（光学工程专业论文）高聚物基pcr微流控芯片的准分子激光制备和应用研究.pdf

摘要摘要本文对生物芯片以及p c r 技术的发展历史、研究现状以及未来发展趋势进行系统回顾和分析。作为第二代生物芯片的p c r 微流控芯片，因其在分子生物学和生物医学上有着重要的应用，是一种值得研究的重要芯片。随后针对目前国内外p c r 微流控芯片的研究现状，提出了采用准分子激光微细加工技术在价格便宜、生物兼容性好的聚甲基丙烯酸甲脂材料( p 姗a ) 上制备p c r 微流控芯片的新方法。p c r 微流控芯片的首要任务是三个恒温区换热长度的计算，针对目前p c r 微流控芯片的设计缺乏理论计算和数值模拟的现状，本文应用计算流体力学软件f l u e n t 分别对宽1 0 0 岬，深5 0 肿的直通道、弯通道以及逶迤型通道内微流体的速度场分布和温度场分布进行了数值模拟，总结出了微流体从入口处充分发展成为层流的过渡长度以及温度场达到稳态的换热长度，随后结合进行p c r 反应的原理，应用c a d 软件设计出了2 0 个循环的p c r 微流控芯片。p c r 微流控芯片的制备则是采用本文提出的新方法，在p m 姒材料上制备出横截面为矩形、底丽光滑、逶迤型的微通道。为此在应用扫描电镜和三维形貌分析仪对p 加雌表面被准分子激光刻蚀前后的形貌、刻蚀粗糙度以及单脉冲刻蚀率等进行详细分析的基础之上，总结出了准分子激光刻蚀p m m a 的宏观规律和微观刻蚀机制，提出了一种准分子激光刻蚀孙d m a 的是光热光化学以及羽辉共同作用的理论解释。随后应用总结出的优化加工参数在该材料上刻蚀出了宽1 0 4 岍，深5 6 岬，矩形度高达8 0 ，底面光滑的2 0 个循环的p c r 微流控芯片。制备出来的芯片必须和相同尺寸的盖片键合在一起，在芯片表面形成密闭的微通道才能投入使用。为此本文应用自己搭建的热压键合装置分析了p m m a 基p c r微流控芯片热压键合过程中压力、温度以及恒温时间对键合质量影响的分析，总结出了该芯片进行热压键合的优化参数为：1 6 0 n ，9 5 。c 和2 0 分钟，然后在此参数下，将该芯片和相同尺寸的盖片键合在了一起，键合后的芯片具有良好的密封性能，最大能够承受o 8 5 m p a 的压力。键合好的芯片还必须和本文自己设计的多路温控系统集成在一起才能投入使用。该温控制系统主要包括两部分：1 ) 温控功能的实现；2 ) 温控系统隔热效果的理论计算和实际测量。其功能的实现主要是采用a d 5 9 0 作为温度传感器，采北京工业大学工学博士学位论文用2 0 5 1 单片机作为核心处理芯片，通过编程实现了对p c r 微流控芯片上三个恒温区的温度独立设置和控制，控制精度为0 3 。c 。本文从数值模拟和理论计算两个方面计算了温控系统铜片上面宽4 n l m 、长6 0 m m 的空气带的隔热效果，并将该结果和应用红外热像仪对铜片表面三个恒温区的测量数据进行比较后发现：该温控系统可以满足进行p c r 反应的温控精度以及温度梯度的要求。最后选用美国k l o e h n 公司v 6 精密注射泵作为进样系统，采用自制的内径为1 0 0 岬、外径为l ，2 砌的毛细管作为耦联装置，将进样系统和2 0 个循环的p c r 微流控芯片连接在一起，对1 7 0 b p 的d n a 片段实现了体外扩增。这表明本文设计搭建的p c r 微流控芯片系统是可行的。总之，一种新型的p c r 技术，p c r 微流控芯片具有高效、耗样少的优点，具有广泛的应用前景，值得开展进一步的深入研究。关键词：聚甲基丙烯酸甲酯p c r 微流控芯片f l u e n t准分子激光微加工方法温度控制i ia 扭f r a c ft h ed e v e l o p m e n th i s t o r y ，t h ep r e s e n ts t a t u sa n dt h ef u t u r et r e n do fb i o c h i pi ss y s t e m l ys u 册a r i z e df i r s t l yi nt h i sp a p e r ，t h e nt h ei m p o r t a n ts t a t u si nt h eh i s t o r yo fb i o c h i pa n dt h er e s e a r c hs i g n i f i c a n c eo fc o n t i n u o u s f l o wp c rc h i pa r ep o i n t e do u t a f t e rt h a t ，t h eo v e r s e aa n di n l a n dr e s e a r c hs t 8 t u sa b o u tc o n t i n u o u s f l o 霄p c rc h i pi ss t u d i e dc a r e f u l ly a n dt h ee x i s t e n tp r o b l e m sa n ds 0 1 u t i o na b o u ti ta r ei n d u c e d i tm e a n st h a tt h ec h e 8 pp o l y m e r sa r ec h o s e na