（光学工程专业论文）激光共焦生物芯片扫描仪中的图像重建与分析.pdf

浙江丈学硕上学位论立 摘要 近l o 多年来，国内生物芯片技术的发展备受瞩目，在生命科学研究、疾病 诊断、新药开发、生物武器、司法鉴定、食品卫生监督等等领域已越来越被广泛 运用。然而在生物芯片技术中的重要组成部分之一生物芯片的检测设备却几 乎一直依赖国外的产品，其垄断性的昂贵价格，加上复杂的专业分析操作，对我 们生物芯片的应用推广造成了许多障碍。因此，开发具有自主知识产权的检测扫 描仪具有深远的意义。 本文提出了种新颖的激光共焦生物芯片扫描仪。仪器基于激光共焦显微镜 的理论，采用振镜和远心线性成像物镜实现x 向扫描；精密导轨和步进电机实 现y 向扫描的检测仪，经验证，扫描仪具有快速、操作简单、检测芯片能力良 好等特征，有望弥补市场的空缺。 在本论文中，首先介绍了生物芯片技术的内涵，对检测系统的结构进行了比 较分析，提出了检测仪的结构特点和存在的问题的解决方案。重点给出了检测系 统研制中，信号的采集与传输的硬件和软件实现，实现了良好的无损数据采集和 实时图像重建；然后通过采集成像实验，对扫描仪的性能参数即分辨率和灵敏度 进行扫描分析，对系统结构加以调整和改进，最终达到了5 u m 分辨率和接近l 荧光分子u m 2 的灵敏度指标。最后给出了深圳益生堂公司提供的丙肝病毒抗体蛋 白芯片h c v 芯片的检测实验结果。 浙江大学倾上学位论文 a b s t r a c t i nt h e p r e s e n t t e n y e a r s ，d o m e s t i cb i o c h i pt e c h n i q u eh a s b e e n d e v e l o p e d e n o r m o u s l y , a n da p p l i e d t om a n yf i e l d s ，s u c ha sl i f es c i e n c e r e s e a r c h 、d i a g n o s i s 、n e w d r u gd e v e l o p m e n t 、b i o - w e a p o nw a r 、j u d i c i a le v a l u a t i o n 、f o o d sa n de n v i r o n m e n t s u p e r v i s ee t c h o w e v e r , t h eb i o c h i pa n a l y z e r , w h i c hi so n ei m p o r t a n tp a r to fb i o c h i p t e c h n i q u e ，i sa l m o s ta l ld e p e n d e do nf o r e i g no n e s a n df o rt h et w of a c t o r so fh i g h p r i c e b e c a u s eo fm o n o p o l ya n dc o m p l i c a t e du s em e t h o db e c a u s eo fa d a p t i n gt o r e s e a r c hf i e l d ，i tb r i n g sm a n yo b s t r u c t i o nt ot h ea p p l i c a t i o na n ds p r e a do fb i o c h i p t e c h n i q u ei n o u rc o u n t r y s oi ti sag r e a ts i g n i f i c a n c et or e s e a r c ha n dd e v e l o pa b i o c h i pa n a l y z e r t h a to w no u r s e l v e si n t e l l e c t u a lc o p y r i g h ta n d o rp a t e n t an o v e ll a s e rc o n f o c a lb i o c h i ps c a n n e rw a s g i v e ni nt h i sp a p e r i tw a sb a s e do n t h e p r i n c i p l e o fl a s e rc o n f o c a l m i c r o s c o p e a n d t h et w o d i m e n s i o n a l s c a n n i n g c o n f i g u r a t i o nw a s a d o p t e db yt h eo p t i c a ls c a n n e ra n dt h et e l e c e n t r i cl i n e a ri m a g i n g o b j e c t i v el e n so fl a r g en u m e r i c a la p e r t u r et or e a l i z ex - d i r e c t i o n ss c a n n i n g ，a n dt h e c