（应用化学专业论文）壳聚糖的超近临界水降解研究.pdf

摘要 本文提出了一种新的壳聚糖降解法一超( 近) 临界水解法： 让壳聚糖在自身具有酸催化和碱催化性能的超( 近) 临界水中 降解。超( 近) 临界水具有特殊的溶解度、很高的离子积、较 低的粘度、较低的表面张力和较高的扩散系数，使得壳聚糖在 超( 近) 临界水中能够快速降解成可水溶的壳寡糖。 论文首先介绍了壳聚糖和壳寡糖的功能用途，接着综述了 目前已有的壳聚糖降解方法，然后对超临界流体和超临界水的 基本性质进行了阐述，及对超临界水在废弃生物资源再利用方 面的应用进行了总结，最后论文详细探讨了壳聚糖在分批式反 应器中超( 近) 临界水解的工艺条件。 在温度2 0 0 3 8 0 ，压力2 0 3 5 m p a ，反应时间1 1 5 m i n ， 壳聚糖初始浓度l0 9 l 以及醋酸浓度0 1 25 ( 80 0 m l 水中加入 1m l 冰醋酸) 的条件下研究了壳聚糖在超( 近) 临界水中的降 解反应，并且探讨了降解产物的活性炭脱色工艺，得出适宜条 件为0 5 9 活性炭10 0 m l 溶液，温度5 0 ，脱色时间10 m i n 。产 物用红外、薄层色谱分析，壳聚糖超( 近) 临界水解产物主要 为单糖及六糖以下的寡糖。在实验取值范围内，研究了其降解 后壳寡糖得率与压力、温度及反应时间的关系，由正交分析可 知对壳聚糖超( 近) 临界水降解制取壳寡糖过程，影响最大的 因素是压力，其次是时间和温度，最佳工艺条件是：操作压力 35 m p a ，反应温度25 0 ，停留时间10 m i n 。 关键词：壳聚糖壳寡糖超( 近) 临界水降解薄层色谱 i l 獭f 喾、导肺阔蘑 羹全交公赢 s t u d i e so nh y d r o l y s i s0 fc h i t o s a n i n s u p e r c r i t i c a la n dn e a r c r i t i c a lw a t e r a b s t r a c t b e c a n s es u p e r c r i t i c a la n dn e a r - c r i t i c a lw a t e rh a y e s p e c i a l s 0 1 u b i l i t y ，h i g h i o n pr o d u c t ，1 0 w s ur f a c et e n s i o na n d h i g h d i f f us i o n c o e f f i c i e n t ，c h i t os a n c a nb e d e g r a d e d i n t os 0 1 u b l e c h i t o o l i g o s a c c h a r i d er a p i d l y s o ，s u p e r cr i t i c a la n dn e a r c r i t i c a l w a t e rd e g r a d a t i o n ，an e w d e g r a d a t i o nm e t h o df orc h i t o s a n ，i s p u t f o r w a r df ir s tt i m eh er e i nt h i st h e s i s ，f u n c t i o nsa n du s eso fc h i t os a na n d c h i t 0 0 1 i g o s a c c h a r i d ew er ei n tr e d u ce d f irs t m e t h o ds f or d e g r a d i n g c h i t os a nt h a th a yea l r e a d y e x is t e da t p r es e n tw e r e s u m m a r i z e di ns u c c e ss i o n a n dt h e n pr o p er t i e so fs u p er er i t i c a l f l u i da n d s u p e r c r i t i c a lw a t e rw er e e x p a t i a t e d ， a n dt h e a p p l i c a t i o n so f s u p e r cr i t i c a lw a r eri nt h e r e c y c l i n g o fw a s t e b i o r e s o u r ce sw e r ea ls os u m m e du p l a s t l y ，p r o c e s sc o n d i t i o n s f ort h es u p er cr i t i c a la n dn e a r cr i t i c a l h y d r 0 1 y z i n go fc h i t o s a ni n b a t c hr e a c t orw er ed i s c uss e di nd e t a i l s u p e r cr