（植物病理学专业论文）枯草芽孢杆菌B11菌株化学诱变的研究.pdf

枯草芽孢杆菌b 1 1 菌株化学诱变的研究 摘要 从西瓜根围分离得到的枯草芽孢杆菌( b a c ? u ss u b t ，s ) b 11 菌株对西瓜枯萎病菌具有较强的抑菌活性。利用化学诱变剂亚硝 基胍对经紫外线诱变b 11 菌株变异获得的g 17 菌株进行诱变。筛 选获得b v 2 2 、b v 5 6 、b v l2 和b v l4 共4 株菌株，这4 株诱变菌株 对西瓜枯萎病菌的抑菌活性比g 17 和b 11 菌株的抑菌活性高。其 中b v 2 2 菌株对西瓜枯萎病菌的抑菌活性比g 17 和b 1 1 菌株提高了 3 6 8 8 和7 2 7 8 ；其粗拮抗物质的含量分别提高了3 0 15 和 6 2 5 3 。经十代连续传代培养后这4 株诱变菌株对西瓜枯萎病菌 的抑菌活性基本上保持不变。 b v 2 2 菌株在p h3 0 l4 和温度1 0 = c 6 0 下均能生长，最适生长p h 为8 0 ，最适生长温度为4 4 。c 。b v 2 2 菌株、g 1 7 菌株和b 1 1 菌株、都能利 用蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、果糖、木糖、核糖、甘氨酸、硫酸铵、 d l 一丙氨酸、l 一赖氨酸、l 一组氨酸作为碳氨源；这三株菌株的接触酶、葡 萄糖氧化发酵、淀粉水解、纤维素分解、七叶苷、酒石酸盐、b 一半乳糖苷、 精氨酸双水解、氰化钾、尿素、柠檬酸盐、丙二酸盐、荧光色素、苯丙氨 酸脱氨酶、明胶水解等反应相同，但对于甲基红、v - p 测定、吲哚、硝酸 盐还原、硝酸还原和反硝化反应，b 11 和g 17 表现相同，而b v 2 2 菌株与前 两株菌株不同。在上这三株菌株的特征相似，均为椭圆形，周生鞭毛。但 这三株菌株的16 sr d n a 序列的碱基进行比较时存在着差异。 b v 2 2 菌株产生的拮抗物质对茉莉白绢病菌( s c l e r o t i u m ，o l f s i i s a c c ) 、水稻纹枯病( r h i z o c t o n i as o l a n ik u h n 人茄青枯拉尔氏菌 i ( r 口b t o 门f 口j d l a n a c e a r 甜m ( s m i t h ) y a b u u c h ie ta 1 ) 、柑桔炭疽病菌 ( c d l l p t o t r i c 矗甜mg l o e o s p o r i o i d e s ( p e n z ) s a c c ) 、茉莉拟茎点霉菌 ( p h o m o p s i ss p ) 、玉米串珠镰孢菌( f u s a r i u mm o n i l i r o r m es h e l d ) ) 、玉米大 斑病菌( e x s e r o h i l u mt u r c i c u m ( p a s s ) l e o n a r d & s u g g s ) 、水稻稻瘟病菌 ( m a g n a p o r t h eg r i s e a ( c o o k ) s a c c ) 、香蕉链格孢菌( a l t e r n a r i a m u s a eb o u r e tb a t ) 、苦瓜链格孢菌( a l t e r n a r i ac u c u m e t i n a 佃1 1 c t e v ) e l l i o t t ) 、番茄灰霉病菌( b o t r y t i sc i n e r e a p e r ) 、白菜黑斑病 菌似l t e r n a r i ab r a s s i c a e0 3 e r k ) s a c c ) 、香蕉新月弯孢c u r v u l a r i al u n a t a ( w a l k e r ) b o e d i j i n ) 、玉米小斑病菌( b i p o l a r i sm a y d i s ) 、八角炭疽病菌 ( c o l l e t o t r i c h u mc o c c d e s ( w a l l ) h u g h e s ) 有抑菌活性。但对草莓轮斑病菌 ( p h o m o p s i so b s c u r a n s ( e 1 1 e te v ) s u t t o n 和杨桃炭痘病菌f c o l l e t o t r i c h u m g l o e o s p o r i o i d e s ( p e n z ) s a c c ) 无抑菌活性。其中对茄青枯劳尔氏菌 ( r s o l a n a c e a r u m ) 和水稻纹枯病( r s o l a n i ) 的抑菌活性特强。 