st h es u b s t r a t e s ta n da2 4 8 n me x c i m e rl a s e rw i t hf l e x i b l ea n da u t o m a t i ce h 8 r a c t e r si ss e l e e t e da san e wm i c r o f a b r i c a t i o nt e c h n i q u e t h em o s ti m p o r t a j l tp r o b l e mo fc o n t i n u o u s f l o wp c rc h i pi st h et r a n s i t i o nl e n g t hc o m p u t a t i o no ft e m p e r a t u r eo rv e l o s i t yd i s t r i b u t i o nf r o mi n l e tt os t e a d ys t a t u s h o w e v e rt h e r ea r en on u m e r i c a lc o p u t a t i o n sa b o u tc o n t i n u o u s f l o wp c rc h i p s ot h em i c r o f l i u d i cv e l o s i t ya n dt e l p e r a t u r ed i s t r i b u t i o ni nd i r e c tm i c r o c h a n n e l ，c u r v em i c r o c h a n n e la n dw i d i n gm i c r o c h a n n e lw i t h1 0 0 i i w i d t ha n d5 0 i 皿d e p t ha r ec o m p u t a t e du s i n gf l u e n ts o f t w a r e t h et r a n s i t i o n1 e n g t h so fm i c r o f l u i df r o mi n l e tt os t e a d ys t a t u sa r ed i s c u s s e d t h e nb a s e do nt h ep r i n c i p l ef o rp c r ，2 0 一c y c l ec o n t i n u o u s f l o wp c ri sd e s i g n e du s i n gc a ds o f t w a r e t ot h ed e s i g n e d2 0 c y c l ec o n t i n u o u s f l o wp c rc h i p ，ak r fe x c i m e r1 a s e r ( d i r e c tw r i t em e t h o d ) i sa d o p t e da st h ef a b r i c a t i o nt e c h n o l o g y ，a n dt h ep o l y m e t h y lm e t h a c r y l a t e ( p d a ) i ss e l e c t e da st h es u b s t r a t e s ot h ea p p e a r a n c e so fp 删as u r f a c ee t c h e db e f o r ea n da f t e rb y2 4 8 n me x c i m e rl a s e ru n d e rd i f f e r e n ti n c i d e n tf l u e n c e sa r ea n a l y z e du s i n gs e m f u r t h e r m o r e ，t h ee t c h i n gr a t e ，r o u g h n e s sv e r s u si n c i d e n tl a s e rf l u e n c e sa n dp u l s en u m b e ra r ei n v e s t i g a t e dt h e o r e t i c a l l ya n de x p e r i m e n t a l l yi nd e t a i lb y3 ds u r f a c ea n a l y z e r t h e nan e wp r i c i p l eo fp 0 d ae t c h e db ye x c i m e rl a s e ri sg i v e n ：t h ep r o c e s si st h ei n t e r a c t i o nr e s u l to fp h o t o d e c o m p o s i t i o n ，h t北京工业大学工学博士学位论文t h e r m a l d e c o r r i p o s t i o na n dp l u m e t h e nt h eo p t i m i z e df a b r i c a t i o