o n v e n t i o n a lm e c h a n i c a lm e t h o d u s i n g l i n e a rd r i v e ra n dl i n e a r g u i d e t r a c kt o y - d i r e c t i o n s t h ee x p e r i m e n tr e s u l t si n d i c a t et h a tt h ed e v i c ec a nr u ns m o o t h l ya n d r a p i d l y , b eo p e r a t e de a s i l ya n d d e t e c tf l u o r e s c e n c ee f f e c t i v e l y t h eb i o c h i pt e c h n i q u ea n dt h ed e t e c t i o nm e t h o d sw e r ei n t r o d u c e dd e t a i l e d l y f i r s t l yi nt h ep a p e r , t h e nt h ec h a r a c t e r i s t i co f t h es c a n n e rr e s e a r c h e da n dt h ep r o b l e m a n dr e s o l u t i o no fi tw e r ep u tf o r w a r d m a i n l yt h e s i g n a lp r o c e s s i n g a b o u tt h e r e a l i z a t i o no f s i g n a ld a t aa e q u i s i t i o na n dr e a l t i m ei m a g i n g ，t h eh a r d w a r es e t t i n ga n d s o f t w a r ep r o g r a m m i n gw e r ep r e s e n t e d n e x t ，o nt h eb a s i so fl o t so fe x p e r i m e n t st h e p e r f o r m a n c ep a r a m e t e r s a b o u tt h er e s o l u t i o na n ds e n s i t i v i t yo ft h es c a n n e rw e r e d i s c u s s e d a n db ya d j u s t i n ga n dm o d i f y i n gt h es y s t e mc o n f i g u r a t i o n ，i t sr e s o l u t i o n r e a c h e d5m i c r o na n ds e n s i t i v i t ya b o u to n ef l u o r e s c e n tm o l e c u l ep e rs q u a r em i c r o n i nt h ee n dt h e e x p e r i m e n tr e s u l t s o ft h e b i o c h i pw h i c hw a sg i v e nb ys h e n z h e n y i s h e n g t a n gb i o l o g i c a lp r o d u c t sc o ，l t dw e r ei n t e r p r e t e d 4 浙江大学硕i ：学位论义 1 研究背景和意义 绪论 生物芯片技术是9 0 年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，是融微 电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的高新技术，具 有重大的研究价值，又具有明显的产业化前景。在基础研究方面，生物芯片可用 于如下研究：药物研究：新靶标、新药物等的研制，查找药物的毒性或副作用， 进行毒理学研究等；疾病诊断：如传染病、肿瘤、遗传病及心血管疾病等的诊断； 基因结构与功能研究：包括基因序列分析、基因诊断、基因表达研究、基因组研 究、基因突变和多态性检测、发现新基因等。在产业化方面，由于芯片的高度使 用价值，在最近短短1 0 多年，各种芯片和配套设备产业带来了巨额利润，是增 长最快的产业领域之一。生物芯片及配套技术的研究不仅是一门科学，更是一项 高科技产业，是今后生命科学领域中的个重要的技术平台。 在生物芯片的制备和研究方面，国外的一些研究机构和企业已发展得相当成 熟，在国内，也已经颇有建树，不断有新的技术成果和产品推出，尤其在应用型 芯片的研制和生产上，有大量新产品出现并投入使用。国内目前即将进入i 临床应 用的芯片有，深圳益生堂公司生产的丙肝病毒抗体蛋白芯片，近期内将投入应用 的生物芯片有艾滋病毒抗体蛋白芯片、梅毒螺旋体抗体蛋白芯片、乙肝病毒耐药 基因检测芯片、骨髓移植配型基因芯片、p 5 3 n r a s k r a s 基因突变寡核苷酸芯片 等，近年内在丌展应用的有过敏源检测芯片、优生优育检测芯片、结核杆菌耐药 检测芯片，1 3 一内酰胺类耐药检测芯片等，另外还有大量研发中的芯片将来可望 进入市场。