i t i c a la n dn e ar - cr i t i c a l h y d r o l y z i n go fc h i t o s a nw a s s t u d i e du n d er f o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：t e m p e r a t u r e 2 0 0 38 0 ， p r e s s u r e2 0 - 35 m p a ，r e a c t i o nt i m e1 15 m i n i n i t i a lc o n c e n t r a t i o u o fc h i t os a n10 9 la n da c e t i ca c i dc o n c e n t r a t i o n0 12 5 pr o d u c ts w er e a n a l y z e db y i ra n d t l c ，a n dm a i np r o d u c t sw e r e m o n os a c k c h a r i d ea n d 0 1 i g o s a c c h a r i d ew i t h d e g r e e o f p 0 1 y m e r i z a t i o nu n d ers i x a tt h e r a n g e o f o p er a t i o n c o n d i t i o n ，t h e r e l a t i o n s h i p s b e t w e e nt h e y i e l d o f c h i t 0 0 1 i g o s a c c h a r i d ea n dt h e o p e r a t i o 1 i i l p a r a m e t e r ss u c ha sp r e s s u r e 。t e m p e r a t u r ea n dr e a c t i o nt i m ew e r e i n v e s t i g a t e d t h ep r o c e s sc o n d i t i o nso fd is c 0 1 0r i n gus i n ga c t i v e c a r b o nw e r ea l s od i s c us s e d a n dt h ea p p r o p r i a t e dc o n d i t i o n sw e r e 0 5 9a c t i v ec a r b o n 1 0 0 m ls o l u t i o l l f t o mq u a d r a t u r ea n a l y s i sw e c a n g e t t h er e s u l tt h a t f ort h e h y dr 0 1 y s iso fc h i t os a ni n s u p e r c r i t i c a l a n dn e a r cr i t i c a lw a t er ，pr es s u r e h a dt h e b i g g e s t c o n t r i b l i t i o n r e a c t i o nt i m ea n dt e m p e r a t u r ew e r e p o s t er i o r ，t h e o p t i m a l p r o c e s sc o n d i t i o n sa r e o p e r a t i n gp r e s s u r e 35 m p a ， r e a c t i o nt e m p e r a t u r e2 5 0 ，r es i d e n c et i m e10 m i n xul i a n g f e n g ( a p p i ie dc h e m i s tr y ) d ir e c t e db ypr o f es s orc h e nk a i x t i n k e y w o r d s ：c h i t os a i l ：c h i t o o i i g o s a cc h a r i d c ； s u p e r cr i t i c a l ( nea l - cr i l ic a dw a t e f ；d e gr a d a t i o n ；t l c 独创性声明 y 6 2 3 8 8 8 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研 究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注 和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研 究成果，也不包含为获得酉j e 太堂或其他教育机构的学位或证 书而是用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所作的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年月 日 第一章前言 甲壳素( c h i t i n ) 又名几丁质、甲壳质、甲壳胺等等，广泛 存在于蟹、虾等甲壳类动物及各种昆虫的表皮和乌贼、贝类等 软体动物的骨髓及外壳，以及蘑菇和菌类等的细胞壁中。