np a r 硼e t e r sa r ec o n c l u d e d ，a n dt h ed e s i g n e d2 ( 卜c y c l ec o n t i n u o u sf 1 o wp c rc h i pi sf a b r i c a t e di np m m as u b s t r a t e( 4 0 眦6 7 衄1 珊)u n d e rt h ep a r a m e t e r s t h ef a b r i c a t e dc o n t i n u o u s f l o wc h i pm u s tb eb o n d e dt o g e t h e rw i t ht h es 鲫es i z ec o v e rc h i pf o r m i n gs e a l e dm i c r o c h a n n e l sb e f o r eu s i n g s ot h eb o n dq u a lit yv e r s u st h ep r e s s u r e ，t e m p e r a t u r ea n dc o n s t a n tt e m p e r a t u r et i m ei sa n a l y z e di nd e t a i lu s i n gt h eh o tb o n d i n gi n s t r u m e n t se s t a b l i s h e db yt h i sp a p e r t h e nt h eo p i t i m i z e dp a r a m e t e r s ( 1 6 0 n ，9 5 。ca n d2 0 m i n ) f o rb o n d i n ga r ef o u n d a n dt h e2 0 一c y c l ep c rc h i pi sb o n d e dt o g e t h e rw i t ha o n t h e rs a m es i z ec o v e rc h i pu n d e rt h ep a r a i n e t e r s t h ed o n d e dc h i pc a ns e a lf l u i dw e lla n de n d u r e0 8 5 m p ap r e s s u r e t h eb o n d e dc o n t i n u o u s f l o wp c rc h i pm u s tb ei n t e g r a t e dw i t ht h et e m p e r a t u r ec o n t r o ls y s t e m ( t c s ) d e s i g n e db ym y s e l fb e f o r eu s i n g t h et c si n c l u d e st w op a r t s ：1 ) t h ef u n c t i o nr e a l i z eo fo ft c s ，2 )t h ea c a d e m i cc o m p u t a t i o na n de x p e r i m e n tv a l i d a t i o no ft h e n n a li n s u l a t i o ne f f e c to ft c s t ot h ef i r s t p a r t ：a d 5 9 0c h i p sa r es e l e c t e da st h et e m p e r a t u r es e n s o r s ，a n d2 0 5 1c h i da c t sa st h ec o n t r o lc e n t e r t h et e m p e r a t u r es e ta n dc o n t r o li nc o n t i n u o u s f l o wp c rc h i dc a nb er e a l i z e db y2 0 5 lc h i p ，a n d t h et e m p e r a t u r ec o n t r o lp r e c i s i o ni s ：3 0 c t ot h es e c o n dp a r t ：t h et h e r m a li n s u l a t i o ne f f e c to fa i rb a n dw i t h4 咖w i d t ha n d6 0 舢1 e n g t hi nc o p p e rf l a k eo ft c si sc o m p u t e dt h e o r e t i c a l l ya n dm e a s u r e de x p e r i m e n t l yu s i n gi n f r or e dt h e r a ld e v i c e t h et e p e r a t u r eg r a d sa r ez 2 2 。a n d1 6 5 。