关键词：枯草芽孢杆菌诱变抗菌谱 s t u d yo nt h em u t a t l 0 no f b a g i l l u ss u b t l l l ss t a l n sb 1 1 a b s t r a c t b a c i l l u ss u b t i l i ss t r a i nb 1 1 ，w h i c hi s o l a t e df r o ms o i li n g u a n g x i ，w a s s t r o n g l yi n h i b i t i o nt ot h eg r o w t ho ft h ep a t h o g e no fw a t e r m e l o nw i l l ，s t r a i ng 1 7 m u t a t e df r o ms t r a i nb 11b ym e a n so fu l t r a v i o l e tr a d i a t i o nw a st r e a t e dw i t h n i t r 。s o g u a n i d i n e ( n t g ) ，a n df o u rs t r a i n s ，w h i c hh a sh i g h e r a n t a g o n i s t i ca c t i v i t y a g a i n s tf o x y s p o r u mt h a ns t r a i ng 1 7 ，w e r eo b t a i n e d s t r a i nb v 2 2p r o d u c e dt h e h i g h e s tq u a n t i t yo fa n t a g o n i s t i cs u b s t a n c ei nf o u rs t r a i n s t h ea n t a g o n i s t i c a c t i v i t yo fs u b s t a n c ep r o d u c e db ys t r a i nb y 2 2i n c r e a s e d3 6 8 8 a n d7 2 7 8 0 0 t h a ns t r a i ng 1 7a n ds t r a i nb 11 ，a n dt h eq u a n t i t yo fa n t a g o n i s t i es u b s t a n c e p r o d u c e db yt h es t r a i ni n c r e a s e d3 0 1 5 a n d6 2 5 3 t h a ns t r a ing 1 7 a n ds t r a i n b 1 1r e s p e c t i v e l y s t r a i nb v 2 2c o u l dg r o ww e l li np h3 1 4a n da t1 0 6 0 s u i t a b l ep i ta n d t e m p e r a t u r ew e r e8p ha n d4 4 f o rt h eg r o w t ha n dp r o d u c e i n ga n t a g o n i s t i c s u b s t a n c eo fs t r a i nb v 2 2 s t r a i nb v 2 2 ，g 1 7a n db 1 1w e r ea l m o s tt h es a m ea t p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t y a l lo ft h e mc o u l du s es u c r o s e ，g l u c o s eh y d r a t e ， m a l t o s e ，l a c t o s e ，m a n n o s e ，x y l o s e ，s o r b i t o l ，r a f f i n o s e ， f r u c t o s e ，r i b o s e ， g a l a c t o s e ，i n o s i t o la sc a r b o ns o u r c e ，a n du s e ( n i t 4 ) 2 s 0 4g l y c i n e ，d l a l a n i ，l l y s i u e ，l - h i s t i d i n ea sn i t r o g e ns o u r c e t h e yw e r et h es a m ei nt h er e a c t i o no f c o n t a c t e de n z y m e ，l e t a b o l i t eo fg l u c o s e ，s t a r c hh y d r o l y s i s ，f i b r eh y d r o l y s i s ， m i l k ，e s c u l i n ，t a r t r a t e ，o n p g ，d e n i t r i f i e a t i o n ，k c n ，u r e a ，s o d i u m c i t r a t e ， m a l o n a t e ，b u ts t a i nb v 2 2w a sd i f f e r e n tw i t hb o t ho fs t a i n sb 1 1a n ds t a i