它是 地球提供给人类除植物纤维外的第二大生物资源，它也是地球 上除蛋白质外数量最大的含氮天然有机物，被科学家誉为继蛋 白质、糖、脂肪、维生素、矿物质以外的第六生命要素。但：黾 直到1811 年才被法国的自然历史学家h br a c o n n o t 发现。壳聚 糖是甲壳素n 脱乙酰基的产物，一般而言，n 乙酰基脱去55 以上的就可称之为壳聚糖。到目前，有关c h i t i n 的知识己非常 丰富，我们已知c h i t i n 是一种维持和保护甲壳动物和微生物躯 体的线性氨基多糖。 甲壳素的化学结构和空间立体结构均与纤维素非常相似 只是纤维素葡萄糖单元上2 位的o h 被n h c o c h3 所取代( 如 图1 1 所示) ，甲壳素学名b ( 1 ，4 ) - 2 一乙酰胺2 脱氧d 葡聚糖， 分子式为( c8 h 13 n o5 ) 。从空间排布看，甲壳素分子呈直链状， 是一种含苷键的氨基线性多糖，极性强，易结晶。甲壳素结构 由于氢键类型不同而具有三种结晶体，第一种是a 甲壳素，由 两条反向平行的糖链组成，第二种是b 甲壳素，由两条同向平 行的糖链组成，第三种是y 甲壳素，由三条糖链组成，两条同 向，一条反向，其衍生物壳聚糖也具有这样三种结晶状态。a 型最丰富、最稳定、自然含量最高，且目前的研究也最深入彻 底。 甲壳素和壳聚糖分子结构中存在大量的羟基、n 乙酰胺基 和氮基，分子链以反平行( a 型) 或平行( b 型) 的方式排布，所以 分子内和分子间均存在大量氢键，故甲壳素和壳聚糖的溶解性 极差。甲壳素不溶于水、稀酸、稀碱、浓碱和一般有机溶剂， 可溶于浓的盐酸、硫酸、磷酸和无水甲酸。壳聚糖分子中乙酰 基的脱除使得游离氨基量增多，酸性介质中氨基被质子化，从 而破坏了甲壳素分子间的氢键，分子刚性减小，松散的结构有 利于溶剂分子的进入，增加了壳聚糖在酸性溶液中的溶解性。 壳聚糖不溶于水和稀碱溶液，可溶于稀的盐酸、硝酸等无机酸 和大多数有机酸，不溶于稀的硫酸和磷酸。 瓯o h 瓯o h 艇o h 图1 1 纤维素、甲壳素及壳聚糖的分 相对甲壳素，壳聚糖的各种性质有了很大 予结构 改变，其化学性 质较甲壳素更活泼，故甲壳素的改性和后续开发利用多以壳聚 糖为研究对象。壳聚糖独特的分子结构使其具有许多优良而独 有的特性，使得壳聚糖的应用已遍及在医学、生物工程、化工、 食品、农业、矿物加工、环保、纺织、造纸和纳米微晶材料制 备等诸多领域i 卜6 1 ，但甲壳素及壳聚糖的高度不 制了他们的应用，必须对甲壳索及壳聚糖进行化 结构修饰，引入或改变其分子链上的某个基团， 溶性极大地限 学深加工，或 或者完全降解 或部分降解其分子链，从而得到一些具有特殊性质、水溶性有 所改善的衍生物产品来满足人们的使用需要。因此甲壳单糖、 寡糖及低聚糖随之问世。 甲壳素壳聚糖的性质随分子量的不同有着较大的差异，随 着研究的深入，人们发现壳聚糖经水解生成的低聚合度的葡胺 瓯 糖有其独特的生理活性功能，具 噬细胞的功能；促进脾脏抗体生 移的作用：降低胆固醇和血脂含 抑菌等生物活性，并能选择性地 杆菌，特别是具有一定聚合度的 生长繁殖的功能，促进蛋白质合 促进植物快速生长等。甲壳素或 萄糖是治疗关节炎、骨关节炎及 医药、食品、化工及化妆品行业 目前，国内外学者提出的降 降解和酶法降解三大类。化学降 量分布宽，同时产物分离提纯困 氧化降解反应的工艺条件复杂， 有更有魅力的新用途：提高巨 成，具有抗肿瘤和抑制肿瘤转 量，抗血栓、抗凝血、抗菌、 活化、增殖人体肠道内的双歧 低聚壳聚糖，具有阻碍病原菌 成，促进植物细胞活化。从而 壳聚糖完全水解得到的氨基葡 风湿性关节炎的有效药物。在 中均有重要用途”。 解方法主要有化学降解、物理 解中的酸性条件下的水解分子 难，生产成本高，污染严重； 反应的稳定性和重复性较差 三废严重，不利于环保；n a n o2 法分子量分布宽，均一性差， 降解过程中破坏了氨基，生产的三废物污染严重。物理降解有 y 射线照射下的辐射降解、光降解、超声波降解这三种方法， 技术也都不成熟。酶降解产量低，成本高，很难应用于批量生 产。 为此，本文提出了一种新的壳聚糖降解法一超( 近) 临界 水解法：让壳聚糖在水的超( 近) 临界状态中快速水解。 超临界水( s u p e r c r i t ic a lw a t e r ，简称s c w ) 是指当水的温 度高于其临界温度3 7 4 1 ，压力大于其临界压力2 2 1m p 时， 纯水的气相与液相消失了，成为均一的流体。s c w 表现为强的 非极性，所以有机组分大多可溶于s c w 中。在超临界流体中， 分子的扩散系数介于气、液之间，具有独特的溶解性。以水为 溶剂的超临界流体反应技术是近来发展的环境友好、可持续发 展的高新技术8 ，9 1 。 我们还没有见到国内外有关详细探讨壳聚糖超临界水解制 取寡糖的文献报道，只有为数不多的几篇文章提到了壳聚糖超 临界水解最终产物为葡胺糖。