c t h i sm e a n st h a tt h ed e s i g nc a nm e e tt h er e q u i r e m e n t sf o rp c rr e a c t i o n i nt h ee n d ，av 6s y r i n g ep u i pi sa d o p t e da st h es a l l l p l ei n j e c t i o ns y s t e m ，w h i c hi sc o n n e c t e dw i t ht h ec o n t i n u o u s f l o wp c rc h i pt o g e t h e ru s i n gac a p i l l a r yw i t h1 0 0 岬i da n d1 2 硼o d t h e n1 7 0 b pd n as e g m e n t sa r e 锄p l i f i e du s i n gt h i ss y t e m t h er e s u l t sm e a nt h ec o n t i n u o u s f l o wp c rc h i ps y s t e mi sf e a s i b l e i ng e n e r a l ，t h ec o n t i n u o u s f l o wp c rc h i pa san e wp c rt e c h n o l o g yh a si va b s t r a c th i g he f f i e n c ya n ds a m p l ec o n s u m i n g1 i t t l ec h a r a c t e r s i th a sw i d e l ya p p l i c a t i o n s d e e pa n dc o n t i n u o u ss t u d ys h o u l db eh o l do n k e yw o r d s ：p m m ac o n t i n u o u s f l o wp c rc h i pf l u e n te x c i m e rl a s e rm i c r o m a c h i n gt e m p e r a t u r ec o n t r 0 1s y s t e mv独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京工业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。签名：蔓坚垄建日期关于论文使用授权的说明2 口哂本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。( 保密的论文在解密后应遵守此规定)签名：遨查墓导师签名日期：衄午第一章绪论本章在系统地回顾生物芯片的研究背景、发展历史、研究现状和发展趋势的基础之上，将对p c r 微流控芯片在整个芯片发展史上的地位及研究的重要意义进行总结，并将针对其存在的问题提出相应的解决方案，即：1 ) 应用计算流体力学软件f l u e n t 对微通道内微流体的速度场分布和温度场分布进行数值实验，为p c r 微流控芯片的理论设计奠定理论基础；2 ) 利用价格便宜、生物兼容性好的高聚物材料代替价格昂贵、生物兼容性差的硅和玻璃成作为基片材料；3 ) 应用加工柔性大、自动化程度高的准分子激光这种新型的微加工方法代替传统的、加l ：工艺复杂、耗时长、成本高的光刻化学腐蚀的方法。1 1 研究背景二十世纪微电子技术的出现使得个人计算机( p c ) 、光盘( c d ) 、数字化视频光盘( d v d ) 、移动电话( m o b i l e ) 等高科技产品变成了现实，并极大地改变了人们的生活和行为方式，人与人之间的距离也极大地缩短。该技术取得的经验被进一步应用于制备微电子机械器件( m e m s ) 和微光学电子机械器件( m o e m s ) ，己取得的进展有：微传感器、微处理器、微透镜等。而微电子技术下一个主要应用目标是生物芯片“。二十一世纪是生命科学的世纪。人类基因组计划已经提前完成，蛋白质组计划已经启动。基因序列数据和蛋白质序列数据正以前所没有的速度增加。然而，怎样去研究众多的基因及蛋白质在生命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学研究工作者共同的课题。生物芯片正是在这样的背景下应运而生的h l 。生物芯片是生命科学研究工作者进行基因测序、基因诊断、基因识别以及基因和蛋白质功能等研究的硬件工作平台。生物芯片的出现将对生命科学、医学、化学、新药开发、国防、司法鉴定、食品和环境卫生监测、步 太空探测等领域带来一场革命“6 “”。美国商界权威刊物f o r t u n e ”1 对此作了如下阐述：“生物芯片将如同电子芯片一样，极大地改变人们的生存状态和生活方法，并可能从根本上改变医学行为和我们的生活质量，从而改变世界的面貌。”由于生物芯片技术领改变医学行为和我们的生活质量，从而改变世界的面貌。”由于生物芯片技术领北京工业大学工学博士学位论文域的飞速发展，美国科学促进协会于1 9 9 8 年底将生物芯片评为该年的十大科技突破之一“。生物芯片的优势是：通量高、微型化、自动化、以及可同时对多个产品进行分析。高通量提高了实验速度，允许对多种基因和基因产物进行比较。