这些芯片作为一种新型的生物医学信息获取的手段，在数量众多的各 级医院、诊所、血站、检疫部门，以及其他医疗卫生和行政机构的大规模应用是 必然趋势。 生物芯片技术除了指生物芯片的制备外，芯片的信息检测也是其中关键的内 容，检测性能的好坏直接制约其技术的发展。而在目前，国内采用的分析仪器全 部来自国外近几年来的发展产品，这些产品都是面向研究使用，价格昂贵，我国 已经引进的此类设备几乎全部为研究结构和芯片制造机构所拥有。我国的应用型 浙江大学坝l ：学位论文 生物芯片研究和丌发走在世界前列，而对芯片信息检测技术，国内却还没有实用 的相关产品出现推广使用，如中国科学院光电技术研究所在技术上丌展了研究， 但要形成最终的实用系统，仍然还有一些技术问题需要攻克。如果生物芯片分析 设备完全依赖进口，大多数机构诸如医疗卫生机构在购买国外扫描仪时会面临严 重的经济负担，这种状况在很大程度上将限制国内生物芯片技术的广泛应用和持 续发展。 作为生物芯片应用必不可少的信息获取和分析设备，生物芯片扫描仪的应用 目标和产业前景是不言而喻的，反过来，性能优越、价格低廉、使用方便的分析 设备又将进一步促进生物芯片的研发，在全球经济体化形势下，有利于国际范 围的竞争。国内市场自2 0 0 0 年1 0 月丌始对生物芯片扫描仪的需求量丌始上升， 生物芯片分析设备成了芯片应用的瓶颈。另外，国外也在积极开发，使过去面向 研究的工作转向应用型的产品，并进一步降低成本，这将导致进一步形成产业垄 断。因此，研究和开发具有创新设计、面向应用的新一代生物芯片分析仪器是 项十分迫切的任务，也是具有很大的意义。 2 研究现状 目前国外主要的技术相对成熟的生物芯片扫描仪有多家，如g e n o m i c s o l u t i o n s 公司的g e n e t a c 系列，a x o ni n s t r u m e n t s 公司的g e n e p i x 系列，g e n e r a l s c a n n i n g 公司的s e a n a r r a ys e r i e s 系列，p a c k a r d 公司的b i o c h i pi m a g e r 系列， m o l e c u l a r d y n a m i c s 公司的a v a l a n c h e 系列，g e n e t i c m i c r o s y s t e m s 公司的g m s 4 1 8 a r r a ys c a n n e r 系列等等。生产的c c d 成像或激光共聚焦扫描成像的系统，技术 发展更新相当快，其系统的分辨率和灵敏度达到挺高的指标，大多数仪器的分辨 率可以达到5 u m ，灵敏度达到0 1 m o l e c u l e sf l u o r g m 2 ，这对当今生物芯片的研究 推广使用，提供了良好的工具。 但是国外研制的生物芯片扫描仪仍然存在一些问题，例如1 、扫描成像速度 慢，费时。扫描仪的两大主流c c d 型和激光共焦扫描型，前者因灵敏度低，分 辨率不高，且噪声比较大，决定了p m t 型，即后者成为了发展主流，而激光共 聚焦成像系统是点成像，为了得到芯片的全部信息，必须进行二维成像扫描，这 样就大大降低了扫描检测速度。2 、成本高，价格昂贵。复杂的成像装置和微机 浙江大学硕上学位论文 组合，复杂的手工操作要求而附带的给专业人员的培训，进口的附加值等，种种 的技术和非技术因素导致仪器价格上扬，这对我们国内一些非专业研究机构和应 用机构带来了相当大的成本问题。3 、在我们使用过程中，发现国外的仪器还存 在如噪声大，对仪器的摆放工作台要求有减震能力等问题。4 、针对医院临床应 用，在国外扫描仪的扫描图像的表达分析中，成像分析参数选择、靶点定位和 识别、结果的解释都需要交互式分布完成。这样的工作方式与临床的其他的渗断 仪器的样品一报告式自动检验过程非常不同，效率低下，对操作人员要求高。因 此，以上所有问题导致了此类扫描系统难以在国内普及。 在国内，有研究所也在从事扫描仪的研发，如中国科学院光电技术研究所， 研制了c c d 生物芯片监测仪和激光共聚焦生物芯片扫描仪，性能良好，但仍存 在扫描速度、外形庞大等不足。 3 课题任务和论文的主要内容 本课题组研制的系统从加快扫描速度、降低生产成本、简化分析过程，面向 国内县级以上医院和相关机构推广使用的角度出发研制，采用光机结合的二维扫 描技术，代替国外扫描仪普遍采用的全机械二维扫描技术，极大提高扫描速度， 并且减少振动噪声，提高仪器使用寿命：采用分时复用的方法实现双波长激光扫 描，消除国外仪器双波长扫描时存在的c r o s s t a l k ( 串扰) 问题，减少了一个多 余的探测器降低生产成本；采用微阵列图像自动分析的图像处理算法，减少劳动 力，很好解决了上述问题。研制的目标是分辨率达到5 u r n ，灵敏度高于l m o l e c u l e s f l u o f f p m 2 。 本论文详细介绍了关于双波长激光共焦生物芯片扫描仪的各种概念理论，扫 描仪的结构选取和部分光路的关键器件设计，实现p m t 模拟信号的采集编程、 图像实时重建，微阵列图像的图像处理方法和生物信息的数据提取，实验结果与 分析。