因此本文首次详细探讨了壳聚糖 在分批式超临界流体反应装置中的降解情况，并确定了最佳工 艺条件，为进一步扩大试验以及最后的工业应用设计提供有关 数据。其显著特点是反应时间较短，反应选择性高，反应在不 加任何催化剂的情况下也可顺利进行，少量的酸可有效提高壳 寡糖的得率，属对环境没有污染的绿色化工，是现在大力倡导 的化工发展方向。 第二章壳聚糖应用、降解研究进展 2 1 壳聚糖的生理活性及其在医药卫生方面的应用 二十世纪八十年代，美国华盛顿大学的科学家首先发现甲 壳素壳聚糖具有生理活性，此后，日本、欧洲等地的科学家相 继发现甲壳素，壳聚糖具有许多其他多糖类物质所不具备的优 异的生理活性。因此，在近十几年的时间里，研究者对壳聚糖 的生理活性及其在医药工业中的应用进行了广泛而深入的研 究。甲壳素和壳聚糖有没有毒性，在二十年前还有些不同意见， 有人认为有低毒性，那时国外也很少进行毒理学方面的研究， 国内更没有进行研究，仅凭一次简单的试验就下结论说有低毒 性是比较武断的。现在，国内外已进行了大量的毒理学研究， 证明甲壳素和壳聚糖是无毒的1 引。 2 1 1 壳聚糖的生理活性 壳聚糖及其某些衍生物分子中存在的游离0 h 和n h2 具有 良好的氢键成键性，并且微酸条件下的壳聚糖具有正电性，使 得壳聚糖具有很高的生理活性。如可以提高机体免疫力和抗菌 消炎【1 3 ，1 4 1 ：壳聚糖分子上有大量氨基，而巨噬细胞和t 淋巴细 胞表面带有负电荷，正负电荷相互吸引而激活这些免疫细胞， 增强其吞噬功能和水解活性，刺激其产生淋巴因子和炎性介质。 微酸条件下的壳聚糖具有正电性，可吸附带负电荷的细菌，使 细菌细胞壁和细胞膜上的负电荷分布不均，干扰细胞壁的正常 合成，打破了在自然状态下的细胞壁合成与溶解平衡，使细胞 膜内物质渗出导致细菌溶解而死亡。故壳聚糖不但可以抑制 细菌的生成，还可以破坏已有细菌，达到抗菌、抑菌的作用。 另外，壳聚糖及其某些衍生物还可调节细胞生长【l5 1 ，提高粘膜 通透性【16 1 ，调节凝血活性”，降血脂、血糖和血压【18 l 和吸湿、 保湿【i9 1 等。 2 1 2 壳聚糖在医药保健品和医学中的应用 目前，壳聚糖在医药保健品和医学中的应用主要集中在抗 肿瘤【20 1 ，防治心脑血管疾病2 、糖尿病22 1 、脂肪肝及肥胖【23 】， 治疗消化道疾病24 1 ，医药材料2 5 1 。药剂辅料26 1 等。 其中抗肿瘤作用是目前壳聚糖研究的一个热点，报道很多， 但互相矛盾的结果也很多。一种说法是，肿瘤细胞表面比正常 细胞表面的阴电荷要高得多，从而聚阳离子电解质能吸附到肿 瘤细胞的表面而使电荷中和，抑制肿瘤细胞的生长和转移。另 有一种说法是癌细胞周围为酸性，壳聚糖( 包括低聚壳聚糖) 的氨基碱性基团可适当调节体内的p h 值，并通过这种调节作用 改变机体处于病态时的生物化学平衡，加强淋巴细胞的生理活 性，从而对癌细胞的繁殖进行抑制。 壳聚糖具有生物可降解性、生物相容性、无毒、促进伤愈 合、消炎、止血、杀菌抑菌、成膜性和高通透性等良好的性质， 因此可将壳聚糖制成一些医用材料用于临床治疗。甲壳素和壳 聚糖制成的医用敷料如无纺布、纱布、绷带、止血棉、薄膜等， 可止血、消炎、减轻伤口疼痛、促进组织生长、加速伤口愈合， 而且愈合后的创面与正常组织相似，无疤痕。 药剂辅料是药物制剂生产的必需材料，随着药物制剂向“三 效”( 高效、速效、长效) 和“三小”( 毒性小、副作用小、剂 量小) 发展，具有无毒性、无刺激、无免疫源性、无热源反应、 不溶血、无致突变型及可自然降解、良好的组织相容性、良好 的缓释和控释作用的甲壳素和壳聚糖成为又一个研究热点。壳 聚糖可用来作为粉剂、颗粒剂、片剂、微囊剂和膜剂等。 2 2 壳聚糖分子量对其性质的影响 壳聚糖是一种大分子多糖，几十年对其进行的研究表明， 壳聚糖的分子结构对其物理、化学、生物性质均有很大影响， 其中。壳聚糖的平均分子量和分子量分布对各种性质影响最大， 6 因此，有必要对壳聚糖分子量对其性质的影响进行一些研究。 2 2 1 分子量对壳聚糖物理性质的影响 分子量的大小将影响壳聚糖的溶解性、液晶性、成膜性和 通透性等物理性质。低分子量壳聚糖分子内的氢键作用减弱， 使壳聚糖分子更容易与溶剂分子作用，改善其在溶液中的溶解 性；分子量越大，重复单元越多，分子构象持续长度越大，从 而导致出现液晶相的临界浓度越低 27 l ；壳聚糖相对分子量低使 得制膜液的粘度低，在成膜过程中交联程度不够，所制的膜易 裂、有亮点及针孔，故膜性能较差；壳聚糖分子链因分子量增 大而变长，在溶液中分子链卷曲、交联，在形成网络时交叉较 多，所以网络中的孔径较小，导致膜的通透性变差，当分子量 小到一定程度时，这种差别减小 2 引。 2 2 2 分子量对壳聚糖生理活性的影响 一般由酸碱法制得的壳聚糖分子量通常在1 05 106 左右， 通过适当方法可将其降解成不同分子量大小的低聚壳聚糖，研 究发现，分子量小于10 0 0 0 的低聚壳聚糖具有许多良好的生理 活性，如吸湿保湿性、抗菌抑菌性、降血脂性、抗癌性等。研 究发现。分子量为15 0 0 和30 0 0 的壳聚糖具有良优良的吸湿保 湿性，其吸湿保湿性强于透明质酸、乳酸钠和甘油 2 。