微型化降低了样品的消耗，缩小了反应体积，提高了样品浓度和加快了反应动力。自动化以及可同时对多个产品进行分析使得大规模d n a 测序等变成了现实。当然必须认识到正是由于面向不同材料的多种微加工技术的出现，才使得生物芯片的实现成为了可能嘲。1 2 生物芯片的概念狭义的生物芯片( b i o c h i p ) 也叫微点阵生物芯片，其概念是指在几平方厘米的基片( 硅、玻璃、高聚物、凝胶、尼龙等) 表面，通过微加工技术获得用于生物化学处理的微结构，在微结构上结合有序点阵排歹j j 可寻址识别的分子( 寡核苷酸、d n a 、多肽、抗体、抗原、蛋白质以及其它生物成分) ，在特定的条件下与目的分子进行杂交反应。其反应结果用同位素法、化学荧光法、化学发光法和酶标法显示，然后用精密扫描仪记录，最后通过计算机软件分析，综合成可读的i c信息“”1 ，狭义生物芯片的分析步骤见图卜l 。图1 一l微点阵生物芯片分析步骤f i g 卜1t h ea n a l y z i n gs t e p so fm i c r oa r r a yc h i p广义的生物芯片是指：将样品的预处理、生物化学反应、检测和数据分析处理等步骤中移植到芯片上，从而获得具有特殊功能的、连续的和微型化的芯片，即芯片实验室( l a b o n c h i p ) 或者 a s 系统n 2 “3 “1 。作为一门新兴的交叉学科，2第一章绪论芯片实验室是微电子、微机械、化学、物理、生物、传感器、计算机等学科和技术高度交叉的产物，因此它的发展需要多个不同领域的科研工作者共同努力才能取得成功“蚓。芯片实验室从概念到最终的产品需要经历以下几个步骤，见图1 2 。图1 2 芯片实验室从概念到成型f i g 卜2f r 锄c o n c e p tt op r o t o t ”ea b o u tl a b o i l c h i p1 3 生物芯片的发展历史生物芯片的概念起源于计算机芯片系统缩微的思想，由二十世纪八十年代提出的分子细胞器件的概念演变而来，随后在1 9 9 1 年f o d o r 等人正式提出了d n a芯片的概念“”。1 9 9 4 年美国和俄罗斯合作共同开发研制出了世界上第一块生物芯片“”。在近十年的时间里，生物芯片的发展经历了三个阶段：第一代是微点阵生物芯片( 包括基因芯片和蛋白质芯片等) ；第二代是微流控芯片( 包括毛细管电泳芯片和聚合酶链式反应微流控芯片等) ；第三代是胛a s 系统也叫芯片实验室( l a b o n c h i p ) ，它是生物芯片的最终目标。下面将分别对这三代生物芯片进行阐述，并着重讨论p c r 微流控芯片。在对p c r 微流控芯片的研究现状进行充分调研的基础之上，将总结出其目前存在的不足并提出相应的解决方案，并给出p c r微流控芯片研究的重要意义。1 4 微点阵类型生物芯片依据固定探针的类型，微点阵生物芯片可分为：d n a 芯片和蛋白质芯片。d n a北京工业大学工学博士学位论文芯片也叫基因芯片“7 ”1 ，最早是由美国a f f y e t r i x 公司研制出来的。d n a 芯片是生物芯片中最基础、研究开发最早、也是最为成熟和目前应用最广泛的产品。d n a芯片是在几平方厘米大的基片表面按照一定的顺序排列一段高密度的d n a 分子作为基因探针，利用基因探针和与特异寡核甘酸碱基互补的原理，进行杂交分析。d n a 芯片根据制作方法又可以分为：原位合成寡核甘酸微点阵芯片( 0 n a ) 和用微量点样技术制作的c d n a 微点阵芯片。d n a 芯片的结果判读应用最多最成功的技术是荧光标记激光共聚焦扫描装置。d n a 芯片的主要应用领域主要有基因组研究、单核苷酸变异态性的检测、肿瘤研究、药理学研究、新药物开发、药物毒性研究、医学诊断、微生物发酵、杀虫剂研究等。蛋白质芯片“则和d n a 芯片类似，是将大量蛋白质有规则地固定到某种固体介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间的相互作用，检测分析蛋白质的一项技术。芯片结果的检测有两种类型：荧光标记激光共聚焦显微镜扫描装置和酶标记c c d 照相机拍摄处理装置。蛋白质芯片的主要应用有：基因表达的筛选、特异性抗原抗体的检测、蛋白质的筛选和功能研究、新药物的开发、疾病的诊断等。从1 9 9 5 年到2 0 0 4 年年初，微点阵类芯片的文献超过了5 0 0 0 篇，其中单是2 0 0 3年的文献就占了一半，这表明微点阵芯片已经成为是生物医学工作者进行基因和蛋白质功能研究重要工具。图卜3 为微点阵生物芯片示例图片。1 ，5p c r 微流控芯片图1 3微点阵类型生物芯片f i g 卜3姒c r oa r r a yc h i p微流控芯片的类型主要有：毛细管电泳芯片( c h i p 七a s e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，简称c c e ) “2 ” 州和聚合酶链式反应微流控芯片( c o n t i n u o u s 一4第一章绪论f l o wp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nc h i p ，简称p c r 微流控芯片) “3 。