ng 1 7 i nt h er e a c t i o no fm e t h y lr e d ，v p t e s t ，d e n i t r i f i c a t i o na n di n d o l e t h es e q u e n c e o f1 6 s d n ao fs t r a i nb v 2 2w a sd i f f e r e n ti ns o m ea d d u c tb a s ep a i rw i t hs t a i nb 1 1 i i i a n ds t r a i ng 1 7 t h ea n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c eh a si n h i b i t o r ya c t i v i t ya g a i n s tm a n yp l a n t p a t h o g e n i cf u n g ia n db a c t e r i a ，s u c ha s s c l e r o t i u mr o l f s i ? ，y f l i z o c t o n i a s o i a n ? c o l l e t o t r i c h u mg l o e o s p o r i o i d e s p h o m o p s i ss p f u s a r i u m m o n i i r o r m ，e x s e r o h i i u mt u r e i c u m , m a g n a p o r t h eg r i s e a ，a 7 t e r n a r i am u s a e 4 1t e r n a r i ac u c u m et i n a ，b o t r y t i sc i n e r e a ，a t t e r n a r i ab r a s s i c a e ，u r v u i a r i a l u n a t 昌b i p o l a r i sm a y d i s , w h i e ha m o n g ，t h ea n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c eo fs t r a i n b v 2 2h a se x t r e m e l yi n h i b i t o r ya c t i v i t ya g a i n s tr s 0 1 a n a c e a r u ma n d 厅 s o l a n i b u tith a se x t r e m e l yi n h i b i t o r ya c t i v i t ya g a i n s tp h o m o p s i so b s c u r a n s a n dc o l l e t o r t i c h u mg l o e o s p o r i o i d e sp a t h o g e n k e yw o r d ：b a c i l l u ss u b t i l i sm u t a ti o n i n h i b i t o r ys p e c t r u m r - 西大掌硕士掌位论文 枯草芽孢杆菌b 11 菌株化掌诱变的研究 1 前言 西瓜枯萎病又称萎蔫病或蔓割病，是由f u s a r ： u mo x y s p o y u ms c h l f s p n i v e u m ( e f s m i t h ) s y n e th a n s 侵染引起的一种世界性土传病害。该病害在西瓜整个生育 期都可以发生，以开花到结果期最重。幼苗发病，叶片皱缩，枯萎发黄，须根减少，倒伏枯 死。成株期发病，病株生长缓慢，叶片自下向上逐渐萎蔫枯死，发病初白天萎蔫夜间尚可 恢复正常，茎基部初呈黄绿色水浸状长条形病斑，以后条斑颜色变深，常纵裂，分泌黄色 胶状物，潮湿时病斑上可生白色至粉红色霉，茎基横断面，可见维管束变褐，为该病的重 要特征。自1 8 9 4 年s m i t h 在美国南卡罗来纳州首次发现以来，目前己几乎发生于世界 各个西瓜产区，辽宁、山东、湖北、北京、广西等1 8 个省市许多地区发生严重。、“。严 重威胁着西瓜的安全生产。由于该病害属于土传病害，病原菌在土壤中可长期存活，防 治十分困难，重茬地一般发病率在3 0 ，严重地块达8 0 以上，甚至造成绝产“1 。 1 1 西瓜枯萎病的防治研究状况 国内外对西瓜枯萎病的防治工作均十分重视，在农业防治、化学防治、微生物防治 方面取得了一些研究进展。 1 1 1 农业防治 1 1 1 1 土壤处理 土壤酸度过高，c 。含量下降，有利于病菌的活动，而不利于瓜类作物的生长，导致发 病率增高。施用石灰可改变土壤酸碱度，利用蟹壳、堆肥、石灰等有机物改善土壤生态 环境，施用土壤添加剂等，对该病有一定的防治效果5 “。江苏省农科院植物保护研究所 夏正俊等将河塘蚌壳粉，甘蔗渣，偏碱的钙镁磷肥和矿灰作为添加物，以8 0 k g 6 6 6 7 m 2 施入病重田可延缓发病期，栽瓜苗时伴随窝施，效果更佳“1 。