肌苷生产菌育种策略.ppt

肌苷生产菌育种策略,1.肌苷简介2.肌苷的用途3.肌苷的生产方法4.肌苷的生物合成途径5.肌苷合成的代谢调节机制6.肌苷产生菌育种思路,1.肌苷,肌苷(1nosine，缩写IR)又称次黄嘌呤核苷，是次黄嘌呤和核糖的缩合物，其磷酸酯为肌苷酸。肌苷分子式为C10H12N405，相对分子质量268.23，其化学结构为：肌苷为白色结晶或呈无水粉末状,易溶于水，pH近中性。在饱和水溶液中约含肌苷15g/L。在稀盐酸或氢氧化钠溶液中易溶，在氯仿、乙醇中不溶。无臭，昧微苦。熔点为218。肌苷的用途,2.肌苷的用途,1在食品方面，肌苷是5-肌苷酸的前体,而其可用来做助鲜剂。2肌苷可直接透过细胞膜，进入人体细胞内，使处于低能缺氧状态下的细胞恢复正常水平继续进行新陈代谢，并能活化丙酮酸氧化酶类，参与人体细胞蛋白质的合成，具有激活细胞、刺激代谢等良好作用。3肌苷的医用价值较广泛，主要应用于心脏疾病、肝脏病、白血球减少症、心脑血管疾病、贫血病、血吸虫病、视网膜炎、神经萎缩、毛地黄中毒等症。,3.肌苷的生产方法,肌苷的工业生产方法主要是是利用枯草芽孢杆菌发酵法生产。发酵法包括直接发酵法和添加前体发酵法。,3.肌苷的生产的方法,3.1直接发酵法：借助于微生物具有合成自身所需核苷的能力，通过对特定微生物的诱变处理，选育出营养缺陷型及核苷结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏，从而达到过量积累某种核苷的目的。3.2添加前提物发酵法：利用核苷酸生物合成途径的补救途径，通过在肌苷生产菌的培养基中添加前体物次黄嘌呤，使嘌呤碱基通过补救途径直接合成核苷，从而增加肌苷的生成量。,4.肌苷的生物合成途径,核苷酸的生物合成途径有两条，一条是利用葡萄糖等碳源和氮源，以5-磷酸核糖为出发物质的从头合成，一条是由嘌呤碱基由于核糖基化及磷酸化而合成的补救途径。Nishikawa等对枯草芽孢杆菌嘌呤核苷酸的生物合成途径的研究结果表明，葡萄糖经磷酸戊糖途径生成5-磷酸核糖，从5-磷酸核糖经过11步酶促反应生成肌苷的直接前体物IMP。IMP再经脱磷酸化转化为肌苷。,4.肌苷的生物合成途径,4.肌苷的生物合成途径,同时在枯草芽孢杆菌中，从IMP开始分出两条环形路线：一条是经过XMP合成GMP,再经GMP还原酶的作用生成IMP；另一条是经SAMP合成AMP，再经过AMP脱氨酶的作用生成IMP，从而实现AMP和GMP的相互转变。,4.肌苷的生物合成途径,肌苷生物合成的补救途径,5.肌苷合成的代谢调节机制,枯草芽孢杆菌中嘌呤核苷酸生物合成的调节机制是，在AMP的生物合成中，PRPP转酰胺酶受AMP的反馈抑制，IMP生物合成系的酶和AMP生物合成系的酶受腺嘌呤系化合物的反馈阻遏。在GMP的生物合成中，IMP脱氢酶受GMP的反馈抑制，IMP生物合成系的酶和GMP生物合成系的酶受GMP的反馈阻遏，从IMP合成AMP、GMP，倾向于优先合成GMP。,6.肌苷产生菌育种思路,6.1选择5-核苷酸酶活力强的菌株6.2切断支路代谢6.3解除菌体自身的反馈调节6.4增加前体物的合成6.5构建肌苷工程菌,6.1选择5-核苷酸酶活力强的菌株,5-IMP,5-核苷酸酶,IR,由5-肌苷酸生成肌苷的反应由5-核苷酸酶所催化，5-核苷酸酶活力强，则有利于5-肌苷酸转化成肌苷，从而使肌苷得以大量积累,6.2.1选育丧失IMP脱氢酶或XMP氨化酶的突变株,PRPP,5IMG,IR,XMP,GMP,SAMP,AMP,IMP脱氢酶,XMP氨化酶,选育丧失IMP脱氢酶或XMP氨化酶的突变株，即黄嘌呤缺陷突变株或鸟嘌呤缺陷突变侏，通过限量添加黄嘌呤或鸟嘌呤来解除鸟嘌呤系化合物对IMP生物合成的反馈调节，增加肌昔前体物IMP的积累。,6.2.2选育丧失SAMP合成酶的突变株,PRPP,5IMG,IR,XMP,GMP,SAMP,AMP,选育丧失SAMP合成酶的突变株，即腺嘌呤缺陷突变株，可切断从IMP到AMP支路代谢，通过限量添加腺嘌呤来解除腺嘌呤系化合物对IMP生物台成的反馈调节，增加肌苷前体物IMP的积累。,SAMP合成酶,6.2.3选育核苷磷酸化酶活力微弱或丧失的突变株,肌苷,次黄嘌呤,核苷磷酸化酶,选育核苷磷酸化酶活力微弱或丧失的突变株，使生成的肌苷不再分解成次黄嘌呤。,6.3解除菌体自身的反馈调节,通过选育抗腺嘌呤、鸟嘌呤结构类似物如8-AG、6-MF、8-AX等(或)抗磺胺类药物如SG、ST等突变株，造就肌遗传上解除正常代谢调控的理想菌株。这是因为一个可能途径是关建梅的结构基因发生突变，使关键酶的调节部位不再能和效应物结合，而活性中心部位却不变，因此当细胞中已有大量最终产物时仍能继续合成该产物。另个可能途径是调节基因发生突变，使阻遏物不再能和效应物结合.,6.4增加前体物的合成,由于肌苷生物合成的最初前体物是5-磷酸核糖，所以选育丧失转酮酶活力的突变株，可以切断HMP途径中该酶所催化的反应，使5-磷酸核糖的积累增加，从而增加肌苷生物合成的主代谢流,6.5构建肌苷工程菌,从理论上讲，肌苷工程菌的构建策略有下列几种：第一，借助于基因克隆与表达技术，将肌苷生物合成途径中的限速酶编码基因导入生产菌中，通过增加基因剂量和(或)更换表达调控条件，扩增其表达。导入的限速酶编码基因既可以是生产菌自身的内源基因，也可以是来自非生产菌(如大肠杆菌)的外源基因第二，采取类似的方法，扩增表达肌苷输出系统的关键基因，或者降低某些基因产物的表达速率，最大限度地解除肌苷及其生物全合成中间产物对某生物合成途径可能造成的反馈抑制第三，将多种完整的核苷生物合成操纵子导入另种核昔生产菌中，构建能同时生成两种甚至多种核苷的工程菌