下面先简单介绍一下毛细管电泳芯片的概念和分类，然后着重介绍p c r 微流控芯片。毛细管电泳芯片是利用m e m s 技术在玻璃、硅、塑料等基片上刻蚀出宽度为微米、长度为毫米的微细通道网络，以电场为驱动力，利用分子或者离子在电迁移或者分配行为上的差异，对复杂试样中的多种组分进行高速分离的技术。根据芯片上微通道网络结构，毛细管电泳芯片可以分成三类：十字型、逶迤型和多通道集成型。图卜4 是最简单的十字型毛细管电泳分析系统的结构示意图。电泳分析时，首先在迸样通道( 图卜4 中的l 和2 之间) 加电压，在电渗流的作用下，试样从试样池1 处经过十字交叉口流向试样废液池2 ；然后切换电压到分离通道( 图卜4 中的3 和4 之间) ，储存在十字交叉口处的试样在电渗流的作用下进入分离通道进行分离，经过检查点d 时，通过激光诱导荧光、电化学或者质谱仪等分析手段记录电泳谱图。逶迤型毛细管电泳芯片和多通道型毛细管芯片的实物见图卜5 中的( a ) 和( b ) 。( a ) 为具有单一分离通道的逶迤型毛细管电泳芯片，( b ) 为具有9 6 个分离通道的毛细管电泳芯片。图1 4 毛细管电泳芯片撮基本装置示意图1 试样池，2 试样废液池，3 缓冲液池，4 缓冲液废液池f i g 卜4t h es h e m a t i cf o r c c ec h i p1s 锄p l er e s e r v o i r ，2u n u s e ds a m p l er e s e r v o i r ，3b u f f e rr e s e r v o ir 4u n u s e db u f f e rr e s e r v o i r北京工业大学工学博士学位论文图1 5毛细管电泳微流控生物芯片f i g 1 5t h ep i c t u r e sf o rc c ec h i p现在，毛细管电泳已经成为一种非常普遍推广的应用方法，国际上有一千多家研究单位在从事毛细管研究，年研究论文已经超过2 0 0 0 篇。从1 9 8 9 年开始，大小国际会议连年不断。现在有十个左右的厂家生产了将近2 0 种型号的毛细管电泳仪。作为毛细管电泳的重要分支毛细管电泳芯片的应用和方法完善是其未来发展趋势。1 5 1p c r 技术简介体外核酸扩增技术的设想最初由k o r a n a 于1 9 7 1 年提出，1 9 8 5 年美国p e c e t u s 公司人类遗传研究室的m u l l i s 等将这些设想变为现实，发明了聚合酶链式反应( p 0 1 y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 。随后经过k e o h a n o g 、s a i k i 等人的改进后，p c r 技术因其灵敏度高、特异性强、易自动化、易操作等特点，受到了人们的高度重视，被广泛地应用到分子生物学和生物医学的各个领域。1 9 9 3 年m i c h a e l s m i t h 和k a r y m u l l i s 凭借该项技术荣获了的诺贝尔化学奖哺1 。p c r 可将一个试管内将所要研究的目的基因或某一d n a 片段于数小时内扩增至1 0 5 乃至1 0 6 倍，使肉眼能直接观察和判断：也可对从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中提取出来的d n a 进行扩增，得到足量的d n a 供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用p c r 几小时便可完成。作为一种完美的体外扩增核酸的技术，p c r 是一个由温度控制和酶催化过程组成的不同温度下三步反应周期性重复的过程，如图卜6 所示。1 )d n a 变性，通过将p c r 反应混合物加热至高温约9 5 左右，保持约1 分钟的时间使模板d n a 双链分解成为两个单链；6第一章绪论2 )引物复性，温度降低到5 0 6 5 时，两个引物分别与模板d n a 两条单链的3 末端复性；3 )引物延伸，温度升高到7 2 左右，在d n a 催化酶的作用下，引物沿着模板d n a 的3 味端向5 端方向延伸，合成一条与模板d n a单连完全互补的新链，完成第一次扩增。4 )新合成的d n a 双链再经过变性解离后又作为新的模板与剩余的引物杂交，引物延伸合成新的模板d n a 链，完成又一次的扩增。5 )如此不断地重复变性、复性以及延伸三个过程，就可以使得模板d n a 的数量不断增加。假设扩增前模板d n a 分子数用n o 表示，经过n 次扩增后，p c r 扩增产物中的模板分子数n 可以表示为：= 0 2 4( 1 - 1 )实际上考虑到每次循环中模板与引物的结合率即扩增效率，则可表示为：= 0 ( 1 + ) 4( 1 2 )其中，e 为扩增效率，一般为o 8 o 9 。图卜6p c r 扩增过程示意图f i g 1 _ 6n l ep r o c e s so fp c r北京工业大学工学博士学位论文1 s 2p c r 技术沿革经过近2 0 年的发展，p c r 经历了三代技术革新。第一代p c r 是p e c e t u s 公司的热循环仪。第二代是静态的微反应槽p c r 芯片( m i c r oc h a m b e rp c rc h i p ) 。