综上所述，本论文的主要内容安排如下： 第一章：激光共聚焦生物芯片扫描仪的概述：包括生物芯片的概念、发展和 应用，荧光物质的性质，生物芯片杂交信号检测的方法。 第二章：扫描仪的结构研究：包括共聚焦原理，系统分析了国外常见实现共 焦二维扫描的结构特点，提出具有创新技术的采用光机结合的二维扫描的结构， 浙江人学颂士学位论文 详细分析了其结构特点，从理论上与实验中验证了可行性。另外从理论上分析了 光路中的一关键器件光束分离器的设计，给出实验的设计结果。 第三章：扫描仪的信号采集硬件系统，分析了p m t ( 光电倍增管) 和p c i 数据采集卡的类型和特征，提出采用凌华公司的p c i 一9 1 11 h r 数据采集卡完成数 据采集任务给出采集卡的特殊硬件设置。 第四章：数据采集的软件实现，系统给出了采集卡的运行实现、图像实时重 建的软件编程和图像的无压缩保存。光机结合的二维扫描中x 向为往返全程连续 扫描，信号采集面临单程数据提取且成像中行对齐问题，本文给出软件方式实现 采集卡缓冲区中的有效数据提取，并利用采集卡的双缓冲数据循环处理方式实现 图像实时显示，并实现图像的t i f f 格式保存。 第五章：介绍微阵列图像的处理方法和数据提取；实验结果：对分辨率板和 灵敏度板进行扫描、数据采集成像，分析了系统的分辨率和灵敏度参数，并对益 生堂提供的h c v 芯片进行重建和数据分析。 第六章：总结和展望：总结本文所作的内容，提出课题进展中存在的一些不 足和尚需进一步展开的工作。 浙江大学预i ：学位论艾 第一章激光共焦生物芯片扫描仪的概述 生物芯片的分子反应信号的检测是生物芯片技术的重要组成部分，它主要包 括杂交信号的产生、信号的收集与传输以及信号的成像图像处理和识别3 个部 分。本论文以上述三个部分分别进行了阐述，杂交信号的产生涉及光路结构的设 计，信号的收集采用p c i 数据采集卡编程实现，扫描芯片成像即微阵列图像的数 据分析。本章首先介绍了生物芯片概念、发展和应用，及实现荧光检测的方法。 1 1 生物芯片的概念 8 0 年代初国际上提出“生物芯片”这一名词形象地把微电子集成电路技术 与生物活性分子功能进行了结台，提出构建具有生物活性的微功能单元，进行信 息的获取、贮存、处理相传输，达到仿生信息处理的目的。后在9 0 年代生物芯 片( b i o l o g i c a lc h i p ) 概念定义为采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量 生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固 化于支持物( 如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体) 的表面，组成密 集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器 比如激光共聚焦扫描仪或电荷耦合器件( c c d ) 对杂交信号的强度进行快速、并 行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量【l j 。 根据芯片上的固定的探针不同，生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞 芯片、组织芯片；根据原理分则有元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物 传感芯片等新型生物芯片：而如果芯片上固定的是肽或蛋白，则称为肽芯片或蛋 白芯片，如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探针或d n a ，就是d n a 芯片。由于 基因芯片( g e n e c h i p ) 这一专有名词已经被a f f y m e t r i x 公司注册专利【2 】 因而其 他厂家的同类产品通常称为d n a 微阵歹i j ( d n am i c r o a r r a y ) 。这类产品是目前最 重要的一种，有寡核苷酸芯片、e d n a 芯片和g e n o m i c 芯片之分，包括二种模式： 一是将靶d n a 固定于支持物上，适合于大量不同靶d n a 的分析，二是将大量 探针分子固定于支持物上，适合于对同一靶d n a 进行不同探针序列的分析。 浙江大学顾i ：学位论文 1 2 生物芯片的发展 生物芯片是由美国旧会山以南的一个新兴生物公司a f r y m e t r i c 首先发展起来 的f 3 】，1 9 9 1 年，公司f o d o r 领导的小组对原位合成制备的d n a 芯片做了首次报 道，他们利用光刻技术与光化学合成技术相结合制作了检测多肽和寡聚核昔酸的 微阵列( m i c r o a r r a y ) 芯片【4 】【5 i ，用该方法制作的d n a 芯片可用于药理基因学研 究与基因重复测序工作 6 1 。这一突破性的进展使生物芯片技术在世界范围内丌始 得到重视。随后，近1 0 多年的发展，各种技术的进步，生物芯片的应用范围不 断扩大，科学家们采用了各种微加工技术在硅、玻璃、塑料等不同基质上加工制 作了各种芯片。