而分寻： 量在9 16 l04 左右壳聚糖具有较好的抗菌抑菌性【30 1 ，可是高 分子量壳聚糖对降低肝总脂肪含量和降低胆固醇的活性却比低 分子量壳聚糖高【3 ，仅聚合度为6 8 的壳聚糖才有较好的抗癌 抑癌的功效【3 。 2 3 壳聚糖降解研究进展 由以上综述可知，壳聚糖分子量的大小对壳聚糖的许多性 质尤其是壳聚糖的生理活性有着很大的影响，天然甲壳素经一 般酸、碱处理后所得壳聚糖的分子量至少有几十万，有的甚至 上百万，生理活性较差而且人体不易吸收，因此，如何根据需 要制备所需分子量范围的壳聚糖成为世界各国科学家们研究的 重点。目前，国内外学者提出的降解方法主要有化学降解、物 理降解和生物降解三大类。 2 3 。1 化学降解 2 3 1 1 在酸性条件下水解 常将壳聚糖溶于一些无机酸如磷酸i 3 3 ，3 ”、盐酸i 35 ，36 中，加 热到一定温度进行降解，壳聚糖在溶液中h + 的催化作用下可发 生水解反应。水解过程中，每一缩醛键断裂均产生两个端基： 一端为缩醛基，另一端为羟基。其水解反应如图2 1 所示。 h ，o 图2 1 酸法降解壳聚糖的反应历程 假设壳聚糖的水解为无规降解过程，则定义 口= s ( n0 1 )( 式中s 为因水解而断裂的键数；no 为聚合物的平 为大分子中每一缩醛键在某一确定时刻的裂解机 水解是单分子反应，则水解速率d s d t ，是与未断 1 ) 均聚合度： a 率。设聚合物 裂的缩醛键数 成正比的，即： d s d t = k ( n0 1 - s )( 2 ) 积分得： s ；( no - 1 ) 【1 - e x p ( - k t ) 1( 3 ) 式中s 与d 是水解进行时间为t 时的断键数目和降解程度；k 为 水解速率常数，所以 口= 1 一e x p ( 一k t )( 4 ) 在时间t 时，水解系统的平均聚合度为n n ，起始聚合度为no ， 则：n n = n o ( s + 1 )( 5 ) 合并式( 3 ) 和式( 5 ) ，消去s 得： 8 弧转 等= 导e 冲 等式两边分别取对数，则得： 乩卜n 掣肭 因此，一l n 【( no 一1 ) ，n 。 与水解时间t 应为直线关系。 由式( 5 ) 微分得： d n o d s ；no ( s + 1 ) 2( 8 ) 合并式( 8 ) 和式( 2 ) 可得 - d n n d t = k ( n02 一no )( 9 ) 当n 。值足够大时，则有： d n 。d t = k n0 2 ( 10 ) 壳聚糖是一种分子量较高的大分子物质，其n n 值很大，水 解过程中n n 的降低速率与所对应的n n 值有关，水解速率逐渐 变小。水解第二阶段，k 值变小水解速率则更加缓慢。壳聚 糖在酸性水溶液中的水解反应，起初水解速率常数较高，可能 是由于壳聚糖分子内存在某些“弱键”。即容易水解断裂的化学 键，这些“弱键”可能是： ( 1 ) 以葡萄糖的啦喃环结构为主少数链节具有呋喃环结 构。 ( 2 ) 存在少数戊糖的环状结构。 ( 3 ) 存在少数开环的半缩醛链节，如： 上述弱键较易水解，从而使壳聚糖在最初阶段具有较高的 水解速率常数。此外，壳聚糖聚集态结构中部分结晶和无定形 部分，无定形部分较易水解，这也影响着壳聚糖的水解速率1 37 。 9 轼 、 h 酸法降解简便易行，但产品分子量分布宽，同时产物分离 提纯困难，生产成本高，污染严重。19 9 7 年，e m m a n u e lb e l a m i e i 38 】 等人提出了壳聚糖固态降解法，即在少量水的存在下用氯化氢 气体对固体片状壳聚糖( 脱乙酰度大于9 7 5 ) 直接进行降解。 反应结束后，过量的氯化氢可以用干空气洗出回收，降低了生 产成本，减少了环境污染。但是由于固体壳聚糖中晶区分子链 排列比非晶区相对紧密，不易溶胀，造成了非晶区降解程度大 于晶区，使得产品的分子量分布较宽，均一性变差。 2 3 1 2 用n a n o2 降解 将壳聚糖溶解于质量分数为1 0 乙酸溶液中，在搅拌下缓 慢滴入一定量的n a n o2 溶液，于4 下静置一段时间，使- n h2 发生重氮化反应，脱去一分子n2 ，引起分子内重排使大分子链 断裂，再用n a b h4 还原端基，完成降解反应i3 9 】。这是传统的化 学降解方法，降解产物的分子量可以通过改变n a n o2 的加入量 和反应时间来控制40 1 ，国内常用此法降解壳聚糖并提取产物中 的单糖组分。该法的主要缺陷在于：( 1 ) 产品的分子量分布太 竟，均一性差：( 2 ) 降解过程中破坏了氨基，理论上加入l 摩 尔n a n o2 就要消耗1 摩尔氨基，而壳聚糖良好的生物相容性主 要由氨基提供，同时分子链上存在足够数量的氨基也是壳聚糖 进行进一步改性的重要前提，氨基数量的减少将会使壳聚糖的 应用受到限制：( 3 ) 生产的三废污染严重。 2 3 1 4 氧化降解 壳聚糖在氧化剂的存在下可以进行氧化降解。h2 02 是一种 很强的氧化剂，在酸、碱和中性条件下都可以使壳聚糖主链上 的1 5 ( 1 ，4 ) 糖苷键发生氧化而断裂，得到相对分子质量小于1 5 万的水溶性壳聚糖，其中以碱性条件下的氧化降解效果为最好。 