第三代是p c r 微流控芯片( c o n ti n u o u sf l o wp c rc h i p ) ，下面将对三类p c r 技术分别进行介绍。1 5 2 1 传统的p c r 热循环仪传统的p c r 热循环仪见图卜7 。通常通过一个可编程的微机对反应混合物的温度循环进行控制，经过2 0 4 0 个循环，约2 3 个小时，可以将产物扩增到纳克级的目标片段。传统的p c r 热循环仪器是目前应用最广泛的仪器，价格4 0 2 0 0万元不等。不过由于该方法存在热容大、加热和冷却速度慢、耗用昂贵的生化试剂多等缺点，因此如何利用微技术建立微型的低热容、耗样少、分析时间短、价格便宜的p c r 扩增方法已成为当前研究热点。图1 7 传统的p c r 热循环仪f i g 卜7t h et r a d i t i o n a lt h e m lc y c l e rp c rd e v i c e s1 5 2 2 静态微反应槽p c r 芯片二十世纪九十年代初期，出现了基于m e m s 技术的静态的微反应槽p c r 芯片，其结构原理示意图见卜8 。其工作原理和传统的p c r 热循环仪相同，是一种微型化的可以快速实现升温降温，对微反应槽中反应混合液进行扩增的仪器，扩增产物可以在片检测，也可以取出来进行离线检测。1 9 9 3 年n o r t h r u p 汹3 等首次报道了硅基静态微反应槽的p c r 芯片。该芯片采第一苹绪论用蚀刻技术在硅片上形成包括一个入口、出口以及几微升反应室的微结构，然后通过阳极键合的方法和p y r e x 玻璃形成密闭的结构，该芯片还集成了加热元件。与传统p c r 相比，在同样的扩增效率下，该方法热循环效率快2 1 0 倍。自从硅基静态微反应槽的p c r 芯片研制成功后，已有大量应用静态微反应槽的p c r 芯片完成d n a 扩增的文献，该芯片得到了不断的改进和发展。p o s e r 。1 等在硅片上分别加工出了2 个和1 0 个微反应室的p c r 芯片，反应体积为4 8 微升：t a y l o r o ”等则在硅片上形成8 个5 皿微阵列反应室；n a g a 3 等则在硅片上加工形成了1 0 0 1 0 0 个微阵列反应室的芯片，并总结出了只要微反应室的体积大于8 5 p l 就可以实现p c r 扩增。随后1 9 9 6 年m a t h i e s m l “领导的研究小组则首次将p c r 微反应槽芯片和c e 芯片结合在一起，完成3 0 次p c r 循环和c e 分离总共需要2 0 分钟。由于硅具有良好的导热性能，而且各相异性腐蚀，蚀刻度容易控制，因此是目前应用最广泛的芯片材料。但是由于其光学性能和生物兼容性较差，所以现在的芯片大多采用硅一玻璃结合的结构或者采用玻璃一p d m s 结合的结构。图1 8 静态微反应槽p c r 芯片f i g 卜8t h em i c r oc h 鲫b e rp c rc h i p1 5 2 3p c r 微流控芯片研究现状1 9 9 8 年a m a n z 嘲等首次应用玻璃基p c r 微流控芯片对1 7 6 b p 的d n a 片段实现了体外连续放大，相关文献在s c i e n c e 上发表。完成2 0 次扩增，最短需要1 5分钟，最长需要1 8 7 分钟。其原理示意图见图卜9 中的( a ) 。由此图可以看出其结构由入口、出口、三个恒温区、微通道以及隔热网格组成。其原理是：p c r反应混合物在精密注射泵的作用下以n l s 的流速进入基片上分别处于三个恒温区的徽通道，通过控制微通道的长度，从而实现p c r 的变性、复性和延伸。目前已有多家研究单位应用自己研制的p c r 微流控芯片成功地实现了d n a 的体外扩9北京工业大学工学博士学位论文增。图l - 9p c r 徽流控芯片f i g 卜9t h ec o n t i n u o u s f l wp c rc h i p2 0 0 1 年，英国学者。”等研制出了一种毛细管p c r 微流控芯片( 见图卜9 ( b ) ) ，毛细管的体积为1 0 u 1 ，完成3 0 次扩增仅需要2 3 分钟，扩赠效率为7 8 。同年德国学者i v o n n e s h n e e g a b 障1 和他的同事分别在玻璃和硅片上制备出了p c r 微流控芯片，并在芯片上集成了加热薄膜和温度传感器；毛细管总体积为3 3 u 1 ，完成2 5 次循环不足半个小时。也是在这一年，美国学者w e i z h a n g 3 。等在p y r e x 玻璃上制备出了2 0 个循环的p c r 微流控芯片，该芯片和带有加热元件以及传感器的另一块p y r e x 玻璃盖片键合在一起形成密闭的微通道。芯片整体尺寸为5 6 咖x 2 4 啪1 衄，微通道宽8 0 微米，深3 0 微米，总长0 5 米，总体积1 微升。利用该芯片可以在0 5 3 分钟的时间内对d n a 片段进行快速放大。2 0 0 2 年，日本学者k a i s u n 。7 1 等在石英玻璃基片上制备出了p c r 微流控芯片，随后将i t 0 导电薄膜沉积在刻蚀后的石英玻璃上，在通道内形成加热膜，极大地提高了加热效率。同年我国浙江大学信息电子工程研究院分别在硅和玻璃上也制备出了p c r 微流控芯片，并完成了扩增。