国际上先后成立的几十家生物芯片公司蓬勃发展，开发了具有自 身特色的技术。如最早涉足的a f f y m e t r i c 公司丌发了多种基因芯片，并部分投入 了商业使用。h y s e q 公司开发的薄膜测序芯片，采用了在已知序列的探针上做标 记，每次用不同的探针去与未知序列的d n a 片段杂交，通过检测荧光得知待测 d n a 片段的序列，s y n t e n i 公司( 现已为i n c y t ep h a r m a c e u t i c a l 并购) 研究了一种用 玻璃作载体的d n a 芯片，利用两种不同的荧光标记物，可同时在芯片上检测诈 常的信使r n a 与受疾病或药物影响后的信使r n a 的表达情况。n a n o g e n 公司采 用电场以主动出击的方式来操纵芯片上的d n a 片段进行杂交，使其系统的反应 速度比一般的让d n a 随机扩散寻找固化杂交探针的被动式检测更快。除了各公 司，国际上许多高校也在进行生物芯片的研究。最近，我国的清华大学、复旦大 学、东南大学、军事医学科学院和中国科学院等机构也丌始了这方面的研究工作。 生物芯片结合了寡核萤酸合成、固相合成、p c r 技术、探针标记、分子杂交、 大规模集成电路制造技术、荧光显微探测、生物传感器及计算机控制和图像处理 等多种技术，充分体现了学科交叉的巨大潜力。至于我们国家，如果各方面重视、 组织得当、加大资金投入力度、重视知识产权的保护，相信不久的将来我国在浚 领域中也会占有一席之地。 1 3 生物芯片的应用 生物芯片技术之所以成为生物学世纪最激动人心的技术，就是因为能够用相 对简单快捷的流程，解决以往极其复杂、十分耗时甚至不可能完成的工作，目前 0 浙江大学颂士学位论文 生物芯片技术已经广泛应用到生物学研究的各个领域，尤其在人类基因组学研 究，包括基因序列分析、基因诊断、基因表达等研究临床医学，如传染病、 肿瘤、遗传病及心血管疾病等的诊断：药物筛选，如新靶标、新模型、新药物等 的研制，查找药物的毒性或副作用等【8 1 ；农业研究，如通过基因分析进行优种选 择，农作物病虫害检疫等，在这些领域带来革命性影u l j j t 9 j 。 尽管生物芯片技术已经开始得到广泛重视，但要使得芯片成为实验室研究或 临床可普遍采用的技术，仍有一些关键的问题亟待解决，比如对于生物芯片的制 作，要提高生物芯片的特异性、重复性、简化样品制备和标记操作；对于其检测， 要增加信号检测的灵敏度、优化扫描条件和检测设备等，生物芯片的检测仪器也 是生物芯片技术能否更好推广更好利用的关键之一。 1 4 生物芯片的荧光物质 生物芯片是采用分子杂交原理进行工作的，其基本做法是将要检测的样品加 以标记，然后与己知的芯片上的探针进行充分杂交，再加以脱洗后用图像显示结 果，然后通过计算机处理来检测待测样品所表达的有关生物信息。由于生物芯片 本身的结构及性质，需要确定杂交信号在芯片上的位置，尤其是大规模生物芯片 由于其面积小，密度大，点样量很少，所以导致杂交信号较弱，需要使用光电倍 增管或冷却的c c d 相机等弱光信号探测装置，此外，大多数生物芯片杂交信号 谱除了分布位点以外，还需要确定每一个点上的信号强度，以确定是完全杂交还 是不完全杂交，因而探测方法的灵敏度及线性响应也是非常重要的。 标记的目的是使待测的样品带上可检测到的示踪标记，是探测系统的信号的 来源。常用标记物有核素标记物和非核素标记物，核素标记的核酸探针敏感性高， 但杂交信号的检测有时要较长的时间，非核素标记的探针因其具有安全、无放射 污染、稳定性好和显色快等优点因而应用普遍，荧光标记属于非核素标记。在生 物芯片的研究中，使用荧光标记物的最多。究其原因，除了其安全性，稳定性外， 还与相应的采用的探测方法有关。目前采用荧光标记的探测方法最多、最成熟。 由于荧光显微镜可以选择性的激发和探测样品中的混和荧光标记物，并具有很好 的空间分辨率和热分辨率，特别是当荧光显微镜中使用了共焦激光扫描技术时， 分辨能力在实际应用中可接近由数值孔径和光波长决定的空间分辨率，而在传统 浙江人学坝：i ：学位论文 的显微镜是很难做到的，这便为生物芯片进一步微型化提供了重要的检测方法的 基础。采用荧光作标记的理由就在此j 。 在光致发光中，如果用一定波长的光( 激励光) 照射某种物质时，物质在极 短的时f b l ( 1 0 9 s ) 内，能立即发射出颜色和强度各不相同且比激发光( 也称吸收 光) 波长更长的光，并随着激发光的消失而立即消失，此种光称为荧光。荧光物 质( 荧光素) 在受到激励光激发后释放出一定强度的荧光，在某一个波长下产生 最高释放强度，并有各自的激发吸收值。图1 1 为常用的3 种荧光物质f l u o r x ， c y 3 ，c y 5 的荧光发射曲线。表1 1 为上述三种物质的各自吸收峰值和发射峰值 波长激光激发波长。 一 4 0 0 4 5 0 5 0 05 5 0 6 0 06 5 07 0 07 5 0 8 0 0 幽1 1f l u o r x ，c y 3 c y 5 三种荧光物质的荧光发射曲线图 表1 1f l u o r x ，c y 3 ，c y 5 三种荧光物质的吸收峰值和发射峰值波长 及激发激光器波长 g 羔!垒! q 鱼鱼z垦! 生坚! ：堕鱼垒! 