h 2 02 氧化降解法中，较高的反应温度和h 2 02 浓度有利于降低 产物的分子量，提高水溶性壳聚糖的收率，但是工艺条件较难 掌握，反应的稳定性和重复性差；另一方面，若温度和h2 0 2 浓度过低，则需要延长反应时间，这会影响产品的外观品质。 研究表明，在6 0 7 0 、h2 02 的质量浓度为1 0 5 0 9 l 条件下 反应的重复性好，产品的外观品质高4 ，42 1 。用h2 02 氧化降解 壳聚糖无毒，无副产物，是一种理想的化学降解方法。另外， 氧化法中还有h2 02 高价氯化物法 43 1 、h2 02 酸法【44 1 、过醋酸 法【45 1 。 2 3 2 物理降解 2 3 2 1y 射线照射下的辐射降解 用y 射线辐射壳聚糖可裂解壳聚糖0 一( 1 ，4 ) 糖苷键，使壳聚 糖降解得到低聚壳聚糖。随着辐照强度和时间的增加，降解产 物粘均分子量及还原糖分子量减小，且降解产物分子量的均 性随着辐照剂量增加而提高i 46 t4 7 1 。 2 3 2 2 光降解 紫外线、可见光和红外线对壳聚糖的辐照也可以引起降解 反应，俗称光降解【4 引。当辐照光的波长小于3 6 0 n m 时降解反应 较明显。红外光谱分析表明，光降解过程中壳聚糖分子链上的 乙酰胺基葡萄糖单元发生脱乙酰化反应，导致氨基的数量增加， 同时使b ( 1 ，4 ) 糖苷键断裂，但降解过程中生成了羰基。 2 3 2 3 超声波和微波法 超声波和微波均具有一定的能量，选用适当频率和功率的 超声波和微波可能将壳聚糖分子结构中的键打断。实现壳聚糖 分子的降解反应 4 9 】。 微波降解壳聚糖过程伴随着脱乙酰反应，而超声波法降解 壳聚糖在降解过程中不会发生n h2 基被缔合的反应，壳聚糖的 n h 2 含量不随降解时间而变化。用微波处理过的壳聚糖溶液的 粘度会随存放时间的增加而减小，并且微波降解的过程中容易 出现局部过热、反应不均、发生交联反应等问题；超声波降解 只适合于在浓度极低的状态下进行。 2 3 3 生物降解 2 3 3 1 酶降解 壳聚糖酶是壳聚糖的专一水解性酶，自然界中的壳聚糖绝 大部分由壳聚糖酶催化水解成小分子，但是商业中壳聚糖酶的 价格昂贵，不易得到【5 0 5 2 1 。近年来研究发现许多种酶如蛋白酶、 脂肪酶、淀粉酶、葡萄糖酶和胰酶等对壳聚糖具有非专一性水 解作用，也可用来催化水解壳聚糖得到低分子量产品i 53 ，5 引。 酶解法反应条件温和，克服了化学降解产品分子量分布宽、 均一性差的缺点，酶的高度选择性有利于控制降解过程，得到 所需分子量范围的低聚壳聚糖；但生物法自身不可避免的一些 缺点使得该法在大规模生产中受到限制。总之，酶解法制备较 高收率的六至八糖在食品及医药方面( 抗癌药物) 有着良好的 前景：但要以经济成本进行大规模工业化生产，还需要进行更 深入的研究。 2 3 3 2 壳聚糖在人体中的降解 壳聚糖具有许多优异的生理活性，作为保健食品已投放市 场，一般市售壳聚糖产品分子量均在1 万以上，人体需对其进 一步降解方可消化吸收。人体中应用的壳聚糖如手术缝合线、 营养保健品及其它可吸收型医用植入材料等均是通过人体血清 中所含的溶菌酶降解后被人体吸收的。壳聚糖的氨基含量对溶 菌酶的催化活性有较大影响，随着氨基含量降低。溶菌酶催化 活性增强，脱乙酰度10 0 的壳聚糖不能被溶菌酶降解；但壳聚 糖对人体的生物相容性主要与其氨基含量有关，氨基含量增加， 有利于降低壳聚糖表面的z e t a 电势，增加其生物相容性，降低 组织排斥性：因而，综合两方面的因素，一般医用壳聚糖脱乙 酰度控制在6 9 73 。壳聚糖在人体中被溶菌酶水解的动力学方 程为： r 一( 1 - d e ) 4 式中，r 为壳聚糖在体内溶菌酶催化作用下的降解速度；d e 为 壳聚糖的脱乙酰度。 2 4 超( 近) 临界流体的特性 2 4 1 超临界流体概述 继固体、液体和气体之后，最近人们又发现了可称为物质 第四状态的超临界流体( s u p e r cr i t i c a lf l u i d s c f ) 。所谓超 临界流体是指物质的温度和压力分别高于其固有的临界温度和 临界压力时所处的特殊流体状态。当把处于气液平衡的物质升 温升压时，热膨胀引起液体密度减小，而压力的升高又使气相 密度变大，当温度和压力达到某一点时，气液两相的相界面消 失，成为均相体系，这一点就是临界点( cr i t i c a lp o i n t ) 。超临 界流体具有类似液体的密度、溶解能力和良好流动性，同时又 具有类似气体的扩散系数和低粘度，处于超临界状态的流体无 论在多大压力下压缩都不能发生液化，故可简单地认为超临界 流体是一种液体和气体的中间状态，即可称为“重的气体”、或 非常“松散的液体”。它具有许多独特的理化性质。 表2 1s c f 与其它流体的传递性质的比较 气体( 常温、 s c f 液体( 常温 物性 常压) t c 。p ct c ，4 p c 常压) 密度( g e m3 ) 0 0 0 06 0 0 0 20 2 0 50 4 0 9o 6 1 6 粘度，( m p a s ) 0 o l 0 0 30 0 l 0 030 0 3 0 0 90 2 一3 0 自扩散系数 0 1 0 40 7 10 “0 2 10 。 ( 0 2 - 2 ) 1 0 。5 ( c m 。