土壤添加剂是一种有机、 无机营养混合物，我国台湾中兴大学研制的s h 混合物可抑制西瓜枯萎病菌厚垣孢子萌 发，促进瓦解芽管，诱发土壤细菌分解菌丝”1 。 高温处理土壤也可以抑制病害的发生，如希腊用太阳能暴晒土壤结合覆膜高温处理 连续1 4d ，大大降低土壤中病原菌数量。近年日本在夏季利用太阳能进行土壤消毒并结 合增施有机物的综合防治方法较好地防治西瓜枯萎病“3 。我国在这方面的研究和实践较 广西大掌硕士掌位论文 枯草芽孢杆菌b ll 菌株化掌诱变的研究 少。 1 1 1 2 选育抗病品种 利用抗病品种防治西瓜枯萎病是一种经济有效的途径之一。但由于病原菌的变异， 抗病育种工作难度较大。据报道目前西瓜专化型共有3 个生理小种。1 。1 9 6 3 年c r a l l 首 次指出佛罗里达州存在2 个生理小种9 3 ；意大利的c i r u l l i 把西瓜枯萎病菌划分为生理 小种0 和1 ；1 9 7 3 年在以色列报道有致病性更强的小种2 “”。我国以生理小种1 占主导。 野生西瓜材料p i 2 9 6 3 4 是国际上公认的唯一抗西瓜枯萎病3 个生理小种的抗源。近年 来利用生物技术将瓠瓜d n a 导入西瓜选育出了抗枯萎病种质资源。1 。高抗西瓜枯萎病的 品种有美国s u m m i t 、c h a r l e s t o ng r a y 等品种和我国的丰收3 号、西农8 号、京抗1 号、 红优4 号、郑抗1 号、抗丙苏红宝、台湾黑宝等对西瓜枯萎病具有一定的抗性。但由于 病原菌的变异，抗病品种栽培3 5 年后失去抗病性，因此，抗病品种满足不了生产的 要求。 i 1 1 3 轮作倒茬 轮作倒茬是生产上最简便、经济、有效的办法。与葱属植物轮作或混植，可以减少 其后茬土壤中枯萎病菌的数量，减轻病害的发生。另外水旱轮作，土壤淹水能够大大降 低病原菌数量。但由于枯萎病菌在土壤中可以长期存活，加之我国耕地面积有限，特别是 在保护地栽培条件下，很难完全实行轮作倒茬。日本报道，瓜类与百合科的大葱、大蒜、 十字花科的甘蓝等轮作或混植，对该病的发生具有较好的控制作用，在瓜类连年种植的 情况下，枯萎病亦不发生“。 i 1 1 4 嫁接换根 嫁接换根也是防治西瓜枯萎病的有效途径之一。西瓜的砧木以葫芦和南瓜为主，目 前在我国可利用的主要西瓜砧木良种是中国农科院郑州果树研究所培育的超丰f 1 西瓜 砧木新品种，超丰f 1 不仅对枯萎病有免疫性，对为害根部的根瘤线虫和守瓜幼虫也有 较好的抗性“”嫁接栽培方法成本低，效益高且简便，但由于需要一定的技术，在我国栽 培技术不高的情况下，有些地方尚未大面积推广。 1 2 化学防治 利用化学农药防治西瓜枯萎病，在苗期主要是用高锰酸钾溶液浸种处理，用多菌灵 进行苗床消毒或利用溴甲烷、棉隆等进行土壤熏蒸处理等预防措施“。在发病初期用多 菌灵或甲基托布津、绿亨一号等药剂喷洒发病植株或灌根，可以起到一定的防治效果， 2 广西大掌硕士掌位论文枯草芽孢杆菌b 11 菌株化学诱变的研究 其中绿亨一号防治话瓜枯萎病具有增产作用“。用化学药剂如敌克松等进行土壤消毒， 效果也较好“。据研究报道：枯萎灵、5 0 菌杀清、1 5 水庄园水剂、5 0 双效灵、治萎 枯、5 0 d t 杀菌剂、6 8 4 托福美、百菌清、苯菌灵、菌毒清，治枯灵，绿风9 5 及可杀 得等药剂对西瓜枯萎病都有一定的防效作用“2 3 1 ”1 药剂防治多以发病前灌根效果较好， 一般应灌2 3 次。但是化学防治由于缺乏高效，低毒，无环境污染的杀菌剂，易造成 农药残留，对人畜有伤害，而且由于枯萎病为土传病害，难以实行大面积的土壤药剂处 理。 1 3 生物防治 生物防治的研究是近年来随着化学农药的普及应用，对环境安全和人类健康日益构 成威胁从而得以重视。近几年来国内外有关植病生物防治的文献资料急剧增加，国际性 学术交流日益频繁。生物防治的生产实践也在不断地扩大。在自然界中存在着大量拮抗 微生物。目前从微生物中发现约有80 0 0 种生物活性物质“1 ，其中大部分生物活性物质 对植物病原菌有抑制活性。由于拮抗微生物容易从自然界中分离得到，在实验室条件下 容易培养，而且拮抗微生物的代谢产物及次级代谢产物对许多病原真菌和病原细菌、病 毒等有拮抗作用，同时微生物制剂施用后，对环境兼容性好，产生的副作用较小。因此， 生物防治成为世界性的热门课题。 目前对西瓜枯萎病的生物防治主要是采用拮抗微生物降低病原菌的密度从而达到 控制病害的目的。其防治机制主要包括产生抗菌素抑制病原菌的生长、与病原菌之间的 生态位点及营养的竞争、诱导寄主产生抗性等。r o b e r t 等从西瓜根际分离的非致病性 f u s a r i u m o x y s p o r u m 在大田土壤处理中能降低病害发生率3 5 7 5 “真菌研究较多的 有口j c h o d e r m a 7 8 _ r z i s n u m , fv i r i d 及6 j i o c a d i u mv i r e n s 等，作用机理主要是竞争、 抗生及寄生作用。