兰：! c y 3 5 5 2 5 6 8g r e e nh e - n e5 3 2 从表中的数值可以看出，荧光物质的发射峰值波长比吸收峰值波长要长，两峰值 波长的差值称为斯托克斯位移( s t r o k es h i f t ) ，这一现象在生物芯片使用的染料中 普遍存在。激发波长的选取就与斯托克斯的位移相关，设计者需通过阅读和分析 某种荧光染料的激发曲线和释放曲线来确定适合某种染料的复合扫描激发波长， 该波长的激发效率至少要达到5 0 7 0 的水平。激发波长要避免太接近释放高i 唪 对应的波长，否则荧光信号受到干扰。所以生物芯片多选用激发波长较长、斯托 克斯位移较大的荧光物质标记，以提高芯片测定的稳定性，降低背景噪声，提高 灵敏度。在我们的实验中，选择了c y 3 ，c y 5 两种染料。 撒啪舯 o 浙江人学硕 ：学位论文 荧光释放强度在某一范围内，与激发光的强度成正比，当荧光释放达到最高 峰后，会出现荧光释放达到饱和或光子将染料破坏淬灭情况，此时增加激发光强 度不能提高释放强度。因此在此要选择合理的激光器的功率。生物芯片上各点的 荧光分子受到激发后，从各个方向释放荧光光子，散射成球状，扫描仪采集这些 散射的光子，由于扫描仪使用的是很低的释放光，几何球状是设计扫描设备的主 要根据，涉及采集效率的问题。 1 5 生物芯片荧光信号的检测 生物芯片在与荧光标、庀的目标抗原或抗体结合后，必须用扫读装置将芯片测 定结果转变成可供分析处理的图像数据，这便是生物芯片的荧光信号检测。检测 原理即为，在激发光激励下，含荧光标记的生物分子片段发射荧光。样品与探针 严格配对的杂交分子的热力学稳定性较高，所产生的荧光强度最强；不完全杂交 的双链分子的热力学稳定性较低，荧光信号弱；不能杂交的，则检测不到或只能 检测到芯片上原有的荧光信号，检测过程中，除了需要确定高密度杂交点在芯片 上的荧光位置外，还需要确定每一点上的荧光信号强度，以确定是完全杂交还是 部分杂交。 荧光信号的检测方法有多种，如荧光显微镜、隐逝波传感器、光散射、表面 共振、电化传感器、化学发光、荧光各向异性等等，但并不是每种方法都适用于 生物芯片。经过几十年来的技术发展，生物芯片的荧光探测一般根据采用的光电 探测的类型或激发光源的不同分类，对于不同的探测器，可以将检测方法分为光 电倍增管型和c c d 型，根据激发光源的不同，可以将其分为激光型和非激光型 1 3 1 。常用的探测器主要有光电倍增管和c c d 光电传感器，其检测手段为激光显 微扫描技术和c c d 扫描技术，都是在入射照明式荧光显微镜基础上发展起来的。 荧光显微镜可以选择性的激发和探测样品中的混和荧光标记物，并且具有很好的 空问分辨率和热分辨率，特别是当荧光显微镜中使用了共焦激光扫描时，分辨能 力在实际应用中可接近由数值孔径和光波长决定钓空间分辨率，这对生物芯片的 微型化提供了重要的检测方法的基础。 目前，商业化的生物芯片扫描仪主要有两大类型：激光共焦生物芯片扫描仪 和c c d 芯片扫描仪。 浙江人学硕士学位论文 1 5 1 激光共焦芯片扫描仪 激光共焦芯片扫描仪以激光作为激发光源，产生较高强度的发射荧光，可极 大提高检测灵敏度。在生物芯片分析中，靶分子常常用2 种或2 种以上的荧光物 质作标记，通过荧光光密度之比来减少或消除测定时某些干扰，以减少实验误差， 提高实验的可靠性。因此，目前商业化的此类扫描仪，多采用两种或两种以上的 不同波长的激光器作为激发光源，多的可达到四种，以激发不同荧光物质标记的 靶分子【1 4 1 。常用的激光器有氩离子激光器、氩氪离子激光器、氦氖激光器等，波 长可从4 8 8 n m 至近红外。 激光扫描共焦扫描仪的结构与激光扫描荧光显微镜的结构非常相似。荧光显 微镜的方法是将处理后的芯片固定在计算机控制的二维传动平台上，将一物镜置 于其上方，由激光器产生的激发光经滤波后通过物镜聚焦到芯片表面，激发荧光 标记物产生荧光，光斑半径约为5 1 0um ，同时通过同一物镜收集荧光信号经另 滤波片滤波后，由冷却的光电倍增管探测，经模数转化后为数字信号，通过计 算机控制传动平台x y 方向上步进平移，生物芯片逐点照射，所采集荧光信号构 成杂交信号谱型，送计算机分析处理，最后形成图像。用这种方法可以得到高分 辨率、质量好的图像结果。非常适用于大规模生物芯片杂交信号的检测。而对比 荧光显微镜，激光共焦扫描仪采用了共焦技术，更具优越性。原理图如1 2 示1 ： 二二色 图1 2 激光共焦荧光检测原理闰 激光光源 浙江人学坝士学位论文 由图可以看出，扫描仪采用了共轭焦点技术，使光源、生物芯片和光电倍增管探 测器处在了彼此对应的共轭位置。因共焦显微镜具有非常好的纵向分辨率，在检 测中，光电倍增管只接收通过探测针孔( 低通空间滤波器) 的光，而来自生物芯 片其他部位的杂散光因在共焦针孑l 处不能聚焦而被滤除，对芯片杂交表面外的信 号的干扰敏感度低，从而可得到高分辩力和高对比度的图像。在扫描系统中，往 往在激光器前也放置一个d q l 光阑以尽量缩小聚焦点处光斑半径，使之能够只照 射在单个探针上。通过计算机控制激光束或生物芯片工作台的移动，便可实现埘 芯片的二维扫描。一副荧光标记杂交信号图谱就可以在几分钟至几十分钟内获 得。