2 0 0 3 年，希腊学者p i e r r e j o b e i d 等在玻璃基片上制备出了2 0 ，2 5 ，3 0 ，3 5 ，4 0 等不同循环数的p c r 微流控芯片，并把激光诱导荧光装置和和该芯片耦合在一起，可以对p c r 扩增产物实现在片检测，极大地提高了p c r 微流控芯片的效率。2 0 0 4 年，日本学者t a t s u h i r o 等在p d m s 基片上制备出了3 0 个循环的p c r 微流控芯片，并将该芯片和带有加热元件以及温度传感器的玻璃片键合在一起，形成密闭的通道，随后对长度为5 8 0 b p 和1 4 5 0 b p的d n a 片段成功地进行了扩增。中国学者在p c r 微流控芯片的研究方面也做出了相应的贡献。2 0 0 2 年浙江大学的q i n t a o z h a n g 等“”应用有限元分析方法( f e a ) 分别对( 玻璃+ 玻璃) 和( 玻璃+ 硅) 的p c r 微流控芯片上温度场分布的均匀性进行了理论模拟实验，为1 0第一荦绪论芯片上温度场分布研究奠定了一定的理论基础。浙江大学的刘金华分别于2 0 0 3年“。和2 0 0 4 “2 3 年，在玻璃基片上制备出了逶迤型和螺旋型的p c r 微流控芯片，并成功地实现了d n a 的放大。p c r 微流控芯片的关键技术之一就是温控制系统。为确保d n a 扩增反应顺利进行，每一温区的温度可单独设置和控制，并要求有一定的温控精度，温区内温度的分布要均匀，温区间相互隔热，加热元件热响应快。其中最影响p c r 微控芯片集成的因素是加热元件的选择，为此本文对国内外已发表的文献中涉及到p c r加热方案进行了总结，主要有以下几种：1 ) 应用电对铜块或者铝块进行加热和风扇冷却相配合，这种方有效地提了冷却时的速度，但是整个装置耗能多，体积大很难缩小，且不透明不利于对芯片内的反应进行在片检测。2 ) 将ito ( 氧化铟锡)薄膜沉积在玻璃芯片的基片上，作为加热器。将带状的金膜沉积在ito 薄膜的两侧作为电极，通过直流电源对ito 薄膜进行加热。3 ) 将铂薄膜作为加热和温度传感器沉积在基片上，直接用外部电源进行加热。第2 和第3 种方法的共同优点是加热效率高，可微型化，集成度高 共同缺点是制作工艺复杂，成本偏高。不同之处是前者可进行在片检测，后者则不可。1 5 3 三类p c r 器件的比较三类p c r 器件之比较见表( 卜1 ) 。表卜1 三类p c r 器件之比较t a b l e 卜1c o m p a r i s o no ft h r e et y p e so fp c rd e v i c e s通过表( 卜1 ) 的比较可以看出，作为一种新型的p c r 技术，它相对于第代p e _ c e t u s 公司的热循环仪和第二代是静态的微反应槽p c r 芯片的优势是：在保证一定扩增效率的前提下，样品的输入和输出是连续的，反应体积可变，反应北京工业大学工学博士学位埝文从静态变为动态，耗样减少，反应时间缩短。1 5 4p c r 微流控芯片待改进之处经过近8 年的时间，p c r 微流控芯片得到了快速的发展。但截止目前所报道的上述p c r 微流控芯片仍存在以下不足：芯片上不同恒温区换热长度的计算缺乏相应的理论依据；基片大多采用传统硅、玻璃或者石英，价格昂贵，生物兼容性差；加工方法大多采用光刻化学腐蚀的方法，加工工艺复杂，时间长；由于芯片的使用寿命短，温控系统和芯片一体集成，成本高。为解决目前p c r 微流控芯片存在的问题，本论文将采用计算流体力学软件f l u e n t 结合有限体元法( f e v ) 对微通道内微流体的速度场和温度场进行数值模拟，然后在此基础上设计出2 0 个循环的p c r 微流控芯片；采用价格便宜、生物兼容性好、光学性能好的p m m a 高聚物材料代替硅和玻璃作为基片材料；采用加工柔性好，自动化程度高的准分子激光这种新型的微加工方法在p m 叭基片上加工2 0 个循环的p c r 微流控芯片。该芯片和相同尺寸的盖片通过热压键合在一起，在芯片上形成用于对d n a 进行放大的密闭微通道。随后芯片和温控系统分离集成，降低了使用成本。1 6 芯片实验室芯片实验室有两个英文名字l a b 一0 n c h i p 或者肛t a s ，是生物芯片发展的最终目标。口a s 的概念最先是在八十年代后期由瑞士c i b a g e i g y 分析实验室的w i d m e r和m a n z 等提出。他们最初的想法是发展一种可把作一个化学分析所需的全部部件和操作集成在一起的微型器件。所以可以把酊a s 看作是化学分析仪器的微型化。完整的 a s 系统的定义是：通过微细加工技术，将微管道、微泵、微阀、锻储液池、微电极、微检测元件、窗口和连接器等功能元件象集成电路一样，使它们集成在基片材料上，得以实现样品提取、混合、扩增、分离、分析等多种分析功能的系统。过去几年来已经研制成功的叮a s 单元功能微器件有：微激励器“”、微泵和微阀、细胞分离芯片“、d n a 提取芯片“、p c r 微流控芯片、c e 电泳芯片、d n a芯片等。微泵和微阀是指可以对微流体进行驱动和控制的微元件。微泵的主要功能是第一章绪论对流体进行驱动。驱动的方式主要有：热驱动，电渗驱动，形状记忆含金驱动，压电陶瓷驱动等。目前大多数的泵采