) 。全血与红细胞的吸收光谱曲线( 图1 3 ) 又与b o u l n o i s ( 1 9 8 6 ) 给出的 血红蛋白的吸收光谱曲线( 图1 4 ) 很相刨1 s l 。由此可见，血液的吸收光谱主要来源 于血红蛋白的吸收 根据g s t h o m a s 等人1 1 9 1 对卟啉环的光谱分析，其特征吸收峰位于波长为4 1 5 r i m ， 5 4 0 n m ，5 7 8 n m 处。因为血液的主要成分是血红蛋白，其主要化学结构为血卟啉环， 1 0 如 帖 如 加 0 硕士论文酒精中毒后的血液荧光光谱研究 因此也可以认为血液吸收光谱中在这三个波长附近的峰是由血红蛋白中的血卟啉环 所为。 w a v e l e n g t h ( a m ) 图1 3 全血和红细胞的吸收光谱曲线 ( 1 ) 全血；( 2 ) 红细胞 1 0 0 0 0 l 1 0 0 1 0 3 0 0 4 0 0 5 0 06 0 07 0 0 w a v e l e n g t h ( r i m ) 图1 4 血液中的血红蛋白的吸收光谱 s b b r o w n 2 0 l ( 1 9 8 0 ) 研究了血红蛋白在波长为5 0 0 , - 0 0 0 n m 范围内的吸收光谱， 如图1 5 所示。其中，虚线是氧合血红蛋白( h b 0 2 ) 的吸收光谱曲线；实线是脱氧血 红蛋白( h b ) 的吸收光谱曲线。在波长为5 4 0 - - 5 8 0 n m 之间，两条曲线都有比较强的 吸收峰。当波长长于6 0 0 h m 时，两条曲线都迅速下降，但两条曲线的下降程度有所 差别。h b 0 2 曲线约在波长为6 7 0 r i m 处下降到最低点；而hb 曲线则在波长为7 2 0 r i m 处才下降到最低点。 骆晓森阱l 等的研究结果表明，在生理温度下，与周围环境达到平衡时生物分子按 能量呈玻尔兹曼分布，即大多数 生物分子都处于电子基态的最 低振动能级，这些处于最低振动 能级的大多数分子对吸收曲线 的峰值部分做出主要贡献；而处 于较高振动能级的少数分子则 对吸收曲线的“斜坡”部分做出 贡献。血液中，氧合血红蛋白与 脱氧血红蛋白通常同时存在，并 且静脉中脱氧血红蛋白的含量 显著高于动脉中脱氧血红蛋白 的含量。波长为6 0 0 , - - 6 7 0 n m 的 殿 。 八 八 iv b 莎 w a v e l e n g t h ( r i m ) 图1 5 血红蛋白在波长为5 0 0 9 0 0 珊波段的吸收光谱 红光波段正处于血红蛋白的一个吸收峰的“斜坡”区域( 图1 5 ) ，因此，当波长为 1 1 刍0口。等口j葛9口拿召eo暑 硕士论文酒精中毒后的血液荧光光谱研究 6 0 0 , - - 6 7 0 n m 的红色激光照射到血液，总会发生引起电子跃迁的吸收过程，尽管其吸收 率比较小。通过吸收的累积作用，也能够产生可观的生物刺激效应。 1 3 1 3 血液的荧光光谱研究 国外在对生物组织的荧光光谱的方面研究中间接地提到血液或血细胞的影响【臻 扭刎，且对血浆的研究报道略多些f 2 5 1 。相比之下，国内学者对血液及其组分的荧光 光谱研究较多一些。例如，陈荣等人1 2 6 1 对用h e - n e 激光激发血液产生的荧光光谱的 初步分析后给出：a 、b 、o 和a b 型血液在波长为6 3 2 8 r i mh e - n e 激光诱导下所产 生的荧光光谱形状相似。荧光光谱曲线都具有3 个峰值，分别位于波长为6 7 0 r i m ， 7 3 0 r i m ( 有的血型出现的峰位在波长为7 8 0 r i m ) 和波长为9 8 1 a m 处，荧光强度的差异 主要是由样品的浓度造成的。降雨强等人 2 7 1 用波长为5 3 2 m 的激光作激发光源，分 别测量正常人血液及其组分( 血浆、血小板、红细胞) 的荧光光谱。结果显示，全血 在6 3 0 r i m 及7 1 0 r i m 附近出现荧光峰值，其各组分的荧光光谱有明显差异，其中血浆 的荧光光谱最强，且谱线较为丰富，故而临床诊断时血浆的荧光光谱更为合适另外， 比较正常人及乙型肝炎患者血浆标本的荧光光谱发现，其7 3 8 n m 处的峰值强度有显 著差异。 宋峰等人 2 8 1 用a r + 激光诱导血液和红细胞与血清的混合体产生的荧光光谱，并指 出在人体动脉的l i t 光谱中红细胞对荧光有再吸收作用。在5 0 0 - - 7 0 0 r i m 波段中，这 种吸收是不均匀的，在5 4 7 n m 和5 8 1 n m 处有最强的吸收，这样导致了凹陷的产生。 此外，在5 3 0 r i m 附近，红细胞的吸收作用较大，这样，当血清中掺入红细胞时，就 出现了荧光光谱蓝移和变窄的现象。 骆晓林等人3 0 l 研究了中心波长为5 0 2 r i m 的高亮度发光二极管、溴钨灯经 d t b 5 3 0 带通滤波片后的光以及波长为6 3 2 8 r i m 的h e - n e 激光诱导下的1 的全血溶 液的光谱。结果表明波长为5 3 0 r i m 光照射血液会产生比较强的荧光发射，这提示 5 3 0 r i m 光对血液有比较强的生物学作用；波长为5 0 2 r i m 的光照射血液也会产生荧光 发射，但其荧光强度比5 3 0 r i m 光照射血液所产生的荧光弱很多，这一结果与血液对 5 0 2 r i m 光的吸收率小于5 3 0 r i