p s e u d o m o n a s f u o r e n c e n s 、p s e u d o m o n ap u t i d a 、s e r r a t i m a z c e s c e n s 和a r t h r o b a t e rs p 是比较好的生防细菌能很好地定殖在作物根际，通过产生 荧光嗜铁素或几丁质裂解酶等细胞壁降解酶阻碍病原菌在寄主体内的增殖和扩展。 s i n g h 等利用几丁质裂解细菌p a e n i b a c i l l us s p 3 0 0 和s t r e p t o m y c e ss p 3 8 5 单独或 者混合施入可以很好的控制黄瓜枯萎病。”。在1 9 8 9 年s u ns k 和h u a n gj w 等报道用木 霉t r i c h o d e r m a l i g n o r u m 防治西瓜枯萎病，并以得一定良好效果。纪明山等实验证 明用绿色木霉t r 一8 菌株和芽孢杆菌b 6 7 菌株的发酵物混合后制成健根宝粉剂还对西瓜 植株具有一定的促进作用。澳大利亚研究开发属于最s u b t i l i s 的a 一1 3 对麦类和胡萝 x - 西大掌司e 士学位论文 枯草芽孢杆菌b 11 菌株化掌诱变的研究 h 立枯病和土传病害具有很好的防病增产作用。”许孔建报道可草芽孢杆菌b - 9 0 3 产生 一种耐高温抗菌物质，有广泛的抑菌谱包括土传镰刀菌、气传植物病原菌。“。 国内生物防治的研究多是筛选在根部有定殖力且无致病性或弱致病性菌系，最近河 南农业大学李洪连等人从大量镰刀菌中筛选出了t 1 l 和a 2 菌株，这两个菌株能在西瓜 根部大量定殖且无致病力，利用它们的固体培养物( 麦粒砂) 按土重1 接种于西瓜育苗土 壤中打钵育苗移栽，田间防效均在7 0 以上汹、“。浙江农业大学林福呈等人从西瓜根围 中分离3 株枯草芽孢杆菌，其中h q s 一0 0 4 菌株抑菌效果最好，2 倍稀释液对西瓜枯萎病 菌的大、小分生孢子萌发抑制率分别为8 9 1 和8 7 9 ”；河南省农业大学于思勤、王 守正等人从西瓜维管束中分离到的弱致病菌株f o 一3 和f 5 1 在幼苗期( 2 叶期) 注射西瓜 茎部，对西瓜枯萎病有明显的交互保护作用，在f o 一3 接种后再接病菌，或f 5 1 接种后 5 天再接病菌，相对防效分别达9 6 8 和9 8 1 啪、州。西瓜枯萎病生物防治因生防因子具 有防治效果易受环境条件的影响、抑菌范围窄等缺点，而尚未成功地应用于大田，然而 就其防治潜力而言，仍不失为值得进一步探索的有效途径。 随着分子生物学及分子遗传学的逐步深入，近几年来，转基因植物和生防菌改良的 研究十分活跃，转基因植物已运用到生产中。如：c h e nw e n s h a w 等已成功利用花粉管 基因转导技术获得1 0 株抗西瓜枯萎病植株。“。通过改良生防菌来防治西瓜枯萎病也取 得了很大的突破。如m a u r h o f e 等将融合质粒m e 3 0 9 0 导入p s e u d o m o n a s f u o r e n c e n s c h a o 获得融合菌株，大大提高了对黄瓜枯萎病的生防能力。“。预计今后通过基因工程技 术进行生防微生物的遗传改良，构建新型高效生防菌这一途径来控制西瓜枯萎病。 1 4 微生物的诱变育种 尽管我国生物菌种种质资源比较丰富，但自然界中具有生防潜力的野生微生物菌种 种质资源是有限的，而且自然界中的拮抗微生物所产生的拮抗物质含量及拮抗物质的种 类比较少，其生防能力较差，其抗菌谱也比较狭窄，直接用于拮抗微生物工厂化生产是 不经济的。因此有必要通过一种新的途径能在短期内使生防菌得到进化。生物的进化实 际上就是对变异选择的过程。在自然状态下，变异发生的频率是很低的，一般来说，单 个生物细胞发生突变的频率介于于千分之一至万分之一之间，单个基因则介于十万分之 一至百万分这一之间。“。因而物种表现为相对的稳定性和一致性。自然界中大量存在的 遗传差异是物种内变异长期积累的结果。然而人工诱变可使自然突变率提高千倍以上。 多年以来，人类渐渐撑握了各种创造生物突变的手段，从而大大丰富了物种的遗传变异 4 广西大掌司e 士掌位论文枯草芽孢杆菌b ll 菌株化掌诱变的研究 范畴，为生物遗传学研究和生物育种奠定了坚实的物质基础。当前工业生产所使用的高 产菌株，几乎都是通过诱变而获得的高产菌株。目前生物诱变手段主要有化学诱变、物 理诱变和空间诱变等诱变方法。在多种诱变技术中，化学诱变因具有时间短，后代稳定 快、方法简便、容易推广应用等优点已在生物育种上得到较广应用，尽管它还存在一些 尚未解决的问题，但将化学诱变应用于生物育种，根据育种目标从后代中选出新种质不 失为一种快速、高效的现代育种方法。 1 5 微生物的化学诱变 第二次世界大战期间，科学家发现了第一个化学诱变剂芥子气，开辟了化学诱 变的新途径1 。从此，利用化学手段进行人工诱变的工作，在世界范围内广泛开展起来。 化学诱变始于2 0 世纪初。1 9 4 3 年o c h l k e r s 用脲脘处理月见草以后，化学药剂的诱变作 用得到肯定1 。 化学诱变就是利用化学诱变剂处理分散均匀的微生物细胞群，以引起碱基置换、染 色体断裂、基因重组或基因突变等生物学效应，使后代产生变异。3 3 “。