图i 3 是g e n e r a ls c a n n i n g 公司的s c a l l a r r a y 丁m 3 0 0 0 的扫描光路图，图中 激发光滤波器和发射光滤波器均为窄带滤波器，带宽通常为1 0 n m 左右，用来滤 除激发光和发射光中心波长以外的杂散光。 滤波片激光光源 聚光物 芯片样品 卜 管 图1 3 s e a n a r r a y t m 3 0 0 0 的扫描光路| 鳘| 激光共焦芯片扫描仪采用激光作激发光源，光电倍增管作探测器，因此有较 高的探测灵敏度。由于生物芯片的制备过程中，步骤较多，如p c r 反应、杂交 反应条件变化多，试剂存储条件不同，不同类型的基因表达等因素的影响，亮度 的动态范围较宽，这就要求光电倍增管有较宽的动态响应范围，此类的扫描仪动 态范围一般可达2 m ，即1 6 位。另外如前所述，可以达到很高的分辨率。此类仪 器的扫描精度主要受x y 移动平台的机械精度、重复精度和环境条件的影响。 1 5 2c c d 型芯片扫描仪 这种探测装置也基于荧光显微镜怕1 ，只是以c c d 作为信号接收器而不是光 浙江大学硕i ：学位论文 电倍增管，一般情况下无须扫描传动平台，因而结构较简单。由于激发光照射光 场为整个芯片区域，为保证激发光的匀场照射，一般不采用激光器作为激发光源， 因荧光信号的强度与激发光的强度密切相关，激光束光强的高斯分布，会使光场 光强分布不均，不利于信号采集的线性响应。可用高压汞灯或高强度氙灯作为激 发光源，单色系统采用激发光窄带干涉滤光片，一般采用数片，由电机驱动选择。 c c d 镜头前也装由电机驱动选择的数片发射光窄带干涉滤光片。其基本原理如 图1 4 所示。 发射光窄光源 发光窄带干涉滤光h 图1 4 c c d 荧光检测原理 光源发出的光线经激发光窄带干涉滤色片后成单色光，激发生物芯片产生荧 光，然后经发射光窄带滤光片后，成像在c c d 的光敏面上。c c d 每次读取一个 激发波长下的图像，对于多色荧光物质标记的芯片，需更换激发窄带和发射窄带 的干涉滤光片，再次读取。由于采用c c d ，实现一次同时读取整个芯片或者线 读取整个芯片( c c d 线扫描) ，大大提高了获取荧光图像的速度。曝光时间可缩 短到零点几秒至十几秒、延长曝光时间或将多次曝光图像叠加，可提高信噪比和 灵敏度，扫描仪的分辨率主要受到c c d 象素总数和被测芯片大小的影响，但象 素的增加会使每个象素感受的光量减少，导致灵敏度降低。目前，c c d 的分辨 率可以做到几十微米，比激光共焦芯片扫描仪低，但结构简单，价格便宜。 1 5 3 激光共焦扫描仪与c c d 扫描仪的比较 比较基于p m t 的扫描与c c d 扫描仪，都有各自的特点。光电倍增管在可见 光波范围是最灵敏的探测器，并可通过改变电压而方便地改变它的灵敏度；c c d 对微弱信号的放大功能不及光电倍增管，需要额外的放大系统来将信号放大，才 能达到光电倍增管的灵敏度范围的上限，其主要的缺点是：c c d 探测器的实际 浙江大学坝一i ：q - 位论文 数值孔径受限，在低亮度背景下，微弱信号难以检测。另外，c c d 检测为了降 低背景噪声，应该采用半导体制冷的c c d ，目前国内好的c c d 制冷技术还尚有 不足。国外冷却设备价值昂贵。采用制冷后的c c d 灵敏度仍不抵p m t 。c c d 的分辨率由于光散射导致象素之问交叉重叠造成信号不够清晰，影响分辨率， p m t 扫描仪因共焦特点可以达到超分辨率。但p m t 的扫描速度低于c c d 。比 较两者的性能，为达到高分辨率和灵敏度，选择了p m t 的扫描仪作为研究对象。 浙江大学顺，p 学位论文 第二章共焦扫描仪的光路结构 由前一章共焦显微镜的原理可知，系统实现荧光点成像，为将整个样品扫描 完全，需要移动样品或用一个微小的反光镜使激光束移动扫描样品，点点成像扫 描决定了其扫描效率比采用c c d 检测的检测仪低，显示了它的不足之处。如何 提高此类仪器的扫描速度，就成了一个具有研究意义的课题。目前，国外此类扫 描仪经过几代的发展，提出了多种实现二维扫描成像的结构，但结构仍不外乎采 用直线驱动器和直线导轨驱动的二维扫描，虽然仪器结构设计在灵敏度分辨率等 有很大提高，但是速度仍然进展缓慢，本章提出了采用远心线性成像物镜结合振 镜的方法代替传统x 向扫描的方法，具有现实可行性，既能保证分辨率和灵敏 度，又较大提高扫描速度。本章分析其结构特点，同时也分析扫描仪光路中的其 他器件的设计结构。 2 1 传统机械二维x 、y 线性扫描技术的典型结构 目前国外共焦扫描仪的二维扫描装置均采用机械二维x 、y 线性扫描技术 典型的总体布局有两种，其一如图2 1 示。 圈2 1 采用机械二维线性扫描技术的生物芯片扫描仪 图2 1 中，直线驱动器和直线导轨结合，使棱镜在x 方向做高精度的往复运 动，用位置传感器判断直线导轨的运动位置，实现x 向的扫描：y 方向的扫描 同样，通过直线驱动器和导轨的机械装置，移动检测平台实现。结构简单易行， 但由分析可知，存在较大不足之处。在共聚焦扫描中，为保证获得的图像有很高 的信噪比，对聚焦状态要求非常严格，要求生物芯片摆放非常平稳，并在扫描运 动中芯片一直保持在同一水平，少有震动。这对实现x 向和y 向的二维运动的 浙江人学坝i ：学位论文 机械加工，就有相当高的精密度要求。在此种扫描结构中，棱镜放在x 向扫描 台上，扫描中，由于直线驱动器的行程长，相应导致棱镜的行程也长，使得激光 的聚焦光斑变化大，影响了仪器的分辨率。