1 s ) 2 4 2 超临界流体特性 超临界状态具有某些不平常的性质。临界点处在气液两相 的端点，对这一类的反常性质可用平均场近似理论来描述。而 更深层次的反常性质，则需用更精辟的热力学来描述，如采用 标度律( s c a l i n gl a w s ) 来理解。胡英也指出，实际工作中大量 1 3 遇到的是一般流体，或称经典流体，临界区由于其奇异性，则 是非经典流体。如a 1 br i g h t 等讨论了从临界区到非临界区的跨 界理论( cr os s o v ert h e o r y ) ，这在理论上是比较严格的，但在 实际应用中却并不方便。因此，也有研究这以工程应用为目的， 采用半经验的方法。 对单组分两相系统，在临界点时，一带) ，；o ，因此其等温压 缩率将有非常大的值。从相律知，在固定温度下，只要有两相 存在，则压力为定值。同样，因一t ：( 一o t ) 。：0 ，则在定压下，将热 c 。、o s 7 输入系统不会导致温度的升高，这只在某一定量的液体蒸发时 存在，否则意味着定压热容将是无穷大。但是等容热容确是定 值，因为在等容下加热，蒸气压和温度都在升高t 罂) 。 0 。 巴、嚣” 故在临界点，其状态为乓和时，一( 嚣) ，和c ，两者都将是无穷大。 当一( 嚣) ，= o ，压力不再是系统的一个“好”变量，因其局部密度 实际上不再受到压力的限制，即局部密度可在大于分子间距的 距离内紊乱的涨落，而密度的涨落会导致强烈的光散射，造成 目测的临界现象一临界乳光的出现。r o w l i n s o n 的分析把目测的 实验现象和热力学概念紧密的联系起来。 近临界点处，非热力学性质也出现了反常性质。如粘度测 量非常困难，其值或保持定值，或会有很小的发散。热导系数 则有更强的发散。扩散速度接近于零。介电常数和折射率没有 临界反常性。至少对非极性流体是如此，或者其反常性在实验 监测的范围内。 临界点的发散或反常性还会在超临界态中得到持续，但这 将呈衰减趋势。如在临界点，岛和时等温压缩率为无穷大， 但随着吖瓦值的增加。它将逐渐下降。在1 吖耳 0 9 9 c m3 ) ，水的扩散系数与水的粘度成反比关系，所以，可根 据水的粘度对水的扩散系数进行估算。此外，高温、高压水的 扩散系数还与水密度有关，随水密度增大而减少。 总之。超临界水的特性可概括为：具有特殊的溶解度、易 改变的密度、较低的粘度、较低的表面张力和较高的扩散系数。 2 6 超( 近) 临界水中的化学反应 2 6 1 超临界水降解反应 一般含有醚、酯和酰胺键的化合物在加入催化剂如酸等的 情况下，容易发生水解 6 0 】，如表2 2 所示。如前所述，在高温 高压下水的离子积增大，具备了酸催化剂的功能，因此这些化 合物在不添加酸催化剂而只加水的情况下也可分解。 表2 2 超临界水中废弃物聚台体的分解 以t o t i n s e n d 【6 0 1 为首的科学家在超临界水中进行了有关煤 的模型化合物的分解实验。实验表明，不直接结合的芳香环以 杂原子连接时，在超临界水中是很容易发生水解的。 超临界水降解反应的典型工艺流程如图2 3 ( a ) 和2 3 ( b ) 所 示。间歇式反应器如图2 3 ( a ) 所示，壳聚糖首先在反应釜中进 行反应，然后骤然降温来终止反应。为了进行进一步的动力学 研究，需要用连续式的反应装置。但由于壳聚糖不溶于水，所 以采用高压浆料泵连续输送甲壳素浆料，装置如图2 3 ( b ) 所示。 甲壳素浆料在通过加热器时被瞬间加热至反应温度，反应被引 发，产物从反应器的出口流出后经过冷却器被迅速冷却，反应 终止。 图2 3 f 4 1 壳聚糖超临界及近临界水降解间歇式反应器 1 9 浆蔽泵泵3 图2 3 ( b ) 壳聚糖超l 临界及近临界水降解连续式反应器 2 6 2 近临界水中的化学反应 近临界水( n e a r cr i t ic a lw a t e r ，简称n c w ) 在许多方面具有 与s c w 相似的性质，具有两方面主要的特征即一个相对高密 度、高温的气相，一个相对低密度( 0 5 0 8 m g m l ) 、高温的液 相。 在近临界状态下，同时发生气相反应和液相反应。 气相：以游离自由基反应为主，再加上热分解、脱氢、脱 水缩合等反应交替进行。 液相；以离子反应为主，同时因有反应活泼的热水分子的 作用而发生水解反应。 在近临界状态下，可通过调节容器内水的比例、反应物的 量、温度、压力等因素，来控制各反应的优先程度。例如。利 用近临界水氧化技术处理污泥，有以下的反应发生：( 1 ) 污泥 的液化( 可溶化) 技术，是利用了近 临界状态下所有气相反应 和液相反应。( 2 ) 污泥的油化( 污泥制油技术) ，是使近临界状 态下的气相反应，即热分解、脱氢、脱水缩合等反应优先进行。 2 7 国内外应用研究现状 国内外至今还没有见到详细探讨壳聚糖超临界水解制取寡 糖的文献报道，只有为数不多的几篇文章提到了壳聚糖超临界 2 0 水解最终产物为葡胺糖【6 。6 3 】。5 _ i 尻雅文 6 4 1 等人开展了以回收废 弃生物原料为目的超临界水解工艺开发的研究，他们利用微分 反应器，以纤维素的分解为例解析了生物原料在超临界水中的 反应速度理论。