然后采用简便、 快速、简单的筛选方法，可筛选符合育种目标的菌株，以供生产实践或科学研究用 3 6 o 化学诱变剂是靠各自的活性基团，靠它们特有的化学特性直接与生物分子进行各种特定 的化学反应，从而引起生物分子化学性质的变化。与物理诱变相比，很多化学诱变剂产 生了高比例的点突变、低比例的染色体畸变，而物理诱变如以y 射线和x 射线为代表的 电离辐射，其穿透力较强，易被染色体组吸收，对染色体结构具有很大的破坏性“。化 学诱变育种具有以下特点。”“1 ：( 1 ) 诱变突变率较高，具有位点特异性；( 2 ) 染色体畸变 的比例相对较少，很少有致死型发生，对处理材料损伤轻；( 3 ) 有迟效作用，即诱变引 起的损伤和染色体断裂，有的并不立即断开；( 4 ) 存在残留药物的后效作用，在m 1 代引 起的生物损伤大；( 5 ) 引起的突变范围广，后代选择需要足够大的群体：( 6 ) 价格便宜， 操作简单，不需要特殊设备。 许建平等利用化学诱变剂烷化剂类的硫酸二乙酯处理枯草杆菌b 8 2 6 ，筛选出了突变 菌n o 3 5 能稳定地保持高效的拮抗活性和遗传“。王璋等人用亚硝基胍处理从土壤中分 离得到的链霉素获得了性能良好的产酶链霉素( w z f f ) “3 1 。 广西大掌硕士掌位论文 枯草芽孢杆菌b 1l 菌株化掌诱变的研究 1 6 化学诱变剂 化学诱变剂大体上有5 种，它们是：烷化剂、碱基类似物、碱基异构体、染色体断 裂剂、诱发多倍体药剂。在诱变育种中，最有效的化学诱剂是烷化剂。烷化剂都带有一 个或多个活泼的烷基，烷基能转移到其它电子密度较高的分子中去。 烷化剂分子的重要成份是它的功能基，是烷化剂活性的重要因素。烷化剂分子可具 有单个、二个或三个功能基，实验证明，多功能基的化合物比单功能基的毒性要强，但 诱变效率并不如单功能基的化合物，所以一般用单功能基的化合物。几种重要的烷化剂 化合物为甲基磺酸乙酯( e m s 英文全写) 、硫酸二乙酯( d e s 英文全写) 、n 一甲基一n 一硝基 一n 一亚硝基胍( n - m e t h y l n n i t r o n n i t r o s o g u a n i d i n e ) ，简称m n n g 或n t g 。特别是亚 硝基胍( n t g ) 和甲基黄酸乙脂( e m s ) 对原核生物的诱变效果很好，可能是这类诱变剂 容易接近原核细胞的d n a 。 在烷化剂中，亚硝基胍对每一个细胞可有诱发一次至多次的效力，故有“超诱变剂” 之称，是已知的有效的诱变剂之一，在适宜的条件下，能在较小的死亡率的条件下得到 较大的突变率。n t g 的浓度和突变率比例之间的关系是复杂的，在0 1 1 o g l 的浓度 下可得到不同种类突变体的最高产量。它是与一个或多个核苷酸碱基直接起化学作用的 诱变剂。 n t g 在碱性条件下会形成重氮甲烷( d i a x o m e t h a n e ，c h 。n 。) ，它是引起诱变和致死的 主要原因，它的效应很可能是重氮甲烷对d n a 的烷化作用引起来的“”。在p h 为6 时两 者均不产生，此时的效应可能是由n t g 本身对核蛋白引起的变化所致“2 1 ，在可见光下， n t g 会释放出n o ，使颜色由土黄色变成黄绿色，所以必须避光保存“4 。 亚硝基胍的使用方法的是配制一定浓度的亚硝基胍溶液，需现用现配，将处于对数 生长期的细胞菌体用缓冲液做成悬浮液，细菌悬浮液浓度约为1 0 6 1 0 7 个m l ，加入n t g 溶液，使最终作用浓度为0 1 1 0g l 并在菌体最适生长温度保持若干时间，适当稀 释倍数，取0 1m l 均匀涂皿。 化学诱变剂亚硝基胍所处理的微生物一般要求呈悬浮液状态。分散状态有利于细胞 均匀地接触诱变剂，也可以部分地避免出现不纯的菌落。因为如果突变发生在两个连在 一起的两个细胞中的一个，那么这两个细胞在培养皿上便将形成一个不纯的菌落。诱变 所处理的细胞中的细胞核愈少愈好，最好是处理单核细胞，因为如果突变发生在细胞中 两个细胞核中的一个，那么这一细胞在培养皿上也将形成一个不纯的菌落。所以在选择 广西大掌硕士掌位论文 枯草芽孢杆菌b 1 1 菌株化掌诱变的研究 诱变材料时，最好是选择单细胞的生物，选综合性状优良，适应性好，但又须改良某个 缺点的菌种，处理后稳定快，能很快再用于生产。亚硝基胍在诱变过程中常受到一些诱 变因素的干扰而影响诱变效应。如诱变剂的分解或水解，使作用过程变得复杂，副作用 明显：处理菌体悬浮液的p h 值影响着化学诱变剂的水解，所以在诱变过程中常选用一 些缓冲液。此外，诱变处理后的材料必须置于最适生长条件下才能表现出真正的处理效 果。 1 7 本研究的意义 西瓜枯萎病是西瓜生产中的重要病害之一，探索经济有效的防治该病的新途径，对 广西瓜稳步发展具有重要意义。b 。菌株是从西瓜根围分离得到的一株有效抑制西瓜枯萎 病菌的枯草芽孢杆菌菌株。该菌株所分泌的拮抗物质水平较低，这对利用b 1 1 菌株生产 拮抗物质带来了难题，因此，对b l l 菌株进行诱变育种，选育出高产拮抗物质的诱变菌 种，将会提高b 1 1 菌株的利用潜力，为利用b 1 1 菌株工厂化生产拮抗性物质打下基础， 也将给西瓜枯萎病的生物防治带来广阔的前景。 