另外由于直线驱动器的频率限制，一 般的驱动频率仅为2 0 h z 左右，扫描速度受制约，效率低，使得生物芯片分析的 时问相当长。此系统中，收集的荧光经过透镜2 聚焦到小孔，透镜2 的数值孔径 的大小会影响荧光的收集量，数值孔径大，收集的荧光多，提高仪器的灵敏度， 反之则降低。但是明显，此透镜的数值孔径受机械结构的限制，不能很大，所以 限制了仪器的分析灵敏度。 为克服以上的一些缺点，提出了改进方法，如图2 2 所示。图中将透镜1 固 定在扫描头上，并与棱镜一起固定于直线导轨上，在直线驱动器的驱动下，做x 向的扫描运动，y 方向的运动装置不变。 图2 2 改进厉的二维线性扫描仪 此装置由于透镜1 离生物芯片距离很近，可以实现大数值孔径的荧光收集， 使得仪器的分析灵敏度达到很高，可达到0 1 个荧光分子u m 2 。另外透镜1 随着 扫描头做x 方向移动时候能保持物象共轭，空间分辨率不随x 方向的运动而降 低。扫描结果能达到图像均匀。但是此装置仍然存在不足之处。首先，没有克服 如上系统结构的缺点，由于直线驱动器的扫描惯性大，扫描频率低，速度慢，而 影响芯片分析时间。其次由于透镜1 的大数值孔径，固定于移动平台上的扫描头， 在扫描过程中，移动焦深的变化，就影响芯片表面上的聚焦光斑，这使得系统对 x 、y 方向的直线导轨的精度及振动情况提出了更严格的要求，系统的结构成本 上升。 浙江大学颂士学位论文 2 2 光机结合的二维扫描技术扫描仪结构 鉴于以上两种结构存在的扫描效率低的不足，提出了一种新型的光机结合的 方式，采用振镜他1 和远心线性成像物镜结合实现x 向扫描，代替机械扫描，y 方向采用与上述结构相同的装罱。实验分析x 向扫描结构具有可行性。 2 2 1 远心线性成像物镜的特点“钔 由普通几何光学可知，对于远心线性成像物镜即厂一目物镜，满足x = ，2 曰 ( 目为振镜的摆动角度，f 为物镜焦距) 的线性关系。如图2 3 简图所示， 幽2 3 一目物镜的透镜前扫描示意图 系统为透镜前扫描，激光束经过振镜扫描后，以不同方向射入聚焦透镜，可 以得到与等角速度偏转对应的焦平面上的等速扫描。扫描中，将入射光束的偏转 位置( 即振镜位置) 置于物镜前焦点处，构成像方远心光路，使得像方主光线与 光轴平行。系统校f 了场曲，就可以在很大程度上实现轴上、轴外像质一致，使 像点精确定位，且提高了边缘视场的分辨率与照度的均匀性。 2 2 2 光机结合的扫描结构 原理图如图2 4 所示，激光束通过振镜的摆动扫描反射向，一占物镜，经物镜 聚焦于生物芯片上，同时，由于采用远心光路，不同入射角度的激光，经物镜后 出射的主光线均垂直于生物芯片。然后聚焦的激光激发荧光发光，荧光沿原光路 返回到光束分离器，最后由聚光透镜收集到4 , ：f b 。这样扫描仪x 向就可以得到 均匀的荧光采样，且各个位置的主光线均垂直生物芯片：y 向同以上两种，由移 动检测平台实现。 浙江人学顾十学位论文 图2 4 光机结合的二维激光共焦生物芯片扫描仪 实现这种二维扫描技术具有较大的不同特点和优势。表现如下： 首先，系统采用振镜摆动，实现了高速扫描。振镜6 4 5 0 ( g a l v n o m e t e ro p t i c a l s c a n n e r ) 摆动频率可达到1 0 0 b i z ，而如前章所提，一般直线往复驱动系统仅为 2 0 h z 左右，因此在用8 0 h z 的高速扫描下可将分析效率比一般的扫描仪提高4 倍，对于常见的4 0 u r n 分辨率的模式，整个芯片区域( 2 2 7 0 m m ) 成像仅需7 0 秒( 双波长，振镜频率5 0 h z ) ，极大地缩短了扫描仪的扫描时间。 其次，图中去除了棱镜，f 一0 物镜固定于光路结构平台中，不随x 向的扫 描移动而移动，扫描中完全克服因了机械二维扫描中，因棱镜的x 向左右移动 而影响激光聚焦光斑的变换，进而影响分辨率的问题。 再次，厂一目物镜设计成尽可能大的相对孔径f = 2 4 ( n a = 0 3 ) ，以便有效 收集芯片上的样品产生的荧光，保证了足够的分析灵敏度，此装置比图2 2 所示 的结构采集荧光的能力弱，但比图2 1 所示的结构强，在系统研制要求下达到所 需的灵敏度要求。 另外，振镜是以扭力棒原理构成，具有相当低的零点漂移( ur a d 级) 和扫 描误差( ur a d 级) ，比国外扫描仪普遍采用的x 方向直线驱动器扫描，具有运 转平稳，无震动噪声的优点，且变形小，使用寿命长，克服了前两者二维直线往 复驱动系统较繁重的后期维护工作，由于机械精密度要求的降低，相对而占可降 低生产成本。 2 2 3 光机二维扫描结构的注意点 由线性成像物镜的设计可知，为了实现等速扫描，要使得聚焦透镜产生一定 浙江人学顿i ：学位论文 的负畸变，才能使得整个视场上有均匀的光强度和分辨率，在实际设计中，往往 比较难以设计完善负畸变量，会产生一些畸变误差，这里，则可以通过振镜的驱 动得到补偿。前面提到振镜是以扭力棒原理构成，以稳定低噪声的三角锯齿型波 驱动，能严格按照驱动电压的大小确定振镜的摆动转角。则厂一0 物镜设计带来 的少量畸变，通过振镜驱动器的反畸变非线性驱动加以补偿，使得系统能在均匀 的扫描频率下得到真实的图像重建。 另外扫描装置结构中，因设计中尺寸的限制，系统采用的振镜的有效垂