用浆料泵供给纤维素浆，再将其与别的地方供 给的超i 临界水混合，使浆液在瞬间升温至超临界状态而完成降 解。在近临界状态以下水的密度几乎不随压力的变化而变化 因此纤维素的水解速度不随压力的变化而变化；但一旦进入近 临界状态，反应速度会急剧加大。超临界水中纤维素的如水分 解速度和以前的稀酸法及浓酸法相比快了l0 0 10 0 0 倍【6 5 l 。 a r m 等人研究了咀超临界水为反应介质。以含量2 的酸为催 化剂，以纤维素、木质素、甲壳素、壳聚糖、丝、尼龙、聚酯、 聚亚胺酯、聚乙烯、聚苯乙烯和聚丙烯等为原料的工艺过程i 6 6 】。 但是除了纤维素外，其它的原料都没有比较完全的数据结论。 2 i 第三章实验部分 3 1 实验主要材料、分析仪器及实验装置 3 1 1 实验材料 表3 1 实验原料和药品 3 1 2 分析仪器 f t i r 型红外光谱仪 7 2 2 光栅分光光度计 t l cs c a n n e r3 型薄层扫描仪 g f 25 4 高效硅胶板 5ul 微量注射器 薄层色谱连续展开仪 乌氏粘度计 日本株式会社岛津制作所： 上海第三分析仪器厂； 瑞士卡玛公司： 青岛海洋化工厂： 上海医用激光仪器厂： 上海玻璃仪器一厂； 上海玻璃仪器二厂。 3 1 3 实验装置 一、分批式超临界流体反应装置 实物照片如图3 1 所示，实验主要装置的规格如下： ( 1 ) 反应釜：采用不锈钢( 1c r 18 n i 9 t i ) 制成，釜内容积为 8 0 0 m l ，耐压5 0 m p a ，耐温4 0 0 。搅拌直流电机装在釜体下部， 通过磁力带动釜体内磁搅拌。 ( 2 ) 手动泵：j b i i i 型，工作压力5 0 m p a ，每泵容积2 10 m l 。 ( 3 ) 缓冲容器：容积2 0 0 m l ，压力5 0 m p a 。 ( 4 ) 压力表：量程6 0 m p a ，精度0 4 ，上海自动仪表厂生产。 ( 5 ) 单向阀：耐压5 0 m p a ，接管内径曲5 m m ( 6 ) 高压三通：耐压5 0 m p a ，接管内径毋5 m m ( 7 ) 冷却器：螺旋结构，内由毋3xlm m 2 高压管线绕成螺旋 状，釜由不锈钢板卷焊而成，冷却水压不大于0 5 m p a ，经过冷 却器冷却，保证温度能从4 0 0 降低到4 5 以下。 ( 8 ) 可控硅直流调速器：z k s 型，搅拌速度0 l5 0 0 r p m 。 ( 9 ) 温度传感器：p t l0 0 ，量程0 6 0 0 图3 1 分批式超临界流体反应装置 二、其它实验设备 表3 2 实验仪器 3 2 实验影响因素及条件控制 3 2 1 实验影响因素 壳聚糖在超( 近) 临界水中的水解受反应温度、反应压力、 反应时间、催化剂等因素的影响 62 】，各影响因素对壳聚糖在超 临界水中水解的影响规律分述如下： ( 1 ) 时间和温度 时间和温度影响反应产物的组成。通常，在临界点以上， 随着温度的升高固体颗粒和液体产物减少，而气相产物增多。 因此高温可被用于平推流等短时间的处理系统，或者是需要大 量的c i 到c 1o 挥发性物质的情况。在近临界状态，长时间的反 应与短时间超临界状态下的反应相似。 ( 2 ) 压力：在纤维素的超临界水解过程中，纤维素的分解 速度在加压时会加快，但葡萄糖的分解反应速度却在加压时减 慢，这是因为葡萄糖分解反应中的主要阶段分子内脱水和低分 2 4 子化在高压下受到抑制的缘故1 6 4 】。 ( 3 ) 金属离子：反应体系中的金属离子通常使得产物的挥 发和半挥发成分变得较单一，石英衬里的反应器可以避免这一 效应，使反应产物更加复杂。如果需要使反应产物变得交单一， 或者沉淀出不需要的产物，可以加入不同的金属。如c u 2 + 的加 入可除去噻吩。钛金反应器被用于强酸和强碱的反应中。 ( 4 ) 氧化和还原物质：近临界或超临界反应体系应尽可能 地减少氧气的存在，否则一些碳将以c o 和c 0 2 的形式损失掉。 a r 和其它惰性气体使系统的脱氧变得容易，并且可以回收纯化 而再次使用。还原性反应物质如h2 可用来降低芳香类物质和不 饱和物质的生成量。还原性物质如硼氢化纳使反应产物变得像 凝胶和二氯甲烷( 不可溶，与润滑油或者原油冻相似) 。加入硼 氢化纳后挥发性和半挥发性物质大量地减少。 ( 5 ) 酸：壳聚糖的超临界水解反应在没有酸的情况下可顺 利进行，但在添加少量酸后可以有效地提高葡胺糖的得率。 3 2 2 实验条件控制 本实验中有几个控制因素：温度、压力、反应时间、催化 剂用量。它们的控制方法如下： ( 1 ) 温度 水的临界温度为3 7 4 1 ，超l | 缶界及近临界水解壳聚糖的实 验可在此温度左右进行。反应釜体壁内装有电加热管，传热速 度快，加热效率高。由智能温度显示调节仪设定并控制实验所 需温度，温度的正负误差为2 度。 ( 2 ) 压力 反应系统的压力是由手动泵及反应体系的手动放空阀和出 口管路上的安全阀来调节，压力数值由精密压力表指示。 ( 3 ) 反应时间 实验中当温度到达设定的温度后，保持设定的反应时间，关 闭加热器，然后迅速放出，通过缓冲罐和冷凝器后冷却至6 0 2 5 以f 。 ( 4 ) 催化剂用量 实验中以无水冰醋酸为催化剂。 本实验在不加酸的情况下也可顺利进行，但在添加少量酸后 可以有效地