广西大学硕士掌位论文 枯草芽孢杆菌b 1l 菌株化掌诱变的研究 2 1 材料 2 材料与方法 2 11 供试菌株 枯草芽孢杆菌( 励c j j “量s u b t i l i s ) b 1 1 菌株和g 1 7 菌株( 枯草芽孢杆菌b 1 1 菌 株经紫外线诱变筛选出来的抑菌活性较强的诱变菌株) ，西瓜枯萎病菌( fo x y s p o r u m s c h l f s p n i v e u m ( e f s m i t h ) s n y e th a n s ) 、茄青枯拉尔氏菌( r a l s t o n i a s d a 门a c p a ，历( s m i t h ) 、番茄灰霉病菌( b o t r y t i sc i n e r e a p e r ) 、水稻稻瘟病菌 ( m a g n a p o r t h eg r i s e a ( c o o k ) s a c c ) 、水稻纹枯病( r h i z o ct o n i as o j a n i k u h nj 、玉米大斑病菌( e x s e r o h i l u mt u r c i c u m ( p a s s ) l e n o n a r d s u g g s ) ，玉米串珠 镰孢菌( f u s a r i u mm o n i l i r o r m e $ h e l d ) 、玉米小斑病菌( b i p o l a r i sm a y d i s h s h i k m i y a b 彰s h o e m ) 、茉莉白绢病菌( s c l e r o t i u mr o l f s i is a c c ) 、茉莉拟茎点霉菌 ( p h o m o p s i ss p ) 、柑桔炭疽病菌( c o l i e t o t r i c h u mg l o e o s p o r i o i d e s ( p e n z ) s a c c ) 、杨桃炭疽病菌( c o l l e t o t r i c h u m o e o s p o r i o i d e s ) 八角炭疽病菌 ( c o l l e t o t r i c h u m 鲥o e o s p o r i o i d e s ) 、白菜黑斑病菌( a t e r n a r i ab r a s s i c a e ( b e r k ) s a c c ) 、芥菜黑斑病菌( a t e r n a r i ab r a s s i c i c o l a ( s c h w ，w i l t s h i r e ) 、香蕉 新月弯孢菌c u r v u l a r i a 咖a 抬仇 k e r ) b o e d i j i n ) 、苦瓜链格孢菌( a l t e r n a r i a c u c u m e t i n a e t e v 夕田j d t 幻、香蕉链格孢菌( t e r n a r i a 埘盯s a eb o u r e t 如t ) 、草莓轮斑病菌( p h o m o p s i so b s c u r a n s 位e te v ) s u t t o n 、均由广西大学植病 研究室提供。 2 12 供试培养基 广西大掌硕士掌位论文 枯草芽孢杆菌b 11 菌株化掌诱变的研究 y d c 液体培养基酵母浸膏 葡萄糖 碳酸钙 蒸馏水 p h p d a 培养基 n a 培养基 丙二酸利用培养基 马钤薯 葡萄糖 琼脂粉 蒸馏水 牛肉浸膏 蛋白胨 葡萄糖 脂脂粉 蒸馏水 p h 酵母膏 ( n h 。) 。s o 。 k z h p 0 4 k h 。p 0 4 n a c l 丙二酸钠 溴百里酚蓝 蒸馏水 p h 9 1 0 0g 2 0g 2 0g 1 0 0 0m l 7 o 2 0 0g 1 5g 1 4g 1 0 0 0m l 3g 1 0g 2 0g 1 4g ( 液体不加琼脂) 1 0 0 0m l 7 2 1 0g 2 0g 0 6g 0 4g 2 0g 3 0g 0 0 2 5g 1 0 0 0m l 7 2 广西大掌硕士掌位自t 2 - 文 枯草芽孢杆菌b l1 菌株化掌诱变的研究 柠蒙酸盐培养 葡萄糖氧化发酵培养基 淀粉水解培养基 甲基红培养基 n a c l m g s 0 47 h 。0 n h 。h 2 p o 。 柠檬酸钠 蒸馏水 0 4 酚红液 p h 蔗糖 蛋白胨 牛肉膏 酵母膏 m g s 0 4 7 h 2 0 琼脂 水 d h 蛋白胨 牛肉汁 o 2 的可溶性淀粉 p h 蛋白胨 葡萄糖 k 。h p n 水 p t t lg 0 2g 0 2g 2g 1 0 0 0m l 2 0m l 7 o bg bg bg 1g 0 5g 1 5g 1 0 0 0m l 7 2 1 0g 1 0 0 0m l 5m l 7 0 bg bg bg 1 0 0 0m l 7 0 广西大掌司e 士学位论文 枯草芽孢杆菌b 11 菌株1 | 翟靼诱变的研究 纤维素分解培养基 硝酸盐还原培养基 亚硝酸还愿培养基 反硝化培养 苯丙氨酸脱氨酶培养基 蛋白胨 n a c l 自来水 p h 牛肉浸膏 蛋白胨 葡萄糖 k n o 。 蒸馏水 p h 牛肉膏 蛋白胨 亚硝酸钠 蒸馏水 p h bg bg 1 0 0 0m l 7 0 3g 3g 1 0g l g 1 0 0 0m l 7 o 1 0 bg 1g 1 0 0 0m l 7 o 普通肉汁胨培养液 1 0 0m l 硝酸钾 1 g p h 7 3 酵母膏 n a 2 h p 0 4 d l 一苯丙氨酸 n 。c l 琼脂 蒸馏水 p h g g g g g o o 3 2 5 屹 m l 广西大掌硕士掌位论文 枯草芽孢杆菌b ll 菌株化掌诱变的研究 明胶液化培养基 萤光色素培养基 碳源利用基础培养 氮源利用基础 蛋白胨 明胶 水 p h 蛋白胨 甘油 k 。h p 0 4 m g s 0 47 h z 0 蒸馏水 ( n h 4 ) 2 s 0 4 n a h 2 p 0 4 h 2 0 k 2 h p 0 4 m g s 0 4 7 h 2 0 c a c l 2 2 h 2 0 蒸馏水 k h 2 p 0 4 n a 2 h p 0 4 m g s 0 4 7 h 2 0 f e s 0 4 7 h 2 0 c a c l ， 葡萄糖 蒸馏水 0g 1 0 0 1 5 0g 1 0 0 0 m l 7 2 2 0g 1 0 g 0 1 5g 0 1 5g 1 0 0m l 2g 0 5g 0 5g 0 2g 0 1g 1 0 0 0 m l 1 3 6g 2 1 3g 0 2g o 5 m g 5m l 1 0 9 1 0 0 0 m l 牛奶分解培养基：( 1 ) 脱脂牛奶的制备：新鲜牛奶用离心机分离，除去上层奶油，取 下层脱脂牛奶。 2 广西大学硕士学位论文枯草芽弛杆菌b 11 菌株化掌诱变的研究 f 2 1 石蕊牛奶配制：2 5 石蕊水溶液4m l ，脱脂牛奶1 0 0m l 。 2 1 3 供试的试剂、酶、缓冲液和常规溶液 化学试剂：亚硝基胍( n i t r o s o g u a n i d i n e ) ( 东京化成工业株式会社生产) 、硫酸 铵、丙酮、氯仿、农用链每素为国产分析纯。 t a q 聚合酶，购自t a k a l a 公司；d n t p ，购自p r o m e g a 公司 甲基红测定用的试剂： 甲基红01g 9 5 乙醇 3 0 0m l 蒸馏水 2 0 0m l v - - p 测定用的试剂： 肌酸 氢氧化钠 淀粉水解用的试剂卢哥氏碘液： 硝酸盐还原用的试剂：格里斯氏 a 液：对氨基苯磺酸 稀醋酸 b 液：一萘胺 蒸馏水 稀醋酸 0 3g 或原粉 4 0 0 5g 1 5 0m l 0 1g 2 0m l 1 5 0m l 吲哚反应用的试剂： 对二甲基氨基苯甲醛 8m l 乙醇( 9 5 ) 7 6 0m l 浓盐酸 1 6 0m l 苯丙氨基酸脱氨酶用的试剂：1 0 f o c l 。溶液 广西大掌硕士掌位沦文 枯草芽孢杆菌b 11 菌期化掌诱变的研究 2 2 方法 2 2 1 供试菌株的培养 2 2 1 1 细菌的活化培养 将b 1 l 菌株、g 1 7 菌，茄青枯劳尔氏菌及诱变菌株于n a 固体培养上画线培养，并 置于适合的温度下培养2d ，再挑取单菌落于固体n a 培养上进行纯化培养，以备用。 2 2 1 2 真菌的活化培养 将真菌从冰箱里取出于p d a 固体培养上进行培养至菌丝长出，再移小块于固体 p d a 培养基上进一步活化培养。 22 2 生长曲线测定 将活化好的g 1 7 菌株种接一环菌体于n a 液体培养基中于3 2 c 下振荡培养( 1 3 0 r m p ) 培养2d ，按1 的接种量接种于n a 液体培养基中，于3 2 。c 恒温振荡( 1 3 0r m p ) 培养。每间隔2h 取4m 1 发酵液，在6 2 5i 3 m 波长下测其0 d 值，以时间为横坐标，0 d 值为纵坐标作图，绘出该菌株的生长曲线。 2 2 3 化学诱变方法 将供试菌株在n a 中3 2 c 振荡培养箱中振荡培养至对数生长期中后期，收集菌体， 用p h7 0 ，0 2m o l l 的磷酸缓冲液稀释菌体成浓度为1 0 7c u f m l 的悬浮液。取2 0m 1 菌体悬浮液分别装于小口试剂瓶中。 精确称取n t g 2 、4 、6 、8 、1 0m g 于小试管中，按1 0m gn t g 加丙酮溶液1m l 的比 例溶解n t g 配成n t g 试液。分别将不同浓度的n t g 试液移到装有菌体悬浮液的小口试剂 瓶中，使用权n t g 的终浓度分别为0 1 、0 2 、0 3 、0 4 、0 5 9 l ，于3 2 c 下振荡( 1 3 0r p m ) 3 0 6 0m i n ，5 0 0 ( r p m ) 离心1 5r a i n 取菌体，分别用磷酸缓冲液洗涤菌体3 次，取菌体沉 淀用生理盐水配成1 0 7 c f u m l 菌体悬浮液，取o 1m l 菌体分别涂布于n a 平板上，3 2 下培养4 8h ，统计菌落，计算致死率。 致死率= 塑驾糕笋m 。 粹僚兮荫隰新 广西大学硕士掌位论文 枯草芽孢杆菌b 11 菌株化掌诱变的研究 22 4 诱变菌株的筛选 将按2 2 1 1 法培养好的西瓜枯萎病菌用无菌水制成浓度为1 0 8 孢子m l 的孢子悬 浮液，取2m l 于灭过菌的培养皿中，往皿中倒入